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Capítulo 1
Técnicas Inmunológicas Analíticas
José G. Kunkel
I. Introducción
Los procedimientos inmunológicos analíticos se han convertido en partes

importantes del arsenal de técnicas para describir y dilucidar cambios fisiológicos
y de desarrollo en antígenos naturales (Ags) de insectos. Los antisueros, que son
soluciones de las secreciones de defensa natural producidas por los sistemas
inmunitarios de los vertebrados en respuesta a antígenos extraños, pueden
utilizarse como reactivos analíticos para realizar mediciones tanto cuantitativas
como cualitativas de estos Ags de insectos. Un antisuero contiene anticuerpos
(AB) que se utilizan para identificar los componentes que están presentes en una
mezcla compleja y medir sus títulos relativos o absolutos al mismo tiempo. La
inmunología también proporciona métodos objetivos para decidir sobre la
homología o el grado de homología entre macromoléculas similares de
diferentes especies o diferentes etapas o tejidos de una sola especie.
Este capítulo abordará el uso pasado y continuo de antisueros policlonales

de interés para los biólogos de insectos. No se intentará ninguna evaluación de la
tecnología emergente de anticuerpos monoclonales (mAB), ya que aún no se
conocen todas sus implicaciones para las investigaciones de insectos. Sin
embargo, se harán notas de advertencia cuando un uso actual de AB policlonal
pueda o no ser reemplazado por mAB.
Antes de que los investigadores se embarquen en el uso de una técnica inmunológica
en particular, deben definir cuidadosamente sus necesidades y recursos. Una
descripción general lúcida de antigenicidad e inmunidad (Berzofsky, 1985; Darnell et
al., 1986) es una lectura esencial antes de intentar comprender los detalles de la
técnica. El investigador debe entonces tomar conciencia de la gama de técnicas
disponibles y de los poderes y limitaciones de cada una.
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técnica. Leer un manual de inmunología puede resultar confuso debido a la

variedad de métodos disponibles (Ouchterlony, 1968; Axelsen, 1983); sin
embargo, existen varias técnicas que han sido particularmente útiles (o
populares) entre los fisiólogos y bioquímicos de insectos.
Leer una selección de aplicaciones recientes de técnicas inmunológicas a
problemas de insectos, como las que se incluyen en este libro y las
bibliografías que lo acompañan, es una buena manera de delinear la gama
de enfoques que han sido útiles en el pasado. Se recomienda cierta
familiaridad con enfoques inmunológicos anteriores exitosos antes de
intentar un método novedoso. Aquí se proporcionan diagramas que
describen resultados idealizados, pero los investigadores interesados
pueden consultar los resultados originales publicados en las referencias
adjuntas. La lectura de un manual reciente de inmunología y la realización de
un curso de formación en aspectos prácticos de la materia son muy
recomendables para quienes deseen maximizar la información que se puede
obtener con las técnicas disponibles.
Las técnicas inmunológicas pueden ser esclarecedoras pero pueden ser costosas
en tiempo, animales, equipos y materiales. Se puede ahorrar una gran cantidad de
tiempo y energía buscando asesoramiento y capacitación de expertos en las primeras
etapas de un estudio. Los niveles de análisis se describen comenzando por el menos
complicado y menos costoso. En las investigaciones exploratorias iniciales, donde no
se sabe mucho acerca de la complejidad del sistema, obviamente se debe probar
primero el enfoque aplicable más simple. El mismo enfoque cuidadoso y graduado es
útil como herramienta didáctica en una clase o laboratorio en el que se desea
introducir a los estudiantes a los conceptos de inmunología de la manera más sencilla
y económica.
II. Comentarios generales sobre el alcance de un enfoque inmunológico
Varias propiedades de los antisueros policlonales no se aplican a los antisueros

monoclonales: Primero, la mezcla de AB que se encuentra en un antisuero
policlonal reconoce una variedad de entidades estructurales (determinantes) en
la macromolécula que actúa como un Ag inmunizante (Fig. 1.1). Estas entidades
incluyen determinantes nativos en la superficie de Ag y determinantes "crípticos"
enterrados en el interior de Ag. Un mAb es, por definición, reactivo
principalmente con un determinante de un Ag inmunizante, aunque su afinidad
con determinantes específicos de otros Ag puede ser mayor o menor y debe
evaluarse mediante la experiencia.
En segundo lugar, la avidez (afinidad aparente) de la población AB por un Ag
puede variar en un amplio rango (Fig. 1.1). La avidez es una afinidad promedio
exhibida por un antisuero complejo que contiene cientos de individuos
Kunkel / EnTécnicas Inmunológicas en Biología de Insectos(1988) Gilbert y Miller Eds. Página 3
anticuerpos de diferentes concentraciones, cada uno con su propia afinidad por el Ag.
Un mAB tiene una afinidad específica por un Ag que puede describirse con precisión
mediante una constante de equilibrio de la reacción de unión.
Figura 1.1.Determinantes antigénicos y antisueros policlonales. Un antisuero policlonal se deriva de múltiples

clones de células productoras de AB y puede tener múltiples AB bivalentes distintos (A1, A2, A3, h4, B1, ..., D3)
reaccionando a cada determinante (A, B, C, D) en un solo Ag nativo, representado en el centro. Los
determinantes A, B y C se representan en la superficie de una proteína nativa globular polivalente. El
determinante interno críptico, D, puede estar enterrado dentro de un núcleo interno de la proteína nativa, y los
anticuerpos reactivos con este determinante latente pueden reaccionar con él solo cuando el Ag está en un
estado desnaturalizado. Cada animal inmunizado con el Ag puede producir anticuerpos contra algunos o todos
estos determinantes. La avidez de un antisuero policlonal particular se determina mediante un promedio
ponderado de frecuencia de las afinidades individuales de la población de AB secretados.
En tercer lugar, en la estequiometría uno a uno de la reacción de

precipitación (Fig. 1.2), los antisueros policlonales no tienen problemas para
vincular grandes Ags en redes extendidas que tienden a precipitar. Sin embargo,
existe el problema de que los AB monoclonales se involucren en el precipitado, a
menos que el Ag se inmovilice de alguna otra manera, ya sea en otra estructura
biológica, como otra subunidad, una membrana, o en un soporte inerte, como
una superficie plástica o nitrocelulosa. membrana. La especificidad permite que
un AB reconozca un determinante en un Ag incluso en presencia de un exceso de
Ag no relacionado. Una reacción altamente ávida (afinidad promedio alta)
permite que se formen muchos enlaces semipermanentes (no covalentes) entre
Ag y AB que no se invierten con la frecuencia suficiente para permitir que Ag
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disolver.
Uno de los peligros de usar anticuerpos monoclonales es que la afinidad y la
especificidad de AB pueden no ser lo suficientemente altas como para formar enlaces
semipermanentes que sobrevivan a los procedimientos de lavado, y dado que no hay
una red sustancial de otros AB involucrados en un precipitado extenso, la tinción
monoclonal de las estructuras pueden ser temporales. Para los antisueros
policlonales, la estequiometría de la reacción de precipitación suele ser equimolar y,
por lo tanto, se pueden medir las concentraciones específicas de Ag en relación con el
título de la solución AB mediante la identificación de la concentración de equivalencia
a la que se alcanza el precipitado máximo, incluso en presencia de grandes excesos de
otras Ags. La mayoría de las técnicas inmunológicas policlonales tienen en cuenta
estas propiedades anteriores.
1. Medición de la complejidad inmunológica de un problema
Los anticuerpos se pueden utilizar para medir y delinear la complejidad

antigénica de una situación. En cierto sentido, uno le pregunta a un vertebrado,
como un conejo, cómo percibe su sistema inmunitario una mezcla de insectos
Ags. La capacidad del conejo para reconocer macromoléculas extrañas es otra
forma de dividir la complejidad de un sistema desconocido. Dado que las
macromoléculas de los insectos son casi todas totalmente extrañas para un
vertebrado, el sistema inmunitario del conejo suele proporcionar una buena
fuente de antisueros contra proteínas individuales o mezclas de insectos. Este
enfoque se puede comparar con otras técnicas analíticas como la electroforesis,
la cromatografía o la enzimología. En cada una de estas últimas técnicas, las
concentraciones de las moléculas o actividades a separar son importantes.
Ninguna de estas técnicas por sí sola es capaz de una identificación definitiva de
una mezcla particular de proteínas. En algunos casos, una combinación juiciosa
de las técnicas permite una fuerte inferencia sobre las identidades de una mezcla
de moléculas.
Las técnicas inmunológicas, por otro lado, son potencialmente capaces de
identificar y medir Ags individuales o mezclas de Ags, todo en un solo
procedimiento. Sin embargo, algunas técnicas inmunológicas tienen como
objetivo, o se limitan a, medir un solo Ag; algunos están diseñados para observar
mezclas o se adaptan a ellos. Se recomienda una comprensión profunda de la
química de los Ags bajo investigación y ABs en general. Asegúrese de leer
extensamente sobre las propiedades generales y el mecanismo de la técnica
inmunológica particular que se está utilizando, sus objetivos y limitaciones.
Prefiero comenzar un estudio con un antisuero policlonal a la mezcla
compleja en la que normalmente se encuentra el Ag de interés. Para
Por ejemplo, si uno está interesado en los principales Ags en un sistema, como la
hemolinfa o la yema de los insectos, un estudio exploratorio de los principales Ags
suele ser útil para indicar la etapa más práctica para la purificación del Ag focal. Tal
estudio también introducirá uno a los principales contaminantes que se enfrentarán
en las etapas posteriores del estudio.
La literatura está llena de ejemplos de exageraciones basadas en un enfoque
inicial demasiado estrecho. Una vez que uno tiene un antisuero específico para
una sola proteína, es fácil concentrarse en esa proteína y olvidarse del resto. Por
ejemplo, un enfoque en la variación en el título de una proteína sérica específica
de larva particular durante el ciclo de vida de una cucaracha (Kunkel y Lawler,
1973; Kunkel, 1975) reveló una fluctuación importante asociada con el ciclo de
muda; unos años más tarde, un estudio más completo encontró que todas las
demás proteínas principales del suero de la cucaracha fluctúan al unísono
(Duhamel y Kunkel, 1978). Si inicialmente se hubiera utilizado un antisuero
general para todas las proteínas séricas, no se habría producido este énfasis en
la fluctuación cíclica de la única proteína sérica.
Vale la pena enfatizar otra precaución relacionada con la complejidad

inmunológica. Ciertas técnicas, como la fijación de microcomplemento, las
transferencias puntuales y ELISA, requieren inherentemente antisueros
monoespecíficos para que su alta sensibilidad en la medición sea confiable. Es
necesaria la experiencia con la complejidad antigénica y AB del sistema en
estudio para evitar artefactos. La especificidad de los antisueros monoespecíficos
debe certificarse mediante una o varias técnicas, como inmunoelectroforesis
(IEP), IEP cuantitativo (QIEP), Ouchterlony (manchado de AB y Ag por separado en
agar, la migración forma una línea de precipitación en el medio) o Western blot
(proteínas identificadas colocándolos sobre nitrocelulosa y sondeándolos con
anticuerpos).
2. Medición cuantitativa de títulos Ag individuales
A. AB como reactivos analíticos: propiedades físicas, estabilidad, almacenamiento
una. Concentración relativa de Ag y AB.Una proporción de una molécula de AB a una

molécula de Ag optimiza la mayoría de los ensayos de inmunoprecipitación. Esta es la
base del uso de antisueros para medir la concentración de un Ag. Sin embargo, esta es
también la base para posibles artefactos. Dado que una molécula AB tiene dos sitios
de combinación, generalmente se forma un precipitado solo si el antisuero es
policlonal y el Ag tiene múltiples determinantes en su superficie o si el Ag tiene
múltiples subunidades con el mismo determinante (Fig. 1.2). En general, el AB
monoclonal no se usa para la formación de precipitados.
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reacciones, porque no se puede contar con que un Ag tenga múltiples sitios de

combinación.
Figura 1.2.La base de la precipitación de Ag por los AB es el entrecruzamiento y la multivalencia. Una red
extendida de entrecruzamiento puede resultar en un precipitado. Todo Ag está ligado a otro Ag a través de un
AB, y todo AB está ligado a otro AB a través de un Ag. La estequiometría de Ag: AB para lograr la precipitación
completa de Ag es de aproximadamente 1: 1. Los requisitos mínimos para la precipitación incluyen partículas
con múltiples subunidades que tienen un solo determinante (derecha) o múltiples determinantes en una sola
partícula (izquierda).
Otro requisito necesario para la precipitación es que AB entrecruce suficiente

Ag en una red insoluble. Fuera del rango de equivalencia aproximada, en el lado
del exceso de Ag, aumenta la probabilidad de encontrar una molécula AB unida a
dos moléculas de Ag sin moléculas AB adicionales disponibles para extender una
red. Este agregado Ag-AB Ag puede ser soluble (Fig. 1.3). Del lado del exceso de
AB, tiende a haber un problema menor, particularmente con antisueros
policlonales contra Ags grandes. Los múltiples determinantes de un Ag grande
pueden adsorber una gran cantidad de moléculas de AB y todavía les quedan
determinantes para entrecruzarse con otra molécula de Ag. Después de la
formación de un precipitado y cuando todo el Ag está involucrado en un
precipitado, AB adicional puede continuar agregándose al precipitado en otros
determinantes sin poner en peligro la posibilidad de disolver el precipitado
recubriendo completamente el Ag con AB en todos sus determinantes. Sin
embargo, en un Ag pequeño, el exceso de AB puede conducir a un complejo AB-
Ag-AB soluble, ya que si un Ag tiene solo unos pocos determinantes, puede estar
completamente recubierto con AB, aún ser soluble y bloquearse para que no se
entrecruce con otros complejos AB-Ag-AB, ya que todos sus determinantes
también están cubiertos por AB.
Figura 1.3.Equivalencia clásica Ag/AB en líquido. Se coloca una cantidad fija de AB en una serie de tubos de
ensayo. Se añade una concentración creciente en serie de Ag a tubos sucesivos. En el extremo de baja
concentración de Ag de la serie, no se forma precipitado, porque el exceso de AB cubre completamente los
determinantes de Ag, y no hay determinantes libres para que un extremo libre de AB se entrecruce. En una
región de 3 a 6 unidades logarítmicas de Ag, toda la Ag en los tubos se precipita con AB disponible,
generalmente en una proporción superior a 1:1. Esta situación es posible porque muchos Ags tienen mucho
más de dos sitios de combinación AB. A medida que la concentración de Ag aumenta más allá de la
equivalencia, aumenta la frecuencia de agregados de Ag solubles unidos por una o unas pocas moléculas de
AB. Finalmente, cada molécula de AB está unida en un complejo soluble con dos moléculas de Ag (Ag-AB-Ag),
b. Supervisión de la síntesis y el procesamiento de Ag.Los antisueros se pueden utilizar

para seguir la síntesis de Ag o la modificación posribosómica mediante la combinación
de la precipitación selectiva de un Ag y el marcaje pulsado o continuo con precursores
radiactivos. Varias formas de usar este enfoque pueden conducir a una comprensión
sustancial de la síntesis, así como de los eventos de procesamiento posribosómico en
la función de una proteína (Hagedorn et al., 1978; Levenbook y Bauer, 1984;
Wojchowski et al., 1986).
B. Muestras de laboratorio y agricultura de campo
Una prueba inmunológica policlonal para un Ag es robusta en muchos sentidos,

porque no depende completamente de que el Ag de interés conserve el 100 % de su
configuración nativa. Algunas pruebas inmunológicas perdonan muchos fenómenos
degradativos, como la actividad de una enzima. De hecho, las pruebas inmunológicas
se pueden realizar en material desnaturalizado adsorbido en soportes inertes como la
nitrocelulosa. Esta propiedad amplía considerablemente la variedad de situaciones de
las que se pueden obtener muestras, incluidos estudios de campo y material
almacenado en refrigerador o congelador. De hecho, útil
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Se han fabricado antisueros contra material fósil de mamut siberiano que se utilizaron
para mostrar una afinidad más estrecha del mamut con el elefante indio que con el
elefante africano.
Los estudios ecológicos y taxonómicos se verían favorecidos por la capacidad
de tomar muestras en el campo y estar seguros de que no se degradarán antes de
que se analicen en el laboratorio. A este respecto, se encuentra disponible un
compuesto orgánico, el fenoxietanol, que se puede agregar a las muestras en el
campo y preservará suficientemente las muestras de proteínas a temperatura
ambiente sin deterioro de las respuestas inmunitarias (Nakanishi et al., 1969).
C. Rango de sensibilidad y capacidad de los procedimientos inmunológicos
Las técnicas inmunológicas varían en sensibilidad en varios órdenes de

magnitud, desde miligramos hasta nanogramos de un Ag. En el método menos
sensible, la precipitación en líquido, el límite superior de Ag a precipitar depende
de la cantidad de AB que uno pueda permitirse usar por precipitación. Esta
técnica se usa a menudo cuando hay grandes cantidades de Ag precipitado
disponibles, como cuando se está monitoreando la síntesis de una proteína. En
tales situaciones, puede haber una cantidad sustancial de proteína no marcada
previamente sintetizada que también debe precipitarse para garantizar que toda
la proteína marcada recién sintetizada se encuentre en el precipitado.
Así, la máxima sensibilidad no siempre es el objetivo de una
técnica inmunológica. Cuando el objetivo es la capacidad máxima, a
veces es posible ampliar la capacidad de un antisuero usándolo
varias veces. La unión de AB a matrices como perlas de agarosa o
dextrano es un enfoque para poder reutilizar un AB
convenientemente. Cuando se necesita la máxima sensibilidad de
medición, hay varias técnicas disponibles. Se pueden detectar
cantidades muy pequeñas de Ag usando cantidades
equivalentemente pequeñas de AB cuya ubicación y cantidad luego
se amplifican y cuantifican mediante capas de AB secundario que
luego se visualizan por medios enzimáticos o fluorográficos. En
muchas de las técnicas más sensibles, la cantidad de Ag precipitada
puede ser tan pequeña que la radiactividad máxima alcanzable
mediante estudios de incorporación no puede detectarse por encima
del fondo.
3. cuantificación del grado de diferencia Ag
A. Variación intraespecífica
una. Procesamiento durante las etapas de síntesis y función.
Durante la síntesis ribosomal y el procesamiento posribosomal de
las proteínas, los anticuerpos pueden interactuar con la
estructura naciente y en desarrollo de forma preparativa o
analítica. Los anticuerpos contra proteínas celulares menores se
pueden usar para precipitar los polisomas en los que se sintetizan
las cadenas nacientes de la proteína, proporcionando así una
forma de purificar los ARNm de proteínas menores (Shapiro et al.,
1974). El procesamiento de proteínas implica a veces la
destrucción de determinantes cuya pérdida puede detectarse y
seguirse inmunológicamente (Storella et al., 1985; Wojchowski et
al., 1986; Kunkel et al., 1987).
b. Identificación de electromorfos homólogos.Las proteínas o enzimas aparentemente

relacionadas dentro de una especie pueden diferir en la movilidad electroforética por
varias razones. Pueden no estar relacionados en absoluto, ser alelos del mismo gen,
ser etapas de desarrollo, ser formas fisiológicas o ser artefactos de procesamiento
diferencial. Las proteínas no relacionadas no reaccionarían inmunológicamente de
forma cruzada. Los antisueros monoespecíficos pueden identificar los electromorfos
distintos o inmunológicamente relacionados de una isozima en transferencias
Western de las proteínas separadas electroforéticamente en un medio de
transferencia como nitrocelulosa o papel diazotado (Towbin et al., 1979; Hawkes et al.,
1982; Smith y Fisher, 1984). Además de utilizar antisueros monoespecíficos, los
antisueros complejos que tienen anticuerpos contra varios péptidos o proteínas se
pueden purificar por afinidad haciéndolos reaccionar con péptidos separados
electroforéticamente transferidos a filtros de nitrocelulosa. Los anticuerpos
específicos de péptido se pueden eluir de los filtros y reutilizar para identificar o
probar la reacción cruzada con otros péptidos o proteínas (Olmsted, 1981).
B. Variación interespecífica
una. Relaciones filogenéticas.El uso de la inmunología para medir las

diferencias fenotípicas entre especies es un método establecido para realizar
investigaciones taxonómicas o filogenéticas (Champion et al., 1978; O'Brien
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et al., 1985). Los anticuerpos contra las proteínas séricas de los insectos
reaccionan más de forma cruzada con especies estrechamente relacionadas, y
esa reacción cruzada disminuye con la distancia filogenética (Kunkel y Lawler,
1974). Se ha utilizado un enfoque cuantitativo para medir el grado de reacción
cruzada de una proteína sérica de drosófilos para estimar los tiempos evolutivos
de divergencia entre insectos (Beverley y Wilson, 1984, 1985).
b. Homología de estructura y función.Muchos Ags de insectos que se han

estudiado no tienen actividad enzimática conocida y, por lo tanto, su
homología con una proteína de otra especie debe basarse en características
físicas y químicas, incluida su reactividad inmunológica cruzada. Cuando dos
especies están suficientemente distantes, la falta de Ag de reacción cruzada
no significa que no compartan Ag homólogo. La homología entre Ags de
diferentes familias u órdenes puede medirse con mayor sensibilidad cuando
se prueban con AB estructuras proteicas internas más conservativas. La
desnaturalización de la proteína de interés en un filtro de nitrocelulosa, por
ejemplo, ha permitido estudiar la homología entre las arilforinas de un
lepidóptero y un himenóptero (Ryan et al., 1984).
tercero Técnicas Específicas
1. obtención de reactivos inmunológicos
A. Elección de animales para la producción de AB
Los animales utilizados para la inmunización con Ags incluyen conejos, cabras,
ratones y pollos. Cada uno tiene sus ventajas y desventajas. El ratón es el más
fácil y económico de albergar, pero quizás el más difícil para obtener grandes
cantidades de antisuero de forma fiable. Sin embargo, algunas técnicas analíticas
solo necesitan pequeñas cantidades de antisuero. Con la práctica, se pueden
obtener grandes volúmenes de antisuero de ratones mediante la inducción de
líquido ascítico durante el procedimiento de inmunización (Tung et al., 1976). Uno
debería poder obtener 10-30 ml de líquido de ascitis por ratón y repetirlo varias
veces para algunos ratones. Además, los ratones son el animal básico para la
producción de mAB. Es posible que los mAB reemplacen muchas de las funciones
anteriores de los AB policlonales en un futuro cercano, particularmente las
funciones que involucran la medición de cantidades traza de Ag.
El conejo ha sido un pilar de la producción de AB para bioquímicos y fisiólogos de
insectos; producirán de manera confiable 50 ml de sangre semanalmente,
indefinidamente. Todavía está por determinarse si las consideraciones de
los costos del cuidado de los animales y la tecnología cambiante desplazarán al

conejo con el ratón u otra fuente de AB. Las cabras también son útiles cuando se
necesitan cantidades muy grandes de antisuero; se pueden obtener 250 ml
semanales de una cabra sin estresarla demasiado (Brookes, 1986). Los pollos rara
vez se usan en contextos bioquímicos de insectos, pero brindan ciertas
comodidades; los anticuerpos se obtienen de los huevos que ponen. El pollo
continúa proporcionando alícuotas cuidadosamente empaquetadas de sus
inmunoglobulinas para la prueba de títulos, y cuando el título de AB es alto, se
junta una serie de huevos para la cosecha final. En general, el conejo aún se
destaca como la fuente AB más utilizada cuando se juzga por el número de
publicaciones.
B. Elección del calendario de vacunación
una. Un protocolo estándar de inmunización.La inmunización de un conejo se

describirá como un ejemplo. El protocolo más utilizado en mi laboratorio tiene
una duración de 3 meses. Un sangrado inicial es útil para proporcionar suero de
control según sea necesario en algunas técnicas y para la compatibilidad cruzada
de serotipos cuando se prevé la combinación de sueros entre conejos. La
inyección inicial se realiza con 250 µg de Ag en 1 ml de PBS (solución salina
tamponada con fosfato) emulsionada con un volumen igual de adyuvante
completo de Freund. La emulsión se hace forzando la mezcla a través de un tubo
fino que conecta dos jeringas. Si la emulsión no se dispersa cuando se echa en un
recipiente con agua, está lista para ser inyectada. Permitir que la mezcla se
congele y descongele varias veces durante la emulsificación ayudará a lo largo
del procedimiento.
La mezcla se inyecta por vía subcutánea a lo largo de un lado de la espalda del
conejo en cuatro o cinco lugares. La segunda inyección se realiza 4 semanas después
de manera similar en el otro lado de la espalda, pero utilizando el adyuvante
incompleto de Freund. Cuatro semanas después, se administra una serie de cinco
inyecciones diarias de 50 #g de Ag en 1 ml de PBS por vía intravenosa a través de la
vena marginal de la oreja.
Siete días después el conejo está listo para ser cosechado por primera vez. El
animal es anestesiado y vasodilatado con una mezcla de droperidal/fentanilo
inyectado por vía subcutánea (Tillman y Norman, 1983). En 20 min se pueden
drenar 50 ml de sangre sin esfuerzo pinchando la arteria central de la oreja con
una aguja de calibre 20 y recogiendo el flujo en un tubo de centrífuga recubierto
de silicona de 50 ml. La sangre se incuba a 37 °C durante 2 horas para que
coagule y luego se coloca en el refrigerador durante la noche para permitir que el
coágulo se contraiga al máximo. El coágulo puede eliminarse y los sueros pueden
centrifugarse para eliminar las células sanguíneas. los sueros
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debe precipitarse con sulfato de amonio saturado a la mitad y disolverse dos

veces en PBS. Este paso es fundamental para evitar que las proteasas, liberadas
por hemólisis menores, digieran progresivamente las inmunoglobulinas. La
purificación adicional de la fracción de IgG en celulosa DEAE es rutinaria en
algunos procedimientos, pero no es esencial para la mayoría de los métodos
descritos en este capítulo.
b. Antisueros para discriminar diferencias cualitativas.para taxonómico

o estudios de homología, se deben tomar diferentes estrategias en la producción de
antisueros. La inmunización de un conejo debe llevarse a cabo durante al menos 10
semanas si se desea que los antisueros presenten una reacción cruzada con los
parientes más lejanos (Champion et al., 1978). Por otro lado, si uno está interesado en
diferenciar entre Ag muy estrechamente relacionados, los primeros AB producidos
después de las primeras semanas de inmunización tienden a ser los más
discriminatorios.
C. Antisueros monoespecíficos
Algunos ensayos inmunológicos requieren antisueros monoespecíficos o son más sencillos

de analizar si se utilizan antisueros monoespecíficos. Los antisueros monoespecíficos son
antisueros policlonales que reaccionan con una entidad macromolecular, ya sea una
proteína nativa de varias subunidades o un único polipéptido derivado de una entidad más
grande. A menudo se pueden obtener antisueros monoespecíficos teniendo cuidado de
purificar el Ag utilizado para la inmunización y utilizando un mínimo de ese Ag en el
procedimiento de inmunización. A menudo, los conejos son perversos porque producen
anticuerpos contra impurezas menores en un Ag "purificado" que tanto les costó ganar. El
antisuero multiespecífico policlonal resultante puede ser inútil tal como está, pero tales
antisueros pueden mejorarse o usarse para mejorar la situación.' Por ejemplo, los
anticuerpos no deseados pueden ser absorbidos por una solución de las impurezas de Ag si
dicha solución está disponible (Tanaka, 1973; Kunkel y Lawler, 1974). En este procedimiento,
se usa una forma soluble o insoluble de los Ag ofensivos para precipitar los AB no deseados.
En un enfoque diferente, se puede usar un antisuero multiespecífico

inicial y las técnicas de QIEP cruzado (Sección III.D.2) para proporcionar una
precipitina Ag/AB pura localizada en un gel que se puede cortar
discretamente de un gel y usar para inmunización de otro conejo (Harboe y
Closs, 1983). Otro enfoque más es utilizar Ag inmovilizado en nitrocelulosa
del tipo deseado para preparar el AB correspondiente mediante la unión por
afinidad al Ag inmovilizado seguido de la elución del AB específicamente
unido y su uso en otras reacciones (Olmstead, 1981; Ryan et al., 1985a). ).
2. Análisis del Título Inmunológico
A. Título Ag vs. Título AB
una. Equivalencia Ag/AB: importancia para evitar falsos negativos.Se puede

obtener una falsa impresión de la especificidad y complejidad de un antisuero si
no se presta atención a las múltiples concentraciones de equivalencia Ag/AB que
operan en un antisuero potencialmente complejo. Cada antisuero policlonal debe
tratarse primero como si fuera un antisuero complejo antes de que se demuestre
que es monoespecífico para el Ag de interés. Cada Ag tendrá su propia
concentración en una mezcla de Ag particular, y cada AB correspondiente tendrá
su propio título en el antisuero complejo. Una curva de titulación puede
demostrar que no existe una relación Ag/antisuero en la que todas las reacciones
Ag/AB estén en equivalencia.
Algunas técnicas, como la precipitación líquida y la prueba de Ouchterlony,
no perdonan esta situación y se pueden obtener conclusiones negativas falsas
sobre la complejidad. Es decir, se puede concluir falsamente que el antisuero es
más específico de lo que realmente es, o se puede concluir que una solución de
Ag dada es antigénicamente más simple de lo que realmente es. Otras técnicas,
como QIEP o QIEP cruzado, pueden tratar mejor los desequilibrios importantes
en las equivalencias Ag/AB. QIEP puede acomodar rutinariamente diferencias de
64 veces en el título de Ag entre soluciones desconocidas mientras que, usando
Ouchterlony o IEP, este orden de diferencia podría hacer que uno pase por alto o
descuide la existencia de Ags particulares en una mezcla compleja.
Es importante evitar la conclusión negativa falsa antes mencionada sobre la

complejidad, porque las técnicas que dependen de la especificidad de un
antisuero, como el Western Blot o la localización in situ (Tanaka e Ishizaki, 1974;
Raikhel, 1984; Grafet al., 1986; Peferoen et al. al., 1986; Raikhel y Lea, 1986) son
en algunos casos intrínsecamente incapaces de rechazar las reacciones de falso
positivo que pueden detectar. Por esa razón, todos los supuestos antisueros
policlonales monoespecíficos y mAB que se utilizarán para la localización in situ
deben probarse para determinar su especificidad utilizando técnicas como la
transferencia Western de extractos de tejido (Graf et al., 1986; Peferoen et al.,
1986; Raikhel et al. , 1986). Está claro, por ejemplo, que la mayoría de los mAb no
distinguen entre los diversosdrosófila productos del gen de vitelogenina (Wu y
Ma, 1986).
b. Ajuste de la técnica y el título AB para la sensibilidad adecuada.La técnica de

elección debe ser apropiada para el problema en cuestión. Si hay grandes
cantidades de Ag disponibles, entonces la principal preocupación podría ser
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conservar valioso antisuero. Si ni Ag ni AB son limitantes, entonces la elección de

la técnica es conveniente y precisa. Las técnicas extremadamente sensibles
requieren que se analicen cantidades muy bajas de Ag. A títulos de Ag muy bajos,
Ag puede perderse de una solución diluida por absorción en superficies de vidrio
o plástico. En algunos casos, un ensayo menos sensible es el enfoque más
confiable. Una regla práctica es no utilizar una técnica que requiera una dilución
excesiva. Si es esencial una alta dilución, entonces todas las soluciones tampón
pueden complementarse con proteína, como albúmina de suero bovino y/o el
plástico, y las superficies de vidrio en contacto con las soluciones diluidas pueden
recubrirse con una capa de silicona para minimizar la adsorción de proteínas.
B. Medición de la concentración relativa de Ag/AB, titulación
una. Título de equivalencia Ag/AB clásico por precipitación en

líquido.Un análisis completo de precipitación de equivalencia en
líquido requiere una cantidad relativamente grande de antisuero,
así como de Ag. Para ser cuantitativamente preciso con este
enfoque, uno debe tener un antisuero razonablemente
monoespecífico y hacer una curva completa de precipitación
desde el exceso de AB hasta el exceso de Ag. El pico de
precipitado ocurre cerca de la equivalencia molar entre Ag y AB.
Este pico se localiza analizando la cantidad de precipitado. El
precipitado puede lavarse para eliminar las moléculas
contaminantes y luego disolverse en álcali. A continuación, el
contenido de proteínas se puede estimar mediante numerosas
técnicas. De esta forma, el título de Ag puede relacionarse con el
título de AB por la cantidad de dilución necesaria para que las dos
soluciones reaccionaran al máximo, es decir, en su punto de
equivalencia. Si las soluciones de antisuero y Ag son complejas,
Figura 1.4.Una prueba de equivalencia Ag/AB en agar es un requisito previo necesario para cualquier prueba exitosa de doble difusión de
Ouchterlony. Se perforan conjuntos paralelos de pocillos en el mismo medio de agar en el que se realizará posteriormente una prueba final
"para publicación". Se tiene cuidado de espaciar los pocillos de manera idéntica al espacio futuro del patrón de prueba final. Se agrega una
cantidad constante de antisuero a un nivel central de pocillos. Se colocan diluciones en serie de Ag en niveles paralelos de pocillos, y se
permite que los Ag y los AB se difundan juntos durante 1 a unos pocos días. Las líneas de precipitación más nítidas se forman entre las
concentraciones de equivalencia de Ag y AB; un Ag puro tendrá una o dos mejores diluciones formando una línea nítida que se intensificará
en el transcurso de unos pocos días. En una mezcla compleja, la dilución de equivalencia de cada Ag puede ser diferente; Inicialmente,
varias diluciones mostrarán líneas nítidas, pero con el tiempo, el exceso de Ag o AB se indica mediante un desenfoque de las líneas de
precipitación. El desenfoque es más realzado por la tinción.
b. Equivalencia Ag/AB en agar.La equivalencia de Ag y AB en agar es

determinado por una combinación de la concentración y el coeficiente de difusión de
la Ag. La relación de equivalencia adecuada se puede determinar mediante una
dilución en serie de Ag en una serie lineal de pozos de prueba de Ouchterlony
paralelos (Fig. 1.4). Los pocillos con títulos equivalentes de Ag y AB producen una línea
de precipitación fina y nítida que no se mueve con el tiempo. A ambos lados de esta
relación de equivalencia, el exceso de Ag o AB crea una línea de precipitación inestable
que se espesa y se vuelve borrosa con el tiempo. La mayoría de las ilustraciones
inmunológicas deficientes de las reacciones de Ouchterlony en los trabajos de
investigación se deben a que no se realizó esta prueba de equivalencia antes de una
prueba final "para publicación".
Figura 1.5.Microtitulación para determinar el volumen de antisuero y Ag portador necesarios para lograr la precipitación total de
una muestra de Ag en una reacción de precipitación de fluidos. Esta técnica se lleva a cabo en tubos de microcentrífuga. Se añade
una cantidad fija de Ag portador (5-10 #g es suficiente) a cada tubo. Un objetivo adicional de este experimento preliminar es
encontrar una cantidad adecuada de Ag portador que proporcione una cantidad manejable de precipitado que pueda verse en el
fondo del tubo después de la centrifugación, lavado por resuspensión en PBS y repelido varias veces sin pérdida de precipitado. Se
añaden volúmenes crecientes de antisuero a la serie de tubos; se da tiempo para que se forme el precipitado y se centrifuga fuera de
la solución. Luego, se analiza el sobrenadante para ver si queda Ag en la solución utilizando cualquier micrométodo disponible, como
QIEP. El volumen de antisuero que precipita completamente la cantidad portadora de Ag permite calcular una cantidad de
equivalencia AB. Utilizando un múltiplo del volumen de equivalencia de antisuero (4 x 32 = 128
# 1) proporciona un sistema de precipitación líquida que siempre producirá al menos el precipitado de trabajo mínimo con el
portador Ag (tubo a la izquierda). Esto protege contra el exceso de AB. Este sistema tiene la capacidad de precipitar el triple de Ag
"desconocido" sin dejar nada en solución (tubo a la derecha). Si solo el Ag desconocido se marca con radiactividad, el precipitado
puede analizarse por diversos medios para establecer la naturaleza y el alcance del marcaje.
3. Estimación cuantitativa de la concentración
A. Técnicas de precipitación (equipo mínimo, nivel de instrucción)
una. Precipitación fluida.La estimación analítica de precipitados mediante la

precipitación en fase líquida de Ag y AB es la reacción inmunológica más sencilla
de interpretar. Suele llevarse a cabo utilizando una dilución fija de antisuero
Página 16
y variar la dilución de Ag desde una concentración de exceso de Ag hasta una

concentración de exceso de AB. La dilución de la solución de Ag en el pico de la
curva de precipitación es una medida relativa del título de Ag. Cuanto mayor sea
el título de Ag en la muestra original, más se debe diluir para alcanzar el pico en
una curva de precipitación.
Cuando el título relativo de la solución de Ag es la principal
información deseada, esta técnica no es el método recomendado;
sin embargo, el análisis de precipitinas fluidas puede ser un
complemento valioso para el análisis cualitativo de un Ag
(Wojchowski et al., 1986). Cuando se desea el título de
equivalencia aproximada de un antisuero, es posible utilizar
técnicas distintas de una curva de precipitación líquida a gran
escala para estimarlo. Por ejemplo, si la información principal que
se busca es la capacidad de un antisuero para precipitar
completamente un Ag, se puede hacer una microtitulación desde
el exceso de Ag hasta la equivalencia de Ag en pequeños tubos de
microcentrífuga de 250 µ1 (Fig. 1.5). El criterio para la
precipitación completa sería no dejar Ag en solución. El Ag que
queda en la solución se puede medir mediante un ensayo más
sensible como QIEP o ELISA.
Armado con el conocimiento de cuánto AB es necesario para
precipitar un Ag en solución, uno puede proceder a estudiar la síntesis y
el procesamiento posribosómico de una proteína. El sitio de tejido u
órgano de síntesis de un Ag puede explorarse de esta manera. El cuerpo
graso se identificó como el sitio de síntesis de vitelogenina en el artículo
seminal utilizando este enfoque (Pan et al., 1969). Marcaje con
aminoácidos 3H o 14C (Pan, 1977; Hagedorn et al., 1978; deBianchi et al,
1983; Brookes, 1986; Borovsky y Whitney, 1987) o 3sS-metionina (Chen et
al., 1978; Brennan et al. ., 1982; Isaac y Bownes, 1982; Kawooya et al.,
1986; Peferoen y DeLoof, 1986; Wojchowski et al, 1986) para la síntesis
de proteínas, 32p para la fosforilación (Masuda y Oliveira, 1985; Della-
Cioppa y Engelmann, 1987 ) y 2-(3H)-manosa para la unión de
oligosacáridos (Kunkel et al., 1980; Wojchowski et al., 1986) se ha
combinado con inmunoprecipitación y conteo de centelleo o análisis
fluorográfico de los precipitados después de SDS-PAGE. Este método de
inmunoprecipitación de una macromolécula marcada se ha convertido
en un enfoque preferido para analizar la síntesis, estructura y función de
proteínas.
b. La prueba del anillo.La prueba más simple para la presencia de un Ag (o un

AB) que da una respuesta cuántica a si Ag está ausente o presente en un
solución (o si existe un AB en un antisuero para una solución de Ag) es la prueba

del anillo. En este ensayo se superpone, en un tubo estrecho, una solución densa
(ajustada al 5% de sacarosa) de Ag (o AB) con una solución ligera (sin sacarosa) de
desconocido a ensayar. En una respuesta positiva, se acumula un precipitado en
la interfase de las dos soluciones en media hora (Fig. 1.6). La interfaz se ve de
canto contra una fuente de luz y se compara con un tubo de control que tiene la
solución de Ag (o AB) desconocida reemplazada por PBS. Una reacción
fuertemente positiva produce un tapón grueso de precipitado en una hora.
Figura 1.6.La prueba del anillo es

una prueba simple y relativamente
rápida de inmunología
reactividad que se lee a simple
vista como positiva o negativa
frente a un tubo de control sin
Ag reactivo en él. La solución
de fondo de AB se hace más
densa mediante la adición de
sacarosa o glicerol. La solución
superior se superpone
cuidadosamente y se anota la
posición de la interfaz
inicialmente nítida. Ag y AB se
difunden juntos y precipitan en
su interfase líquida. En una
"prueba positiva", una
precipitación es fácilmente
visible en la interfase en media
hora.
Este ensayo rápido puede ser útil para evaluar si el suero de una inmunización de
un animal en particular con un Ag es un éxito o un fracaso, antes de intentar una
evaluación más cuidadosa del antisuero. También ha sido utilizado por algunos
autores para analizar fracciones cromatográficas en busca de un Ag antes de agrupar
las fracciones (Borovsky & Whitney, 1987). Para una respuesta sí/no, la prueba circular
es costosa si el antisuero o Ag es valioso, ya que la prueba se basa en la observación
de un precipitado que requiere volúmenes relativamente grandes de Ag y antisuero
en comparación con otros ensayos que se enumeran a continuación. Sin embargo, si
el tiempo o los suministros inmunológicos son los factores más importantes, es útil
tener este ensayo disponible.
B. Estimación basada en la difusión de la concentración de Ag
una. Oudin unidimensional, difusión única.Oudin ideó la medida cuantitativa

más simple del título de Ag mediante difusión en agarosa.
Página 18
(Becker et al., 1951). Esta es una técnica simple pero elegante que requiere
muy poco equipo especializado. Un investigador podría realizar este ensayo
con un bajo presupuesto y lograr determinaciones precisas y de alta
sensibilidad. La teoría subyacente a la determinación del coeficiente de
difusión de Ags utilizando esta técnica también la proporciona Becker y
asociados (1951). Los alumnos de un laboratorio de enseñanza pueden
realizar esta prueba con una alta proporción de aciertos. Una ventaja de la
técnica es que no tiene que leerse en ningún momento específico después
del inicio de la reacción y no requiere productos químicos o tintes especiales
más allá del agar purificado o tampón de agarosa, sal y fosfato. El único
equipo especializado que se necesita son los tubos en los que se lleva a cabo
la reacción. Estos tubos se pueden fabricar a partir de 1/4" o3/16"stock de
tubos de vidrio blando, disponible en la mayoría de las casas de suministros
científicos. La fabricación de los tubos es sencilla, implica cerrar un extremo
de cada tubo con un mechero Bunsen o más rápidamente con un soplete de
acetileno.
Figura 1.7.El ensayo unidimensional de
difusión única de Oudin. El antisuero se coloca
en una capa de gel de ionagar o agarosa y se
considera relativamente estacionario. Una
dilución de Ag, de mayor concentración que la
cantidad equivalente de AB, sirve como el
único componente de difusión dominante. La
solución de Ag se agrega a la parte superior
del agar en un tiempo cero registrado y la Ag
comienza a difundirse en la fase de agar AB. Se
ve un frente de precipitaciones avanzar con el
tiempo. Para cada tubo individual, la distancia,
d, de nigración frontal dividida por la raíz
cuadrada del tiempo transcurrido, t, da un
valor constante, k. Este valor k es proporcional
a la concentración de Ag, y una serie de
diluciones proporciona una curva de
calibración de k frente a [Ag] para determinar
títulos relativos o absolutos de Ag
desconocido.
En la técnica de Oudin, AB se dispersa uniformemente en agarosa al 0,5 % y

se coloca en un tubo estrecho. El AB en agar se cubre con una solución de Ag que
debe estar al menos más concentrada que el título de equivalencia del AB en
agar. El Ag se difunde en el gel y forma una zona de precipitado visible cuando el
Ag libre se encuentra y precipita con su AB correspondiente (Fig. 1.7). La
velocidad a la que este frente de precipitado desciende por el tubo es
proporcional tanto a la concentración como al coeficiente de difusión del Ag. La
tasa de migración frontal cambia de manera predecible,
siendo proporcional a la raíz cuadrada del tiempo. Por esta razón, todas las
muestras deben aplicarse aproximadamente al mismo tiempo, incluidos los
estándares. Los tubos se cubren con aceite mineral para evitar la evaporación y
se incuban a temperatura constante en posición horizontal.
Deben evitarse los golpes de calor o los cambios de temperatura prolongados, ya
que la velocidad de difusión depende de la temperatura y la densidad del precipitado
será diferente a diferentes temperaturas. Los artefactos de temperatura pueden dar la
apariencia de un frente artificial que podría resultar confuso en un antisuero
complejo. Afortunadamente, los frentes Ag/AB se mueven con el tiempo, pero los
"frentes" del artefacto de temperatura permanecen en su lugar. Las concentraciones
desconocidas de Ag generalmente se determinan por comparación con las curvas
estándar de concentración absoluta o relativa conocida que se ejecutan al mismo
tiempo. Las curvas estándar son altamente reproducibles, dadas condiciones técnicas
y físicas constantes.
Si el antisuero que se utiliza es complejo y la solución de Ag contiene varios
de los Ag que reaccionan con el antisuero, esta técnica está plagada de
problemas, ya que varios frentes de precipitado se moverán a lo largo del tubo y
es posible que no se puedan distinguir. La técnica se limita a soluciones de Ag y
AB de títulos relativamente altos, ya que el resultado es un precipitado visible que
no puede mejorarse con tinciones de proteína.
A pesar de su sensibilidad relativamente baja, la técnica de Oudin se ha
utilizado en numerosos estudios de insectos para una variedad de
propósitos. Antes de la llegada de QIEP, la prueba de Oudin era el método
preferido para medir la concentración de un Ag en una solución, ya fuera
una muestra de suero (Kunkel y Lawler, 1974; Pan, 1977; Tojo et al., 1980,
1981). ; Teller et al., 1983), un extracto de tejido (Ogawa y Tojo, 1981; Tojo et
al., 1980, 1981), una fracción de gradiente de sacarosa (Kunkel y Lawler,
1974) o una fracción de columna de cromatografía (Duhamel y Kunkel , 1983,
1987). La técnica sigue siendo útil, ya que no requiere que las muestras se
diluyan, desalen o dialicen antes de la prueba, como suele ser necesario con
QIEP.
b. Inmunodifusión radial.Esta técnica es bidimensional.

análogo de la técnica de Oudin (Inglid, 1983). Se vierte una placa de AB en agar y
se cortan pocillos de Ag en la placa. Se desarrolla un círculo de precipitado
alrededor del pozo a medida que el Ag se difunde y se encuentra con AB; el
frente circular se ensancha con el tiempo (Fig. 1.8). Funciona sobre la misma base
teórica pero no logra la misma elegancia cuantitativa que el Oudin, ya que el
reservorio de Ag suele ser limitado y el sistema se queda sin Ag. Esto da como
resultado una desviación del comportamiento teórico ideal, que depende de un
reservorio de Ag infinito. Sin embargo, el agotamiento de Ag
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proporciona un punto final para el ensayo ya que el anillo deja de crecer y se

oscurece visiblemente en su borde, lo que indica que ha terminado de
expandirse. El momento de este punto final depende del coeficiente de difusión y
la concentración de Ag y AB, pero generalmente ocurre dentro de unos pocos
días. Este retraso en la capacidad de leer el ensayo reserva esta técnica para
aplicaciones en las que el análisis de datos no es una prioridad. La concentración
de Ag es proporcional al diámetro del frente de precipitado. La concentración de
Ag generalmente se calcula a partir de una curva estándar establecida por
separado o de estándares ejecutados con muestras desconocidas. Las
concentraciones en el rango de microgramos son medibles. un solo3¼ x 4"placa
puede acomodar hasta 20 incógnitas.
Figura 1.8. Radial
La inmunodifusión es
bidimensional, único-
ensayo de difusión de
naturaleza similar a la prueba
de Oudin. Al igual que en la
prueba de Oudin, AB suele
servir como fase estacionaria
y Ag suele ser la fase móvil o
dominante. difundiendo
componente. El antisuero es
dispersa en agar y recubre un
portaobjetos o una placa de Petri. Las
muestras de Ag se colocan en pocillos
cortados en la superficie del agar. Ag
se difunde radialmente,
formando un frente precipitado
medida que avanza. El sistema se queda sin Ag y se desarrolla un borde más oscuro de precipitado en el borde del
precipitado final. El diámetro de este disco de precipitado se determina después de la tinción y se compara con una curva
estándar establecida para ese antisuero mediante un conjunto previo o simultáneo de diluciones en serie de títulos de Ag
conocidos.
Esta técnica requiere menos equipo que la prueba de Oudin; se puede

realizar en un portaobjetos de microscopio o en placas de Petri desechables
o reutilizables. Es casi tan costosa en antisueros como la prueba de Oudin si
se evalúa en la etapa de precipitación sin teñir. Sin embargo, es posible leer
las placas de inmunodifusión radial después de la tinción. Por lo tanto, se
puede lograr un aumento sustancial en la sensibilidad y la economía del
antisuero mediante la dilución del antisuero por debajo del nivel de
visibilidad conveniente del precipitado no teñido. Se requiere
intrínsecamente menos Ag para ejecutar el ensayo, ya que el reservorio de
Ag está limitado al volumen que cabe en el pozo de muestra. Los antisueros
complejos y las soluciones de Ag presentan el mismo problema de confusión
de los frentes de precipitación que con la prueba de Oudin, aunque si el Ag
es una enzima para la que se dispone de una reacción de tinción
colorimétrica adecuada,
Varios estudios de proteínas de suero de insectos han encontrado que

esta técnica es económica, sensible y efectiva para cuantificar los cambios en
la concentración de proteínas durante el desarrollo (Irie y Yamashita 1983;
Marinotti y deBianchi, 1983; deBianchi y Marinotti, 1985; Haunerland y
Bowers, 1986; Trost y Goodman, 1986).
C. Técnicas electroforéticas de inmunoprecipitina
Figura 1.9.Cuantitativo
inmunoelectroforesis
(QIEP) o IEP "cohete". El
anticuerpo se dispersa
uniformemente en la fina capa
de agarosa del portaobjetos. La
cantidad de Ag colocada en
cada pozo se puede estimar por
la cantidad de área AB que se
barre en un "cohete" de
precipitación por el
electroforéticamente
Ag propulsado. Este método,
como la difusión radial, tiene
un punto final autoimpuesto
que ocurre cuando todo el Ag
en el pozo ha reaccionado con
su cantidad equivalente de
AB.
una. Inmunoelectroforesis cuantitativa, QIEP o IEP "cohete".El problema de las

determinaciones cuantitativas de soluciones complejas de Ag se resolvió hasta
cierto punto con la llegada de QIEP (Laurel, 1972; Verbruggen, 1975). Las ventajas
de esta técnica son su alta sensibilidad (ng de Ag) y su capacidad para cuantificar
una gran serie de muestras a la vez. Rutinariamente, se pueden procesar 50
muestras por portaobjetos de 3¼ x 4" en una cámara que contendrá múltiples
portaobjetos. La técnica tiene un punto final, al igual que la inmunodifusión
radial, y por lo tanto no se desarrollará en exceso. QIEP agrega al método de
difusión radial la fuerza de electroforesis (Fig. 1.9). El equipo involucrado puede
ser moderadamente costoso y puede impedir el uso de esta técnica para
laboratorios que no están debidamente equipados. Se requiere una fuente de
alimentación de electroforesis estándar, así como una cámara de electroforesis
horizontal. La electroforesis se lleva a cabo a un pH de 8,3, que está lo
suficientemente cerca del pI medio de las inmunoglobulinas para que
permanezcan aproximadamente estacionarias. Siempre que el Ag sea móvil a ese
pH (y la mayoría lo son), esto da como resultado un arco de precipitación en
forma de cohete que se deposita en la agarosa. Si el Ag no es lo suficientemente
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móvil a pH 8,3, las proteínas pueden tener que ser carbamiladas antes de la
electroforesis (Dillwith y Chippendale, 1984). Uno de los beneficios de la técnica
QIEP es que todo el Ag en el pozo de muestra se ve obligado a interactuar con AB
relativamente rápido, dentro de varias horas para Ag razonablemente móvil. El
volumen de agar que se elimina de AB por el movimiento de Ag es igual al
volumen de equivalencia para esa cantidad de Ag. Aunque con concentraciones
más altas de antisueros, los "cohetes" de precipitina son inmediatamente visibles,
el procedimiento de rutina general para obtener la máxima sensibilidad con esta
técnica es usar una concentración de AB más baja en el agar y teñir los cohetes
después de secar el agar sobre el portaobjetos. Esta técnica es unas 100 veces
más sensible para medir Ag que la inmunodifusión radial, especialmente para
moléculas de Ag grandes que quedan atrapadas por la difusión interna de AB en
el pocillo de la muestra a bajas concentraciones en inmunodifusión radial. Las
soluciones complejas de antisueros y Ag a menudo se resuelven en cohetes de
diferentes densidades, de modo que con un poco de experimentación y lógica,
los componentes de un sistema complejo se pueden identificar y medir al mismo
tiempo.
QIEP se ha utilizado para analizar el título de numerosas proteínas
de insectos en fluidos o tejidos fisiológicos. Se ha seguido el título de la
proteína vitelogenina en hemolinfa y tejidos de animales normales o
tratados experimentalmente para numerosas especies de insectos
(Greenberg et al., 1978; Hagedorn et al., 1978; Kunkel, 1981; Buschor y
Lanzrein, 1983; Koenig y Lanzrein, 1985; Kunkel y Nordin, 1985; Benford
y Bradley, 1986; Oliveira et al., 1986; Zhu et al., 1986; Imboden et al.,
1987). Varias otras proteínas séricas, incluidas las proteínas de
almacenamiento (deBianchi y Marinotti, 1984; Levenbook y Bauer, 1984;
Ryan et al., 1985b; deKort y Koopmanschap, 1987), proteína asociada a la
diapausa (Dillwith et al., 1985) y lipoforina ( Venkatesh y Chippendale,
1986) pueden ser monitoreados usando QIEP-.
b. Estimación QIEP de síntesis y procesamiento de proteínas.Utilizando un antisuero

monoespecífico para un Ag de interés, es posible realizar un estudio de incorporación
de un marcador radiactivo en un Ag que luego se analiza mediante QIEP en el que el
Ag marcado se precipita en un cohete (Hagedorn et al., 1978; Levenbook y Bauer ,
1984). Para eliminar los recuentos falsos de los componentes de la muestra
electroforéticamente inmóviles, el gel del pocillo de muestra se mantiene libre de AB
como en el QIEP de cohete fusionado (Fig. 1.13, pocillos 1 y 2). La cantidad máxima de
precipitado en cada cohete se puede aumentar utilizando una mayor concentración de
antisuero en el gel AB. Como regla general, cada vez que se duplica la concentración
de antisuero, se reduce a la mitad el área de la rúcula creada por una determinada
cantidad de Ag. Las rúculas que contienen de 2 a 10 ng de proteína no son
irrazonable. Siempre se debe tener cuidado en esta técnica para ejecutar el paso
electroforético el tiempo suficiente para eliminar todos los sustratos y proteínas no
reactivos del gel. El "cohete" de precipitación visible se corta de la losa de gel de agar
en el portaobjetos después del paso de electroforesis y se disuelve en una solución de
centelleo para el recuento. Este método se comparó favorablemente en precisión con
las técnicas de precipitación en líquido (Hagedorn et al., 1978).
D. Técnica de inmunotransferencia cuantitativa (sensibilidad máxima)
La inmovilización de Ag o AB en un soporte como un pocillo de plástico de una placa de microtitulación o un filtro de nitrocelulosa y el
posterior sondeo de esa proteína inmovilizada con AB o Ag, respectivamente, es una técnica rápida y sensible para cuantificar Ags.
Cuando el soporte es un filtro de algún tipo, la técnica se denomina transferencia de puntos (Hawkes et al., 1982; Jahn et al., 1984). El
sondeo de la proteína inmovilizada se puede realizar mediante una sonda unida a fluorescencia, enzima o radionúclido. La sonda principal
suele ser un AB o una lectina (Haunerland et al., 1986; Marinotti y Bianchi, 1986). A menudo, la sonda AB no se puede visualizar
directamente de manera conveniente. A menudo se utiliza un segundo reactivo para todo uso, como un segundo AB, que reconoce la
clase de especie del AB primario, o la proteína A, una proteína bacteriana que se une a las inmunoglobulinas. Este reactivo secundario
tiene un grupo informador unido covalentemente, como una molécula fluorescente o un radionúclido o una enzima cromogénica que
puede localizarse mediante ensayos convenientes. Cuando el soporte es una placa de microtitulación y el método de desarrollo de la
sonda es a través de un AB ligado a enzimas, la industria de desarrollo que rodea a esta tecnología ha denominado a la técnica ELISA
(ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas) (ver Capítulo 2). Esta técnica funciona mejor con antisueros monoespecíficos y es
particularmente adecuada para mAb, ya que proporciona una inmovilización artificial para el Ag, obviando la importancia del
entrecruzamiento. Cuando el soporte es una placa de microtitulación y el método de desarrollo de la sonda es a través de un AB ligado a
enzimas, la industria de desarrollo que rodea a esta tecnología ha denominado a la técnica ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a
enzimas) (ver Capítulo 2). Esta técnica funciona mejor con antisueros monoespecíficos y es particularmente adecuada para mAb, ya que
proporciona una inmovilización artificial para el Ag, obviando la importancia del entrecruzamiento. Cuando el soporte es una placa de
microtitulación y el método de desarrollo de la sonda es a través de un AB ligado a enzimas, la industria de desarrollo que rodea a esta
tecnología ha denominado a la técnica ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas) (ver Capítulo 2). Esta técnica funciona mejor
con antisueros monoespecíficos y es particularmente adecuada para mAb, ya que proporciona una inmovilización artificial para el Ag,
obviando la importancia del entrecruzamiento.
4. Análisis de Complejidad
El análisis de la complejidad es una característica particularmente importante de

la inmunología. Con el antisuero(a) apropiado, un investigador puede identificar y
medir el título de los Ags principales y secundarios en un extracto. Esto es útil
para seguir los cambios en títulos de Ag particulares durante un ciclo fisiológico o
de desarrollo o durante la purificación de Ags particulares. Las técnicas
particulares son más o menos útiles a este respecto.
A. La prueba de Ouchterlony, doble difusión

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La inmunodifusión doble, o la prueba de Ouchterlony, no suele ser la técnica de elección para demostrar la
complejidad, pero es una técnica poderosa cuando se aplica correctamente. Desafortunadamente, la técnica a
menudo se lleva a cabo en condiciones en las que se minimiza la capacidad de medir la complejidad. Su homónimo
(Ouchterlony, 1968) describe cómo maximizar la visualización de la complejidad con Ouchterlony. Esta
maximización implica asegurarse de que los reservorios de Ag y AB sean lo suficientemente grandes para
mantener cantidades infinitas de reactivos de manera efectiva. En ese caso, el lugar del gel en el que se logra la
equivalencia de Ag y AB tenderá a ser estacionario, ya que el precipitado de un par Ag/AB en particular se acumula
en esa línea del gel durante más tiempo. Esta situación rara vez se puede lograr con Ouchterlony ejecutado en un
portaobjetos de microscopio en el que los pozos tienden a ser pequeños (3-10 #1) y la distancia entre pozos
también es pequeña. En la mayoría de los casos, un antisuero complejo utilizado en Ouchterlony producirá un
patrón de líneas de precipitación difícil de interpretar (fig. 1.10 (1)). La mayoría de los pares Ag/AB estarán
desequilibrados y producirán líneas de precipitación curvadas hacia el pozo Ag o el pozo AB. Es raro que todos los
anticuerpos de un antisuero complejo estén lo suficientemente equilibrados para producir líneas de precipitación
rectas y nítidas como en (Fig. 1.10 (2)). Para obtener la máxima resolución, se sugiere que la forma del patrón del
pozo sea rectangular; el gel debe verterse en una placa de Petri y los pocillos deben colocarse lo suficientemente
separados para permitir que varios pares de Ag/AB formen líneas de precipitación distintas. Las mayores distancias
entre pozos hacen que los títulos de AB y Ag más altos en los pozos de muestra sean necesarios para lograr
precipitados visibles en el gel. Las líneas de precipitación resultantes se pueden mejorar mediante una serie de
modificaciones. La colocación de un componente osmóticamente activo, como una solución de dextrano de alto
peso molecular, en los pocillos de reactivos evitará que el pocillo se seque al perder líquido en el gel. Esto
mantendrá por más tiempo la aparente fuente infinita de reactivos en los pozos. La reacción de precipitación sin
teñir es más intensa a temperaturas más frías, y la densidad del precipitado puede mejorarse mediante la inclusión
de PEG6000 (Verbruggen, 1975) en el agar. La colocación de un componente osmóticamente activo, como una
solución de dextrano de alto peso molecular, en los pocillos de reactivos evitará que el pocillo se seque al perder
líquido en el gel. Esto mantendrá por más tiempo la aparente fuente infinita de reactivos en los pozos. La reacción
de precipitación sin teñir es más intensa a temperaturas más frías, y la densidad del precipitado puede mejorarse
mediante la inclusión de PEG6000 (Verbruggen, 1975) en el agar. La colocación de un componente osmóticamente
activo, como una solución de dextrano de alto peso molecular, en los pocillos de reactivos evitará que el pocillo se
seque al perder líquido en el gel. Esto mantendrá por más tiempo la aparente fuente infinita de reactivos en los
pozos. La reacción de precipitación sin teñir es más intensa a temperaturas más frías, y la densidad del precipitado
puede mejorarse mediante la inclusión de PEG6000 (Verbruggen, 1975) en el agar.
Varios estudios de Ags de insectos han utilizado la técnica de Ouchterlony de

manera efectiva para demostrar la complejidad antigénica de fuentes de Ag
particulares y probar la pertenencia de un Ag particular a una etapa particular.
Por ejemplo, usando antisueros complejos separados hechos contra suero de
langosta hembra y macho, se demostró que el principal Ag de vitelina de ovocito
de langosta reaccionaba solo con suero anti-hembra (Gellissen et al., 1976). Otro
enfoque que se utiliza a menudo es utilizar un monoespecífico
antisuero contra un Ag como la vitelina purificada a partir de huevos y luego muestran

a través de Ouchterlony que está presente en varias mezclas complejas como el
extracto de huevo y la hemolinfa femenina pero no en la hemolinfa masculina (Mundal
y Law, 1978).
Figura 1.10.Ensayo de doble
difusión de Ouchterlony.
(1) Suero desequilibrado. Las
múltiples líneas de
precipitación Ag/AB no son
rectas y se curvan alejándose
de la fuente del componente
en exceso. (2) Suero
equilibrado. Las múltiples
líneas de precipitación Ag/AB
son rectas y nítidas. Esto ocurre
cuando cada Ag y AB tienen
una equivalencia aproximada.
Equilibrado
complejo antisueros para
Ouchterlony son difíciles de
lograr de forma rutinaria.
B. Análisis electroforético de la complejidad inmunológica
una. Inmunoelectroforesis (IEP).Con mucho, la forma más eficaz de mejorar el análisis de la complejidad antigénica es
combinar o seguir un paso o pasos electroforéticos con un paso inmunológico. El IEP clásico separa Ags en agarosa mediante
electroforesis en un portaobjetos antes de colocar los anticuerpos en un canal paralelo al carril de electroforesis. La
preseparación electroforética, seguida de la difusión hacia un reservorio de antisuero, proporciona focos separados de
difusión para Ag separables electroforéticamente, y esto mejora la resolución al reducir la congestión de bandas que se
observa en Ouchterlony (Fig. 1.11, arriba). En algunos casos, un antisuero complejo puede proporcionar evidencia valiosa de
la participación de un antígeno de una mezcla en un proceso fisiológico como la coagulación del suero de insectos (Bohn y
Barwig, 1984). La absorción de antisueros complejos con soluciones de Ag menos complejas puede dar como resultado
antisueros más específicos con nombres como específicos de mujeres (Telfer, 1954; Pan y Wyatt, 1971; Tanaka, 1973; Kunkel y
Pan, 1976; Mundall y Law, 1979 ;Ogawa y Tojo, 1981), antisuero específico para larvas (Kunkel y Lawler, 1974) o específico
para huevos (Yamashita, 1986) (Fig. 1.11, abajo). La absorción de un antisuero implica la precipitación de la mayoría de los AB
comunes a una fuente de Ag heteróloga. En la situación más favorable, se espera que la fuente heteróloga difiera de la fuente
homóloga en uno o unos pocos Ags, de modo que el antisuero absorbido pueda retener AB hasta uno o solo unos pocos Ags.
antisuero específico de larva (Kunkel y Lawler, 1974) o específico de huevo (Yamashita, 1986) (Fig. 1.11, abajo). La absorción de
un antisuero implica la precipitación de la mayoría de los AB comunes a una fuente de Ag heteróloga. En la situación más
favorable, se espera que la fuente heteróloga difiera de la fuente homóloga en uno o unos pocos Ags, de modo que el
antisuero absorbido pueda retener AB hasta uno o solo unos pocos Ags. antisuero específico de larva (Kunkel y Lawler, 1974)
o específico de huevo (Yamashita, 1986) (Fig. 1.11, abajo). La absorción de un antisuero implica la precipitación de la mayoría
de los AB comunes a una fuente de Ag heteróloga. En la situación más favorable, se espera que la fuente heteróloga difiera
de la fuente homóloga en uno o unos pocos Ags, de modo que el antisuero absorbido pueda retener AB hasta uno o solo
unos pocos Ags.

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distintas Ags.
Figura 1.11.Inmunoelectroforesis
(IEP). La electroforesis previa de
una mezcla de antígenos en
agarosa se combina con un paso
posterior similar a la doble
difusión de Ouchterlony.
Después de la separación
electroforética en la primera
dimensión, se corta un canal en
el agar paralelo a la dirección de
la electroforesis y el antisuero
se añade a la artesa y se deja que se difunda y precipite con los Ags separados
electroforéticamente. En este ejemplo se muestra una mezcla de Ags que reacciona
con un antisuero crudo (canal superior) y un antisuero absorbido (canal inferior).
Figura 1.12.QIEP cruzado es la extensión

lógica de IEP a QIEP. La primera
dimensión se puede ejecutar de manera
similar al IEP de la Figura 1.11 anterior o,
para una mejor resolución, la primera
dimensión se puede realizar en un
aparato de placa de agarosa vertical u
horizontal. El trozo de agarosa del gel de
primera dimensión se monta en un
portaobjetos y se complementa con
agarosa que contiene AB como en QIEP.
La electroforesis de segunda dimensión
de la
Ags en ángulo recto crea "cohetes" de precipitación AG/AB con una densidad característica de precipitado.
Las soluciones de Ag complejas se pueden analizar con antisueros complejos usando este método. La
fusión de cohetes adyacentes se puede utilizar para identificar electromorfos o isozimas homólogos.
b. Variaciones sobre QIEP.La complejidad inmunológica se puede tratar de varias

maneras usando modificaciones a la técnica QIEP básica según Laurell (Laurell,
1972; Axelsen, 1983). Al igual que en el IEP, se puede combinar el paso de
detección inmunológica (QIEP) con un paso de separación previo, como
electroforesis en agarosa simple en placa o placa en la primera dimensión para
permitir que se resuelvan los Ags en la primera dimensión antes del paso QIEP
aplicado en ángulos rectos. (Figura 1.12). Por lo general, la primera dimensión no
se realiza en acrilamida u otros medios que no sean agarosa, porque existen
incompatibilidades de otros medios con la agarosa a menos que se tenga un
cuidado especial. Esta técnica, QIEP cruzada, se ha utilizado con eficacia en el
seguimiento y evaluación de la purificación de proteínas. Si un antisuero al crudo
la mezcla inicial está disponible, se pueden aplicar pasos de purificación y usar

QIEP cruzado para verificar en cada paso sucesivo cuánto se han reducido los
principales contaminantes (Barwig, 1985). En soluciones antigénicas
extremadamente complicadas, como el suero de lepidópteros y los extractos de
yema, este método se ha utilizado con eficacia para identificar y seguir los
diferentes componentes durante el desarrollo (Telfer et al., 1981).
Otro tipo de paso previo a QIEP es la simple difusión de las muestras en
pocillos adyacentes en agar simple durante unas horas antes de agregar el agar
AB al resto del portaobjetos. Este enfoque, llamado QIEP fusionado, da como
resultado la fusión de cohetes de precipitación de proteínas idénticas adyacentes
(fig. 1.13, pocillos 3 y 4). Esta fusión suele ser suficiente para confirmar la
existencia de múltiples reacciones Ag/AB en las muestras adyacentes (Storella et
al., 1985; Wojchowski y Kunkel, 1987). También se puede analizar un conjunto de
Ags con varias capas de antisueros más o menos específicos (Wojchowski et al.,
1986).
Figura 1.13.Fused QIEP es
una extensión lógica del
Prueba de doble difusión de Ouchterlony
para QIEP. Las muestras con
Los Ag potencialmente relacionados se
colocan en sus pocillos de muestra
individuales (1-6) cortados en una tira
basal de agar que contiene tampón de
electroforesis pero no antisuero. Se
permite que los Ags se difundan durante
un tiempo determinado
experimentalmente para permitir una
mezcla suficiente de los Ags. Se agrega
un gel antisuero, similar al de QIEP, al
resto del portaobjetos después de 2 h de
difusión, y las muestras se someten a
electroforesis en el agar antisuero. Ags
en pozos 3 y 4 representan
una reacción de identidad; forman una línea de precipitación continua similar a una línea de identidad en
la prueba de Ouchterlony. Ags en los pocillos 5 y 6 muestran una identidad parcial al formar un "espolón"
de precipitado en lugar de una línea continua. Las muestras 1 y 2, colocadas en sus respectivos pocillos
justo antes de la electroforesis, forman distintos "cohetes" de precipitina, cuya homología no se ha
probado, pero dejan partículas que contaminan la muestra en el gel que rodea el pocillo de la muestra.
C. PAGE electrotransferencia, Western blot.Una poderosa técnica que se ha agregado

al arsenal de técnicas para analizar la complejidad es la técnica de electrotransferencia
(Olmsted, 1981; Towbin et al., 1979). Esto combina la técnica cuantitativa de
transferencia de puntos con la transferencia electroforética de una muestra de Ag
unidimensional o bidimensional separada electroforéticamente (Fig. 1.14 (1)) a un
filtro de nitrocelulosa. Este filtro puede ser
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sondeado directamente con una solución AB específica o una solución de lectina

y los Ags reconocidos por fluorescencia ligada, reacciones de enzimas ligadas o
métodos de radiactividad ligada (Fig. 1.14 (2-4)). Se ha utilizado ampliamente en
la literatura de invertebrados para identificar péptidos específicos (Brock and
Roberts, 1983; Sharrock, 1983; Ryan et al., 1984, 1985a,b, 1986; Smith and Fisher,
1984; Osir et al., 1986) , para identificar vías de procesamiento (Wojchowski et al.,
1986; Della-Cioppa y Engelmann, 1987) e investigar mezclas complejas de Ag
(Cox, 1987). Además, los anticuerpos se pueden eluir de las hojas de nitrocelulosa
y la misma hoja se puede sondear con antisueros adicionales (Fig. 1.14 (3, 4))
(Legocki y Verma, 1980). Alternativamente, se pueden recuperar los anticuerpos
que reconocen una mancha o banda en particular, y estos se "purifican por
afinidad". se pueden usar anticuerpos para sondear transferencias Western
adicionales (Olmsted, 1981; Smith y Fisher, 1984). Esta última técnica permite una
capacidad ilimitada para clasificar la complejidad de las mezclas de Ag.
Figura 1.14.Un ejemplo de

electrotransferencia de PAGE, la
transferencia Western.
(1) O'Farrell (1975)
Electroforesis 2D de antígenos
por enfoque isoeléctrico en la
primera dimensión seguido de
SDS-PAGE en la segunda
dimensión. (2, 3) Los Ag
separados se transfieren por
transferencia electroforética a
una o más membranas de
nitrocelulosa y se prueban con
antisueros específicos. (4) Es
posible la eliminación del AB de
sondeo de la membrana de
nitrocelulosa, y se lleva a cabo
el resondeo del Ag aún unido
con otro AB.
5. Diferencias cualitativas y similitudes entre Ags
A. Técnicas de difusión para demostrar homologías cualitativas
una. Ouchterlony (equipo mínimo, nivel de instrucción).La técnica utilizada

con más frecuencia para demostrar la identidad o las desviaciones de la
identidad en dos Ags es la técnica de doble difusión de Ouchterlony.
(1965). Esta aplicación de la técnica de Ouchterlony funciona mejor con

antisueros monoespecíficos, ya que los antisueros complejos, como se sugiere en
la Sección III.D. 1.a, puede resultar confuso de interpretar. El Ag contra el que se
preparó el antisuero se denomina Ag homólogo. Un Ag' de una fuente diferente,
tal como un tejido, estadio o especie diferente, se denomina Ag heterólogo. Los
Ag se colocan en pozos periféricos y se les permite difundir hacia un pozo que
contiene un antisuero (Fig. 1.15 (1-3)). El cruce de las líneas de precipitación de los
dos sistemas sin ninguna indicación de interacción es una indicación de distinción
inmunológica (Fig. 1.15 (1)). La fusión completa de las líneas de precipitación es
una indicación de que los Ags homólogos y heterólogos en los dos pocillos de Ag
son idénticos, al menos al nivel de la capacidad de esta técnica para discernir la
identidad (Fig. 1. 15 (2)). Las desviaciones de la identidad se ven como "espuelas"
en el punto de fusión de las dos líneas de precipitación (Fig. 1.15 (3)). Dichos
estímulos son indicaciones de que falta un determinante en el Ag homólogo o
que ha cambiado drásticamente.
Figura 1.15.Comparación de doble difusión de Ouchterlony de Ags. Se coloca un antisuero

policlonal complejo o específico en un pocillo central de una losa de agaróstico y se deja que
interactúe con Ag que se difunde hacia él desde dos pocillos periféricos. (1) Demostración de
Ouchterlony de la falta de homología entre el antígeno A y el antígeno B. (2) Demostración de
Ouchterlony de la identidad completa del antígeno A con A'. (3)
Demostración de Ouchterlony de identidad parcial entre el antígeno A y A".
en el Ag heterólogo. Las jerarquías de estimulación se pueden desarrollar en una

matriz de similitud, y dichas matrices se han utilizado para construir árboles
filogenéticos.
La homología entre un Ag derivado de diferentes etapas o fuentes tisulares

dentro de una especie a menudo se puede establecer con esta técnica (Pan, 1977;
Chino y Yazawa, 1986; Venkatesh y Chippendale, 1986). Esto puede tomar la
forma de afirmaciones de identidad absoluta que a menudo se exageran, ya que
la prueba de Ouchterlony a veces no detecta diferencias de hasta un 5% de
diferencia en la secuencia de aminoácidos. A menudo se afirma, por ejemplo, que
la vitelogenina y la vitelina de un determinado
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las especies son inmunológicamente idénticas en base a la falta de estimulación

en el ensayo de doble difusión de Ouchterlony. Tal falta de diferencias de baja
resolución sobrevivirá hasta que sea probada o refutada por una prueba más
discriminatoria. El método inmunológico de elección para detectar desviaciones
mínimas de la identidad es la fijación de microcomplemento (MC/F).
La homología entre Ags de diferentes especies de insectos a menudo se ha
demostrado con la prueba de Ouchterlony. La simple existencia de Ag
homólogos en otros insectos se investiga con relativa facilidad utilizando la
técnica de Ouchterlony (Kunkel y Lawler, 1974; deBianchi et al., 1983; Dillwith et
al., 1985). Algunas proteínas, como las vitelogeninas, han cambiado rápidamente
durante la evolución (Kunkel y Nordin, 1985) y, por lo tanto, cuando se encuentra
una reacción cruzada, es evidencia de una relación filogenética relativamente
estrecha. Así, las observaciones de una fuerte reacción de identidad entre las
vitelogeninas deleucofeayNauphoeta(Imboden et al., 1987) y entrebombyxy
Filosamia(Izumi et al., 1980) son particularmente importantes para los
experimentos fisiológicos relacionados con los pares de especies. Homología
entre arilforinas purificadas particulares de dos especies "modelo" bien
estudiadas,Hyalophora cecropiaymanduca sexta, se determinó con antisueros a
la proteína de cada uno (Telfer et al., 1983). Dos proteínas séricas del lepidóptero
poco estudiadoPapilio polixenos (Ryan et al., 1986) demostraron ser homólogos a
dos proteínas séricas bien estudiadas deManduca sexta.Se demostró que las
arilforinas del gusano cogollero del maíz y del gusano cornudo del tabaco son
homólogas utilizando los datos disponibles. manducaAB (Haunerland y Bowers,
1986). De esta manera, una vez que se establecen las homologías entre
proteínas, alguien que trabaje en una especie relativamente poco estudiada
puede aprovechar la experiencia de investigadores anteriores sobre propiedades
y técnicas de purificación desarrolladas utilizando proteínas de especies "modelo"
bien estudiadas. La ausencia de una reacción cruzada inmunológica con la
prueba de Ouchterlony se debe considerar con cautela. La falta de reacción de la
LSP anticucaracha con el suero de grillo (Kunkel y Lawler, 1974) es una función de
la distancia filogenética esperable en una divergencia tan antigua. Similarmente,
Hialóforaymanduca Las arilforinas no reaccionan de forma cruzada conCalífora
arilforina (Telfer et al., 1983), niDrosophila melanogasterLSP2 reacciona de forma
cruzada con similares
proteínas tan alejadas comoceratitus(Mintzas y Reboutsicas, 1984). Por supuesto,
estos resultados negativos no se interpretan como prueba de que una proteína
funcional y relacionada homólogamente no existe en parientes lejanos a menos
que se disponga de evidencia inmunológica de que la reacción inmunológica
cruzada se extiende tan lejos. En algunos casos, se pueden usar otras técnicas
inmunológicas para establecer relaciones más distantes (consulte la Sección
III.E.2.c a continuación) (Ryan et al., 1984).
b. Demostración de Oudin de homología y propiedad física.

diferencias Apuede usarse antisuero monoespecífico para medir el grado de
homología entre dos Ag reactivos usando la prueba de Oudin (Hayden y
Becker, 1960). Si dos Ags tienen características físicas idénticas y difieren sólo
en la secuencia de aminoácidos, el grado de reacción cruzada inmunológica
se puede estimar comparando la densidad del frente de precipitina formado
por cada Ag con el mismo AB en tubos de Oudin. Este es un procedimiento
simple que se puede realizar con cualquier aparato de barrido de gel y da
como resultado comparaciones cuantitativas paralelas a las medidas
realizadas por MC'F (Kunkel y Lawler, 1974; Kunkel y Nordin, 1985).
El ensayo de difusión simple de Oudin también es capaz de detectar las
diferencias físicas o cambios en Ags que afectan el radio de Stoke y el
coeficiente de difusión (Becker et al., 1951). Dichos cambios deben ser
relativamente grandes para ser detectados, como la diferencia entre un
monómero y un dímero de Ag. Cuando la prueba de Oudin detecta
diferencias sustanciales en el coeficiente de difusión de dos Ags, se
contraindica el uso de pruebas de Oudin para comparar el grado de reacción
cruzada. Sin embargo, cabe señalar que esta contraindicación se aplica
también a las complicaciones creadas con otras técnicas inmunológicas. Es
posible en algunos de estos casos forzar a todos los Ag a un estado
monomérico uniforme con el propósito de realizar comparaciones
cuantitativas (Beverley y Wilson, 1982).
B. Técnicas electroforéticas para demostrar diferencias

cualitativas
una. Inmunoelectroforesis (IEP).El IEP se ha utilizado de forma eficaz para

demostrar las diferencias de movilidad electroforética de un Ag (Bohn y Saks,
1986). Cuando se realiza en agarosa purificada al 1%, la diferencia de
movilidad puede interpretarse como diferencias de carga, ya que las
macromoléculas globulares de hasta 1 megadalton no interactúan con la
matriz del gel. Si el pH del tampón para el paso electroforético se ajusta para
permitir una estimación del pH de inversión de la dirección del antígeno en
el campo electroforético, se pueden determinar los puntos isoeléctricos de
Ags (Kunkel y Pan, 1975).
b. QIEP fusionado.La identidad o similitud inmunológica puede ser

demostrado en QIEP en una técnica análoga a la formación de espolón de
Ouchterlony. Como en Ouchterlony, la atención a la posibilidad de artefactos es
esencial. Usando este procedimiento, la pérdida o cambio de un determinante en un
Página 32
Se puede detectar proteína durante un paso fisiológico, de desarrollo o

evolutivo. Cuando los Ags cambian sustancialmente, se puede notar una
disminución en la densidad de la línea de precipitación para el Ag heterólogo
además del espolón de precipitación (Fig. 1.13, muestras 5 y 6).
C. QIEP cruzado.Movilidad electroforética de Ags homólogos

difiere en cantidades sustanciales debido a diferencias alélicas o procesamiento
posribosomal. Las isoenzimas o electromorfos pueden analizarse para detectar
reacciones cruzadas inmunológicas permitiéndoles separarse lo suficiente en
electroforesis unidimensional de modo que produzcan bandas de tinción
separadas en su primera dimensión. Mediante electroforesis en una dimensión
de antisuero, se puede comprobar si son proteínas inmunológicamente distintas
o si son formas de movilidad diferentes de una proteína relacionada (fig. 1.12).
Tal técnica demostró siete estructuras oligoméricas aleatorias
inmunológicamente relacionadas de la proteína LSP de suero de insecto
hexamérica (Duhamel y Kunkel, 1983). Un estudio similar demanduca
demostraron que tres electromorfos de vitelogenina son inmunológicamente
idénticos (Imboden y Law, 1983). Por supuesto, tales electromorfos podrían tener
hasta un 5% de diferencia en la secuencia de aminoácidos y aún así no dar lugar
a una diferencia de espolón.
d. Ensayo de transferencia Western, homologías.La combinación de separación

electroforética e identificación inmunológica se combina en la técnica de
transferencia Western (Towbin et al., 1979). Esta técnica se ha utilizado en varios
casos para establecer la homología entre proteínas de insectos de diferentes
tejidos y etapas de desarrollo. Las etapas del procesamiento del péptido vitelina
fueron establecidas por Purcell y colaboradores (1986) elaborando un antisuero
monoespecífico para péptidos de etapa posterior y usando esos AB para sondear
péptidos precursores de etapa anterior. Las homologías entre proteínas séricas y
tisulares de diferentes especies (Brock y Roberts, 1983; Ryan et al., 1985a; Kozma
y Bownes, 1986) e incluso entre diferentes órdenes de insectos (Ryan et al., 1984;
Robbs et al., 1985 ) se han demostrado mediante transferencia de Western. La
homología no es un problema trivial, porque se ha demostrado que los insectos
tienen muchas proteínas séricas distintas con diferentes movilidades
electroforéticas nativas y pesos moleculares diferentes pero similares (Wyatt y
Pan, 1979). La reutilización de la transferencia de proteína original en
nitrocelulosa con diferentes anticuerpos de sondeo es una ayuda sustancial para
clasificar la complejidad de los geles (Legocki y Verma, 1980). Además, la
recuperación de AB a partir de transferencias de puntos de Ag específicos en
geles SDS PAGE o nativos 1D o 2D es extremadamente útil para asignar
homologías entre Ags.
C. Cuantificación de diferencias cualitativas
una. Reacciones cuantitativas de precipitación.El uso de reacciones de

precipitación líquida para comparar Ags es bastante sensible, y se ha
demostrado que sus resultados son paralelos a la técnica MC'F más
exigente y más sensible, pero la técnica de precipitación líquida
desperdicia soluciones de Ag y AB. La técnica realizada correctamente
requiere que se realice una curva de precipitación completa desde el
exceso de AB hasta el exceso de Ag para cada par AB/Ag (Leone, 1947). El
par homólogo Ag/AB dará la mayor integral de área bajo la curva de
precipitación. Esta técnica es relativamente fácil de realizar en un
laboratorio de enseñanza utilizando un espectrofotómetro simple, como
Bausch & Lomb Spectronic-20, para medir la turbidez de la reacción de
precipitina líquida. Las reacciones se desarrollan con relativa rapidez y se
puede realizar fácilmente una comparación entre dos Ags en el espacio
de un período de laboratorio. Sin embargo,
Se puede obtener mucha más información detallada sobre el grado de
relación inmunológica entre los Ag utilizando las jerarquías de espolones de
doble difusión de Ouchterlony (Ouchterlony, 1968), que son interpretables en
términos de determinantes compartidos y diagramas de Ven (Moore y Goodman,
1968). Por lo tanto, si dos técnicas o procesos diferentes destruyen un
determinante de proteína de un Ag particular, la comparación de las dos formas
modificadas con Ouchterlony puede demostrar si se han modificado o no dentro
del mismo determinante. Se pueden ordenar tres especies biológicas
relacionadas con Ag de reacción cruzada según la fecha en que compartieron un
Ag común, evidencia de su relación filogenética. Por ejemplo, los Dictyoptera
comparten un Ag, LSP (Kunkel y Lawler, 1974), lo que permite las afinidades
filogenéticas relativas de las cucarachas, termitas, y mantis depredadoras para
ser investigadas. A partir de la fuerza de las espuelas en esas comparaciones de
grupos, está claro que el LSP de termitas está más estrechamente relacionado
con el LSP de cucarachas de lo que se podría haber sospechado anteriormente y
que el LSP de las mantis depredadoras está más distantemente relacionado que
el de las termitas.
Hay una multidimensionalidad en los datos de estímulo de Ouchterlony que
no está disponible a través de otras técnicas de comparación. Además de estimar
la proporción de determinantes compartidos con un Ag relacionado, la prueba de
Ouchterlony permite comparar si los determinantes compartidos con otros dos
Ag relacionados son iguales. Se ha demostrado que la cuantificación a través del
tamaño de los espolones está altamente correlacionada con MC'F (Moore y
Goodman, 1968). También existe la posibilidad de cuantificar la
Página 34
reacciones de espolón de precipitina por barrido densitométrico de precipitinas

(Butler y Leone, 1968). Esta técnica se ha utilizado para demostrar la afinidad de
las vitelinas de lepidópteros dentro del género specioseCatocalla (Kunkel et al.,
1976), concluyendo que la reacción cruzada de vitelina puede ser útil para
diferenciar especies estrechamente relacionadas.
b. Fijación de microcomplemento (MC'F).La capacidad de MC'F para detectar

diferencias de un solo aminoácido entre dos proteínas homólogas la ha
establecido como la técnica inmunológica de elección en la detección y
cuantificación de diferencias cualitativas entre Ags. La técnica utiliza soluciones
diluidas de Ag que no necesitan ser antisueros puros y monoespecíficos. La
concentración de AB utilizada para lograr un pico de fijación del complemento
con diluciones del Ag homólogo se usa como referencia para calcular el aumento
necesario en la concentración de AB para obtener una curva de fijación
equivalente para un Ag relacionado. El logaritmo del aumento requerido en la
concentración se denomina distancia inmunológica (DI) y es proporcional a la
diferencia porcentual en la secuencia de aminoácidos. La reacción cruzada
inmunológica desaparece en una serie de Ags bien estudiados con desviaciones
en la secuencia de aminoácidos que se acercan al 30-40% (Champion et al.,
Aunque las mutaciones de un solo aminoácido en las enzimas se han
detectado consistentemente con MC'F (Champion et al., 1974), se debe agregar
que varias modificaciones posribosómicas, como la escisión de péptidos o la
fosforilación, también pueden tener grandes efectos en MC'F y carecer de ellos.
Por lo tanto, la identidad no es prueba de que un Ag heterólogo reconocido como
diferente por MC'F represente un producto génico distinto.
MC'F no se ha aplicado extensivamente a los problemas de insectos, pero cuando
se aplicó ha resultado en algunas conclusiones interesantes. Una importante proteína
sérica de los drosófilos se ha estudiado con MC'F, lo que sugiere conclusiones de largo
alcance sobre el mecanismo de evolución de las Drosophilinae hawaianas (Beverley y
Wilson, 1985; Lewin, 1985). Esta misma proteína se encuentra en todos los dípteros y
podría ser la base para una escala de tiempo unificada del reloj de proteínas de la
evolución de los dípteros (Beverley y Wilson, 1984). De manera similar, una importante
proteína sérica de cucarachas, LSP (Kunkel y Lawler, 1974), relacionada con las
arilforinas de insectos holometábolos, se estudió con MC'F (Kunkel y Nordin, 1985) en
una amplia selección de cucarachas que mostraron que LSP tiene una historia larga y
conservadora que incluye una fuerte relación con una proteína de suero de termitas.
Así, la relación inmunológica estudiada con este Ag en particular sostiene que las
termitas ocupan una posición dentro del orden Dictyoptera equivalente a las familias
de las cucarachas. Aunque algunos taxónomos argumentarían que la evolución de la
sociabilidad da a las termitas como grupo el derecho a ocupar
su propio orden, una perspectiva filogenética que se concentre en el tiempo y los

puntos de ramificación de las divergencias podría considerar que las termitas se
originaron como una familia social de cucarachas. Usando antisueros contra esta
y otras proteínas similares, se podría unificar el estudio filogenético de los
artrópodos en general. El uso de distancias inmunológicas proporciona otra
medida cuantitativa con la que estudiar la evolución del organismo.
IV. Conclusiones
Las técnicas descritas en este capítulo de ninguna manera agotan la variedad de

enfoques inmunológicos posibles para el estudio de insectos Ags. Son más bien
una lista seleccionada de los enfoques aplicados personalmente y con frecuencia
que, en mi opinión, han tenido un impacto útil en el campo de la bioquímica y
fisiología de los insectos. Incluso entre las técnicas discutidas, hay una gran
cantidad de variaciones que pueden ser útiles para responder una pregunta en
particular. Tales variaciones pueden obtenerse de la literatura general sobre
técnicas inmunológicas (ver Axelsen, 1983) después de que uno tenga una
comprensión firme de los principios básicos. Cada año aparecen nuevas técnicas
y productos, y la persona familiarizada con los procedimientos generales es más
hábil con nuevas técnicas o variantes de métodos antiguos.
Expresiones de gratitud.La búsqueda bibliográfica y la experiencia con las

técnicas antes mencionadas se obtuvieron y se pusieron en práctica bajo los
auspicios de subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias (DCB851778
I) y el Departamento de Agricultura de EE. UU. (86-CRCR-I-2153). Agradezco a
R. Dompencial, E. Bowdan y GI Kunkel por las lecturas del manuscrito.
Referencias
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Biografía. acta882: 427-436.
Figura 1.1.Determinantes antigénicos y antisueros policlonales. Un

antisuero policlonal se deriva de múltiples clones de células productoras de
AB y puede tener múltiples AB bivalentes distintos (A1, A2, A3, h4, B1,
. . . , D3) reaccionando a cada determinante (A, B, C, D) en un solo Ag nativo,
representado en el centro. Los determinantes A, B y C se representan en la superficie
de una proteína nativa globular polivalente. El determinante interno críptico, D, puede
estar enterrado dentro de un núcleo interno de la proteína nativa, y los anticuerpos
reactivos con este determinante latente pueden reaccionar con él solo cuando el Ag
está en un estado desnaturalizado. Cada animal inmunizado con el Ag puede producir
anticuerpos contra algunos o todos estos determinantes. La avidez de un antisuero
policlonal particular se determina mediante un promedio ponderado de frecuencia de
las afinidades individuales de la población de AB secretados.
Figura 1.2.La base de la precipitación de Ag por los AB es el entrecruzamiento y

la multivalencia. Una red extendida de entrecruzamiento puede resultar en un
precipitado. Todo Ag está ligado a otro Ag a través de un AB, y todo AB está
ligado a otro AB a través de un Ag. La estequiometría de Ag: AB para lograr la
precipitación completa de Ag es de aproximadamente 1: 1. Los requisitos
mínimos para la precipitación incluyen partículas con múltiples subunidades que
tienen un solo determinante (derecha) o múltiples determinantes en una sola
partícula (izquierda).
Figura 1.3.Equivalencia clásica Ag/AB en líquido. Se coloca una cantidad fija

de AB en una serie de tubos de ensayo. Se añade una concentración
creciente en serie de Ag a tubos sucesivos. En el extremo de baja
concentración de Ag de la serie, no se forma precipitado, porque el exceso
de AB cubre completamente los determinantes de Ag, y no hay
determinantes libres para que un extremo libre de AB se entrecruce. En una
región de 3 a 6 unidades logarítmicas de Ag, toda la Ag en los tubos se
precipita con AB disponible, generalmente en una proporción superior a 1:1.
Esta situación es posible porque muchos Ags tienen mucho más de dos sitios
de combinación AB. A medida que la concentración de Ag aumenta más allá
de la equivalencia, aumenta la frecuencia de agregados de Ag solubles
unidos por una o unas pocas moléculas de AB. Finalmente, cada molécula de
AB está unida en un complejo soluble con dos moléculas de Ag (Ag-AB-Ag),
Página 46
Figura 1.4.Una prueba de equivalencia Ag/AB en agar es un requisito previo necesario

para cualquier prueba exitosa de doble difusión de Ouchterlony. Se perforan
conjuntos paralelos de pocillos en el mismo medio de agar en el que se realizará
posteriormente una prueba final "para publicación". Se tiene cuidado de espaciar los
pocillos de manera idéntica al espacio futuro del patrón de prueba final. Se agrega
una cantidad constante de antisuero a un nivel central de pocillos. Se colocan
diluciones en serie de Ag en niveles paralelos de pocillos, y se permite que los Ag y los
AB se difundan juntos durante 1 a unos pocos días. Las líneas de precipitación más
nítidas se forman entre las concentraciones de equivalencia de Ag y AB; un Ag puro
tendrá una o dos mejores diluciones formando una línea nítida que se intensificará en
el transcurso de unos pocos días. En una mezcla compleja, la dilución de equivalencia
de cada Ag puede ser diferente; Inicialmente, varias diluciones mostrarán líneas
nítidas, pero con el tiempo, el exceso de Ag o AB se indica mediante un desenfoque de
las líneas de precipitación. El desenfoque es más realzado por la tinción.
Figura 1.5.Microtitulación para determinar el volumen de antisuero y Ag portador necesarios para lograr la precipitación total de una
muestra de Ag en una reacción de precipitación de fluidos. Esta técnica se lleva a cabo en tubos de microcentrífuga. Se añade una
cantidad fija de Ag portador (5-10 #g es suficiente) a cada tubo. Un objetivo adicional de este experimento preliminar es encontrar una
cantidad adecuada de Ag portador que proporcione una cantidad manejable de precipitado que pueda verse en el fondo del tubo después
de la centrifugación, lavado por resuspensión en PBS y repelido varias veces sin pérdida de precipitado. Se añaden volúmenes crecientes
de antisuero a la serie de tubos; se da tiempo para que se forme el precipitado y se centrifuga fuera de la solución. Luego, se analiza el
sobrenadante para ver si queda Ag en la solución utilizando cualquier micrométodo disponible, como QIEP. El volumen de antisuero que
precipita completamente la cantidad portadora de Ag permite calcular una cantidad de equivalencia AB. El uso de un múltiplo del volumen
de equivalencia de antisuero (4 x 32 = 128 #1) proporciona un sistema de precipitación líquida que siempre producirá al menos el mínimo
precipitado de trabajo con el transportador Ag (tubo de la izquierda). Esto protege contra el exceso de AB. Este sistema tiene la capacidad
de precipitar el triple de Ag "desconocido" sin dejar nada en solución (tubo a la derecha). Si solo el Ag desconocido se marca con
radiactividad, el precipitado puede analizarse por diversos medios para establecer la naturaleza y el alcance del marcaje. El uso de un
múltiplo del volumen de equivalencia de antisuero (4 x 32 = 128 #1) proporciona un sistema de precipitación líquida que siempre
producirá al menos el mínimo precipitado de trabajo con el transportador Ag (tubo de la izquierda). Esto protege contra el exceso de AB.
Este sistema tiene la capacidad de precipitar el triple de Ag "desconocido" sin dejar nada en solución (tubo a la derecha). Si solo el Ag
desconocido se marca con radiactividad, el precipitado puede analizarse por diversos medios para establecer la naturaleza y el alcance del
marcaje. El uso de un múltiplo del volumen de equivalencia de antisuero (4 x 32 = 128 #1) proporciona un sistema de precipitación líquida
que siempre producirá al menos el mínimo precipitado de trabajo con el transportador Ag (tubo de la izquierda). Esto protege contra el
exceso de AB. Este sistema tiene la capacidad de precipitar el triple de Ag "desconocido" sin dejar nada en solución (tubo a la derecha). Si
solo el Ag desconocido se marca con radiactividad, el precipitado puede analizarse por diversos medios para establecer la naturaleza y el
alcance del marcaje.

Figura 1.6.La prueba del anillo es una prueba simple y relativamente rápida de
reactividad inmunológica que se lee a simple vista como positiva o negativa
contra un tubo de control que no contiene Ag reactivo. La solución de fondo de
AB se hace más densa mediante la adición de sacarosa o glicerol. La solución
superior se superpone cuidadosamente y se anota la posición de la interfaz
inicialmente nítida. Ag y AB se difunden juntos y precipitan en su interfase
líquida. En una "prueba positiva", una precipitación es fácilmente visible en la
interfase en media hora.
Figura 1.7.El ensayo unidimensional de difusión única de Oudin. El antisuero se

coloca en una capa de gel de ionagar o agarosa y se considera relativamente
estacionario. Una dilución de Ag, de mayor concentración que la cantidad
equivalente de AB, sirve como el único componente de difusión dominante. La
solución de Ag se agrega a la parte superior del agar en un tiempo cero
registrado y la Ag comienza a difundirse en la fase de agar AB. Se ve un frente de
precipitaciones avanzar con el tiempo. Para cada tubo individual, la distancia, d,
de nigración frontal dividida por la raíz cuadrada del tiempo transcurrido, t, da un
valor constante, k. Este valor k es proporcional a la concentración de Ag, y una
serie de diluciones proporciona una curva de calibración de k frente a [Ag] para
determinar títulos relativos o absolutos de Ag desconocido.
Figura 1.8.La inmunodifusión radial es un ensayo bidimensional de difusión única de

naturaleza similar a la prueba de Oudin. Al igual que en la prueba de Oudin, el AB
suele servir como fase estacionaria y el Ag suele ser el componente de difusión móvil o
dominante. El antisuero se dispersa en agar y cubre un portaobjetos o una placa de
Petri. Las muestras de Ag se colocan en pocillos cortados en la superficie del agar. Ag
se difunde radialmente, formando un frente precipitado a medida que avanza. El
sistema se queda sin Ag y se desarrolla un borde más oscuro de precipitado en el
borde del precipitado final. El diámetro de este disco de precipitado se determina
después de la tinción y se compara con una curva estándar establecida para ese
antisuero mediante un conjunto previo o simultáneo de diluciones en serie de títulos
de Ag conocidos.
Figura 1.9.Inmunoelectroforesis cuantitativa (QIEP) o IEP "cohete". El anticuerpo

se dispersa uniformemente en la fina capa de agarosa del portaobjetos. La
cantidad de Ag colocada en cada pocillo se puede estimar por la cantidad de área
AB que se barre en un "cohete" de precipitación por el Ag propulsado
electroforéticamente. Este método, como la difusión radial, tiene un punto final
autoimpuesto que ocurre cuando todo el Ag en el pozo ha reaccionado con su
cantidad equivalente de AB.
Página 48
Figura 1.10.Ensayo de doble difusión de Ouchterlony. (1) Suero desequilibrado.

Las múltiples líneas de precipitación Ag/AB no son rectas y se curvan alejándose
de la fuente del componente en exceso. (2) Suero equilibrado. Las múltiples
líneas de precipitación Ag/AB son rectas y nítidas. Esto ocurre cuando cada Ag y
AB tienen una equivalencia aproximada. Los antisueros complejos balanceados
para Ouchterlony son difíciles de lograr de manera rutinaria.
Figura 1.11.Inmunoelectroforesis (IEP). La electroforesis previa de una

mezcla de antígenos en agarosa se combina con un paso posterior
similar a la doble difusión de Ouchterlony. Después de la separación
electroforética en la primera dimensión, se corta un canal en el agar
paralelo a la dirección de la electroforesis, y se agrega antisuero al canal
y se deja que se difunda y precipite con los Ags separados
electroforéticamente. En este ejemplo se muestra una mezcla de Ags
que reacciona con un antisuero crudo (canal superior) y un antisuero
absorbido (canal inferior).
Figura 1.12.QIEP cruzado es la extensión lógica de IEP a QIEP. La primera

dimensión se puede ejecutar de manera similar al IEP de la Figura 1.11 anterior o,
para una mejor resolución, la primera dimensión se puede realizar en un aparato
de placa de agarosa vertical u horizontal. El trozo de agarosa del gel de la
primera dimensión se monta en un portaobjetos y se complementa con agarosa
que contiene AB como en QIEP. La electroforesis de segunda dimensión de los
Ags en ángulo recto crea "cohetes" de precipitación AG/AB con una densidad de
precipitado característica. Las soluciones de Ag complejas se pueden analizar con
antisueros complejos usando este método. La fusión de cohetes adyacentes se
puede utilizar para identificar electromorfos o isozimas homólogos.
Figura 1.13.Fused QIEP es una extensión lógica de la prueba de doble difusión de

Ouchterlony a QIEP. Las muestras con Ags potencialmente relacionados se colocan en
sus pocillos de muestra individuales (1-6) cortados en una tira basal de agar que
contiene tampón de electroforesis pero no antisuero. Se permite que los Ags se
difundan durante un tiempo determinado experimentalmente para permitir una
mezcla suficiente de los Ags. Se agrega un gel antisuero, similar al de QIEP, al resto del
portaobjetos después de 2 h de difusión, y las muestras se someten a electroforesis en
el agar antisuero. Ags en pozos 3 y 4 representan una reacción de identidad; forman
una línea de precipitación continua similar a una línea de identidad en la prueba de
Ouchterlony. Ags en los pocillos 5 y 6 muestran una identidad parcial al formar un
"espolón" de precipitado en lugar de una línea continua. Las muestras 1 y 2, colocadas
en sus respectivos pocillos justo
antes de la electroforesis, forman distintos "cohetes" de precipitina, cuya

homología no se ha probado, pero dejan partículas que contaminan la
muestra en el gel que rodea el pocillo de la muestra.
Figura 1.14.Un ejemplo de electrotransferencia de PAGE, la transferencia

Western. (1) O'Farrell (1975) Electroforesis 2D de antígenos por enfoque
isoeléctrico en la primera dimensión seguido de SDS-PAGE en la segunda
dimensión. (2, 3) Los Ag separados se transfieren por transferencia o
electroforéticamente a una o más membranas de nitrocelulosa y se prueban
con antisueros específicos. (4) Es posible la eliminación del AB de sondeo de
la membrana de nitrocelulosa, y se lleva a cabo el resondeo del Ag aún unido
con otro AB.
Figura 1.15.'Comparación de doble difusión de Ouchterlony de Ags. Se coloca un

antisuero policlonal complejo o específico en un pocillo central de una losa de
agarosco y se permite que interactúe con Ass que se difunde hacia él desde dos
pocillos periféricos. (1) Demostración de Ouchterlony de la falta de homología
entre el antígeno A y el antígeno B. (2) Demostración de Ouchterlony de la
identidad completa del antígeno A con A'. (3) Demostración de Ouchterlony de
identidad parcial entre el antígeno A y A".

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Técnicas Inmunológicas Analíticas

Los procedimientos inmunológicos analíticos se han convertido en partes

Este capítulo abordará el uso pasado y continuo de antisueros policlonales

técnica. Leer un manual de inmunología puede resultar confuso debido a la

II. Comentarios generales sobre el alcance de un enfoque inmunológico

Varias propiedades de los antisueros policlonales no se aplican a los antisueros

Figura 1.1.Determinantes antigénicos y antisueros policlonales. Un antisuero policlonal se deriva de múltiples

En tercer lugar, en la estequiometría uno a uno de la reacción de

1. Medición de la complejidad inmunológica de un problema

Los anticuerpos se pueden utilizar para medir y delinear la complejidad

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2. Medición cuantitativa de títulos Ag individuales

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3. cuantificación del grado de diferencia Ag

b. Identificación de electromorfos homólogos.Las proteínas o enzimas aparentemente

una. Relaciones filogenéticas.El uso de la inmunología para medir las

b. Homología de estructura y función.Muchos Ags de insectos que se han

tercero Técnicas Específicas

1. obtención de reactivos inmunológicos

A. Elección de animales para la producción de AB

los costos del cuidado de los animales y la tecnología cambiante desplazarán al

B. Elección del calendario de vacunación

una. Un protocolo estándar de inmunización.La inmunización de un conejo se

debe precipitarse con sulfato de amonio saturado a la mitad y disolverse dos

b. Antisueros para discriminar diferencias cualitativas.para taxonómico

Algunos ensayos inmunológicos requieren antisueros monoespecíficos o son más sencillos

En un enfoque diferente, se puede usar un antisuero multiespecífico

2. Análisis del Título Inmunológico

A. Título Ag vs. Título AB

una. Equivalencia Ag/AB: importancia para evitar falsos negativos.Se puede

Es importante evitar la conclusión negativa falsa antes mencionada sobre la

b. Ajuste de la técnica y el título AB para la sensibilidad adecuada.La técnica de

conservar valioso antisuero. Si ni Ag ni AB son limitantes, entonces la elección de

B. Medición de la concentración relativa de Ag/AB, titulación

una. Título de equivalencia Ag/AB clásico por precipitación en

b. Equivalencia Ag/AB en agar.La equivalencia de Ag y AB en agar es

3. Estimación cuantitativa de la concentración

A. Técnicas de precipitación (equipo mínimo, nivel de instrucción)

una. Precipitación fluida.La estimación analítica de precipitados mediante la

y variar la dilución de Ag desde una concentración de exceso de Ag hasta una

b. La prueba del anillo.La prueba más simple para la presencia de un Ag (o un

solución (o si existe un AB en un antisuero para una solución de Ag) es la prueba

Figura 1.6.La prueba del anillo es

B. Estimación basada en la difusión de la concentración de Ag

una. Oudin unidimensional, difusión única.Oudin ideó la medida cuantitativa

En la técnica de Oudin, AB se dispersa uniformemente en agarosa al 0,5 % y

b. Inmunodifusión radial.Esta técnica es bidimensional.

proporciona un punto final para el ensayo ya que el anillo deja de crecer y se

Esta técnica requiere menos equipo que la prueba de Oudin; se puede

Varios estudios de proteínas de suero de insectos han encontrado que

C. Técnicas electroforéticas de inmunoprecipitina

una. Inmunoelectroforesis cuantitativa, QIEP o IEP "cohete".El problema de las

b. Estimación QIEP de síntesis y procesamiento de proteínas.Utilizando un antisuero