1.

CAPITULO 1: INTRODUCCIÓN
1.1. Situación Problemática
El estadio larval (cisticerco o metacéstodo) de Taenia solium infecta el
sistema nervioso central humano causando la Neurocisticercosis. La NCC es
la parasitosis má s comú n del sistema nervioso central. En la actualidad, es
endémica en la mayor parte de países en desarrollo, y una enfermedad
emergente en los países industrializados debido al aumento en inmigració n
proveniente de zonas endémicas.
La inmunopatología de la enfermedad es compleja, se han desarrollado
mú ltiples estudios sobre la interacció n hospedero-parasito para
comprender mejor esta enfermedad, en los que se han descrito los
mecanismos de supervivencia, convivencia y degeneració n del parasito, la
respuesta inmune que se genera alrededor de este, así como también
mejores métodos de diagnó sticos má s sensibles, específicos y que brinden
informació n adicional.
Existe una pobre correlació n entre la serología positiva, síntomas
neuroló gicos y la presencia de lesiones por NCC en imá genes, los tres
pilares diagnó sticos. Esto debido al resultado clínico inesperado de la
enfermedad asociado a factores como: ubicació n y nú mero de pará sitos en
el cerebro, viabilidad del parasito, tipo de respuesta inmune frente al
parasito, intensidad de la inflamació n alrededor del cisticerco. Un tema
controversial es que en muchos casos la sintomatología se ve exacerbada
por el tratamiento o cuando el parasito esta degenerado y/o calcificado.
Es por ello que la viabilidad de parasito juega un papel importante en la
inmunopatología de esta enfermedad. Se han descrito y postulado
mecanismos por los que el parasito permanece viable en tejido frente a la
respuesta del hospedero, estos son enmascaramiento antigénico y la osmo-
regulació n con el medio externo a través de corpú sculos calcá reos.
Estos ú ltimos has sido estudiado y se ha descrito su composició n orgá nica e
inorgá nica en mayor detalle. Se postula que los corpú sculos calcá reos
cumplirían funciones como: deposició n focal de cantidades excesivas de
calcio que protegen a las larvas contra la calcificació n, como reservorio de
carbonato para protecció n del tejido parasito contra á cidos orgá nicos del
metabolismo intermediario o durante su pasaje a través del estomago al
hospedero definitivo, como reservorio de fosfatos que entran y salen al
medio externo dependiendo de las condiciones externas. La materia
orgá nica de estos corpú sculos aun no han sido descritas en su totalidad.
Seria importante conocer má s sobre estas proteínas, cuantas son, funció n
que desempeñ an, su antigenicidad y si son liberadas o no al medio externo.
1.2. Formulación del Problema
¿Cuál es el perfil proteico de la matriz orgánica del corpúsculos calcáreo y que
capacidad antigénica presentan estas proteínas identificadas con anticuerpos
monoclonales específicos para antígenos de Taenia solium?
1.3. Justificación teórica
Conocer el perfil proteico de los corpúsculos calcáreos e identificar si tienen
características antigénicas nos daría nueva información para el estudio y
 seguimiento de esta enfermedad en relación a la viabilidad del parasito y su
interacción con el hospedero.
Además, actualmente se cuenta con un banco de anticuerpos monoclonales
producidos por el Laboratorio de inmunopatología experimental en NCC de la
Universidad Peruana Cayetano Heredia, el cual está en fase de caracterización y
descripción de sus potencialidades de uso.
Es por ello que el presente estudio tiene como propósito aislar las proteínas de
corpúsculo calcáreo e identificarlas a través de MoAb producidos
específicamente para antígenos de Taenia solium, aportando a su
caracterización, a fin de conocer cuáles son proteínas inmunogénicas
potenciales de emplearse como blanco diagnostico o de tratamiento para la
enfermedad por neurocisticercosis.
Esta investigación beneficiaria al entendimiento de la enfermedad, a la
evaluación de la viabilidad del parásitos en el seguimiento clínico, y con
potencial apoyo al diagnostico y/o tratamiento de pacientes con NCC.
1.4. Justificación práctica
Es estudio de nuevas moléculas antigénicas del parasito larval viable de Taenia
solium y del empleo de anticuerpos monoclonales específicos proveen
herramientas biotecnológicas con potencial uso en el diagnostico y/o tratamiento
de la NCC.
1.5. Objetivos
1.5.1. Objetivo general
 Identificar las proteínas inmunogénicas de corpúsculos calcáreos de
cisticerco de Taenia solium a través del uso de anticuerpos
monoclonales específicos contra este parasito
1.5.2. Objetivos específicos
 Aislar los corpúsculo calcáreos de cisticercos de Taenia solium
 Aislar las proteínas de corpúsculo calcáreos de cisticercos de Taenia
solium.
 Seleccionar del total de anticuerpos monoclonales aquellos que
reactivos a corpúsculos calcáreos
 Determinar la antigenicidad de las proteínas de interés empleando
anticuerpos monoclonales específicos para Taenia solium

2. CAPITULO 2: MARCO TEÓRICO

La Neurocisticercosis es una enfermedad causada por el estadio larval
(cisticerco o metacéstodo) de Taenia solium. Esta enfermedad parasitaria es la
más frecuente a nivel del Sistema Nervioso Central causada por la ingesta accidental
de huevos de Taenia solium en alimentos contaminados por portadores de teniasis
(1-5) (Anexo 1). La NCC afecta a miles de individuos de países en vías de
desarrollo, así mismo se ven afectados países desarrollados que tienen un alto
grado de inmigrantes provenientes de á reas endémicas. La Neurocisticercosis se
ha convertido en una causa cada vez más importante de las convulsiones en los
Estados Unidos (7).
En países endémicos como: Perú , México, Guatemala, Ecuador, Colombia,
Nigeria, Sudá frica, la India, entre otros; la teniasis y cisticercosis son
extremadamente comunes, así como la sintomatología neuroló gica (1). En el
Perú la infección por Taenia solium es hiperendémica en la sierra y en algunas zonas
de la costa y selva; tal como lo muestran los resultados de los estudios realizados por
The Cisticercosis Working Group in Perú (1-3). Existen zonas rurales y
suburbanas hiperendémicas como Huancayo, Ayacucho, Tumbes donde se
reporta que el 40% de casos de epilepsia está asociado a la NCC (2,3). La
sintomatología clínica en pacientes con NCC son: cuadros de epilepsias, dolores
de cabeza, problemas visuales, confusió n, ataxia, déficit motor, afectació n de
pares craneales, ataxia, síntomas de hidrocefalia, psicosis (3,4, 6).
Existen estudios que demuestras una fuerte asociació n entre la teniasis, la
crianza de cerdos y el mal tratamiento de residuos fecales humanos infectados
(1,3,5). A través de estudios seroló gicos se ha determinado una prevalencia de
cisticercosis del 20 al 30 % en regiones endémicas. Asimismo, má s del 6% de la
població n podría tener el parasito adulto (1).
La variabilidad de la sintomatología, como cefalea, transtornos mentales,
hidrocefalia, epilepsia que produce el pará sito en el sistema nervioso central
está ligada a la localizació n y a la respuesta inflamatoria del hospedero (5).

Estadio larval del tenia solium e inmunopatologia

Los huevos de la tenia se desprenden de las heces y contaminan los alimentos por
falta de medidas de salubridad y higiene. Cuando estos huevos son ingeridos y
expuestos al ácido gástrico del estómago humano, pierden su cápsula protectora y se
convierten en larvas, llamadas oncósferas. Las oncósferas cruzan el tracto
gastrointestinal y migran a través del sistema vascular al cerebro, los músculos y los
ojos principalmente (Anexo1). Una vez en el cerebro, el estadio larval (quistes,
cisticercos o metacestodo), genera una respuesta inmune mínima y puede
permanecer en el cerebro en forma viable por años (7,8).
El citicerco viable, de 1-1.5 cm de diámetro localizado en el parénquima cerebral,
que se conoce como un quiste vesicular, tiene muy poca o ninguna respuesta inmune
del huésped. En esta etapa, el escólex por lo general se identifica como un nódulo
excéntrico dentro del quiste. A medida que el quiste se degenera, el líquido se fuga
del quiste hacia el parénquima cerebral, lo que genera una fuerte respuesta inmune
(7,8)
La epileptogénesis en pacientes con Neurocisticercosis se puede atribuir a varios
factores: Inflamación, gliosis, la genética y la predilección por los quistes de viajar a
la zona frontal y los lóbulos temporales (7).

La sintomatología adversa, ocasionada por la inflamació n que induce el parasito

en el tejido cerebral que lo rodea, afecta al humano ocasionando cuadros de
epilepsia (1).
Mientras el parasito se encuentra viable, escapa de la respuesta inflamatoria,
pero cuando éste comienza a degenerar, fisioló gicamente o por efecto del
tratamiento, la inflamació n se exacerba y trae consigo todas las consecuencias
antes mencionadas. (1).
Si bien el tratamiento actual con antihelmínticos es efectivo contra Taenia
solium, este causa reacciones adversas. La respuesta del parasito al tratamiento
estimula la reacció n inflamatoria (4). No se conoce a detalle qué, có mo o porqué
se liberan ciertas moléculas fuertemente inmunó genas, o la fisiología del
parasito en tejido hospedero.
La inmunopatología de la enfermedad es compleja y está en constante estudio.
Desde que el parasito se aloja en el cerebro hasta las primeras manifestaciones
clínicas, pueden transcurrir incluso añ os hasta que se presenten los primeros
síntomas, esto va depender de factores como: la viabilidad del parasito,
ubicació n y nú mero de cisticercos en el cerebro (4,1), respuesta inflamatoria
alrededor del tejido(5), tipo de respuesta inmune del hospedero (4,6). No
existe un tratamiento eficaz sin riesgo de complicaciones para esta enfermedad
y aquellos esquemas con antiparasitarios son aun controversiales y siguen en
consenso por la variabilidad de condiciones para el desencadenamiento de esta
enfermedad. En la mayoría de casos la sintomatología se ve exacerbada por el
tratamiento o cuando el parasito esta degenerado y/o calcificado (1,4,7). El
tratamiento antihelmíntico, usando praziquantel y albendazol, es efectivo
contra Taenia solium, matando a un 85% de cisticercos localizados en
parénquima cerebral, sin embargo se han observado una exacerbació n de
síntomas neuroló gicos, el cual ha sido atribuido a la reacció n inflamatoria
causado luego de la muerte del parasito (13-15).

La viabilidad del parasito juega un papel fundamental en la inmunopatología de

esta enfermedad. Los cisticercos pueden vivir en el huésped humano infectado por
años y pueden calcificarse. Un quiste viable (activo), cuando está localizado en el
tejido cerebral, es responsable de ciertas manifestaciones clínicas; sin embargo al
morir los parásitos provocan una intensa inflamación e infiltrados que están
asociados con las convulsiones (10). Los cisticercos calcificados son los más
comunes en resultados radiológicos en los países endémicos de Neurocisticercosis y
también pueden ser responsables de las convulsiones (12). Se ha descrito que
algunos mecanismos por los que el parasito permanece viable son el
enmascaramiento antigénico (8-10), la osmo-regulació n con el medio externo a
través de corpú sculos calcá reos (11,12).
El cisticerco mantiene una constante interacción con el medio externo (tejido
cerebral), del cual obtiene los nutrientes necesarios para su subsistencia y además del
cual debe permanecer oculto “enmascarándose” con proteínas y otras moléculas
propias del hospedero, para evadir la respuesta inmunológica (16-18). A su vez el
parasito va a liberar sustancias de desecho (19), otras moléculas como fosfatos y
carbonatos, para mantener adecuado el medio a su alrededor u otras moléculas que
podrían ejercer alguna función sobre el metabolismo o células del hospedero (20).
Se han descrito diferentes estructuras y células que componen la membrana o pared
quística y escólex del cisticerco de Taenia solium como: microtrichas, membrana
basal, células cytones subtegumentales, células flamígeras, células ductales, ductos
protonefridiales, corpúsculos calcáreos, fibras musculares, fibras de tejido conectivo
entre otros y muchas de las cuales se han estudiado a nivel estructural, histológico,
otras a nivel bioquímico, y unas pocas a nivel de función fisiológica como es el caso
de los corpúsculos calcáreos (20-22).
Los corpú sculos calcá reos son unas estructuras que se encuentran dentro del
parasito tanto en su membrana como en su escolex. Estos está n conformados
por calcio en mayor concentració n, otros minerales y una matriz orgá nica que
alberga proteínas. Estudios previos del corpú sculos calcá reo demuestran su
participació n en la osmoregulació n del parasito con su medio externo (11-16)
lo que podría influir en la viabilidad del parasito y / o su tendencia a
degenerarse y calcificarse (11).
Los corpúsculos calcáreos (CC) son concreciones minerales, que pueden representar
hasta el 41% del peso seco del parásito (21,23,24), están formados por láminas
concéntricas de material inorgánico, principalmente calcio y fosfato de magnesio y
carbonato, intercaladas con una matriz orgánica (21,23). La presencia de glucógeno
como polisacáridos, lípidos, los residuos de aminoácidos tales como Asp, Glu y Gly.
Asimismo, se han descrito proteínas de origen desconocido en la matriz orgánica de
la Taenia taeniaeformis (25).
La formación de estos corpúsculos calcáreos en Taenia solium, a diferencia de otros
helmintos, se da a nivel de los ductos protonefridiales, de manera extracelular
(28,29), sin embargo no se describe a detalle las proteínas implicadas en su
formación, o las células que generan la matriz para el inicio de la formación, ni la
liberación de sustancias asociadas a los corpúsculos calcáreos.
Recientemente, un proteína de unión a calcio se ha descrito en CC de Echinococcus
granulosus (EgCaBP1) (26). Participación de proteínas de unión a calcio (CaBP) en
la acumulación local de Ca2+ ha sido descrita en varios de los filos de invertebrados
y de los organismos vertebrados (27,28).
Una fracción proteica fue aislada de corpúsculos calcáreos de cisticercos Taenia
solium, en los cuales se encontró antígenos que fueron reconocidos por sueros de
pacientes con Neurocisticercosis activa a través ELISA y WesternBlot y no por
sueros de pacientes con otros desordenes neurológicos. Los resultados mostraban
que se trataban de proteínas de alto peso molecular, diferentes a los usados en las
pruebas de diagnostico. (29).
Lo que si se conoce es que existen proteínas asociadas a estos corpúsculos y que son
fuertemente antigénica (30,31), sin embargo aun no se las ha detectado con
anticuerpos monoclonales específicos anti Taenia solium para estudiarlas mas a
fondo y ver su potencial aplicación para el diagnostico, tratamiento o seguimiento de
la enfermedad.

Las proteínas de corpú sculos calcá reos de Taenia solium que aun no han sido
aisladas ni descritas en su totalidad podrían estar asociadas con el
desencadenamiento de los síntomas e inmunopatología de la enfermedad. En
otros pará sitos como Echinococcus granulosus se ha descrito una proteína con
un dominio de unió n a calcio asociada a CC (17) o proteínas similares en otros
pará sitos (18). Se describió una proteína de corpú sculo calcá reo de cisticerco
de Taenia solium identificada con un anticuerpo monoclonal producido a partir
de Equinococcus granulosus, encontrá ndose similitudes entre ambas y donde se
sugiere ahondar en el estudio de las demas proteínas en corpú sculo calcá reo de
Taenia solium(18).
 El diagnóstico de Neurocisticercosis es difícil y generalmente se basa en los datos
clínicos del paciente, ayudados por varios métodos, tales como resonancia
magnética, tomografía computarizada y pruebas serológicas (9,10). Sin embargo, el
diagnóstico basado en imágenes tiene inconvenientes y a menudo no está disponible
en las zonas endémicas, mientras los métodos de inmunodiagnóstico son útiles para
epidemiología pero tienen limitaciones asociadas con la sensibilidad y especificidad
(11).
El diagnostico de esta enfermedad se realiza a través de la clínica,
neuroimagenes y pruebas seroló gicas (ELISA , Western Blot) en LCR y suero.
Las pruebas en LCR son má s precisas pero la obtenció n de la muestra es
dificultosa e incó moda para el paciente. Las pruebas por neuroimá genes son
costosas y ademá s no son accesibles a zonas suburbanas donde hay mayor
prevalencia de la enfermedad. Las pruebas seroló gicas son má s econó micas. Sin
embargo el inconveniente que presenta la técnica de ELISA en suero es la
reactividad cruzada con otros pará sitos y que la detecció n de anticuerpos
circulantes no provee informació n por si sola respecto a la viabilidad del
parasito, sin embargo la técnica se ha ido mejorando con la utilizació n de
anticuerpo monoclonales para detecció n de antígenos. (1,19-21), se ha
desarrollado un test de Elisa para detecció n de antígenos excreció n circulantes
en suero a través del uso de anticuerpos monoclonales para antígenos de
Taenia saginata con buenos resultados (20). Aun así se mejoraría el diagnostico
si se emplearan anticuerpos monoclonales producidos específicamente para
Taenia solium. Tambien se han desarrollado ensayos de
inmunoelectrotransferencia para ealuar anticuerpos frente a antigenos del
parasito (22,23), en bú squeda proteínas antigénicas del parasito completo, así
también se han realizado estudios probando el uso de otros antigenos parasitos
como Taenia crassiceps en bú squeda de anticuerpos en suero (24).
En el laboratorio de Inmunopatología experimental en Neurocisticercosis-
UPCH, se ha llevado a cabo con éxito la producció n de anticuerpos
monoclonales (MoAb) contra diversos antígenos de Taenia solium. Estos MoAb
son de suma importancia por su potencial aplicació n en el diagnostico y/o
tratamiento de la enfermedad.
Es así, que identificar las proteínas de corpú sculo calcá reo de Taenia solium y
determinar cuá les son inmunogénicas con anticuerpos monoclonales
específicos para este parasito, nos llevaría a mejorar el entendimiento de la
inmunopatología de la enfermedad asociada al rol que cumplen los corpú sculos
calcá reos en el mantenimiento de la viabilidad del parasito y tener mejores
herramientas para el diagnostico y/o tratamiento de la NCC.
Por ello, el objetivo de este trabajo es identificar las proteínas inmunogénicas
de corpú sculos calcá reos de cisticerco de Taenia solium a través del uso de
anticuerpos monoclonales específicos contra este parasito, utilizando técnicas
de inmunodetecció n de antígenos como: Western blot,, Inmunohistoquímica y
técnicas de cultivo de pará sitos.

3. CAPÍTULO 3: METODOLOGÍA
3.1. Tipo de estudio
 No experimental (descriptivo)
3.2. Recolección de la muestra
Se obtuvieron 600 cisticercos de Taenia solium de tres cerdos
naturalmente infectados y sin tratamiento.
3.3. Materiales
 Anticuerpos monoclonales
 Medio de cultivo DMEN, RPMI
 Suero bovino fetal
 L- Glutamina
 Antibióticos y anti fúngicos
 Suero fisiológico
 Buffer fosfato salino
 Glicina tamponada
 Acrilamida / Bis acrilamida
 Frascos de vidrio de 50, 100 ml
 Tubos Falcon estériles 15, 50 ml
 Flask y placas de 12, 6 pozos
 Pipetas descartables
 Laminas portaobjetos y cubreobjetos
 Buffer PBS
 TRIS
 EDTA
 Tween 20
 Bradford
 Tips 0-200 µm
 Tips 100-1000µm
4. Equipos
 Cabina de flujo laminar
 Estufa CO2
 Microscopio Óptico
 Microscopio de inmunofluorescencia
 Centrifuga refrigerada
 Cámara de electroforesis
 Fuente de poder
 Pipetas automá ticas

4.1. Métodos
4.1.1. Obtención de corpúsculos calcáreos y de sus proteínas asociadas
( Zurabian R . y col 2005 y Park YK y cols. 2005)
Se realizo un nuevo procedimiento de obtención de las proteínas de
corpúsculo calcáreo en base a lo descrito por ambos autores.

Los cisticercos de Taenia solium fueron extraídos de músculo esquelético

de 3 cerdos naturalmente infectados, se recolectaron en promedio de 200
cisticercos por cerdo, haciendo un total de 600 cisticercos obtenidos en
total.
Los parásitos fueron lavados 10 veces con solución de buffer fosfato (PBS)
pH 7.4 estéril (0.45M NaCl, 15mM Phosphate) conteniendo antibióticos e
inhibidores de proteasas 1X PMSF.
Los cisticercos fueron homogenizados con la solución de buffer fosfato
antes descrita, empleando un homogenizador Polytron (Kinematica PCU)
bajo la máxima intensidad de 1-2 minutos a 4ºC. El homogenizado fue
centrifugado a 12000 rpm por 15 minutos a 4ºC. , a fin de sedimentar los
corpúsculos calcáreos. Se retiro el sobrenadante y detritus celulares
quedándonos con el precipitado blanquecino donde se encontraron los
corpúsculos calcáreos. Se realizaron dos lavados adicionales con buffer
fosfato para mejorar la separación y limpieza de los corpúsculos calcáreos.
Los corpúsculos calcares limpios fueron sometidos a disolución del
material que lo compone a fin de liberar las proteínas, a través del uso una
solución de acido sulfámico 0.1M (9.7%) a pH 1.2; en proporción de 2:1
(dos volúmenes de la solución de ácido sulfámico con 1de la cantidad de
corpúsculo calcáreo obtenido) y se disolvió usando un vortex a maxima
velocidad por 1 minuto. Luego se procedió a centrifugar a 15000 rpm por 5
min a 4ºC. El sobrenadante fue colectado y el precipitado residual fue
tratado nuevamente con 0.1 M de solución de acido sulfámico y así
sucesivamente hasta la disolución completa del los corpúsculos calcáreos.
Durante este proceso, los corpúsculos fueron observados al microscopio
para confirmar la disolución. Todos los sobrenadantes obtenidos fueron
congelados a -70ºC hasta su requerimiento.
4.1.2. Medición de proteínas
La medición de proteínas de proteínas se realizo de los sobrenadantes
obtenidos en la disolución de corpúsculos calcáreos. Para ello se empleo el
reactivo de Bradford. Se realizo el ensayo en micro placa utilizando el
reactivo de Bio-Rad Protein Assay. Se detecto colorimétricamente las
concentraciones de proteínas a 660nm. Se realizo la curva de calibración
con suero bovino fetal (BSA) a diferentes concentraciones.
 4.1.3. Electroforesis para la detección de proteínas asociadas a corpúsculos
calcáreos

Se realizo la electroforesis para proteínas en gel de poliacrilamida SDS-

PAGE (gel de apilamiento y de corrida) al 10%, con una potencia de 100 V
para el apilamiento y 70 V para la corrida electroforética. Empleando el
marcador de peso molecular pre-teñido de Bio-Rad 161-0318 y
evidenciadas con tinción de plata.
4.1.4. Selección de anticuerpos monoclonales contra corpúsculos calcáreos
de Taenia Solium: Inmunolocalización en tejido
Se cuenta con un total de 22 anticuerpos monoclonales (Anexo 2)
Para preseleccionar los anticuerpos monoclonales que reconozcan proteínas
asociadas a corpúsculos calcáreos se realizo una evaluación por
inmunolocalización en tejido de parasito. Para ello se desarrolló la técnica
de inmunofluorescencia, método ya estandarizados en el Laboratorio de
Inmunopatología en Neurociticercosis (LIPE). Se emplearon cortes (4 μm)
de cisticercos parafinados y transferidos a láminas `portaobjeto tratadas con
poli-L-lisina. Las muestras fueron desparafinadas hasta ser rehidratadas. El
desenmascaramiento antigénico se realizo con buffer citrato pH 6.0 a 90ºC
por 30 minutos. Se utilizo como anticuerpo primario a los anticuerpos
monoclonales producidos en el LIPE (22 anticuerpos monoclonales en
total), como anticuerpo secundario a un anti-ratón (anti IgG+anti IgM)
marcado con DyLigh. Las muestras fueron evaluadas en un microscopio de
Inmunofluorescencia Carl Zeiss, y las imágenes capturadas por una cámara
Canon PowerShot A3300 IS de 8.2 mega pixels.
4.1.5. Inmunodetección de proteínas usando anticuerpos monoclonales
TsW
Se desarrollo la electrotransferencia de proteínas del gel de electroforesis a
papel de nitrocelulosa. Se emplea el buffer de transferencia ( 25mM Tris-
Base, 192 mM glicina, 20% metanol en un litro de agua miliQ) a 70V por 1
hora.
Se cortaron las tiras de papel nitrocelulosa conteniendo las proteínas
transferidas para realizar la inmunodetección con los anticuerpos
monoclonales seleccionados. Posteriormente se marcó con anticuerpo
secundario anti ratón biotinado y revelado con sustrato precipitante.

5. CAPITULO 4: RESULTADOS
5.1. Obtención de corpúsculos calcáreos y sus proteínas asociadas
En la figura 1 se muestra el esquema utilizado para la extracción de corpúsculos
calcáreos de cisticerco de Taenia solium
 Extra Lava
cción do

Homogen Centrifu
ización gación

Corpúsculo
calcáreo

A B
Figura 1. Procedimiento de obtención de corpúsculos calcáreos de cisticerco de
Taenia solium.

Luego de varios pasos de lavado de los corpúsculos calcáreos se obtuvo un sedimento

limpio sin restos de debris celular, tal como se puede apreciar en la figura 2.

Figura 2. A, Precipitado blanquecino correspondiente a corpúsculos calcáreos

(flecha). B, corpúsculos calcáreos vistos al microscopio con resolución 40X.

Posterior a la obtención de corpúsculos calcáreos, se procedió con la disolución

empleando la solución de ácido Sulfámico. Obteniéndose 15 sobrenadantes hasta
su completa disolución. En el precipitado numero 15 ya no se observo
corpúsculos calcáreos visto por microscopio óptico.

5.2. Medición de proteínas

Se realizo la medición de proteínas del los 15 sobrenadantes obtenidos por
duplicado. Se calcularon los resultados en base a la curva de calibración con
BSA (Figura 3)
Figura 3. Curva de calibración con Suero Bovino fetal medido por método
Bradford.
 DESCRIPCIÓN OD CONCENTRACIÓN
MUESTRA MEDIA UG/ML

1 Sobrenadante 1 0.433 60.89

2 Sobrenadante 2 0.424 55.91
3 Sobrenadante 3 0.432 60.34
4 Sobrenadante 4 0.411 48.71
5 Sobrenadante 5 0.422 54.80
6 Sobrenadante 6 0.422 54.80
7 Sobrenadante 7 0.434 61.45
8 Sobrenadante 8 0.985 366.50
9 Sobrenadante 9 0.692 204.29
10 Sobrenadante 10 0.490 92.45
11 Sobrenadante 11 0.480 86.92
12 Sobrenadante 12 0.422 54.80
13 Sobrenadante 13 0.412 49.27
14 Sobrenadante 14 0.429 58.68
15 Sobrenadante 15 0.427 57.57
Tabla
1. Concentración de proteínas obtenidas en los sobrenadantes de la
disolución de los corpúsculos calcáreos

Los sobrenadantes 8 y 9 son los que muestran la mayor concentración de

proteínas de corpúsculos. Y son empleados para realizar la identificación en
electroforesis.

5.3. Identificación de proteínas de corpúsculo calcáreo

Se tomaron alícuotas de los sobrenadantes (Sup) números: 1, 8, 9, 13, 14, 15
para evaluar las proteínas de corpúsculos calcáreos por electroforesis
 Figura 4. Electroforesis de proteínas de corpúsculo calcáreo. Carril 1:
Antígenos de cisticerco completo de Taenia solium , Carril 2: Antígenos de
Fluido vesicular de cisticerco de Taenia solium, Carril 3: Marcador de Peso
molecular, Carril 4: Sup 8, Carril 5: Sup 1, Carril 6: Sup 9, Carril 7: Sup
13, Carril 8: Sup 14, Carril 9: Sup 15.

Se identifican proteínas de 97, 66, 57, 41, 40, 33, 31, 29, 24, 22, 21, 14, 8, 6
kDa.
Se juntaron los sobrenadantes con mayor concentración de proteínas (Sup 8 y 9)
para realizar la electrotransferencia, y poder obtener en papel de nitrocelulosa
los antígenos de corpúsculos calcáreos a identificar.

5.4. Selección de anticuerpos monoclonales Ts

Se realizó la inmunofluorescencia en corpúsculos calcáreos fijados en lámina
marcando con anticuerpos monoclonales Ts (anticuerpo primario) y anticuerpo
anti ratón + Dylight (anticuerpo secundario). Se obtuvieron 7 anticuerpos con
reacción positiva a corpúsculos calcáreos, 1 anticuerpo con positividad
indeterminada y 10 anticuerpos negativos. Los corpúsculos calcáreos tienen
cierta inmunofluorescencia natural, que es muy distinta, inespecífica y menos
intensa que la reacción con el fluorocromo Dy Light. Se seleccionaron 10
anticuerpos (tabla 2) 7 reactividad positiva, 1 reactividad indeterminada, y 2
reactividad negativa seleccionados al azar; para realizar el siguiente paso, el de
enfrentarlos a los antígenos fijados en papel de nitrocelulosa. (Figuras 5-11)
CLONA CODIGO ANTÍGENO ISOTIPO FLUORESCENCIA WESTERN
INTERNO EMPLEADO BLOT
PARA SU
PRODUCCIÓN
TsW1 W2G10 Antígeno IgM POSITIVA Seleccionado
Completo
TsW2 W4A4 Antígeno IgM PARCIAL Seleccionado
Completo
TsW3 W1G12 Antígeno IgG1 NEGATIVA
Completo
TsW4 W2D7 Antígeno IgM NEGATIVA
Completo
TsW5 W1H2 Antígeno IgG1 NEGATIVA
Completo
TsW6 W2B11 Antígeno IgG3 NEGATIVA Seleccionado
Completo
TsW7 W1G4 Antígeno IgM NEGATIVA
Completo
TsW8 W6A7 Antígeno IgM POSITIVA Seleccionado
Completo
TsW9 W2H7 Antígeno IgG3 POSITIVA Seleccionado
Completo
TsW10 W5D10 Antígeno IgG1 POSITIVA Seleccionado
Completo
TsW11 W5H10 Antígeno IgM POSITIVA Seleccionado
Completo
TsV1 V4G1 Fluido IgG1 POSITIVA Seleccionado
Vesicular
TsV2 V1C12 VF IgG1 NEGATIVA
TsV3 V2H12 VF IgG1 NEGATIVA Seleccionado
TsV4 V3C4 VF IgG4 NEGATIVA
TsV5 V2H1 VF IgG2a NEGATIVA
TsE1 E3G4 E/S IgM POSITIVA Seleccionado
TsE2 E1G7 E/S IgG3 NEGATIVA
Tabla 2. Anticuerpos monoclonales Ts
 PBS W2G1 W6A7
0
Figura 5. Inmunofluorescencia en corpúsculos calcáreos. A y B Control de
PBS, C y D Reacción positiva con anticuerpo W2G2. E y F Reacción
Positiva con anticuerpo W6A7. Las imágenes superiores e inferiores son las
mismas vistas con filtro fluorescente y luz visible respectivamente.

W2H7 W5D1 W5H1

0 0
Figura 6. Inmunofluorescencia en corpúsculos calcáreos. A y B Reacción
Positiva con anticuerpo W2H7, C y D Reacción positiva con anticuerpo
W5D10. E y F Reacción Positiva con anticuerpo W5H10. Las imágenes
superiores e inferiores son las mismas vistas con filtro fluorescente y luz
visible respectivamente.

V4G1 E3G4 W4A4

Figura 7. Inmunofluorescencia en corpúsculos calcáreos. A y B Reacción
Positiva con anticuerpo V4G1, C y D Reacción positiva con anticuerpo
E3G4. E y F Reacción indeterminada con anticuerpo W4A4. Las imágenes
superiores e inferiores son las mismas vistas con filtro fluorescente y luz
visible respectivamente.

W1G1 W1H2 W1G4

2
Figura 8. Inmunofluorescencia en corpúsculos calcáreos. A y B Reacción
negativa con anticuerpo W1G12, C y D Reacción negativa con anticuerpo
W1H2, E y F Reacción negativa con anticuerpo W1G4. Las imágenes
superiores e inferiores son las mismas vistas con filtro fluorescente y luz
visible respectivamente.

W2D7 W2B1 E1G7

1
Figura 9. Inmunofluorescencia en corpúsculos calcáreos. A y B Reacción
negativa con anticuerpo W2D7, C y D Reacción negativa con anticuerpo
W2B11, E y F Reacción negativa con anticuerpo E1G7. Las imágenes
superiores e inferiores son las mismas vistas con filtro fluorescente y luz
visible respectivamente.
 V3C4 V2H12 V1C12
Figura 10. Inmunofluorescencia en corpúsculos calcáreos. A y B Reacción
negativa con anticuerpo V3C4, C y D Reacción negativa con anticuerpo
V2H12, E y F Reacción negativa con anticuerpo V1C12. Las imágenes
superiores e inferiores son las mismas vistas con filtro fluorescente y luz
visible respectivamente.

V2H1
 Figura 11. Inmunofluorescencia en corpúsculos calcáreos. A y B Reacción
negativa con anticuerpo V2H1. Las imágenes superiores e inferiores son las
mismas vistas con filtro fluorescente y luz visible respectivamente.

5.5. Inmunodetección de proteínas antigénicas de corpúsculo calcáreo

Se realizó el Wester Blot empleando los anticuerpos seleccionados previamente
(Tabla2). Como control positivo se usó suero de ratón inmunizado con antígeno
completo del parasito, como control negativo solución PBS. Todos anticuerpos
monoclonales seleccionados como “positivos” en lámina marcaron bandas. El
anticuerpo seleccionado como “indeterminado” en lámina no marco ninguna
banda, lo que confirma que la reactividad evidenciada al microscopio se trató
solo de sobre concentración del anticuerpo.
Los anticuerpos W2H7, W5D10, W2G10, W5H10 y W6A7 identificaron las
moléculas de 66, 57 y 6.5 KDa. El Anticuerpo E3G7 identificó moléculas de 98,
82, 66, 22 y 6.5 KDa. El anticuerpo V4G1, muy similar al anterior identifico
moléculas de 98, 82, 6.5 KDa y de manera intensa la molécula de 66 KDa. Los
anticuerpos W4A4, V2H12 y W2B11 no marcaron ninguna banda.

Figura 12. Western Blot de antígenos de corpúsculos calcáreos y

Anticuerpos monoclonales contra Taenia solium. Carriles: (1) Suero +, (2)
 Control de PBS, (3) W2H7, (4) W4A4, (5) W5D10, (6) W2G10, (7) W5H10,
(8) E3G7, (9) V2H12, (10) W2B11, (11) V4G1, (12) W6A7.

6. CAPITULO 5: DISCUSION
Fluorescencia natural de corpúsculo calcáreo
Fluorescencia indeterminada
Proteínas inmunogénicas
Proteínas identificadas por anticuerpos monoclonales que identifican moléculas de
Excreción Secreción (ES) y Fluido Vesicular. Serian moléculas de corpúsculo
calcáreo secretadas al medio externo e inmunogénicas.
Proteínas antes descritas del mismo peso molecular en diagnóstico, fisiología y en
otros parásitos.

7. CAPITULO 6: IMPACTOS (OPCIONAL)

7.1. Propuesta para la solución del problema
7.2. Costos de implementación de la propuesta
7.3. Beneficios que aporta la propuesta

8. CONCLUSIONES
9. RECOMENDACIONES
10. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
11. ANEXOS

ANEXO 1. CICLO DE VIDA DE Taenia solium

 ANEXO 2. TABLA DE ANTICUERPOS MONOCLONALES PRODUCIDOS
EN EL LABORATORIO DE INMUNOPATOLOGIA EN
NEUROCISTICERCOSIS-UPCH

Nombre Código interno Fuente Isotipo

1 TsW1 W1H12 WA IgG1
2 TsW2 W1G12 WA IgG1
3 TsW3 W3F10 WA IgG1
4 TsW4 W5D10 WA IgG1
5 TsW5 W2G10 WA IgM
6 TsW6 W4A4 WA IgM
7 TsW7 W2H7 WA IgG3
8 TsW8 W5H10 WA IgM
9 TsW9 W1G4 WA IgM
10 TsW10 W1H2 WA IgG1
11 TsW11 W6A7 WA IgM
12 TsW12 W2B11 WA IgG3
13 TsW13 W2D7 WA IgM
14 TsV1 V3C4 VF IgG1
15 TsV2 V2H1 VF IgG2a
16 TsV3 V4G1 VF IgG1
17 TsV4 V2H12 VF IgG1
18 TsV5 V1C12 VF IgG1
19 TsE1 E3G4 ES IgM
20 TsE2 E3G8 ES IgM
21 TsE3 E1G7 ES IgG3
22 TsE4 E2F4 ES IgM