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Wat. Res. vol. 35, núm. 15, págs. 3579–3586, 2001

# 2001 Elsevier Science Ltd. Todos los derechos reservados
Impreso en Gran Bretaña
Información personal: S0043-1354(01)00100-2 0043-1354/01/$-ver material preliminar

DECOLORACIÓN ÓPTIMA Y MODELADO CINÉTICO DE COLORANTES

SINTÉTICOS POR CEPAS DE PSEUDOMONAS
JIAN YU*, XIAOWEI WANG y PO LOK YUE
Departamento de Ingeniería Química, Universidad de Ciencia y Tecnología de Hong Kong, Clear
Water Bay, Kowloon, RAE de Hong Kong, China

(Recibido por primera vez el 4 de julio de 2000; aceptado en forma revisada el 5 de febrero de 2001)

Resumen}Se aislaron Pseudomonas spp de una instalación de tratamiento de aguas residuales de una tintorería
anaeróbica-aeróbica como los degradadores de colorantes azoicos más activos. La decoloración de colorantes
azoicos y colorantes no azoicos, incluidos antraquinona, complejo metálico e índigo, se comparó con cepas
individuales y un consorcio bacteriano formado por la cepa individual y lodo municipal (50:50 en peso). El
consorcio mostró una mejora significativa en la decoloración de dos colorantes no azoicos recalcitrantes, pero
poco efecto en los colorantes que las cepas individuales podrían degradar en gran o moderada medida. La
decoloración del ácido violeta 7 (monoazo) por una cepa GM3 de Pseudomonas se estudió en detalle en diversas
condiciones. La actividad de decoloración óptima se observó en un rango estrecho de pH (7–8), un rango estrecho
de temperatura (35–40 °C), y en presencia de nitrógeno orgánico y amónico. El nitrato tuvo un efecto inhibidor
severo sobre la decoloración del colorante azoico: 10 mg/L condujo a una caída del 50 % en la actividad de
decoloración y 1000 mg/L a una depresión completa de la actividad. Se establece un modelo cinético que da la
dependencia de la tasa de decoloración de la concentración de masa celular (primer orden) y la concentración de
colorante (medio orden). La velocidad aumentó con la temperatura de 10 a 358 °C, lo que puede predecirse
mediante la ecuación de Arrhenius con la energía de activación de 16,87 kcal/mol y el factor de frecuencia de
1,491011 (mgL)1/2/g DCM min. # 2001 Elsevier Science Ltd. Todos los derechos reservados Palabras
clave}degradación de colorantes sintéticos, reducción de azo anaeróbico, cinética de decoloración de
Pseudomonas 10 mg/L condujo a una caída del 50 % en la actividad de decoloración y 1000 mg/L a una depresión
completa de la actividad. Se establece un modelo cinético que da la dependencia de la tasa de decoloración de la
concentración de masa celular (primer orden) y la concentración de colorante (medio orden). La velocidad
aumentó con la temperatura de 10 a 358 °C, lo que puede predecirse mediante la ecuación de Arrhenius con la
energía de activación de 16,87 kcal/mol y el factor de frecuencia de 1,491011 (mgL)1/2/g DCM min. # 2001
Elsevier Science Ltd. Todos los derechos reservados Palabras clave}degradación de colorantes sintéticos,
reducción de azo anaeróbico, cinética de decoloración de Pseudomonas 10 mg/L condujo a una caída del 50 %
en la actividad de decoloración y 1000 mg/L a una depresión completa de la actividad. Se establece un modelo
cinético que da la dependencia de la tasa de decoloración de la concentración de masa celular (primer orden) y la
concentración de colorante (medio orden). La velocidad aumentó con la temperatura de 10 a 358 °C, lo que puede
predecirse mediante la ecuación de Arrhenius con la energía de activación de 16,87 kcal/mol y el factor de
frecuencia de 1,491011 (mgL)1/2/g DCM min. # 2001 Elsevier Science Ltd. Todos los derechos reservados
Palabras clave}degradación de colorantes sintéticos, reducción de azo anaeróbico, cinética de decoloración de
Pseudomonas que se puede predecir mediante la ecuación de Arrhenius con la energía de activación de 16,87
kcal/mol y el factor de frecuencia de 1,491011 (mgL)1/2/g DCM min. # 2001 Elsevier Science Ltd. Todos los
derechos reservados Palabras clave}degradación de colorantes sintéticos, reducción de azo anaeróbico, cinética
de decoloración de Pseudomonas que se puede predecir mediante la ecuación de Arrhenius con la energía de
activación de 16,87 kcal/mol y el factor de frecuencia de 1,491011 (mgL)1/2/g DCM min. # 2001 Elsevier Science
Ltd. Todos los derechos reservados Palabras clave}degradación de colorantes sintéticos, reducción de azo
anaeróbico, cinética de decoloración de Pseudomonas
3580
*Autor a quien debe dirigirse toda la correspondencia. Teléfono:
+852-2358-7135; fax: +852-2358-0054; Email:
kejianyu@ust.hk
INTRODUCCIÓN
Cada año se producen más de 7105 toneladas métricas de
tintes sintéticos en todo el mundo para teñir y estampar,
y entre el 5% y el 10% se descarga con aguas residuales
(Vaidya y Datye, 1982). Una cantidad muy pequeña de
tinte en agua (10–50 mg/L) es muy visible y afecta el
mérito estético, la transparencia del agua y la solubilidad
de los gases de los cuerpos de agua (Banat et al., 1996).
Con diferentes estructuras químicas para cumplir con los
diversos requisitos de coloración, los tintes sintéticos se
pueden clasificar por sus cromóforos, como cromóforos
azo, antraquinona e índigo. Los colorantes azoicos
constituyen el grupo más grande de más de 10000
colorantes comerciales (Zollinger, 1987). La mayoría de
los colorantes azoicos son resistentes al ataque
microbiano aeróbico en el tratamiento convencional de
lodos activados (Ganesh et al., 1994). Sin embargo, la
secuenciación del tratamiento anaeróbico-aeróbico de
colorantes azoicos se ha encontrado eficaz en la
eliminación de color del agua (O'Neill et al., 2000a). Los
enlaces azo se reducen y escinden en condiciones
anaeróbicas para formar las aminas correspondientes y
las aminas aromáticas intermedias se mineralizan aún
más en condiciones aeróbicas (O'Neil et al., 2000b; Tan,
et al., 1999). En este combinado
Jian Yu et al.
sistema, los microbios anaeróbicos y facultativos juegan
un papel importante haciendo que los colorantes azoicos
recalcitrantes sean rompibles por microbios aeróbicos.
Al mismo tiempo, los anaerobios también digieren y
eliminan una cantidad significativa de DQO y DBO de
las aguas residuales.
(Yu et al., 2000).
Se ha demostrado que la decoloración anaeróbica-
aeróbica de dos etapas es eficaz y estable en instalaciones
de laboratorio en condiciones bien controladas
(Fitzgerald y Bishop, 1995; Basibuyuk y Forster, 1997).
Sin embargo, se observó una fluctuación de la eficiencia
en la eliminación del color en una instalación industrial
para el tratamiento de aguas residuales de una casa de
teñido. Esta instalación anaeróbica-aeróbica de dos
etapas se operó en un modo de flujo continuo a 125 m3/h
en condiciones fluctuantes como el pH, la temperatura y
la DQO del afluente. Si los colorantes azoicos no se
reducen y escinden en la etapa anaeróbica, lo más
probable es que dejen intacta la etapa aeróbica. La
composición del colorante también podría ser un factor
importante que cause una decoloración inestable porque
los colorantes comerciales consisten en azo y otros
cromóforos. Para comprender y resolver el problema del
rendimiento de decoloración inestable, como primer
paso,
 Decoloración de tintes sintéticos
de lodo Los resultados pueden brindarnos, combinados con la tecnología de sonda de ARNr 16S, una idea
de la dinámica en la actividad de degradación, sinérgica
3579
interacción y composición de toda la población
microbiana que generalmente se trata como una caja
negra (van Lier et al., 1997). Puede conducir a una
mejora en el diseño del proceso, la operación y la
eficiencia del tratamiento. Este documento informa los
resultados de la investigación y un modelo cinético para
la degradación del colorante azoico. Las cepas
microbianas más activas para la reducción de azo se
aislaron primero del lodo y se comparó su decoloración
de azo y otros cromóforos, incluidos antraquinona,
complejo metálico e índigo. Se investigó más a fondo la
influencia de varios factores ambientales en la actividad
de decoloración de una cepa microbiana representativa,
incluido el efecto de los nutrientes y la inhibición de los
nitratos. Se desarrolló un modelo cinético para
cuantificar los efectos de la concentración de tinte, la
concentración de masa celular y la temperatura en la
decoloración anóxica. Finalmente,
MATERIALES Y MÉTODOS
Se compraron ocho tintes sintéticos con contenidos de tinte
de 50 a 80% de Aldrich (Milwaukee, EE. UU.) y se usaron tal
como se entregaron. Los tintes incluían dos cromóforos
monoazo, dos diazo, dos antraquinona, un complejo metálico y
un índigo, como se muestra en la Fig. 1. Por conveniencia, los
nombres comerciales se usan en este estudio. Se prepararon
soluciones madre de colorante y se usaron en todos los
experimentos.
Aislamiento y cultivo de cepas.
Se recolectaron muestras de lodo activado de la instalación de
tratamiento de aguas residuales anaeróbica-aeróbica de dos
etapas de una tintorería local y se cultivaron en un medio de
cultivo de enriquecimiento que contenía (por litro) 1,5 g de
peptona, 0,75 g de extracto de levadura, 0,75 g de NaCl, 50 mg
de Ácido violeta 7 (monoazoico) ) y 50mg Acid red 151 (diazo)
(pH 7). Los dos colorantes azoicos se utilizaron como
indicadores de la actividad microbiana. Los cultivos mixtos que
mostraban una actividad de decoloración rápida y estable se
enriquecieron mediante cultivos repetidos. Las cepas
individuales se aislaron adicionalmente de los cultivos estables
con placas de agar del mismo medio de enriquecimiento (agar al
2%). Se recolectaron tres colonias alrededor de las cuales se
expandieron rápidamente zonas limpias para una mayor
identificación fisiológica de acuerdo con el Manual de Bergey
(Kney y Holt, 1984). Las cepas únicas transferidas desde los
cultivos inclinados de almacenamiento se cultivaron en matraces
de 1000 ml que contenían 300 ml de medio de crecimiento a 358
°C en un baño de agitación rotatorio a 150 rpm durante 24 h. Se
mezcló el mismo volumen de una solución mineral y una
solución nutritiva para hacer el medio de cultivo que contenía
(por litro): 5 g de peptona, 2,5 g de extracto de levadura, 2,5 g
de NaCl (pH 7). La solución mineral contenía (por litro):3,5 g
NaH2PO4, 5,0 g K2HPO4, 2,5 g (NH4)2SO4, 0,2 g
MgSO42H2O, 0,05 mg FeSO4, 0,01 mg CuSO4, 0,005 mg
ZnSO4, 0,005 mg CoCl2, 0,005 mg MnCl2, 0,005 mg CaCl2 y
0,005 mg Na2MoO4. La masa celular se recogió con
centrifugación a 10.000 g durante 20 min y se resuspendió en
3581
una solución de NaCl al 0,9 % para los experimentos de
decoloración. Las células también se homogeneizaron con
sonicación a 20 kHz a 48 °C para liberar las enzimas
intracelulares para las pruebas de decoloración.
Decoloración y medición
Las soluciones de prueba de decoloración se prepararon a
partir de las soluciones madre de colorante, las soluciones de
suspensión celular, el agua y/o el medio de cultivo según el
porcentaje predeterminado. Las soluciones contenían finalmente
(por litro): 100 mg de colorante y 750 mg de masa de células
secas (aproximadamente 3 g de masa húmeda), y se mantuvieron
a 35°C durante 1 a 48 h en condiciones anóxicas estáticas. El
tiempo de incubación dependía de las condiciones y propósitos
de la prueba. Después de centrifugar a 10.000 g durante 20 min,
los sobrenadantes se decantaron y diluyeron hasta una
absorbancia por debajo de 0,8 para muestras de alta intensidad
de color. La absorbancia se midió con un espectrofotómetro en
las longitudes de onda de máxima absorción de los colorantes
individuales. La decoloración se determinó por reducción de la
absorción. También se utilizó un procedimiento similar para
determinar la actividad de decoloración de las cepas incubadas
durante 1 hora. Los datos de decoloración iniciales se usaron
para calcular la actividad de las cepas basándose en el miligramo
de colorante degradado por gramo de masa celular seca por hora.
La concentración de colorante en mg por litro se determinó a
partir de la curva de calibración de absorbancia de las soluciones
estándar. El crecimiento celular durante la prueba de
decoloración se controló con un contador de células (Coulter
multisizer II, Coutler Electronics Ltd. England) después de diluir
la solución 1000 veces con la solución de dilución Isotone1 del
fabricante. La masa de células secas en solución suspendida se
determinó después de la deshidratación a 80°C hasta peso
constante. El crecimiento celular durante la prueba de
decoloración se controló con un contador de células (Coulter
multisizer II, Coutler Electronics Ltd. England) después de diluir
la solución 1000 veces con la solución de dilución Isotone1 del
fabricante. La masa de células secas en solución suspendida se
determinó después de la deshidratación a 80°C hasta peso
constante. El crecimiento celular durante la prueba de
decoloración se controló con un contador de células (Coulter
multisizer II, Coutler Electronics Ltd. England) después de diluir
la solución 1000 veces con la solución de dilución Isotone1 del
fabricante. La masa de células secas en solución suspendida se
determinó después de la deshidratación a 80°C hasta peso
constante.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Identificación de cepas y decoloración de colorantes.
3582 Jian Yu et al.
Se aislaron tres cepas (GM3, Q3 y Z1) como los
degradadores azoicos más activos. Todos ellos son Gram
negativos y reducción de nitrato positivos. Pertenecen a
Pseudomonas según 14 reacciones fisiológicas (datos no
mostrados aquí) en el manual de Bergey, pero con
apariencia de colonia diferente. Después de incubar en
las soluciones de prueba de decoloración durante 48 h a
358 °C, las cepas mostraron su capacidad de
decoloración diferente en los ocho colorantes sintéticos
que se enumeran en la Tabla 1. Los cuatro colorantes
azoicos con diferentes estructuras químicas se
decoloraron casi por completo. Debido a que Acid violet
7 (monoazo) y Acid red 151 (diazo) se habían utilizado
como dos indicadores en nuestros cultivos de
enriquecimiento y selección, se esperaba que las cepas
pudieran decolorarlos en gran medida (> 90%). Es
interesante, sin embargo, para notar que las cepas
también mostraron una buena capacidad de decoloración
Fig. 1. Las estructuras químicas, nombres comerciales (cromóforos) de ocho colorantes sintéticos utilizados en
este estudio.
de otros dos colorantes azo (eliminación de color de 87 a
95%), Reactive black 5 y Acid yellow 34. Este hecho
implica que las enzimas clave (azo reductasas) tenían un
amplio espectro de sustrato para reducir y escindir los
enlaces azo en diferentes colorantes (Zimmermann et al.,
1982). Sin embargo, para los cromóforos no azoicos, las
cepas mostraron capacidades de decoloración de
moderadas a bajas. Dos tintes de antraquinona, Reactive
blue 2 y Acid green 27, se decoloraron en diferentes
grados, 14–24% y 60–84%, respectivamente. Parecía
que las cepas no atacaban al cromóforo de antraquinona
para eliminar el color como lo hacían con los enlaces azo,
sino que atacaban primero a otros grupos. De esta forma,
la decoloración se vio afectada por las estructuras
químicas de los dos colorantes como el anillo de triazina
en Reactive blue 2. El mismo mecanismo de
descomposición no específico también podría aplicarse
al índigo carmín que se decoloró moderadamente. Se
 Decoloración de tintes sintéticos 3583

observó un fenómeno interesante para Acid red 183 que
tiene un enlace monoazoico en complejo con cromo
como su cromóforo. Las cepas tenían poca capacidad de
decoloración para eliminar su color del 20 al 26%. En
comparación con su alta actividad de descomposición de
los enlaces azo, las cepas y/o las azo reductasas pueden
verse severamente inhibidas por el cromo de metal
pesado en Acid red 183.
Para encontrar si las enzimas extracelulares o
intracelulares decoloraban los tintes, la solución de
prueba de decoloración se centrifugó después de 2 horas
de incubación. Se decantó una alícuota de la solución
sobrenadante y se incubó para la decoloración en
paralelo con la solución de suspensión celular. Se
observó poca decoloración adicional del sobrenadante
(53 %) mientras que el color en la solución de suspensión
desapareció por completo. Este hecho indica que las
enzimas clave de la reducción azo están en el citoplasma
y, por lo tanto, las moléculas de colorante deben
transferirse a las células para su descomposición o las
enzimas necesitan cofactores que están disponibles en las
células vivas. La decoloración de los ocho colorantes
sintéticos por células rotas con enzimas intracelulares se
comparó además con las células intactas. No se observó
mejora o deterioro significativo (5 a 10%), lo que indica
que la decoloración del tinte implica las enzimas
intracelulares constitutivas. La masa celular también fue
desactivada por esterilización a 1218C por 15min, y poca
remoción de color (53%)
Tabla 1. Decoloración de colorantes por tres cepas aisladas de Pseudomonas (GM3, Q3 y Z1) (reducción %Abs)
Tintes croforo Absa
decoloración de azo y se utilizó en nuestro modelo
cinético.
Factores ambientales en la decoloración de un colorante
monoazoico
Dado que las tres cepas de Pseudomonas mostraron
habilidades similares para descomponer colorantes
sintéticos, se informaron estudios posteriores sobre la
cepa GM3 por su capacidad y cinética de
descomposición del ácido violeta 7 (monoazo) en
diversas condiciones. Aunque la masa celular de la cepa
GM3 se cultivó en condiciones aeróbicas, la
decoloración del colorante azoico fue más favorable en
condiciones anóxicas, como se observó en las soluciones
de prueba estática: primero apareció una solución limpia
en la parte inferior y luego se expandió hacia arriba hasta
la solución completa. La cepa mostró su mayor actividad
en un estrecho rango de pH de 7–8, como se muestra en
la Fig. 2. La actividad se redujo en aproximadamente un
50 % cuando el pH de la solución se desvió del nivel
ligeramente alcalino en 0,5 unidades. Este hecho implica
que el pH local en el microambiente del lodo activado
puede tener un efecto muy significativo sobre la
actividad de decoloración. El efecto de la temperatura
sobre la actividad de decoloración también fue
significativo (Fig. 2). Un rango de temperatura óptimo es
bastante estrecho de 35 a 408C. La actividad aumentó
considerablemente cuando la temperatura se elevó de 10
GM3 Q3 Z1

Abdominales (%) Abdominales (%) Abdominales (%)

Violeta ácido 7b monoazo 2.66 0.07 97.4 0.16 94.2 0.01 99.6

Rojo ácido 151b diazo 2.28 0.22 90.3 0.20 91.4 0.03 98.9

Negro reactivo 5 diazo 2.63 0.24 91.1 0.33 87.5 0.14 94.6

Amarillo ácido 34 monoazo 3.24 0.26 91,9 0.32 90,0 0.34 89.5

Azul reactivo 2 antraquinona 1.21 0.99 18.3 1.04 14.2 0.92 24.3

Verde ácido 27 antraquinona 1.20 0.30 75.5 0.19 84.2 0.48 60.5

Rojo ácido 183 complejo metálico 1.50 1.20 20.1 1.16 22.6 1.10 26.7

Índigo carmín Índigo 3.91 1.22 69.0 1.53 60.8 0.48 87,9

a
Absorbancia de la solución de tinte original (100 mg/L) en la longitud de onda de máxima absorción de los tintes individuales.
b
Los dos colorantes azo utilizados para el cultivo de enriquecimiento y a 358C, y luego disminuyó rápidamente por encima de
la detección. los 408C. La energía de activación basada en la ecuación
de Arrhenius para la influencia de la temperatura se
estudiará más a fondo después de establecer un modelo
cinético.
se observó debido a la adsorción física de los ocho
colorantes en la masa de células muertas. La masa de
células vivas fue el biocatalizador responsable de la Efecto de nutrientes e inhibición de nitratos.
3584 Jian Yu et al.
Tabla 2. Influencia de la fuente de nitrógeno en la decoloración del ácido violeta 7 (monoazo) por la cepa GM3
Nitrógeno KCla peptona
Concentración (mg/L) 1000 1000
abdominales residuales 0.439 0.169
Decoloración (%) 83.5 93,9
La Tabla 2 muestra la influencia de la fuente de
nitrógeno en la reducción del enlace azoico (–N=N–) del
ácido violeta 7. En comparación con la solución de
control en la que se añadió KCl a 1000 mg/l, tanto el
nitrógeno orgánico en peptona como el nitrógeno
inorgánico en amonio el cloruro tuvo un efecto positivo
en la decoloración. Sin embargo, el nitrato tuvo un efecto
inhibidor severo sobre la reducción y escisión del enlace
azoico. En comparación con el 90% de eliminación de
color en condiciones normales, un nitrato
Fig. 2. Efectos del pH de la solución (arriba) y la temperatura
(abajo) sobre la decoloración del ácido violeta 7 (colorante
monoazoico) por la cepa GM3. La reacción se llevó a cabo
durante 2 h en soluciones estáticas que contenían 100 mg de
colorante/L y 0,75 g de masa celular seca a 35 °C para el efecto
del pH o a pH 7 para el efecto de la temperatura.
La concentración de 1000 mg/L condujo a una
eliminación de color de solo el 2 %, lo que
probablemente se debió a la adsorción física de las
moléculas de colorante por parte de la masa celular. Este
hecho también implica que la adsorción física de las
moléculas de colorante en la masa celular fue un
mecanismo insignificante en la eliminación del color. En
una solución mixta de nitrato y peptona (1:1), se observó
NH4Cl KNO3 KNO3+Peptona
1000 1000 500+500
0.295 2.61 2.518
89.3 2.3 5.2
el mismo efecto inhibidor aunque se observó crecimiento
celular. La Figura 3 muestra que el efecto adverso del
nitrato fue tan significativo que un nivel de trazas de
nitrato (10 mg/L) podría reducir la actividad de
decoloración en aproximadamente
a
Se agregó KCl a la solución de prueba como control.
Fig. 3. Efecto inhibidor del nitrato (arriba) y efecto promotor de
los nutrientes de crecimiento (abajo) sobre la decoloración por
la cepa GM3 a pH 7 y 358C en soluciones estáticas: 100 mg de
colorante/L y 0,75 g de masa celular seca/L. La prueba de
inhibición de nitratos se permitió durante 48 horas y la prueba
de nutrientes se permitió durante 60 minutos.
50%. El nitrato y su forma reducida, el nitrito, podrían
ser utilizados por la tensión como aceptor de electrones
en condiciones anaeróbicas, compitiendo con el enlace
azoico por los electrones y, por lo tanto, inhibiendo la
reducción y la descomposición del cromóforo azoico
(Zissi y Lyberatos, 1996). También podrían ser el
inhibidor de la azo reductasa, como lo implica el bajo
nivel de la concentración inhibitoria del 50 % (10 mg/L).
 Decoloración de tintes sintéticos 3585

Esta inhibición de nitrato presenta un serio desafío para decoloración específica con una unidad que depende de
controlar el contenido de nitrato en las aguas residuales los valores de m y n (mg(1n). L(mþn1)/mg DCMm min).
de las casas de teñido, ya que el nitrato es una sal Dado que no se observó crecimiento o muerte celular en
omnipresente y puede tener un alto nivel de la solución de prueba que contenía nutrientes en 2 h, el
concentración en las aguas residuales. Aunque el nitrato efecto de la concentración de masa celular en la tasa de
también se forma a partir de nitrógeno orgánico o de decoloración fue constante. Este modelo tarifario
amonio a través de la nitrificación en condiciones (ecuación (2)) puede tomarse como un tipo modificado
aeróbicas, puede tener poco efecto inhibidor una vez que del modelo tarifario de Michaelis-Menten (ecuación (1))
los huesos azo se han escindido en la etapa anaeróbica. cuando no se incluye el parámetro Km. La ecuación (3a)
En ausencia de nitrato, otras formas de nitrógeno, como da la concentración de tinte con el tiempo dependiendo
la peptona y el amonio, como se muestra en la Fig. 3, del orden de reacción parcial de la concentración de tinte
podrían mejorar significativamente la actividad de (n).
descomposición del colorante azoico de la cepa. La
actividad de decoloración se midió como la tasa de C ð1nÞ ð1 nÞkMm
decoloración inicial en los primeros 60 minutos. El ¼1 t ðn 6¼ 1Þ ð3aÞ
recuento del número de células por mililitro en los C0ð1nÞ
minutos 0 (2,28108), 30 minutos (2,24108) y 60 minutos C0
(2,20108) confirmó que la actividad de decoloración y
aumentó debido a la actividad enzimática, no al C metro
crecimiento celular en presencia de nutrientes de
¼ exp ðkM tÞ ðn ¼ 1Þ ð3bÞ
crecimiento.
C0

Modelo cinético de decoloración

En la Fig. 4 se muestra una relación lineal de alto grado
Para medir la tasa máxima de decoloración del ácido
(R2>0.99) entre la raíz cuadrada de la concentración del
violeta 7 por la cepa GM3, se incubó una solución de
tinte y el tiempo, lo que da una reacción de medio orden.
prueba que contenía 100 mg de colorante y 1,6 g de masa
(n=1/2) respecto a la concentración de colorante
celular seca (DCM) por litro y 50 % v/v de medio de
(ecuación
crecimiento en condiciones anóxicas a 358 °C durante 2
(4)).
horas. . La figura 4 muestra los cursos de tiempo de la
reducción de la absorción (Abs) y la disminución de la
concentración del tinte. El modelo de tasa de tipo C1=2 ¼ C01=2 k2 mmt ð4Þ
Michaelis-Menten (ecuación (1)) se ha utilizado La ecuación 4 también se puede reorganizar a la ecuación
ampliamente para la cinética isotérmica de conversión de (5) para el orden de reacción (m) con respecto a la
sustrato por enzimas y/o células vivas. Los dos concentración de masa celular realizando experimentos
parámetros del modelo (Vm y Km) de la ecuación de de decoloración con diferentes concentraciones iniciales
velocidad no lineal consisten en velocidades específicas de masa celular (M).
(k1; k1 y k2) y actividad enzimática (E0) y, por lo tanto,
son funciones de la temperatura. Debido a la no
2ðC01=2 C1=2Þ ¼ kMm ð5Þ
linealidad,

v¼ d½S ¼ t
El lado izquierdo de la ecuación (5) podría medirse
Vm½S ¼ k2½E0½S d1Þ dt experimentalmente y representarse frente a las
kmetroþ ½S k1 þ k2=k1 þ ½S concentraciones de masa celular como se muestra en la
Fig. 5. La linealidad (R2>0,98) entre kMm y M indica
que m es igual a uno. La figura 5 también muestra la
Un modelo cinético general (ecuación (2)) de la
relación no lineal entre la concentración de colorante
decoloración del colorante ofrece la conveniencia del
residual y la concentración de masa celular. Por lo tanto,
análisis del efecto de la temperatura.
la decoloración fue una reacción de primer orden con
corriente continuaMinnesota respecto a la concentración de masa celular (M). La
ecuación (6a) da el modelo cinético de la decoloración
¼ kmC ð2Þ
del colorante azoico por la cepa GM3 de Pseudomonas.
dt
donde t es el tiempo (min), M y m son la concentración corriente continua 1=2
de masa celular (mg DCM/L) y su orden de reacción ¼ kMC ð6aÞ
parcial, C y n son la concentración de colorante (mg/L) dt
y su orden de reacción parcial, y k es la tasa de y su forma de integración,
3586 Jian Yu et al.

1=2 1=2 km C ¼ C0 2 toneladas ð6bÞ

A partir de la pendiente de la línea lineal en la Fig. 4 con la masa celular inicial (M = 1,6 g DCM/L), la ecuación
(6(b)) da la tasa de decoloración específica,
ðmg LÞ1=2
k ¼ 0:12 a 358C
g DCM min

Energía de activación de la decoloración

Hemos observado un efecto significativo de la
temperatura sobre la decoloración del colorante
monoazoico por la cepa GM3 en la Fig. 2. La decoloración
aumentó de 10 a 358C y luego disminuyó por encima de
los 408C. Este último

Fig. 4. Arriba: los cursos de tiempo de decoloración de Acid

violeta 7 por cepa GM3 a pH 7 y 358C en solución estática: relación general entre la concentración de colorante, la
100mg colorante/L y 1.6g DCM/L. Abajo: ajuste de datos y temperatura y la concentración de masa celular,
estimación de parámetros del modelo cinético de decoloración
(ecuación (4)).
Fig. 5. Efecto de la concentración de masa celular en la
concentración de colorante residual a 358C y pH 7 en soluciones ¼ ð8Þ
0
de prueba que contienen Experiencia Mk0
100mg colorante/L por 2h. La línea lineal es el mejor ajuste de o, t RT
datos con la ecuación (5) dando m cerca de 1. ( 01=2 1=2Þ) ln ðMk0Þ E 2ðC C
podría atribuirse a la muerte celular o la
en ¼
desnaturalización de la enzima a altas temperaturas
t RT ð9Þ
porque la tasa de decoloración depende de la
2ðC1=2 C1=2Þ mi
concentración de masa celular dada por el modelo
cinético (ecuación (6a)). En el rango de temperatura de
10–358C, el aumento de la decoloración con la
temperatura depende de la energía de activación del
reacción dada por la ecuación de Arrhenius.
mi
k ¼ k0 exp d7Þ
donde C0 y C son las concentraciones de colorante inicial
RT
e instantánea (mg/L) en el tiempo t (min), y M es la
donde k0 es el factor de frecuencia y tiene la misma concentración de masa celular (g DCM/L). El lado
unidad que k, E es la energía de activación (cal/mol), R izquierdo de la ecuación (9) se midió y graficó contra el
es la constante del gas (1.987cal/molK) y T es la recíproco de la temperatura como se muestra en la Fig.
temperatura (K). Las ecuaciones (6a) y (7) dan la 6. El alto grado de linealidad (R2>0.99) entre dos
 Decoloración de tintes sintéticos 3587

variables brinda estimaciones confiables de la energía de Decoloración en un Consorcio

activación (E) y la factor de frecuencia (k0).
1=2
11ðmg LÞ
k0 ¼ 1:4910
DCM min
E ¼ 16:87 kcal=mol
Esta energía de activación de la decoloración por parte
de la cepa GM3 de Pseudomonas se encuentra en el lado
de alto valor del rango general de energía de activación
de las reacciones catalizadas por enzimas, que
generalmente están dentro del rango de 4 a 20 kcal/mol,
en su mayoría alrededor de 11 kcal/mol (Shuler y Kargi,
1992).
La cepa GM3 de Pseudomonas mostró una alta
actividad de decoloración en cuatro colorantes azoicos
con diferentes estructuras químicas, pero una actividad
g de moderada a pobre en colorantes no azoicos (Tabla 1).
Podría atribuirse a las azo reductasas que no eran las
enzimas específicas para descomponer los cromóforos
no azo como la antraquinona y el índigo. También podría
atribuirse al efecto tóxico del complejo metálico como el
cromo en las células y las enzimas. Se preparó un
consorcio bacteriano mezclando la cepa GM3 y lodo
activado municipal a razón de 50:50 en masa para
investigar la interacción sinérgica entre la

consorcio en comparación con el 18% por cepa única. En

Fig. 6. Estimación de la energía de activación con la ecuación
(7) y datos de la Fig. 2.
degradador específico y los no degradantes ubicuos. La
Tabla 3 da la decoloración de los tintes recalcitrantes en
este consorcio. El lodo activado municipal en sí eliminó
una cantidad insignificante de color (55%). El colorante
monoazoico Violeta ácido 7 se decoloró en la misma
medida tanto en el cultivo puro como en el consorcio. Se
observó mejora en otros cuatro colorantes no azoicos
aunque el grado de mejora fue diferente. Para los tintes
(verde ácido 27 e índigo carmín) en los que la cepa GM3
tuvo una actividad moderada (75–80 %), el consorcio no
mostró una mejora significativa en la degradación al
proporcionar un 5–6 % más de eliminación de color, lo
que podría atribuirse a la eliminación del color por los
lodos municipales. Sin embargo, para los tintes
recalcitrantes (Reactivo azul 2 y Acid red 183) en los que
la cepa tuvo poca actividad (18–20% de decoloración),
la mejora fue significativa. El azul reactivo 2, un tinte de
antraquinona recalcitrante, se decoloró al 77% por
cultivo de una sola cepa, la decoloración avanzó muy
lentamente y realmente se detuvo después de 48 horas.
Pero en el consorcio, la decoloración se produjo de forma
continua durante 76 h, lo que implica que un
cometabolismo podría estar involucrado en la
degradación del Reactive blue 2 en el consorcio. Otro
tinte recalcitrante,
Acid red 183, presentaba un monoazo y complejo de
cromo. La única cepa tuvo poca actividad en su
decoloración (20 %), pero con la ayuda de otros
microorganismos del consorcio, se eliminó hasta un 57
% del color. La toxicidad de los cationes de cromo podría
reducirse debido a la adsorción de metales pesados en el
lodo activado. Más estudios cinéticos sobre el consorcio
revelarán el efecto sinérgico cuantitativo.
CONCLUSIONES
Los colorantes azoicos con diferentes estructuras
químicas pueden descomponerse eficazmente en
condiciones anóxicas mediante tres cepas de
Pseudomonas aisladas de la instalación industrial. La
tasa de descomposición, sin embargo, depende de las
condiciones ambientales como el pH, la temperatura y
los nutrientes. Un efecto inhibitorio severo proviene del
nitrato, un anión inorgánico ubicuo en la mayoría de las
aguas residuales industriales. Las cepas pueden escindir
eficazmente los enlaces azoicos independientemente de
las estructuras de los tintes, pero pueden descomponer
los tintes no azoicos al atacar las moléculas orgánicas
enteras del tinte, lo que da un grado diferente de
eliminación del color. Para la decoloración con

Tabla 3. Decoloración de colorantes recalcitrantes por Pseudomonas cepa GM3 en un consorcio de lodos activados municipales
Tintes cromóforo Absb inicial
GM3 Consorcio

Abdominales Eliminación (%) Abdominales Eliminación (%)

Violeta ácida 7 monoazo 2.66 0.16 97.4 0.15 96.5

Azul reactivo 2 antraquinona 1.21 0.99 18.3 0.28 77.2c
Verde ácido 27 antraquinona 1.20 0.30 75.5 0.23 80.5
Rojo ácido 183 complejo metálico 1.50 1.20 20.1 0,64 57.3
Índigo carmín Índigo 3.91 1.22 69.0 1.05 73.1
a
Eliminación de color insignificante solo con lodos municipales (55%).
bSolución colorante
100mg/L.
C
Conseguido en 72h.
3588 Jian Yu et al.

colorantes azoicos, la velocidad depende de la

concentración del colorante (medio orden) y la
concentración de masa celular (primer orden) y la
temperatura. Esto último se puede predecir con una
energía de activación de 16,87 kcal/mol en un rango de
10 a 358 °C.

Agradecimientos}La investigación descrita en este documento

fue apoyada por el Consejo de Desarrollo y Tecnología
Industrial (ITDC), Hong Kong SAR, China. Los autores también
aprecian la identificación de la cepa por parte del Instituto de
Microbiología de Guangdong, China.
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