UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DEL ESTADO DE MÉXICO

FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

CAMPUS TOLUCA

LICENCIATURA
MÉDICO VETERINARIO Y ZOOTECNISTA

ASIGANTURA
VIROLOGIA

PROYECTO DE INVESTIGACIÓN
INFLUENZA AVIAR

PRESENTA:
EMVZ. FLOR DULCELINA LEÓN MACEDO

CATEDRÁTICO:
DRA. TRINIDAD BELTRÁN LEÓN

5TO SEMESTRE
GRUPO 01
PERIODO ESCOLAR 2022-B

TOLUCA ESTADO DE MÉXICO

A 21 DE NOVIEMBRE DE 2022
 ÍNDICE
DEFINICIÓN DE LA ENFERMEDAD....................................................................................3
CLASIFICACIÓN DE LA ENFERMEDAD...............................................................................4
CARACTERÍSTICAS DEL VIRUS..........................................................................................6
A. MORFOLÓGICAS...............................................................................................................6
B. FÍSICO-QUÍMICAS..............................................................................................................8
C. GENÓMICAS......................................................................................................................9
D. REPLICACIÓN..................................................................................................................12
E. BIOLÓGICAS....................................................................................................................16
PATOGÉNESIS................................................................................................................16
A. CONTAGIO......................................................................................................................17
AVES..........................................................................................................................................................17
HOMBRE....................................................................................................................................................17
B. SÍNTOMAS......................................................................................................................18
AVES..........................................................................................................................................................18
HOMBRE....................................................................................................................................................19

PROPIEDADES ANTÍGENAS............................................................................................19
A. DETECCIÓN DEL ANTÍGENO.............................................................................................19
B. DETECCIÓN DIRECTA DEL RNA........................................................................................20
C. SECUENCIA GENÉTICA.....................................................................................................26
CUADRO CLÍNICO Y LESIONES........................................................................................27
DIAGNOSTICO...............................................................................................................30
A. EXTRACCIÓN DE ARN VIRAL:...........................................................................................31
B. SÍNTESIS DE ADN COMPLEMENTARIO:............................................................................31
C. PCR EN TIEMPO REAL:.....................................................................................................31
D. AISLAMIENTO DEL VIRUS DE INFLUENZA AVIAR:............................................................32
E. SECUENCIACIÓN DEL GENOMA DEL VIRUS DE INFLUENZA AVIAR:..................................32
F. ANÁLISIS FILOGENÉTICO DEL VIRUS DE INFLUENZA AVIAR:............................................33
PREVENCIÓN Y CONTROL..............................................................................................34
REFERENCIAS................................................................................................................36
 INFLUENZA AVIAR

DEFINICIÓN DE LA ENFERMEDAD

Los virus de la influenza aviar son extremadamente variables, altamente

contagiosos, y están ampliamente distribuidos entre las aves, especialmente en
las aves acuáticas y las aves limícolas silvestres. La mayoría de estos virus, que
normalmente son transportados en forma asintomática por las aves silvestres, solo
causan enfermedad leve en las aves de corral. Estos virus también se denominan
virus de influenza aviar de baja patogenicidad (IABP). Otros, los virus de influenza
aviar de alta patogenicidad (IAAP), pueden destruir hasta un 90 ó 100% de las
parvadas de aves de corral. Las epidemias de influenza aviar de alta
patogenicidad se pueden propagar rápidamente, devastar la industria avícola y
originar graves restricciones comerciales. Algunos virus de influenza aviar también
pueden infectar a los mamíferos, como también a los humanos. La gravedad de la
influenza aviar zoonótica varía según el virus. Aunque muchas de las infecciones
en humanos se limitan a conjuntivitis o enfermedades respiratorias leves, algunas
cepas virales provocan enfermedades graves e incluso la muerte. Generalmente,
los virus de la influenza aviar no se propagan eficazmente en los mamíferos y las
infecciones se limitan a animales individuales o pequeños grupos. Sin embargo,
algunos virus pueden adaptarse a una especie nueva y causar epidemias o
pandemias.

Los virus de la IAAP se han eliminado de las aves de corral domésticas en

muchos países, incluido EE. UU. y Canadá; sin embargo, estos virus se pueden
reintroducir a través de aves de corral, aves silvestres o aves de compañía
importadas. Es posible que las aves silvestres sean portadoras de los virus de la
IAAP, pero históricamente esto parece ser poco frecuente. Con más frecuencia,
las aves silvestres transmiten los virus de la IABP a las aves de corral, y luego
estos virus mutan para transformase en virus de IAAP mientras circulan entre las
parvadas de aves de corral. Aunque los brotes de IAAP pueden ser devastadores,

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el virus se erradica exitosamente en la mayoría de los casos. Sin embargo,
actualmente el mundo está experimentando un brote de influenza aviar de gran
alcance para el cual no se prevé una erradicación completa e inmediata a nivel
mundial. En 2003, los virus de la IAAP del subtipo H5N1 aparecieron en aves de
corral de varios países en el sudeste de Asia. Aunque por momentos esta
epidemia pareció estar bajo control, nunca se erradicó por completo. Los brotes
continuaron arrasando y propagándose y, finalmente, los virus de linaje asiático
H5N1 alcanzaron otras partes de Asia, Europa, África y el Medio Oriente.

Las cepas responsables de esta epidemia parecen ser excepcionalmente

virulentas. Se han encontrado en muchas especies de aves silvestres, lo cual es
inusual, y se han registrado numerosas muertes en estas especies. Desde enero
de 2010, estos virus también han sido responsables de aproximadamente 470
infecciones en humanos, generalmente como resultado del contacto directo con
aves de corral; alrededor del 60% de estos casos fueron mortales.

Los virus de linaje asiático H5N1 han causado enfermedades en otros mamíferos,
como gatos domésticos, diversas especies de félidos grandes, gatos de algalia,
perros mapaches, un perro y un visón. Algunas de estas infecciones fueron
mortales. Además, estos virus se han detectado en cerdos y picas, y se han
establecido infecciones experimentales en diversas especies como zorros,
hurones, roedores y conejos. Se teme que un virus de linaje asiático H5N1 pueda
eventualmente adaptarse a los humanos, con lo cual se originaría una grave
pandemia en humanos.

CLASIFICACIÓN DE LA ENFERMEDAD
La influenza aviar es producto de una infección por virus del género influenzavirus
A y la especie de la influenza A de la familia Orthomyxoviridae. Estos virus
también se denominan virus de influenza tipo A. Además de los virus de la
influenza A, estas especies incluyen los virus estrechamente relacionados de la
influenza humana, equina, porcina y canina. Los virus de la influenza A se
clasifican en subtipos en base a dos antígenos de superficie; las proteínas

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hemaglutinina (H) y neuraminidasa (N). Existen 16 antígenos hemaglutinina (de
H1 a H16) y nueve antígenos neuraminidasa (de N1 a N9). Estas dos proteínas
participan en la adhesión de las células y la liberación desde las células. Además,
son blancos principales para la respuesta inmunológica. Los subtipos de los virus
de la influenza A se clasifican en cepas. Las cepas de los virus de influenza se
describen de acuerdo a su tipo, su huésped, el lugar del primer aislamiento, el
número de cepa (si lo hubiera), el año de aislamiento y el subtipo de antígeno. Por
ejemplo, un virus H5N1 aislado de los pollos en Hong Kong en 1997 es un
A/pollo/Hong Kong/y385/97 (H5N1). En el caso de las cepas de humanos, el
huésped generalmente se omite.

Los virus de la influenza aviar se clasifican como virus de IAAP o IABP, de

acuerdo a las características genéticas del virus y a la gravedad de la enfermedad
en pollos infectados en forma experimental. Si bien hay excepciones (p.ej., los
virus que se ajustan a la descripción de los virus de IAAP pero que causan
enfermedades leves), los virus de la IAAP normalmente causan enfermedades
graves en las aves de corral, mientras que las infecciones de IABP son
generalmente mucho más leves. Hasta el momento, solo los subtipos que
contienen H5 o H7 han resultado altamente patogénicos; los subtipos que
contenían otras hemaglutininas se han encontrado solamente en la forma de
IABP. También existen virus H5 y H7 de IABP, y estas cepas pueden evolucionar
a cepas de alta patogenicidad. Los virus de la IABP que se encuentran en las aves
silvestres pueden dividirse en linajes de Eurasia y Norteamérica. Aunque los virus
ocasionalmente se cruzan entre estas dos regiones geográficas, esto resulta poco
frecuente. Cuando un subtipo se ha establecido y ha circulado por un tiempo,
pueden ocurrir numerosas variantes en la población. Por ejemplo, entre las aves
de corral, actualmente se encuentran múltiples genotipos y una variedad de clases
de virus H5N1 de linaje asiático.

Las aves acuáticas y las aves zancudas, que parecen ser los reservorios naturales
de los virus de la influenza A, son portadoras de todos los antígenos H y N

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conocidos, generalmente en forma de la IABP. Los subtipos predominantes en los
patos silvestres varían periódicamente. Por lo general, los virus H3, H4 y H6 se
detectan en los patos silvestres de Norteamérica y Europa del Norte, pero pueden
encontrarse casi todos los antígenos hemaglutinina y neuraminidasa. Las aves
zancudas (familias Charadriidae y Scolopacidae) parecen tener una mayor
variedad de combinaciones de hemaglutinina y neuraminidasa que los patos. En el
este de EE.UU., se han aislado virus H1 al H12 (IABP) de estas aves; los virus H1,
H2, H5, H7 y H9-H12 son particularmente frecuentes. Las gaviotas se infectan
generalmente con virus de IABP H13, que son poco frecuentes en otras especies
aviares. También pueden ser portadoras de virus H16.

Se dispone de información limitada sobre los subtipos encontrados en otras

especies de aves. Entre los subtipos detectados en ñandúes se encuentran H3N2,
H4N2, H4N6, H5N1, H5N2, H5N9, H7N1, H7N3, H9N2, H10N1, H10N4 y H10N7.
Las cepas de las aves de jaula normalmente contienen H3 o H4; sin embargo,
también pueden ocurrir infecciones con subtipos de alta patogenicidad que
contienen H7 o H5. En un estudio se encontraron muy pocos virus de la influenza
aviar en aves paseriformes silvestres, palomas y tórtolas.

CARACTERÍSTICAS DEL VIRUS

a. Morfológicas
El virus de influenza A es una partícula pleomórfica envuelta, cuya membrana
lipídica se obtiene a partir de la célula huésped (Figura 1).

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Las partículas virales esféricas tienen un diámetro aproximado de 100 nm, pero
también se han observado partículas filamentosas de más de 300 nm de diámetro
en aislamientos de muestras clínicas frescas. Las glicoproteínas virales HA y NA
se encuentran ancladas en la envoltura lipídica y las mismas pueden observarse,
mediante microscopía electrónica, como espículas que se proyectan hacia el
exterior de la superficie del virus (Figura 2).

Estas espículas tienen una longitud entre 10 y 14 nm, y mantienen una relación
aproximada de cuatro HA por cada NA en membrana. Además de estas dos
proteínas de membrana, existe otro componente menor en la envoltura viral
denominada proteína M2. Esta proteína conforma el único canal iónico presente
en el virus de influenza A.

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Por debajo de la envoltura lipídica, se encuentra la proteína más abundante del
virión conocida como proteína de matriz M1. La misma se encuentra rodeando el
complejo ribonucleoproteico (RNP), el cual está compuesto por ARN viral (ARNv)
recubierto por nucleoproteína NP y asociado con el complejo heterotrimérico de
polimerasa viral (PB2, PB1 y PA). Esta capa de proteína M1 se puede también
visualizar por microscopia electrónica en partículas virales dañadas, revelando la
superestructura helicoidal interna del virus.

El complejo RNP, que fue separado en gradiente de sacarosa por Duesberg,

también puede ser visualizado mediante microscopía electrónica utilizando tinción
positiva con acetato de uranilo. Más recientemente, se han hecho intentos para
visualizar RNPs o segmentos individuales de ARN por microscopía electrónica de
secciones delgadas de partículas virales, lo que permitió evidenciar la preferencia
de los viriones por empaquetar los ocho segmentos de ARN esenciales para la
replicación viral.

Por último, también se han encontrado pequeñas cantidades de la proteína

nuclear de exportación NS2 en las partículas del virus de influenza A.

b. Físico-químicas
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El virus de influenza, al estar rodeado por una membrana lipídica, es muy sensible
a cualquier agente deslipidizante o desnaturalizante. Diferencias en el pH, fuerzas
iónicas, o composición iónica en el medio que rodea la partícula viral tendrán
influencia en la resistencia del virus a agentes físicos y/o químicos. Además, los
virus de influenza son relativamente termolábiles, por lo que se inactivan
rápidamente a temperaturas mayores a los 50°C. Por ello, cualquier agente que
afecta la estabilidad de las membranas, proteínas o ácidos nucleicos, tales como
radiación ionizante, detergentes, disolventes orgánicos, u otros, pueden reducir o
hasta incluso destruir completamente la infectividad del virus.

Para una adecuada conservación de la partícula viral infectiva se puede utilizar

una solución salina equilibrada a pH neutro y bajas temperaturas (-80°C).

Temperatura y pH: El virus se inactiva a 56°C durante 60 minutos, a radiación

ionizante o a pH ácido ≤ 2.

Desinfectantes: El virus es altamente susceptible a productos químicos como

hipoclorito de sodio, etanol 70%, agentes oxidantes, compuestos de amonio
cuternario, aldeídos, fenoles, ácidos, povidona yodada, y solventes de lípidos.

c. Genómicas
El genoma del virus de influenza A está compuesto por ocho segmentos de ARNv
de cadena simple y polaridad negativa, que codifican para las once proteínas
virales detallas en la Tabla 1.

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Los tres primeros segmentos, PB2, PB1 y PA respectivamente, codifican cada uno
para una subunidad de la polimerasa viral. El segundo segmento también codifica
una proteína accesoria, PB1- F2, a partir de una marco abierto de lectura (ORF)
alternativo en el segmento PB1. La proteína PB1-F2 es característica de los virus
de influenza A, se localiza en mitocondria y tiene actividad pro-apoptótica.
Aparentemente, esta proteína es realmente una proteína accesoria, debido a que
algunas cepas virales aisladas de seres humanos y animales carecen de este
marco abierto de lectura.

El segmento 4 codifica para la proteína hemaglutinina HA. Esta proteína, en su

forma madura, es una glicoproteína trimérica integral de membrana tipo I que se
encuentra en la envoltura lipídica de los viriones y en la membrana celular de las
células infectadas. La HA sufre varias modificaciones post- traduccionales, como
glicosilación, palmitoilación, clivaje proteolítico, formación de enlaces disulfuro y
cambios conformacionales. El clivaje de la molécula precursora HA0 en las
subunidades HA1 y HA2 (que luego son unidas por puente disulfuro) es mediada

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por proteasas celulares y es esencial para actividad fusogénica de la HA, la cual
permite la unión del virus a la superficie de la célula huésped a través de los
receptores de ácido siálico celulares. Esta proteína, al ser la más abundante en la
membrana del virus, constituye el principal epitope neutralizante. A su vez, el
nombre “hemaglutinina” hace referencia a la capacidad de esta proteína de
aglutinar los glóbulos rojos de la sangre.

Otra proteína del virus es la proteína NP, la cual es codificada por el segmento 5.
Es una proteína altamente básica cuya función principal es la encapsidación del
ARN viral (un monómero de NP se une aproximadamente a 24 nucleótidos de
ARN), necesaria para que la polimerasa del virus pueda reconocer cada segmento
de ARNv y así formar los complejos RNP. Además, la proteína NP interacciona
con la maquinaria de importación nuclear celular, permitiendo transportar a las
RNPs virales dentro del núcleo.

El segmento 6 codifica para otra glicoproteína de superficie, la proteína

neuraminadasa NA, la cual está compuesta por un tetrámero que da origen a una
proteína integral de membrana tipo II. La función principal de la NA es la liberación
de las partículas virales de la membrana celular, mediante el clivaje de las uniones
entre la HA y el ácido siálico celular.

El segmento 7 tiene la particularidad de codificar dos proteínas virales, la proteína

de matriz M1 y la proteína M2. La M1 se traduce a partir de un transcripto colineal,
mientras que la M2 se produce a partir de un ARNm viral que realizó splicing
alternativo. M1 está asociada a la membrana lipídica del virus y juega un rol
esencial durante el brote de los viriones maduros a partir la célula huésped.
Además, la proteína M1 regula el movimiento de las RNPs fuera del núcleo e
inhibe la síntesis de ARNv en estadíos tardíos del ciclo de replicación viral. Por
otro lado, la proteína M2 es un tetrámero integral de membrana tipo III con
actividad de canal iónico. Este canal de M2 permite la acidificación del core de la

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partícula viral, permitiendo la disociación de la proteína M1 de las RNPs, lo que se
conoce como desnudamiento.

El último de los segmentos de los virus de influenza A, el segmento 8, es el más

pequeño de los ARN virales. El mismo codifica la proteína NS1 a partir de un
transcripto colineal, y la proteína NS2 a partir de un ARNm producido por splicing
alternativo. La proteína NS1 se expresa en altas cantidades en las células
infectadas. Es una proteína que se une selectivamente al ARN de la célula
interfiriendo en el procesamiento del ARNm celular. Además, se ha probado que
tiene actividad antagonista del interferón tipo I, inhibiendo de esta forma la
actividad antiviral de la célula huésped. Por otro lado, la proteína NS2 media la
exportación nuclear de las nuevas RNPs sintetizadas durante la replicación del
virus, por lo que su expresión se correlaciona con los estadíos tardíos del ciclo de
replicación viral.

d. Replicación
El virus de influenza A tiene un ciclo de replicación (Figura 3) que comprende las
siguientes etapas detalladas a continuación:

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Figura 3: http://gsdl.bvs.sld.cu/greenstone/collect/preclini/index/assoc/HASH26ea.dir/fig67.2a.png

1. Adsorción y entrada a la célula huésped: El primer paso para iniciar el ciclo de

replicación viral es la adsorción, o unión, del virus la célula huésped. En el caso de
los virus de influenza A, esta unión se produce ente la glicoproteína de superficie
viral HA y el ácido siálico (ácido N- acetilneuramínico) de la célula target. Dentro
de los virus de influenza A, los virus de influenza humana se unen
preferentemente al ácido N-acetilneuramínico que se encuentran unido a la
penúltima galactosa mediante un enlace α2-6, mientras que los virus de influenza

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aviar se unen mayoritariamente al ácido siálico que se une con un azúcar en un
enlace α2-3 . A pesar de la existencia de cierta especificidad entre los virus de
influenza A, hay que considerar que no es absoluta y que tanto las células
humanas como las aviares pueden tener ácido siálico con ambas uniones.
Además, existen estudios que demuestran que los virus de influenza tienen la
capacidad de adaptarse a un huésped particular a través de mutaciones en el sitio
de unión al receptor celular de la HA. Una vez que el virus de influenza está
adsorbido a la membrana celular continúa su entrada a la misma.
Tradicionalmente se consideraba que el virus de influenza entraba a la célula por
una endocitosis mediada por clatrina, pero existe evidencia de que la
internalización del virus puede ser por un mecanismo independiente de clatrina y
caveolina, dependiente de un pH ácido que transporta el virus a endosomas
tardíos.

2. Fusión y desnudamiento: Después de la endocitosis, el virus de influenza

requiere de un pH ácido para fusionarse con las membranas endosomales. Esta
actividad de fusión es inducida por un cambio estructural en la HA, pero para que
esto ocurra el precursor HA0 debe primero ser clivado en dos subunidades, HA1 y
HA2. Una vez en el medio ambiente ácido del endosoma, la molécula HA clivada
experimenta un cambio conformacional que expone el péptido de fusión en el
extremo N-terminal de la subunidad HA2, permitiéndole interactuar con la
membrana del endosoma. El cambio estructural realizado de algunas moléculas
de hemaglutininas abre un poro que libera los contenidos del virión.

El desnudamiento efectivo también depende de la presencia de la proteína M2, la

cual tiene una actividad de canal iónico [39]. Esta proteína asociada al virus
permite el flujo de H+ desde el endosoma hacia el interior de la partícula viral, los
cuales rompen las interacciones proteína- proteína de la proteína M1 resultando
en la liberación de RNPs al citoplasma. Esto completa el proceso de
desnudamiento.

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3. Síntesis de ARN (transcripción y replicación): El proceso de captación de las
moléculas RNPs a través de los poros nucleares es un proceso activo, que
involucra la interacción de la maquinaria de transporte nucleocitoplasmático de la
célula huésped con las señales de localización nucleares (NLS) presentes en
todas las proteínas que forman las RNPs. Sin embargo, sólo la señal en la NP ha
mostrado ser suficiente y necesaria para la importación del ARNv. Una vez en el
núcleo, el ARN viral entrante de polaridad negativa se transcribe primero a ARNm.
Estos ARNm son copias incompletas del templado de ARNv y son encapuchados
y poliadenilados, a diferencia del ARNv, para su posterior traducción en el
citoplasma celular. La amplificación del genoma viral comprende un proceso que
involucra la realización de una copia completa del ARNv de polaridad positiva, la
cual es referida como ARN complementario (ARNc), que a su vez será utilizada
como templado para producir luego más copias completas de ARNv. Todas estas
reacciones son catalizadas por el mismo complejo de polimerasas viral.

4. Ensamblado y liberación de viriones: Los virus de influenza generalmente se

ensamblan y liberan por la membrana apical de células polarizadas, como lo son
las células epiteliales de pulmón e intestino. Las proteínas que se localizan en la
membrana apical son la HA, NA y M2, pero la proteína indispensable para el
correcto ensamblado de la partícula viral es la proteína M1. Se considera que la
M1 interacciona con las colas citoplasmáticas de las glicoproteínas y las RNPs,
formando un puente entre los componentes del core interno y las proteínas de la
membrana.

Una vez acumulada la proteína M1 en la cara interna de la membrana lipídica, se

produce una curvatura de la misma y se inicia el proceso de brotación del virión.
Dicho proceso finaliza cuando se logra separar completamente la envoltura viral
de la membrana celular. Debido a que la proteína HA ancla el virus a la célula
mediante la unión a receptores que contienen ácido siálico en la superficie celular,
se requiere de la actividad enzimática de la proteína NA para eliminar el ácido
siálico y, de ese modo, liberar finalmente el virus de la célula huésped. También se

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requiere de la actividad de la NA para eliminar el ácido siálico de los hidratos de
carbono presentes en las propias glicoproteínas virales, para así evitar que las
partículas de virus se agreguen.

e. Biológicas
Puede afectar a varias especies avícolas para el consumo (pollos, pavos,
codornices, gallina de guinea, etc.), aves de compañía y aves silvestres. El virus
también se ha aislado en algunas especies de mamíferos, incluidos los humanos,
ratas y ratones, comadrejas y hurones, cerdos, gatos, tigres y perros.

PATOGÉNESIS
Los virus de la influenza tienen dos características:
• Gran capacidad de mutación (de modificar parte de su dotación genética),
por lo que varían rápidamente, y por lo que las vacunas deben
"actualizarse" con frecuencia
• Capacidad de recombinarse (de intercambiar entre sí fragmentos de RNA).

Hasta la fecha todos los virus altamente patógenos aislados han sido virus A de
influenza, subtipos H5 y H7.

Las puertas de entrada del virus son la vía respiratoria y la oral. El virus se
multiplica inicialmente en las mucosas conjuntival, respiratoria e intestinal y, tras
ello, se disemina en la sangre (viremia). Se produce una multiplicación secundaria
en los órganos, principalmente en el tracto respiratorio y digestivo. Las cepas
altamente patógenas se replican en todo el organismo.

Las aves enfermas eliminan el virus por las secreciones de narinas, boca, ojos, y
por las heces. Los virus altamente patógenos pueden seguir activos durante largo
tiempo en heces infectadas, tejidos y agua.

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El virus altamente patógeno se ha encontrado principalmente en gallinas y pavos.
Las aves silvestres son reservorios de virus, pudiendo llevarlo normalmente en el
tracto respiratorio o intestinal, pero no suelen contraer la infección.

A. Contagio
Aves
Es una enfermedad de rápida difusión.
La entrada a las explotaciones se produce por:
• Traslado de aves, personas, vehículos, equipos, piensos y jaulas
contaminados
• Movimiento de aves acuáticas y marinas.
• Transporte de huevos (el virus puede estar en la superficie).
• Infección de pollitos en la planta de incubación por huevos rotos o
contaminados.

Dentro de la explotación, la transmisión se produce por:

• Contacto directo entre aves sanas y enfermas (secreciones, especialmente
heces).
• Contacto con materiales, piensos, agua, equipo y ropa contaminados.
• Vía aerógena.
• La dispersión entre países se produce por el tráfico internacional de aves
vivas y por las aves migratorias (su posible papel no está claro).

Hombre
Aunque las posibilidades son muy bajas, la variante altamente patógena H5N1
tiene capacidad de transmitirse del ave al hombre y causarle la enfermedad,
situación que viene favorecida por el comercio avícola y los sistemas productivos
primitivos en zonas rurales, con falta de higiene y contacto muy estrecho con aves
infectadas, cadáveres, superficies u objetos contaminados con sus heces.

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No se ha demostrado la transmisión por consumo de carne de aves o huevos
debidamente cocinados, ni hay evidencias de transmisión entre humanos del virus
H5N1, aunque constituye un motivo de preocupación en el mundo.

B. Síntomas
Aves
El periodo de incubación es de 3 a 5 días. Los síntomas varían según la cepa del
virus y la especie afectada:
• Forma leve (influenza aviar poco patógena):
- Plumaje erizado.
- Reducción de la producción de huevos.
- efectos leves en el sistema respiratorio.
• Forma grave (influenza aviar altamente patógena):
• Afecta al tracto respiratorio y a otros órganos y tejidos, pudiendo
producir hemorragia interna masiva. Se pueden presentar los siguientes
signos clínicos (o al menos algunos):
 Postración y depresión extrema.
 Caída repentina de la producción de huevos, varios huevos
con cáscara blanda o sin cáscara.
 Edema y congestión de carúnculos y crestas.
 Edema de la piel debajo de los ojos.
 Tos, estornudos y signos nerviosos.
 Diarrea.
 Hemorragias en las mucosas y en los jarretes.
 Algunas muertes aisladas, seguidas de una difusión rápida y
una tasa de mortalidad cercana al 100 %, en 48 horas.

Las lesiones, inespecíficas, pueden ser menos marcadas en pavos que en

gallinas. Los gansos y los patos pueden no presentar síntomas clínicos ni
lesiones.

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Hombre
La enfermedad inducida por H5N1 altamente patógena suele ser grave,
manifestándose neumonía vírica, insuficiencia multiorgánica, rápido deterioro y
elevada tasa de mortalidad.

PROPIEDADES ANTÍGENAS
En la actualidad, las técnicas convencionales de aislamiento y caracterización
para el diagnóstico de la influenza A continúan siendo métodos fundamentales, al
menos para el diagnóstico inicial de las infecciones por influenza A y para
proporcionar virus para análisis más detallados, como las pruebas in vivo y la
secuenciación génica. A partir de aquí, pueden no resultar útiles para confirmar o
descartar la presencia de virus infeccioso cuando los resultados de otras pruebas,
como la RT-PCR convencional o en tiempo real, son todas débilmente positivas.
Sin embargo, los métodos convencionales tienden a ser costosos, emplean
numerosa mano de obra y son lentos. Ha tenido lugar una gran evolución y mejora
de las técnicas moleculares y de otras técnicas diagnósticas, muchas de las
cuales se aplican actualmente de forma habitual al diagnóstico de las infecciones
por influenza A como primera opción.

a. Detección del antígeno

Existen varios kits comerciales de AC-ELISA para la detección de los virus de la
influenza A en las aves de corral (Swayne et al., 2020). La mayoría de estos kits
son enzimoinmunoanálisis o se basan en la inmunocromatografía (dispositivos de
flujo lateral) y utilizan un anticuerpo monoclonal frente a la nucleoproteína; deben
ser capaces de detectar cualquier virus de la influenza tipo A. La principal ventaja
de estas pruebas consiste en que pueden poner de manifiesto la presencia de
influenza A en 15 minutos. Las desventajas son que pueden carecer de
sensibilidad, que pueden no haber sido validadas para diferentes especies de
aves, que no se consigue la identificación del subtipo vírico H o N y que son caros.
Las pruebas deben interpretarse solo en la parvada como un colectivo y no como

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prueba individual. Las muestras orofaríngeas o traqueales de aves clínicamente
infectadas o muertas proporcionan la mejor sensibilidad. Sin embargo, la falta de
sensibilidad constituye una importante desventaja para la utilización de las
pruebas de detección de antígeno disponibles. Las sensibilidades de estas prueba
pueden variar entre los hisopos cloacales y traqueales, mientras que pueden
funcionar peor con muestras de aves acuáticas o aves silvestres que con pollos.
Se ha descrito una sensibilidad mejorada pero moderada en los llamados
dispositivos de flujo lateral cuando se usan muestras de folículos de plumas de
aves infectadas por IAAP (Slomka et al., 2012). Debido a la baja sensibilidad, la
detección de antígenos se utiliza principalmente para la detección, en condiciones
de campo, de casos clínicos de alta mortalidad por presuntas infecciones por el
virus de la influenza A, seguida de la confirmación de los resultados mediante una
prueba de laboratorio más sensible.

b. Detección directa del RNA

Como se ha indicado en las definiciones actuales de la IAAP, se han utilizado
técnicas moleculares en el diagnóstico de la IA durante cierto tiempo. Además,
recientemente ha habido desarrollos para su aplicación a la detección y
caracterización del virus de la influenza A directamente a partir de muestras
clínicas de aves infectadas. Es obligatorio el uso de protocolos estrictos para evitar
el riesgo de contaminación cruzada entre las muestras clínicas cuando se utilicen
métodos de detección molecular muy sensibles que permiten una rápida detección
del ARN vírico para el diagnóstico de laboratorio confirmativo de las infecciones
por influenza aviar. Además, los métodos analíticos de detección de ARN deben
validarse con respecto al estándar de la OIE utilizando materiales clínicos para
demostrar que las pruebas son “adecuadas para el fin” y pueden aplicarse en el
diagnóstico de campo, el cual puede incluir el uso de estándares internos para la
prueba. Las reacciones control propician una mayor confianza en la integridad de
las reacciones moleculares, en las muestras clínicas y en los resultados.

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Además, estas evaluaciones permiten establecer de forma adecuada los umbrales
para la interpretación de los resultados (valores que determinan si el resultado es
positivo o negativo). La mayor sensibilidad de la RT-PCR en tiempo real conduce
a la detección de ARN vírico en muestras en ausencia de virus infecciosos y se
debe tener cuidado al interpretar resultados con límites de detección pequeños
que pueden no ser indicativos de una infección activa. Este problema puede
superarse mediante el análisis de varias muestras de la misma parvada de aves
infectadas, lo que es especialmente relevante cuando se analizan muestras de
aves de corral domésticas para la investigación de enfermedades.

En entornos con instalaciones más limitadas, las técnicas de RT-PCR en muestras

clínicas pueden, con los cebadores correctamente definidos, dar como resultado
una rápida detección e identificación de subtipos (al menos de los subtipos H5, H7
y H9, y también existen ensayos desarrollados más recientemente para otros
subtipos), incluido un producto de ADNc que se puede utilizar para la
secuenciación de nucleótidos. Sin embargo, estos métodos ahora han sido
reemplazados en gran medida por las pruebas de detección molecular preferidas
para el virus de la influenza A mediante RT-PCR en tiempo real, una modificación
de la RT-PCR que reduce el tiempo tanto para la identificación del subtipo de virus
como para la secuenciación. Por ejemplo, Spackman et al. (2002) utilizaron un
sistema de cebador de RT-PCR en tiempo real de un solo paso/ sonda de
hidrólisis fluorogénica para la detección de los virus de la influenza A y la
determinación del subtipo H5 o H7.

La prueba funcionó bien en relación con el aislamiento del virus y ofreció una
alternativa mucho más barata y rápida, con diagnóstico en muestras clínicas en
menos de 3 horas. En estudios posteriores, se demostró que la RT-PCR en tiempo
real tiene una sensibilidad y una especificidad equivalentes al aislamiento del virus
en numerosos entornos, pero las actualizaciones del diseño de cebadores/sondas
pueden ser beneficiosas con el tiempo para adaptarse a la evolución genética en
las regiones de genes a las que se dirigen los ensayos (Laconi et al., 2020).

21
Estas pruebas proporcionan una alta sensibilidad y especificidad, similares a las
del aislamiento de virus cuando se utilizan en frotis traqueales y orofaríngeos de
pollos y pavos, pero pueden carecer de sensibilidad para la detección del virus de
la influenza A en frotis fecales, heces y tejidos de algunas especies de aves,
debido a la presencia de inhibidores de la PCR que dan lugar a falsos negativos
(Das et al., 2006). La incorporación de un control interno positivo en la prueba
verificará una ejecución adecuada de la misma. Además, se han desarrollado
mejoras en los métodos de extracción de ARN para eliminar la mayoría de los
inhibidores de la PCR de las muestras.

La RT-PCR en tiempo real, normalmente basada en la sonda de hidrólisis para la

generación de la señal de fluorescencia específica de la diana, se ha convertido
en el método de referencia de muchos laboratorios para el diagnóstico, al menos
parcial, directamente a partir de muestras clínicas. Este método ofrece resultados
rápidos, con sensibilidad y especificidad comparables a las del aislamiento del
virus. Estas cualidades son ideales para la gestión de un brote de la influenza A,
en que el periodo de tiempo durante el cual puede obtenerse un diagnóstico fiable
es crucial para la toma de decisiones por parte de las autoridades veterinarias
correspondientes. Además, se pueden diseñar sistemas de RT-PCR en tiempo
real para trabajar con un formato de 96 pocillos en combinación con la extracción
robotizada del ARN de alto rendimiento a partir de las muestras (Agüero et al.,
2007).

El método de diagnóstico mediante RT-PCR en tiempo real adoptado en la

mayoría de los laboratorios se ha basado en la detección genérica inicial del virus
de la influenza A en muestras clínicas, principalmente dirigiéndose inicialmente al
gen de la matriz (M), que está altamente conservado en todos los virus de la
influenza A , seguido de pruebas específicas de RT-PCR en tiempo real para los
subtipos víricos H5 y H7. Se han descrito numerosos ensayos para la detección
altamente sensible del gen M (o NP) que cumplen los criterios de una prueba de

22
detección adecuada. Para la identificación de subtipos, los cebadores utilizados en
la RT- PCR en tiempo real se dirigen a la región HA2, ya que está relativamente
bien conservada dentro de los genes de la hemaglutinina de los subtipos H5 y H7
(Spackman et al., 2008; Spackman y Suarez, 2008). Por lo tanto, ha servido como
región diana para estos subtipos. Spackman et al. (2002) demostraron la
detección específica de estos subtipos, pero advirtieron que sus secuencias de
cebador/sonda para H5 y H7 habían sido diseñadas para la detección de cepas
H5 y H7 de Norteamérica y podrían no ser adecuadas para todas las cepas H5 y
H7. Y así sucedió. Slomka et al. (2007) describieron la modificación de las
secuencias de oligonucleótidos de H5 utilizadas por Spackman et al. (2002) para
permitir la detección del subtipo H5N1 (linaje eurasiático ["Goose/Guangdong”
[Gs/GD]) y otros subtipos H5 eurasiáticos que se han aislado en los últimos 15
años tanto en aves de corral como en aves silvestres. A medida que el grupo de
virus 'Gs/GD' se diversificó y se extendió por varios continentes, se volvió
importante que los diagnósticos en todos los entornos demostraran ser adecuados
para la detección de este linaje de virus H5 dividido en múltiples clados
(Organización Mundial de la Salud, Organización Mundial de Sanidad Animal,
Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura, y
Grupo de Trabajo sobre Evolución del H5N1, 2014). Se han desarrollado métodos
rápidos más nuevos que permiten la detección y la subtipificación simultáneas,
acelerando el tiempo para lograr una identificación rápida de un virus de la
influenza A utilizando tecnologías de matrices (Hoffmann et al., 2016) o microchip
(Kwon et al., 2019).

La RT-PCR en tiempo real de Eurasia validada ha demostrado ser valiosa en la

investigación de muchas muestras clínicas de influenza aviar altamente patógena
H5Nx y otros subtipos enviados a Laboratorios de Referencia Internacionales de
Europa, África, Asia y Norteamérica desde 2005 (Liu et al., 2018; Slomka et al.,
2007). Cada conjunto de cebadores y sondas debe validarse frente a un conjunto
diverso de virus para que la prueba sea aplicable a una amplia gama de especies
de aves y en virus de amplias áreas geográficas y períodos de tiempo. Además,

23
los métodos de RT-PCR en tiempo real ahora se utilizan ampliamente para la
determinación rápida y precisa del subtipo de neuraminidasa (James et al., 2018).

Uno de los problemas de las pruebas nuevas que surgen rápidamente es que los
métodos y protocolos pueden desarrollarse y comunicarse sin que la prueba esté
debidamente validada. Esto se ha abordado para algunos de los protocolos de RT-
PCR en tiempo real. En la Unión Europea, los Laboratorios Nacionales de
Referencia han colaborado para definir y validar protocolos que pueden
recomendarse para su uso en Europa (Hoffmann et al., 2016; Nagy et al., 2020;
Slomka et al. 2007). Es importante que esto incluya análisis de rutina de los virus
detectados (coordinados a través de los Laboratorios de Referencia de la OIE) en
ensayos estándar para asegurar una detección específica fiable de virus
contemporáneos que afectan a las aves de corral y otras poblaciones.

Además, dada la alta variabilidad en el genoma de la influenza A, es imperativo

que los ensayos utilizados en el diagnóstico y la vigilancia de rutina tengan sean
sometidos a una demostración continua de su aptitud para la detección de virus
contemporáneos validada para su uso en la región donde se aplican. Debe haber
una correspondencia adecuada con las cepas locales, teniendo en cuenta que
existe una variabilidad regional e intercontinental significativa entre virus
endémicos particulares. Laconi et al. (2020), al revisar cinco métodos de RT-PCR
en tiempo real validados y bien utilizados, concluyeron que el monitoreo continuo
del rendimiento del ensayo utilizando metodología tanto in silico como in vitro era
importante, ya que la aparición de nuevas cepas que contienen mutaciones dentro
de las áreas de unión de cebadores y sondas podría afectar significativamente el
resultado de una prueba.

De forma creciente, con las mejoras en el diseño de ensayos y el uso de métodos

bioquímicos novedosos, se desarrollan ensayos de detección relevantes para
todos los virus de la influenza A de todos los hospedadores (animales y humanos)

24
(Nagy et al., 2020) con gran relevancia para una interfaz entre las aves y 'otros'
hospedadores.

Se han descrito protocolos de la RT-PCR en tiempo real que amplifican regiones

de la totalidad del punto de escisión del gen de la HA0. Esto puede proporcionar
pruebas que sean útiles para virus específicos. Por ejemplo, Hoffman et al. (2007)
han descrito una prueba RT-PCR en tiempo real específica para los virus
euroasiáticos de IAAP H5N1 tipo Quinghai del clado 2.2 que constituye un medio
rápido para determinar el patotipo en este subgrupo de virus H5N1 de la IAAP sin
secuenciación. Para situaciones en las que se detectan grandes cantidades de
muestras/casos positivos durante episodios de la enfermedad, se han creado RT-
PCR en tiempo real dirigidas de forma específica para la detección y
patotipificación sensible y simultánea de los virus, lo cual puede resultar muy útil,
sobre todo cuando se aplica a sistemas de alerta temprana, como la vigilancia de
poblaciones de aves silvestres destinada a determinar la posible presencia local
de IAAP (Graaf et al., 2017; Naguib et al., 2017).

Se han diseñado modificaciones del método sencillo de detección de ARN vírico

por RT-PCR para reducir el efecto de las sustancias inhibidoras en la muestra
tomada, la posibilidad de contaminar los ácidos nucleicos y el tiempo necesario
para producir un resultado. El sistema de amplificación isotérmica mediada por
bucle (LAMP) para la detección de H5 y H7 parece mostrar una alta sensibilidad y
una especificidad fiable (Ahn et al., 2019; Bao et al., 2014), pero puede tener una
aplicación limitada debido a la susceptibilidad a mutaciones víricas que afecten a
las regiones diana, lo cual reduce la detección de virus (Postel et al., 2010).

El aumento de la innovación y las mejoras tecnológicas han hecho posible que las
tecnologías de detección de antígenos mejoradas y de base molecular se hayan
desarrollado lo suficiente como para disponer de pruebas rápidas para la
detección en la parvada de la presencia de subtipos específicos del virus de la
influenza A y marcadores de patogenicidad (Inui et al., 2019). Además, las

25
innovaciones en el diseño de pruebas han permitido, por ejemplo, el desarrollo de
PCR ultrarrápidas basadas en chips aplicables en condiciones de campo (Kwon et
al., 2018) con una aplicación cada vez mayor prevista en el futuro.

c. Secuencia genética
Actualmente, la RT-PCR en tiempo real es el método preferido de vigilancia de
virus porque la prueba proporciona diagnósticos rápidos y sensibles para la
influenza H5, H7 y H9 y está disponible en altas producciones. Sin embargo, un
mayor uso de las tecnologías de secuenciación, particularmente a medida que los
costos unitarios se reducen con la mejora de la tecnología, ofrece poderosas
oportunidades para detectar y secuenciar simultáneamente muestras clínicas en
un laboratorio o en condiciones de campo, por ejemplo, aplicando tecnología de
nanoporos (King et al., 2020).

La secuenciación de genes se está aplicando cada vez más no solo a la

caracterización detallada de virus para su uso en epidemiología molecular, sino
también a la subtipificación de virus y definición de marcadores para todos los
hospedadores, incluido el riesgo zoonótico. La metodología de secuenciación de
Sanger se ha utilizado mucho durante décadas y permite la determinación rápida
clásicamente de un gen diana (H) en 24-36 horas para definir la patogenicidad del
virus (véase el apartado B.1.1.1) y todavía tiene una utilidad generalizada.

Sin embargo, dado que los datos genómicos se pueden determinar rápidamente
utilizando tecnología de secuenciación de próxima generación, permite un análisis
más amplio con diversas herramientas bioinformáticas (Zhang et al., 2017). Por
ejemplo, con la ampliación del acceso a la metodología de secuenciación, ya sea
a través de laboratorios especializados o proveedores comerciales, ahora es
posible determinar las secuencias genómicas de los virus de la influenza A de las
aves para proporcionar un nivel de caracterización importante en la identificación
rápida de agentes patógenos y la intervención en los brotes.

26
Convencionalmente, las secuencias de nucleótidos se han utilizado en la
epidemiología de los brotes para inferir el origen de los virus y las relaciones
precisas entre los diferentes virus asociados dentro del mismo evento (por
filogenia), con el fin de apoyar la gestión de los brotes. Las secuencias de genes
de la hemaglutinina y la neuraminidasa víricas pueden compararse rápidamente
con secuencias conocidas de todos los subtipos en bases de datos de genes y
usarse para comprobar coincidencias, identificando así el subtipo vírico y sus
relaciones filogenéticas. Esto a menudo evita la necesidad de cultivar el virus para
una identificación rápida, aunque la fiabilidad y la calidad de los datos se reducen
al aumentar los valores del ciclo umbral en las muestras que se utilizan en la RT-
PCR en tiempo real.

Cada vez más, estos análisis se están aplicando ahora a nivel del genoma
completo para revelar los genotipos del virus y proporcionar una mayor
especificidad analítica a los análisis. Dichos métodos son especialmente valiosos
para rastrear desde la evolución del virus, que puede mapearse con mayor
precisión, incluido el cambio debido al reordenamiento genético, un mecanismo
clave asociado a la diversidad del virus y la aptitud para infectar a las aves. Este
sistema es especialmente valioso para incursiones tempranas o iniciales en un
episodio nuevo, ya que permite una mayor precisión en la determinación del
origen del virus y los mecanismos que conducen a la aparición del virus. Esto se
ha vuelto cada vez más importante para caracterizar la rápida evolución y la
amplia diversidad de virus del linaje Gs/GD asociados a la propagación
transcontinental. La traducción de las secuencias de nucleótidos de todos los
segmentos genómicos en secuencias de aminoácidos permite la extracción de
datos para deducir otras características o rasgos del virus, como el tropismo, los
marcadores de rango de hospedadores, incluida la susceptibilidad zoonótica y
antiviral predicha, que tienen un gran valor como datos a tener en cuenta en la
gestión de los brotes.

CUADRO CLÍNICO Y LESIONES

27
Los signos clínicos de infección por IA son variables y fuertemente influenciados
por la patogenicidad de los virus involucrados, las especies infectadas, la edad de
las aves, enfermedades virales o bacterianas concurrentes y el medio ambiente.
La virulencia exhibida en pollos puede variar durante un brote

Infección con virus no patógenos

• Aves infectadas sin signos clínicos aparentes, con presencia de
seroconversión.
• Algunos de estos virus tienen el potencial para volverse virulentos mediante
mutación genética.
Infección con virus de baja o leve patogenicidad
• Los signos clínicos en pollos y pavos varían de inaparentes a enfermedad
respiratoria leve o severa y pueden ser confundidos con laringotraqueítis
infecciosa y otras enfer- medades del tracto respiratorio.
• La mortalidad varía entre el tres por ciento en ponedoras enjauladas y 15
por ciento en pollos para carne (engorda, parrilleros, broilers).
• La producción de huevos en ponedoras puede caer algunas veces hasta el
45 por ciento de la producción total esperada en una parvada grande, para
luego retornar a niveles normales de producción en 2 a 4 semanas.
• En brotes se ha podido demostrar la mutación hacia alta virulencia.

Infección con virus altamente patógenos

• En casos sobreagudos que incluyen muerte súbita, como aquellos
observados en el brote 2004-5 en Vietnam, los signos clínicos pueden no
ser observados y las muertes se producen algunas horas después del inicio
de la depresión. Se han reportado tasas totales de mortalidad cercanas al
100 por ciento para casos sobreagudos y agudos.
• En casos agudos, las mortalidades ocurren en las primeras 24 horas
después de la expresión de signos clínicos iniciales de la enfermedad y
frecuentemente en las siguientes 48 horas. En otros casos se observan

28
 signos clínicos más diversos y eviden- tes, y las mortalidades pueden
retrasarse hasta por una semana.

En muchos casos, las aves de corral que mueren por una manifestación aguda de
la enfer- medad carecen de lesiones patológicas visibles. En las infecciones
agudas encontradas en los pollos hay congestión pulmonar grave, hemorragias y
en los pollos muertos, edemas; los otros órganos y tejidos tienen una apariencia
normal. Se observan lesiones más variadas y visibles en pollos que sobreviven de
3 a 5 días incluyendo congestión y/o cianosis de la cresta y barbilla y cabezas
hinchadas. Los cambios en las crestas y barbillas evolucionan desde áreas de
depresión rojo oscuras a áreas azules de necrosis isquémica. Internamente, las
características de las infecciones agudas por virus causantes de la IAAP son
cambios hemorrágicos, necróticos, congestivos y trasudados. Frecuentemente, los
oviductos e intes- tinos muestran cambios hemorrágicos severos.

A medida que la enfermedad evoluciona, el páncreas, hígado, bazo, riñones y

pulmones pueden presentar focos necróticos amarillentos. Las hemorragias
(petequiales o equimóticas) cubren la grasa abdominal, superficies serosas y el
peritoneo. La cavidad peritoneal frecuentemente se llena con yemas de huevos
provenientes de la ruptura del ovario., aso- ciado con inflamación severa de los
sacos aéreos y peritoneo en aves que sobreviven de 7-10 días. Las hemorragias
podrían estar presentes en el proventrículo, especialmente en la unión con el
ventrículo (molleja).

En casos producidos por virus de la IA de leve patogenicidad, se pueden observar

lesio- nes en los senos, caracterizadas por inflamación catarral, serofibrinosa,
mucopurulenta o caseosa. La mucosa traqueal puede estar edematosa con
exudado variando de seroso o caseoso. Los sacos aéreos pueden estar
engrosados y contener exudado de fibrinoso a caseoso. Puede observarse
peritonitis de catarral a fibrinosa y peritonitis por la presencia de yemas de huevo

29
en la cavidad, enteritis de catarral a fibrinosa en los ciegos y/o intestino,
particularmente en pavos, y exudados en los oviductos de aves ponedoras
(Easterday et al 1997). Las lesiones histopatológicas previamente descritas no son
definitivas para diagnós- tico de IAAP, aunque la vasculitis en el cerebro y otros
órganos deben hacernos sospechar de la enfermedad.

DIAGNOSTICO
Los virus de la influenza aviar pueden identificarse a través de las pruebas de
reacción de cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR), la
detección del antígeno o el aislamiento viral en muestras de exudados de las vías
respiratorias y faríngeas. La prueba de RT- PCR es normalmente la primera que
se realiza para detectar la infección por virus de linaje asiático H5N1. El
aislamiento viral se realiza en los laboratorios de referencia H5 de la Organización
Mundial de la Salud (OMS). En los EE.UU, los Centros para el Control y

30
Prevención de Enfermedades de EE.UU. (CDC) confirman las muestras que
resultan positivas según las RT-PCR o las pruebas de antígeno. Las pruebas RT-
PCR y de antígeno de los virus de la influenza aviar deben realizarse en
laboratorios con condiciones de bioseguridad de nivel (BSL) 2. Se necesitan
laboratorios con condiciones de bioseguridad de nivel 3+ mejoradas para realizar
el aislamiento de los virus H5N1 de IAAP. La serología se ha utilizado para
vigilancia. El ensayo de microneutralización es la prueba más confiable para
detectar anticuerpos contra los virus de la influenza aviar.

Para realizar la detección del AIV se armaron pooles conteniendo 50 μl de cinco

hisopados cloacales. Aquellos pooles positivos fueron abiertos y cada uno de los
hisopos que lo componían fue analizado individualmente de la misma forma.

A. Extracción de ARN viral:

La extracción de ARN viral se realizó con el kit QIAamp Viral RNA Mini Kit
(QIAGEN, Valencia, CA, USA), con el fin de obtener un templado óptimo para los
estudios posteriores. Todas las muestras fueron procesadas de acuerdo con las
instrucciones del fabricante, utilizando 140 μl de suspensión de hisopo cloacal en
PBS. El ARN resultante se eluyó en un volumen final de 60 μl y se almacenó a -
70oC hasta su posterior utilización.

B. Síntesis de ADN complementario:

El ARN obtenido fue sometido a la reacción de transcripción reversa (RT),
mediante la utilización de la enzima High Capacity cDNA Archive kit (Applied
Biosystems, Foster City, CA, USA), de forma de obtener el ADN copia (ADNc).
Para ello se utilizaron 15 μl de ARN viral en un volumen final de reacción de 30 μl.
Las condiciones de temperatura y ciclado utilizadas fueron las especificadas por el
fabricante.

C. PCR en tiempo real:

31
La detección del AIV se realizó sobre el ADNc obtenido por medio de una reacción
en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real. Para tal fin, se utilizó la enzima
TaqMan PCR Universal Master Mix (Applied Biosystems) y un par de primers y
sonda dirigidos a amplificar una región del gen de la matriz (M), que detecta
cualquier subtipo de virus de influenza tipo A [86]. La reacción de PCR en tiempo
real se realizó en un equipo ABI Prism 7500 SDS (Applied Biosystems, Foster
City, CA, USA).

D. Aislamiento del Virus de Influenza Aviar:

El aislamiento viral se realizó a partir de cada hisopo que resultó positivo al AIV
por RT-PCR en tiempo real (rRT-PCR). El procedimiento para realizar el
aislamiento viral se llevo adelante dentro del laboratorio de bioseguridad del tipo
NSB4 OIE que el INTA posee en el Instituto de Virología. Para ello se utilizaron
huevos embrionados de pollo de 9-11 días de edad (Rosenbusch, CABA,
Argentina) libres de patógenos específicos (SPF). Brevemente, 200 μl del
hisopado cloacal fueron inoculados en la cavidad alantoidea de los huevos. Los
mismos se incubaron durante 72 horas y luego se cosechó el líquido alantoideo de
acuerdo con los protocolos estandarizados descriptos en el Manual de la OMS
sobre Influenza Animal Diagnóstico y Vigilancia [87] y de la normativa argentina. El
líquido alantoideo cosechado se almacenó a -70oC hasta su posterior utilización
para detección del Virus de Influenza Aviar como se detalló anteriormente en el
punto

E. Secuenciación del genoma del Virus de Influenza Aviar:

A partir del líquido alantoideo donde se pudo aislar el AIV se realizó la
secuenciación de los ocho segmentos genómicos virales. Brevemente, el ARN
viral se extrajo del fluido alantoideo utilizando el kit QIAamp Viral RNA Mini Kit
como se mencionó en el punto 4.1.2.1. Luego se realizó una RT seguida por una
PCR utilizando primers específicos para cada gen del AIV como se describió
previamente [88]. Los fragmentos amplificados por RT-PCR se resolvieron
mediante electroforesis en geles de agarosa al 1% y se purificaron con el kit

32
QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Valencia, CA, USA) según instrucciones del
fabricante. Finalmente, la secuenciación se realizó usando el kit de secuenciación
BigDye Terminator v3.1 en un analizador de ADN ABI PRISM 3700 (Applied
Biosystems, Foster City, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante.

F. Análisis filogenético del Virus de Influenza Aviar:

Las secuencias nucleotídicas y aminoacídicas consenso de cada uno de los
segmentos genómicos de los virus de influenza aviar fueron ensambladas y
editadas utilizando el programa Megalign de Lasergene 8,1 (DNASTAR, Madison,
WI, EE.UU.). Los análisis filogenéticos se realizaron con secuencias de genes del
AIV disponibles en el banco de datos de Influenza Research Database. El
programa BioEdit 7 se utilizó para la alineación y el análisis de residuos.

Para la construcción de los árboles filogenéticos se utilizó el programa MEGA 6.0.

En el mismo se realizó el análisis por el método de distancia Neighbor Joining (NJ)
aplicando el modelo de sustitución de nucleótidos de Kimura 2 parámetros. Para
evaluar la confiabilidad de los nodos de los árboles, se realizó la prueba de
remuestreo por la técnica de bootstrap (1000 réplicas).

33
PREVENCIÓN Y CONTROL
Las aves de corral pueden infectarse mediante el contacto con aves o fomites
recién introducidos y también mediante el contacto con aves silvestres,
particularmente aves acuáticas. Se puede disminuir el riesgo de infección
mediante un manejo de la parvada tipo todo adentro / todo afuera (se retira a
todos los animales juntos para desinfectar el área) y mediante la prevención del
contacto con aves silvestres o sus fuentes de agua. Las aves de corral
provenientes de mercados de aves vivas o del matadero no deben devolverse al
criadero. Además, es necesario mantener estrictas medidas de higiene y
bioseguridad para evitar la transmisión del virus en fomites.

34
Los brotes pueden controlarse mediante la rápida despoblación de las parvadas
infectadas y expuestas, la eliminación adecuada de materiales contaminados y
aves muertas y estrictas medidas de bioseguridad. Las granjas deben permanecer
en cuarentena, y se deben establecer controles de movimiento y vigilancia. Las
instalaciones infectadas deben limpiarse y desinfectarse cuidadosamente. Se
deben eliminar los insectos y los ratones de las instalaciones, luego se deben
despoblar las parvadas y destruir las aves muertas, para lo cual se pueden
enterrar o utilizar en tratamientos de compostaje o incinerar. Una vez que se
hayan sacrificado las aves, el estiércol y el alimento se deben trasladar a un piso
de cemento descubierto. Si el piso es de tierra, también se debe extraer 2cm o
más de suelo. El estiércol se puede enterrar a una profundidad de al menos 1,5m.
También se puede abonar durante 90 días o más, según las condiciones
ambientales. El compost se debe cubrir completamente con bolsas de polietileno
negras para evitar el ingreso de aves, insectos y roedores. Las plumas se pueden
quemar o utilizar como abono: o bien, se pueden extraer para luego rociar el área
con desinfectante. Se deben utilizar equipos rociadores de alta presión para
limpiar todos los equipos y las superficies del edificio. Una vez que todas las
superficies estén limpias y libres de material orgánico, se deben rociar todas las
instalaciones con un desinfectante residual aprobado.

Las vacunas para la IAAP no se usan en forma rutinaria en EE.UU. o en la

mayoría de los otros países; sin embargo, los países pueden considerar la
vacunación como una medida de control preventiva o auxiliar durante un brote.
Las vacunas aviares son generalmente autógenas o de los virus con el mismo
subtipo o tipo de hemaglutinina. En la actualidad, las vacunas con licencia en los
EE.UU. incluyen las vacunas H5 con virus enteros inactivados y las vacunas
recombinantes contra la viruela aviar. El uso de estas vacunas requiere la
aprobación del veterinario Estatal y, en el caso de las vacunas H5 y H7, la
aprobación del Departamento de Agricultura de Estados Unidos (USDA). Debido a
que las vacunas pueden permitir a las aves excretar el virus mientras permanecen
asintomáticas, es crucial que se realice una buena vigilancia y se controlen los

35
movimientos durante la campaña de vacunación. Los métodos usados para
reconocer infecciones por virus de campo en parvadas vacunadas incluyen
estrategias como “DIVA”, siglas en inglés (diferenciar animales vacunados de los
infectados) y el uso de aves centinela. La vacunación puede ejercer presiones de
selección en los virus de la influenza aviar y eventualmente podría provocar la
evolución de los aislamientos resistentes a las vacunas.
No debe alimentarse a los mamíferos con aves de corral u otras aves que puedan
estar infectadas con los virus H5N1 de linaje asiático o con otros virus de IAAP.
También debe evitarse que estos entren en contacto con parvadas y aves
silvestres posiblemente infectadas. Durante los brotes, los gatos y perros deben
permanecer, en lo posible, en espacios cerrados.

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