PRÁCTICA

Aislamiento E Identificación de Listeria Monocytogenes

Ediver Leal, Johanna Contreras
Ingeniería Agroindustrial
Departamento de Ciencias Agrarias y del Ambiente
Universidad Francisco de Paula Santander

RESUMEN

El presente procedimiento tiene como monocytogenes es uno de los principales

objeto describir la metodología llevada a
cabo por el Laboratorio de Microbiología
para realizar la detección, aislamiento e
identificación de Listeria monocytogenes
en productos cárnicos como por ejemplo
la carne de hamburguesa. La listeriosis se
trata de una infección provocada por L.
monocytogenes siendo su principal vía
de transmisión, la ingestión de alimentos
contaminados. Si bien la incidencia de
esta enfermedad no es muy elevada, la
morbilidad sí es un factor a tener en
cuenta ya que cuando aparece de forma
tardía en recién nacidos suele
manifestarse gravemente con afectación
al SNC, pudiendo provocar meningitis
bacteriana en neonatos. Incluso puede
llegar a contabilizarse entre un 30 y un
50% de mortalidad en estos casos. Esta
bacteria ha sido asociada a alimentos tales
como la leche, quesos (particularmente
variedades blandas – madurados), helados
y productos cárnicos. Afecta
principalmente a los niños, ancianos,
mujeres gestantes y personas
inmunosuprimidas, ocasionando
abortos, meningoencefalitis y meningitis.
Por ello, se hace necesario un control
microbiológico de los alimentos,
especialmente aquellos
destinados a los lactantes y para usos
médicos especiales, ya que como se ha
comentado, estos colectivos son
particularmente sensibles. Listeria
agentes patógenos trasmitidos por los
alimentos. Se desarrolla adecuadamente a
temperaturas de refrigeración superiores a
3,5°C; esta capacidad le permite mantener
la viabilidad en el interior o en las
superficies de los alimentos que
generalmente se preservan a bajas
temperaturas. Se encuentra ampliamente
distribuido en el medio ambiente y en las
superficies de contacto de las plantas
procesadoras de alimentos de los
alimentos, pudiendo estar presente en el
producto mismo.
ABSTRACT
The purpose of this procedure is to
describe the methodology carried out by
the Microbiology Laboratory to detect,
isolate and identify Listeria
monocytogenes in meat products such as
hamburger meat. Listeriosis is an
infection caused by L. monocytogenes
being its main route
Transmission, ingestion of contaminated
food. Although the incidence of this
disease is not very high, morbidity is a
factor to take into account since when it
appears late in newborns it usually
manifests itself severely with CNS
involvement, and can cause bacterial
meningitis in neonates. You can even
count between 30 and 50% mortality in
these cases. This bacterium has been
associated with foods such as milk,
cheeses (particularly
soft varieties - matured), ice cream and
meat products. It mainly affects children,
the elderly, pregnant women and
immunosuppressed people, causing
abortions, meningoencephalitis and
meningitis. Therefore, microbiological
control of food is necessary, especially
those
intended for infants and for special
medical uses, since as mentioned, these
groups are particularly sensitive. Listeria
monocytogenes is one of the main
pathogens transmitted by
foods. It develops properly at cooling
temperatures above
3.5 ° C; This ability allows you to
maintain the viability inside or on the
surfaces of foods that are generally
preserved at low temperatures. It is
widely distributed in the environment and
in the contact surfaces of the food
processing plants of the food, being able
to be present in the
product itself.
Palabras claves: L. monocytogenes,
alimentos, Gram Positivos, Catalasa,
Bacilos Cortos.
INTRODUCCION
Listeria monocytogenes se transmite
principalmente por vía digestiva a través
de los alimentos
contaminados y afecta a colectivos
especialmente susceptibles: ancianos y
recién nacidos,
mujeres gestantes y personas
inmunocomprometidas; en estos
colectivos la letalidad puede
alcanzar el 30%.
L. monocytogenes se diferencia de otros
patógenos por su alta capacidad de
resistencia a
condiciones adversas: frío (<0º C), calor
(>50º C), acidez (pH>4,3) y salinidad
(12% de cloruro
sódico), y por presentar gran ubicuidad en
el medio ambiente. Todos estos factores
favorecen la
contaminación de los alimentos.
Por ello, se hace necesario un control
microbiológico de los alimentos,
especialmente aquellos
destinados a los lactantes y para usos
médicos especiales, ya que como se ha
comentado, estos
colectivos son particularmente sensibles.
Se considera un patógeno oportunista con
tasas de mortalidad del 20-30%. Todas las
cepas de L. monocytogenes se consideran
patógenas, aunque su virulencia es
variable y
las manifestaciones clínicas dependerán
del estatus inmunológico de cada
individuo.
Los consumidores esperan que la
protección frente a los riesgos tenga lugar
a lo largo de
toda la cadena agroalimentaria, desde la
producción primaria hasta el consumo,
para lo
cual se requiere que todos los sectores de
la cadena actúen de forma integrada. La
evaluación de riesgo durante el proceso
de producción del queso, permitirá
adoptar
medidas preventivas para evitar la
contaminación por L. monocytogenes y
permitirá
orientar las acciones de Inspección,
Vigilancia y Control (IVC), utilizando los
recursos de
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manera eficiente y protegiendo de esta
manera la salud pública, reduciendo el
riesgo de
ETA.
MATERIALES Y EQUIPOS RESULTADOS

 Agua Peptonada 225 ml Formación de colonias verde grisáceo

 Agar Palcam con halo negro mediante siembra por
 Gradillas agotamiento
 Pinzas
 Cajas de Petri
 Mechero
 Tubos de enseyo
 Prueba Bioquímica TSI
 Prueba Bioquímica SIM
 Prueba Bioquimica Catalasa
 Prueba Moorfologica Tinción de
Gram

PROCEDIMIENTO

Pre-enriquecimiento selectivo
 Pesar 25 gr de alimento y luego
mezclar en 225 ml en agua
Peptonada 225 ml
respectivamente
 Incubar a 30°C durante 24 horas

Enriquecimiento Selectivo
 Añadir 1 ml de caldo de
enriquecimiento a 9 ml de KOH al
0.5 %. Mezclar e inmediatamente
sembrar por agotamiento con agar
Palcam
 Incubar a 35°C durante 48 horas
 Examinar el crecimiento de
colonias típicas de
L.Monocytogenes, colonias de
verde grisáceo con un halo negro
 Realizar confirmación bioquímica
de SIM TSI y Catalasa
 Confirmación morfológica
Tinción de Gram
Prueba Bioquímica
Catalasa
Prueba Bioquímica SIM
Prueba Bioquímica TSI
Prueba Morfológica Tinción de
Gram
DISCUSION DE RESULTADOS
Se realizan las pruebas en la
hamburguesa en búsqueda de Listeria
Monocytogenes dando como
resultado crecimiento de colonias
típicas verde grisáceo con halo negro
que nos indica presencia de Listeria
Monocytogenes en 25 gramos de
carne de hamburguesa.
De acuerdo a la NTC 1325 establece
los requisitos que deben cumplir los
productos cárnicos procesados no
enlatados literal 2.1.19 carne de
hamburguesa (producto cárnico
procesado, sometido o no a
tratamiento térmico, elaborado con
base en carne de animales de abasto y
con la adición de sustancias de uso
permitido), si la muestra ensayada no
cumple con los requisitos establecidos
en esta norma, se considera no
clasificada o es rechazada.
La NTC 1325 nos da a entender que
el producto no fue procesado en
condiciones asépticas adecuadas por
lo tanto es motivo de rechazo para el
consumo humano. La NTC 1325
exige que el resultado sea negativo.
DISCUSION DE RESULTADOS
PRUEBAS BIOQUIMICAS Y
MORFOLOGICA
Partiendo del crecimiento obtenido en
las cajas de Petri en agar Palcam se
realizan la prueba bioquímica de
Catalasa que descompone el peróxido
de hidrógeno en agua y oxígeno. El
desprendimiento de burbujas
procedentes del oxígeno en el
portaobjetos nos da indicativo de
presencia positiva para Listeria
Monocytogenes en 25 gramos de
carne de hamburguesa.
Partiendo del crecimiento obtenido en
las cajas de Petri en Agar Palcam se
realiza la tinción de Gram que tiene
como objetivo clasificar bacterias
tanto Gram negativas como positivas,
se realiza dicha tinción y se procede a
mirar en el microscopio en lente 40X
y 100X detectando bacilos positivos
para Listeria Monoctygones.
Partiendo del crecimiento de colonias
obtenido en agar Palcam se realiza la
siembra mediante punción para la
prueba bioquímica SIM para cada
placa e incubando por 24 horas en
donde el primer tubo se torna de color
negro que nos da entender presencia
de Listeria Monocytogenes en 25
gramos de carne de hamburguesa, se
procede a verificar el segundo tubo
donde el cambio de color fue a un
amarillo opaco en donde se confirma
la presencia de Listeria
Monocytogenes con reacción cruzada
con otras baterías cruzadas
posiblemente Staphylococcus aureus
debido a que la carne de hamburguesa
contenía queso al momento de realizar
el pre-enriquecimiento selectivo, de
acuerdo a la NTC 1325 el producto es
motivo de rechazo o no clasificado,
no conveniente para el consumo
humano.
Partiendo de la siembra obtenida en
Agar Palcam donde hubo crecimiento
de colonias típicas de Listeria se
realiza prueba Bioquímica para TSI
para cada placa en tubo por punción y
extendido a través del pico de flauta
esperando incubación de 24 horas, se
verifica si hubo algún cambio, pero no
lo hubo que nos da entender que no
hay presencia de Listeria
Monocytogenes en 25 gramos de
carne de hamburguesa.
CONCLUSIONES
Listeria monocytogenes es un
patógeno intracelular facultativo que
provoca infección
intestinal, y enfermedades invasivas
como meningitis y bacteriemia. Los
principales grupos de
riesgo son embarazadas, neonatos e
inmunodeprimidos.
Si bien la incidencia no es muy alta,
se debe conceder mayor importancia a
Listeria monocytogenes por su alta
tasa de mortalidad, así como a la
morbilidad de algunas de la
enfermedades que produce.
En los últimos años se está
registrando un incremento de los
casos, motivado por el consumo de
alimentos precocinados y listos para
el consumo. Este estudio identifica el
riesgo que podría constituir
la venta al por menor de alimentos
listos para el consumo contaminados
con L. monocytogenes,
en las plazas de mercado, comidas
rápidas, ventas de calle.
Un aspecto importante para disminuir
el riesgo de infección por L.
monocygenes
es la educación al consumidor,
orientada especialmente a los grupos
de riesgo, sobre aspectos relacionados
con la manipulación de los alimentos
en el
hogar, el almacenamiento, la
contaminación cruzada y las prácticas
de higiene personal. Se deberá
informar al consumidor sobre la
temperatura de refrigeración
apropiada y la limpieza de
refrigeradores domésticos, así como
de la relevancia de conocer la vida útil
y la temperatura de conservación que
aparecen en las etiquetas de los
productos. Dada la proporción de
resultados positivos para L.
monocytogenes en el presente estudio,
se puede afirmar que el consumo
indiscriminado en Colombia de estos
alimentos podría ser un factor de
riesgo mayor que en otros países, en
los cuales desde hace algunas décadas
se ha implementado la vigilancia para
este patógeno.
Se logra establecer la calidad y la
inocuidad del producto en este caso
fue carne de Hamburguesa
determinando la presencia de Listeria
Monocytogenes en crecimiento de
placa con Agar Palcam, y en las
pruebas bioquímicas de Catalasa, SIM
y TSI y en su morfología.
Para nuestro análisis se determina que
no son bien empleadas las prácticas de
 manufactura del alimento ya que se
encontró presencia.
Este análisis nos permite también
evaluar la calidad de la materia prima,
el proceso y la inocuidad del alimento
a la hora de su preparación para el
consumo humano.
CONSULTAS
Fundamento Caldo
El caldo Fraser se utiliza con
acriflavina, ácido nalidíxico y citrato
amónico férrico para el
enriquecimiento selectivo de Listeria
spp. en un entorno de laboratorio. El
caldo Fraser no está destinado a ser
utilizado en el diagnóstico de
enfermedades u otras condiciones en
humanos.
Listeria monocytogenes, descrita por
primera vez en 1926 por Murray,
Webb y Swann, es un problema
extenso en las industrias alimentarias.
La evidencia de brotes de listeriosis
ha indicado que la principal ruta de
transmisión es a través del consumo
de piensos contaminados con Listeria
monocytogenes. Los vehículos
implícitos de transmisión incluyen
pavo, Frankfurts, ensalada de col,
leche pasteurizada, queso estilo
mexicano y pâté.
El caldo Fraser se basa en la
formulación de Fraser y Sperber. Este
medio se usa en la detección rápida de
Listeria a partir de muestras
alimentarias y ambientales. Listeria
spp. crecen en un rango de pH de 5.0
– 9.6, y sobreviven en productos
alimenticios con niveles de pH fuera
de estos parámetros. Listeria spp. son
bacilos cortos y motiles,
microaerófilos, Gram-positivos, no
esporulados, no encapsulados ni
ramificados. La motilidad se
pronuncia a 20°C. La identificación
de Listeria se basa en el aislamiento
exitoso del organismo, caracterización
bioquímica y confirmación
serológica.
Fórmula Litro
Digerido enzimático de 5g
caseína
Digerido enzimático de tejido 5g
animal
Extracto de carne de res 5g
Extracto de levadura 5g
Cloruro de sodio 20 g
Fosfato disódico 12 g
Fosfato monopotásico 1.35
g
Esculina 1g
Cloruro de litio 3g
pH final: 7.2 ± 0.2 a 25°C
Fundamento Tinción de Gram
Esta es una técnica que presenta 4 pasos
fundamentales: tinción, fijación con el
mordiente, decoloración y contratinción.
Por tanto, esta técnica además de colorear
a las bacterias, también permite
diferenciarlas.
El cristal violeta es el primer colorante
utilizado. El mismo tiene afinidad por el
peptidoglicano y teñirá de morado a todas
las bacterias presentes, posteriormente se
coloca el lugol, que actúa como
mordiente, es decir, inducirá a la
formación de complejos insolubles de
cristal violeta-yodo – proteínas
ribonucleares dentro de la célula.
Las bacterias Gram positivas, al tener una
pared gruesa de peptidoglicano, forman
más complejos (cristal violeta-yodo), por
tanto, retienen el colorante.
Además, también influye que la pared de
las bacterias Gram positivas contienen
mayor cantidad de ácidos no saturados,
los cuales muestran gran afinidad por los
agentes oxidantes (Lugol).
Mientras, las bacterias Gram negativas
poseen una capa delgada de
peptidoglicano, lo que hace que las
bacterias formen menos complejos que
las Gram positivas.
Posteriormente viene el paso de la
decoloración, donde las bacterias Gram
positivas y Gram negativas se comportan
de manera diferente.
Las bacterias Gram negativas contienen
una membrana externa rica en
lipopolisacáridos que forma parte de su
pared celular. Las grasas son destruidas
por el contacto con el alcohol acetona, por
lo que la membrana externa se
desestabiliza, siendo liberado el cristal
violeta.
Es así como luego es contrateñida con la
safranina o fucsina básica, tomando el
color rojo.
En el caso de las bacterias Gram
positivas, resisten la decoloración porque
el decolorante actúa cerrando los poros, lo
que impide que el complejo cristal
violeta/yodo pueda salirse.
Por tanto, se mantiene estable la
coloración con el cristal violeta, y no hay
cabida para la safranina o la fucsina. Por
esto estas bacterias se tiñen de azul
intenso o morado.
Fundamento TSI
El agar TSI o agar hierro triple azúcar es
un medio de cultivo sólido que sirve
como prueba bioquímica para orientar la
identificación inicial de los bacilos Gram
negativos. Se fundamenta en evidenciar la
fermentación de los azúcares presentes, y
la producción de sulfuro de hidrógeno y
gas.
Su composición y fundamento es muy
similar a la prueba de Kligler hierro, con
la diferencia que este último contiene solo
glucosa y lactosa. En cambio, -como su
nombre lo indica- el agar hierro triple
azúcar contiene tres carbohidratos
fermentables: glucosa, lactosa y sacarosa.
Fundamento SIM
El medio SIM es un agar semisólido y
diferencial, especialmente diseñado para
ayudar a la identificación de algunas
bacterias, principalmente de la familia
Enterobacteriaceae. Está compuesto por
tripteína, peptona, sulfato de hierro,
sulfato de amonio, tiosulfato de sodio y
agar.
Este medio permite la ejecución de tres
importantes pruebas: la producción de
sulfuro de hidrógeno (H2S), la formación
de indol y la motilidad, de allí proviene el
acrónimo SIM. Por su gran utilidad no
puede faltar en un laboratorio de
bacteriología.
Fundamento Catalasa
La catalasa es una enzima clasificada
como una hidroperoxidasa, esto quiere
decir que utilizan como sustrato al
peróxido de hidrógeno (H2O2). También
se le considera una oxidorreductasa, ya
que en la reacción donde participa hay un
elemento que sirve como donante de
electrones (sustancia reductora) y otro
como receptor de electrones (sustancia
oxidante).
La catalasa es una proteína que contiene
un grupo prostérico con cuatro átomos de
hierro trivalentes (Fe+++), por tanto es
una homoproteína. El ión férrico se
mantiene oxidado durante la reacción.
Se puede decir que la catalasa es una
enzima desintoxicante, pues su función es
eliminar sustancias que se producen
durante el metabolismo bacteriano que
son tóxicas para las bacterias. Entre estas
sustancias se encuentra el peróxido de
hidrógeno. El peróxido de hidrógeno se
forma de la descomposición de los
azúcares por la vía aeróbica. Este proceso
ocurre de la siguiente manera:
El ión superóxido (O2–) (radical libre) se
forma como producto final de la
asimilación de la glucosa por la vía
aerobia. Este es tóxico y es eliminado por
la enzima superóxido dismutasa que lo
transforma en oxígeno gaseoso y
peróxido de hidrógeno. El peróxido de
hidrógeno también es tóxico para las
bacterias y debe ser eliminado. La enzima
catalasa desdobla el peróxido de
hidrógeno en agua y oxígeno.
La catalasa puede actuar sobre otros
sustratos diferentes al peróxido de
hidrógeno, como alcoholes, aldehídos,
ácidos, aminas aromáticas y fenoles. Sin
embargo, el peróxido de hidrógeno puede
ser utilizado también por la catalasa para
oxidar otros compuestos tóxicos como el
alcohol metílico y etílico. Así mismo, la
catalasa está presente en las células
fagocíticas, protegiéndola de la acción
tóxica del peróxido de hidrógeno.
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