Título

Mechanisms involved in the inflammatory process of gilthead seabream (Sparus aurata)

Otros títulos
Mecanismos implicados en el proceso inflamatorio de la dorada (Sparus aurata)

metadata.dc.contributor.*
Esteban Abad, María de los Ángeles
Guardiola Abellán, Francisco Antonio
Campos Sánchez, Jose Carlos
Escuela Internacional de Doctorado

Palabras clave
Acuicultura
Patología
Inmunología
Citología

Fecha de publicación
2022-06-20

Editorial
Universidad de Murcia

Resumen
La inflamación es una respuesta inespecífica desencadenada por el sistema inmunitario innato frente a cualquier
estímulo de diversa etiología para defender el organismo, en este caso el de peces, y devolverlo a la homeostasis
inicial. La inflamación presenta una serie de síntomas muy característicos y por los que puede ser fácilmente
þÿidentificable cuyo conjunto recibe el nombre de Signos cardinales de la inflamación , y se pueden diferenciar dos
tipos de inflamación: i) la inflamación aguda, o respuesta inmediata, la cual puede desarrollarse de forma breve ante
la detección del estímulo inicial, y durar días o semanas hasta su final resolución; y ii) la inflamación crónica,
producida ante la ineficacia de los mecanismos defensivos para resolver la inflamación aguda y cuyos efectos están
altamente relacionados con la aparición de enfermedades crónicas . La inflamación es un evento muy común que
ocurre en acuicultura debido a las intensas condiciones de producción a los que son sometidos los peces para cubrir
las demandas del mercado. Este escenario hace a los animales más susceptibles a heridas, traumatismos e
infecciones por patógenos, lo que podría estar relacionado con la aparición de enfermedades asociadas, que muchas
veces se traducen en pérdidas económicas para el propio sector. La inflamación supone un mecanismo esencial para
devolver a los peces a su estado inicial de salud, ya que participa de forma directa en la reparación del tejido dañado.
No obstante, hasta la fecha no se ha desarrollado ningún modelo inflamatorio en peces que permita profundizar en
sus mecanismos de inflamación y salud de manera adecuada.La presente Tesis Doctoral pretende mejorar el
conocimiento sobre el proceso de inflamación de la dorada (Sparus aurata), una de las especies de interés en
acuicultura más importantes del Mar Mediterráneo. Para alcanzar nuestro objetivo dividimos esta Tesis Doctoral en
tres capítulos.En el Capítulo I se evaluaron los efectos sistémicos provocados por una inyección de carragenina. Los
peces fueron inyectados intramuscularmente con PBS (control) o carragenina (1%) y tras 1,5, 3 y 6 horas se tomaron
muestras de moco de la piel, suero, riñón cefálico e hígado para determinar el estado inmunológico y antioxidante en
la dorada. Los resultados evidenciaron que una inyección intramuscular de carragenina al 1% es suficiente para
provocar inflamación en los ejemplares, provocando además un aumento de actividades inmunitarias humorales en
el moco de la piel a las 3 horas de la inyección. Sin embargo, la inyección de carragenina no tuvo repercusiones en la
inmunidad sistémica de la dorada. Además, aunque se observó una disminución de la actividad de la catalasa en el
hígado a las 3 y 6 horas después de la inyección, no se detectaron variaciones significativas en la expresión de
ninguno de los genes estudiados en el hígado, evidenciando que este órgano no se vio afectado por la inyección de
carragenina.El Capítulo II de esta Tesis Doctoral consistió en el estudio de los efectos locales desencadenados por la
carragenina en el lugar de la inyección. Así, los animales fueron inyectados intramuscularmente con PBS (control) o
carragenina, tomando muestras de piel para el estudio histológico e inmunohistoquímico y para el análisis de la
expresión génica a 1,5, 3 y 6 horas después de la inyección. Los resultados evidenciaron un aumento en el número
de células mucosecretoras de la piel y de granulocitos acidófilos en la piel a las 1,5 y 3 horas después de la
inyección, respectivamente. Considerando los resultados obtenidos, se diseñó otro ensayo donde los peces fueron
inyectados intramuscularmente con PBS (control) o con carragenina, y la zona de inyección fue evaluada mediante
ecografía en tiempo real y micro-CT a las 1,5, 3, 6, 12 y 24 horas después de la inyección. Los resultados
evidenciaron los síntomas típicos de la fascitis necrosante humana (aumento del grosor de la piel, edema y enfisema)
en el músculo subyacente de los animales inyectados a las 1,5, 3 y 6 horas, los cuales se redujeron hasta
desaparecer a las 12-24 horas de la administración de la carragenina. Esta sintomatología parece deberse a las
moléculas liberadas en el sitio de la inflamación y a la posible degradación de la carragenina en dicho lugar, lo que
apuntaria en ultimo lugar a las etapas finales de la respuesta inflamatoria.En el Capítulo III de la presente Tesis
Doctoral se incluyeron los resultados obtenidos del análisis génico de la respuesta inflamatoria provocada por la
carragenina en la dorada. Para ello, la expresión de 40 genes relacionados con la inflamación se evaluó in vivo en
dos ensayos que se llevaron a cabo por separado. En el primer experimento, los especímenes de dorada fueron
inyectados con PBS (control) o carragenina por vía intramuscular, y después de 1,5, 3 y 6 horas se recolectaron las
muestras de piel del área inyectada y se procesaron para evaluar la expresión génica. En el segundo ensayo se
replicó el mismo diseño experimental, pero aumentando el tiempo de muestreo a 12 y 24 horas. El incremento de
marcadores celulares y la expresión de genes pro-inflamatorios, así como la disminución de genes anti-inflamatorios
en el intervalo de 1,5 a 6 horas después de la inyección, indicaron la duración de la inducción de la respuesta
inflamatoria provocada por la carragenina. No obstante, los resultados obtenidos a las 12 y 24 horas después de la
inyección parecieron indicar la activación de mecanismos necesarios para terminar la respuesta inflamatoria inducida
por la carragenina, restaurando la homeostasis de la piel. Estos resultados fueron respaldados por un ensayo in silico
en el que se estudió la conservación filogenética de las 40 moléculas previamente estudiadas por expresión génica a
partir de secuencias de proteínas de dorada en comparación con otras secuencias proteicas de teleósteos,
presentando las proteínas de la corvina amarilla (Larimichthys crocea L.) los mayores porcentajes de identidad con
las secuencias proteicas de la dorada. Además, las proteínas de la inflamación más conservadas fueron aquellas
implicadas en su regulación, hecho que apoya la hipótesis de que los mecanismos génicos reguladores podrían
activarse 24 horas después de la inyección de la carragenina para controlar la respuesta inflamatoria.Finalmente,
todos los hallazgos de esta Tesis Doctoral evidencian que una sola inyección de carragenina al 1% puede ser
utilizada para desencadenar una inflamación local en doradas, lo que constituye un modelo para continuar
estudiando este proceso, tanto en la salud como en la enfermedad en esta especie.
Inflammation is a non-specific response triggered by the innate immune system against a stimulus of any etiology
(injuries, trauma, infections, irritating products, etc.) to defend the organism, in this case fish, and restore it to the
initial homeostasis. It presents a series of very characteristic symptoms called "cardinal signs of inflammation" by
which it can be easily identifiable. Two types of inflammation can be differentiated: i) acute inflammation, or immediate
response, which can be developed briefly upon detection of the initial stimulus, and last for days or weeks until its final
resolution; and ii) chronic inflammation, produced by the inefficiency of defensive mechanisms to resolve acute
inflammation and whose effects are highly related to the appearance of related chronic diseases. In this sense,
inflammation is a very common event that occurs in the aquaculture industry due to the intense production conditions
(overcrowding, quality water, deterioration of environmental conditions) to which fish are subjected to meet market
demands. Under these situations, fish become more susceptible to wounds, trauma, and pathogens, that could be
related to inflammation and the appearance of associated diseases, and which often translate into economic losses
for the sector itself. Inflammation is an essential process to return fish to their initial state of health, since it participates
directly in the repair of damaged tissue. However, to date no model of fish inflammation has been developed that
allows to delve into its intrinsic mechanisms in an adequate way. This Doctoral Thesis aimed to improve the
knowledge of the inflammation process on gilthead seabream (Sparus aurata), one of the most important
Mediterranean cultured fish species. To get our objective we divided this Doctoral Thesis in three chapters.In Chapter
I, the systemic effects caused by an injection of carrageenin were evaluated. Thereby, the fish were injected
intramuscularly with PBS (control) or carrageenin (1%), and 1.5, 3 and 6 h post-injection, samples of skin mucus,
serum, head-kidney and liver were obtained to determine the immunological and antioxidant status of gilthead
seabream. Results evidenced that one intramuscular carrageenin injection of 1% is enough to provoke inflammation
in the fish specimens, causing an increase in humoral activities in the skin mucus at 3 h post-injection. However, the
carrageenin injection had no impact on the gilthead seabream systemic immunity. In addition, although a decrease in
the hepatic catalase activity was observed at 3 and 6 h post-injection, no significant variations were detected in the
gene expression of none of the genes studied in the liver, evidencing that this organ was not affected by
carrageenin.The Chapter II of this Doctoral Thesis consisted in the study of the local effects triggered by carrageenin
at the injection place. Thus, the fish were injected intramuscularly with PBS (control) or carrageenin (1%), and skin
samples were obtained at 1.5, 3, and 6 h post-injection and processed on one side for histology and
immunohistochemistry procedures, and on the other hand, for gene expression analysis, revealing an increase in the
number of skin mucus-secreting cells and acidophilic granulocytes in the skin near the injection place at 1.5 and 3 h
post-injection, respectively. Considering the results obtained, another assay was designed in which the fish were
injected intramuscularly with PBS (control) or carrageenin, and the injection area was evaluated by real-time
ultrasound and micro-CT at 1.5, 3, 6, 12 and 24 h after injection. The results evidenced the typical symptoms of
human necrotizing fasciitis (increased skin thickness, edema, and emphysema) in the underlying muscle of animals
injected at 1.5, 3, and 6 h, which were reduced to disappearance at 12-24 h after carrageenan administration. This
symptomatology seems to be due to the molecules released at the site of inflammation and the possible degradation
of carrageenin at that site, which would point to the final stages of the inflammatory response.The Chapter III of this
Doctoral Thesis included the results obtained from the gene analysis of the inflammatory response caused by
carrageenan in sea bream. The expression of 40 inflammatory related-genes was evaluated in vivo in the gilthead
seabream in two separate trials: In the first experiment, fish specimens were injected with PBS (control) or
carrageenin intramuscularly, and 1.5, 3 and 6 h post-injection and skin samples were obtained from the injected area
and processed to evaluate gene expression. In the second assay, the same experimental design was replicated, but
increasing the sampling time to 12 and 24 hours. The up-regulation of cell markers and pro-inflammatory gene
expression, as well as the down-regulation of anti-inflammatory-related genes in the interval of 1.5-6 h post-injection,
indicated the duration of the induction of the inflammatory response caused by carrageenin. Nonetheless, results
obtained at 12 and 24 h post-injection seemed to indicate the activation of mechanisms necessary to terminate the
inflammation response to carrageenin and restore skin homeostasis. These results were supported by an in silico
assay carried out to study the phylogenetic conservation of the 40 inflammation related-molecules previously studied
from protein sequences of gilthead seabream in comparison to other teleost protein sequences, the proteins of large
yellow croaker (Larimichthys crocea L.) presenting the highest percentages of identity with the protein sequences of
gilthead seabream. Furthermore, the most conserved proteins of inflammation were those involved in its regulation.
This fact also supports the hypothesis that regulatory gene mechanisms could be activated 24 h after carrageenin
injection in order to control the inflammatory response.Finally, all the findings of this Doctoral Thesis evidenced that
one single injection of 1% carrageenin can be used to trigger a local inflammation in gilthead seabream, which
constitute a model to continue studying this important process, both in health and disease in this fish species.

URI
http://hdl.handle.net/10201/121543