Design and Types of Bioreactors

En general, la mayoría de los sistemas de reacción biológica se pueden clasificar en

dos grupos principales: sistemas de suspensión y sistemas de inmovilización. Los
biorreactores de tanque agitado, airlift y de columna de burbujas se utilizan
principalmente para cultivos en suspensión; Los biorreactores de membrana, de
lecho empacado y de lecho fluidizado se utilizan principalmente para cultivar células
adheridas o reacciones de enzimas inmovilizadas. Obviamente, hay algunos
biorreactores que se pueden aplicar en estas dos categorías. Por ejemplo, con los
transportadores apropiados, las células o enzimas inmovilizadas en los
transportadores pueden suspenderse en biorreactores de tanque agitado (STR) o
biorreactores de columna de aire/burbujas.

Fundamental Design Principles

La función básica de un biorreactor es proporcionar condiciones óptimas para la

fisiología y el metabolismo celular mediante la regulación de varios factores
químicos y/o físicos. El diseño y la selección de cada tipo de biorreactores son
únicos, pero existen algunos principios básicos fundamentales. En general, los
criterios principales para el diseño de un biorreactor deben considerar una
transferencia de oxígeno adecuada, un esfuerzo cortante bajo y una mezcla
adecuada. Al considerar el diseño y la selección del reactor, los nutrientes deben
proporcionarse de manera efectiva a las células y los productos de desecho deben
eliminarse. El crecimiento celular y la cinética de formación de productos deben
evaluarse para poder definir una condición ambiental óptima y determinar un modo
operativo. Deben estudiarse los fenómenos de transporte, incluidos el mezclado, la
fuerza de corte y la transferencia de oxígeno, a fin de definir los criterios para el
diseño y el escalado de biorreactores. Los parámetros operativos, como la
temperatura, el pH, la concentración de OD y las concentraciones de sustrato,
deben ser fáciles de controlar y monitorear. Además, el biorreactor debe ser lo más
simple y económico posible y debe operar fácilmente sin contaminación con
microorganismos. En la industria biofarmacéutica, el diseño y la selección de
biorreactores también deben considerar el cumplimiento de las buenas prácticas de
fabricación actuales (cGMP). La mayoría de las veces, es difícil o imposible cumplir
con todos los requisitos, por lo que se debe hacer algún compromiso. Por ejemplo,
es muy importante dar una consideración equilibrada entre los requisitos de mezcla
y transferencia de masa y la sensibilidad al corte de las células en el diseño de
sistemas de biorreactores a gran escala.

Stirred-Tank Bioreactors / Biorreactores de tanque agitado

Los STR son uno de los biorreactores más convencionales. Debido a sus ventajas,
como la fácil ampliación, la buena mezcla de fluidos y la capacidad de transferencia
de oxígeno, los impulsores alternativos y el fácil cumplimiento de los requisitos de
cGMP, los STR se utilizan comúnmente. Sin embargo, este tipo de biorreactor
también tiene varias limitaciones, como el alto consumo de energía, el alto
cizallamiento y las preocupaciones sobre el sellado y la estabilidad de los ejes en
los biorreactores altos. En comparación con los microorganismos, tanto las células
animales como las vegetales son sensibles a la cizalladura, lo que da como
resultado esfuerzos notables para modificar y optimizar el sistema impulsor a fin de
equilibrar los requisitos de mezcla y transferencia de masa y el daño potencial por la
fuerza hidrodinámica. Se han realizado numerosas modificaciones de los STR
convencionales mediante el desarrollo de nuevos diseños de impulsores (Figura 2)
[4–8]. Varios investigadores han estudiado la hidrodinámica de múltiples sistemas
de impulsores [9–11]. Varios fabricantes biofarmacéuticos han implementado con
éxito STR en una escala de 10 000 a 20 000 l para cultivos de células animales a
gran escala (Tabla 1) [12, 13].

Pneumatically Agitated Bioreactors / Biorreactores agitados neumáticamente

El biorreactor neumático es un tipo de reactor de dispersión gas-líquido que consiste

en un recipiente cilíndrico, donde el aire comprimido o el gas la mezcla
generalmente se introduce en el fondo del recipiente a través de boquillas, placas
perforadas o un rociador de anillo, para aireación, mezcla y circulación de fluidos,
sin partes mecánicas móviles. Hay dos tipos principales de agitación neumática
biorreactores: biorreactores de columna de aire y de columna de burbujas, que
generalmente son de bajo esfuerzo cortante y de diseño y construcción simples.
Constan de un cuerpo principal; dispositivo de burbujeo de aire; generador de vapor
para esterilización; entrada de aire, sistema de ventilación de aire; varios controles
sistema de control de temperatura, oxígeno y pH; y sistemas de tuberías para el
transporte de vapor, aire, medios y masas de producto.
Los biorreactores Airlift (Figura 3) tienen algunas ventajas sobre los STR, como
distribuir la tensión de cizallamiento de manera más suave al no tener un mezclador.
o impulsor y fácil de construir y escalar a bajo costo. Sin embargo, la falta de un
impulsor también trae algunas desventajas como
como mala mezcla de fluidos para cultivos altamente viscosos en comparación con
STR y formación de espuma grave bajo alta aireación. Biorreactores Airlift ha
construido varias configuraciones para su uso en una variedad de procesos de
fermentación, cultivos celulares y aguas residuales biológicas
tratamiento. El biorreactor airlift es el segundo tipo que está bien documentado y
caracterizado, pero menos que el STR.
Membrane Bioreactors / Biorreactores de membrana

Los biorreactores de membrana, que utilizan membranas especializadas para

retener las células en los reactores, están diseñados para la separación de células
in situ. del medio e integre la producción y la separación en un solo paso. Las
principales ventajas de los biorreactores de membrana son la alta densidad celular,
alta productividad volumétrica y bajo esfuerzo cortante. Sin embargo, las
desventajas como la escasa viabilidad celular, el proceso deficiente la estabilidad
(ensuciamiento y obstrucción de la membrana), la falta de homogeneidad del
producto y los gradientes de difusión limitan las aplicaciones a gran escala. A pesar
de las debilidades, se han probado muchas configuraciones de membrana (como
biorreactores rotativos y de hoja plana) y, entre ellos, la configuración de fibra hueca
es particularmente interesante. Los reactores de membrana se han utilizado para
una enorme variedad de aplicaciones en cuatro áreas principales: biocatálisis,
fermentación, cultivos celulares y tratamientos de aguas residuales y gases
residuales.
Biorreactores de lecho fijo / Fixed-Bed Bioreactors
Los reactores de lecho fijo (empaquetado) son uno de los tipos de biorreactores
empleados con más frecuencia para sistemas de inmovilización. Este tipo de
biorreactor tiene las ventajas de la simplicidad de operación y altas velocidades de
reacción. Las enzimas o las células se inmovilizan de forma apropiada portadores,
que están empaquetados en los reactores fijos, lo que resulta en áreas de contacto
interfacial específicas sólidas-líquidas altas, y la velocidad del líquido que se arrastra
sobre las partículas sólidas estáticas alivia sustancialmente la resistencia de la
película a la transferencia de masa. Las principales desventajas del biorreactor de
lecho fijo son sus coeficientes de transferencia de calor y masa relativamente bajos
debido a las bajas velocidades del líquido. para aerobic.
Los sistemas biológicos, el contacto gas-líquido eficiente y la eliminación de dióxido
de carbono son muy críticos. Un reactor de lecho fijo a menudo acumula
bolsas de gas estancadas, que causan inundaciones de gas y producen una mala
distribución del líquido. Por lo tanto, no ha sido ampliamente utilizado en ejercicios
aeróbicos o procesos de fermentación microbiana.

Biorreactores de lecho fluidizado / Fluidized-Bed Bioreactors

El reactor de lecho fluidizado es otro biorreactor ampliamente utilizado para
sistemas de inmovilización. Un reactor de lecho fluidizado puede proporcionar una
grado de mezcla intermedio entre los dos extremos del reactor de lecho empacado y
el STR. Por un lado, la subida del movimiento del fluido transporta las células
inmovilizadas hacia arriba; las partículas suben hasta que la fuerza de la gravedad
hace que las partículas caigan. La fluidización se logra mediante el movimiento
combinado hacia arriba y hacia abajo de las partículas. En comparación con el
reactor de lecho fijo, elLas principales ventajas del biorreactor de lecho fluidizado
incluyen las siguientes: El sistema es homogéneo y más fácil de monitorear y
controlar los parámetros de funcionamiento; se logra una buena mezcla; se esperan
mayores tasas de transferencia de masa y de calor; y ampliar puede lograrse sin
aumentar los gradientes de concentración. Sin embargo, también existen
dificultades operativas. El gran problema es que no es fácil predecir los patrones de
retromezclado y fluidización. La aplicación del reactor de lecho fluidizado con células
inmovilizadas se ha logrado principalmente en el tratamiento de aguas residuales.
También se han empleado reactores fluidizados para micro portador culturas.

Biorreactores de onda / Wave Bioreactors

Los reactores de olas (Figura 4) [14] han surgido y se han aplicado en los últimos
años, que pueden generar un movimiento de olas al balanceo de una bolsa que
contiene cultivo de un lado a otro. Estas ondas proporcionan mezcla y transferencia
de masa, lo que resulta en un adecuado medio ambiente para el cultivo en
suspensión de células animales y vegetales. Varias líneas celulares, incluido el
ovario de hámster chino (CHO) celular.

Se han probado en el sistema. Además, el reactor utiliza una cámara desechable de

plástico pre esterilizada, lo que proporciona la máxima facilidad de operación y
protección contra la contaminación cruzada. La cámara se coloca sobre una
plataforma basculante especial y facilita el cumplimiento de cGMP. Recientemente,
estos sistemas de biorreactores de onda se han ampliado hasta una capacidad de
1000 l y una densidad celular de hasta 107 células. ml-1 se logró [14, 15].
11.1 Resumen de posibles operaciones de recuperación /
Bioprocess Engineering : An Introductory Engineering and Life
Science Approach

Las operaciones unitarias que se utilizan para recuperar bioproductos incluyen

aquellas que facilitan la desintegración de sólidos, la separación y recuperación de
sólidos y líquidos, la recuperación de moléculas solubles y las denominadas
operaciones de acabado que incluyen procesos como el secado y la cristalización.
Cada uno de estos se describe y evalúa con referencia a la descripción general de
los posibles pasos de recuperación como se describe en Figura 11.1. La primera
consideración en un programa de recuperación es, sin duda, optimizar el
rendimiento del producto en el proceso anterior. Una alta concentración de producto
que ingresa al programa de recuperación reduce el número y el tamaño de las
operaciones de procesamiento posteriores y los costos de recuperación asociados.
El primer paso físico en el proceso de recuperación es separar las células y el fluido
extracelular (Sección 11.2) para que la corriente relevante pueda ser procesada
para la recuperación del producto. Los pasos subsiguientes en el programa diferirán
dependiendo de si la corriente sólida o líquida ingresa al proceso. Si el producto se
solubiliza en la corriente líquida, la recuperación de la corriente líquida se realiza
mediante operaciones unitarias diseñadas para concentrar y purificar una molécula
soluble (Sección 11.4). Es recomendable realizar primero aquellas operaciones
unitarias que proporcionen algún grado de concentración para que las etapas
posteriores de purificación puedan realizarse con menos material. Esto es
especialmente importante durante la recuperación de biomoléculas especializadas
que requieren equipos costosos
(por ejemplo, ciertos tipos de cromatografía) para cumplir con las especificaciones
de alta pureza. Para un producto que está asociado con la corriente sólida, ya sea
dentro del citoplasma o adherido a la superficie celular, se deben realizar
operaciones iniciales para extraer el producto antes de que pueda tener lugar la
purificación. Esto requiere la desintegración de la célula y la posterior separación del
extracto celular de los desechos celulares (Sección 11.3). El extracto celular luego
ingresa a uno o más de los procesos diseñados para concentrar y purificar una
molécula soluble (Sección 11.4). Por supuesto, si el producto son las propias
células (por ejemplo, S. cerevisiae y S. carlsbergensis destinadas a las industrias de
alimentos y bebidas), solo se requieren operaciones de acabado como el secado.

12.3 SÍNTESIS DE PROCESOS DE BIOSEPARACIÓN

El desarrollo de un diagrama de flujo para la recuperación y purificación de un

producto biológico es un proceso creativo que se basa en la experiencia y la
imaginación del ingeniero. Se han hecho intentos para capturar esa experiencia en
la computadora en forma de sistemas expertos [3-6] y automatizar hasta cierto
punto las tareas de síntesis del proceso. Los ingenieros experimentados confían en
gran medida en ciertas reglas generales, también conocidas como heurísticas, para
armar el esqueleto de un proceso de recuperación y purificación [7]. Algunas de
estas heurísticas son las siguientes:

1. Retire primero las impurezas más abundantes.

2. Elimine primero las impurezas más fáciles de eliminar.
3. Haz que las separaciones más difíciles y costosas duren.
4. Seleccionar procesos que hagan uso de las mayores diferencias en las
propiedades de el producto y sus impurezas.
5. Seleccionar y secuenciar procesos que exploten diferentes fuerzas impulsoras de
separación.

La figura 12.2 proporciona una estructura generalizada para crear una

representación de diagrama de bloques inicial de un proceso de recuperación de
productos. Para cada categoría de producto (intracelular o extracelular) existen
varias ramas en la ruta principal. La selección entre las ramas y operaciones
unitarias alternativas se basa en las propiedades del producto, las propiedades de
las impurezas y las propiedades de los microorganismos, células o tejidos
productores. Por lo tanto, la síntesis de bioprocesos consiste en secuenciar los
pasos de acuerdo con las cinco heurísticas anteriores y la estructura de la figura
12.2. La mayoría de los bioprocesos, especialmente aquellos empleados en la
producción de productos de alto valor y bajo volumen, operan en modo discontinuo.
Por el contrario, los procesos continuos de bioseparación se utilizan en la
producción de productos bioquímicos básicos, como ácidos orgánicos y
biocombustibles.

Etapas de recuperación primaria

La recuperación primaria abarca los primeros pasos del procesamiento posterior
donde se produce cierta purificación y reducción del volumen del caldo. La
recuperación primaria incluye tanto la etapa de separación de sólidos como partes
de las etapas de aislamiento del producto discutidas en el Capítulo 1 (Tabla 1.10).
El primer paso depende de si el producto es intracelular (permanece dentro del
microorganismo después de su expresión) o extracelular (secretado en la solución).
Casi todos los bioproductos de bajo peso molecular son extracelulares, al igual que
muchos que tienen un alto peso molecular. La recuperación y purificación es más
fácil para estos bioproductos que para los productos intracelulares debido a la
menor cantidad de impurezas presentes. La mayoría de las proteínas eucariotas
recombinantes producidas por procariotas los microorganismos son productos
intracelulares (consulte el Capítulo 3 para conocer las definiciones de células
procariotas y eucariotas). Estas proteínas se acumulan dentro de la célula huésped.

en forma nativa o desnaturalizada; los productos intracelulares desnaturalizados a

menudo forman cuerpos de inclusión insolubles (IB). A continuación se incluye una
breve revisión de los pasos de recuperación primaria más comunes (descritos en los
Capítulos 3, 4, 5 y 6), y se incluyen varios fundamentos para la selección de la
operación de la unidad. El proceso de insulina humana analizado en este capítulo
proporciona información adicional sobre la recuperación y purificación de productos
intracelulares ecuperación de productos intracelulares.
Recuperación de productos intracelulares

Recolección de células
El primer paso de purificación de los productos intracelulares es la recolección de
células. La eliminación del líquido extracelular está de acuerdo con la primera
heurística general: eliminar primero las impurezas más abundantes. Como se ve en
la Figura 12.2, la centrifugación y la filtración por membrana (ya sea microfiltración o
ultrafiltración) son las únicas técnicas utilizadas para la recolección de células a gran
escala. Como se explicó en el Capítulo 5, la centrifugación tiene ventajas para
microorganismos grandes y densos (diámetro >2 um y densidad >1,03 g/cm³). Por
ejemplo, la centrifugación es muy eficiente para recolectar levadura. Para
microorganismos más pequeños, se pueden usar varias técnicas de coagulación
para aumentar el tamaño de las partículas sedimentadas (consulte el Capítulo 3). La
filtración por membrana tiene ventajas para recolectar células pequeñas y livianas.
Otra ventaja de la filtración por membrana es su recuperación superior del producto.
La pérdida de células durante la centrifugación suele ser del 1 al 5%. Sin embargo,
con la filtración por membrana, esencialmente todas las células se recuperan a
menos que haya una ruptura celular (lisis) o que las membranas se rompan.
Interrupción celular El segundo paso para los productos intracelulares suele ser la
disrupción celular, que sirve para romper las células huésped y liberar el producto
intracelular. Las diversas opciones para la disrupción celular se presentan en el
Capítulo 3. La disrupción de bacterias y levaduras se lleva a cabo mediante
homogeneizadores de alta presión o molinos de perlas [8]. Para grandes
capacidades (varios metros cúbicos por hora) sólo son prácticos los
homogeneizadores de alta presión. El choque osmótico se utiliza a menudo para la
liberación de productos periplásmicos que se acumulan entre la membrana celular y
la pared celular. Antes de la interrupción, el concentrado a menudo se diluye (entre
un 5 y un 10 %) con un "tampón de lisis" para crear condiciones que minimicen la
desnaturalización del producto tras su liberación de la célula. Para microorganismos
difíciles de alterar, se requieren múltiples pases de homogeneización a 500 a 1000
bar. También se requieren pases múltiples si el producto forma cuerpos de inclusión.
Esto permite que se libere el SII y rompe los desechos celulares en partículas muy
pequeñas, lo que facilita la separación de los IB de los desechos celulares aguas
abajo. Parte de la degradación del producto también ocurre durante la ruptura
celular como resultado del alto cizallamiento en las interfases y la oxidación.

Eliminación de desechos celulares

Los desechos celulares generados por la ruptura celular generalmente se eliminan

mediante centrifugación o microfiltración. Otras opciones incluyen la filtración
rotatoria al vacío, la filtración en prensa, la filtración profunda, la extracción y la
cromatografía de adsorción en lecho expandido (EBA). Producto Soluble. Cuando el
producto es soluble, se recupera durante la eliminación de restos celulares en la
fase ligera de una centrífuga o en la corriente de permeado de un filtro. Las
centrífugas solo pueden separar de manera eficiente partículas bastante grandes de
restos celulares (> 0,5 um de diámetro de Stokes). Por lo tanto, cuando se utiliza
una centrífuga para la eliminación de restos celulares, debe seguir un paso de
filtración de pulido después de la centrifugación para eliminar pequeñas partículas
de desecho que, de lo contrario, podrían causar graves problemas en los procesos
posteriores, como la cromatografía. Para el pulido se pueden utilizar filtros de varios
tipos (p. ej., microfiltros de profundidad, de prensa, de vela, de vacío rotatorio, de
membrana). Como alternativa, estos filtros se pueden utilizar para la eliminación de
restos celulares sin un paso de centrifugación anterior. Es muy difícil predecir a priori
qué filtro funcionará mejor para un producto específico, por lo que normalmente se
utilizan pruebas de laboratorio y de escala piloto para tomar esta decisión. Además,
cuando se utilizan microfiltros para la eliminación de desechos celulares, se requiere
cierto grado de diafiltración para lograr un rendimiento de recuperación de producto
aceptable. Producto insoluble. Cuando el producto es insoluble y forma cuerpos de
inclusión. primero debe separarse de las partículas de restos celulares, luego
disolverse y replegarse (consulte el ejemplo de insulina más adelante en este
capítulo para obtener información adicional sobre el tema). Afortunadamente, los
cuerpos de inclusión suelen tener un gran diámetro (0,3-1,0 um) y una alta densidad
(1,3-1,5 g/cm³) [9] y se pueden separar de los restos celulares con una centrífuga de
discos (Capítulo 5). Los cuerpos de inclusión se recuperan en la fase pesada de la
centrífuga, mientras que la mayoría de las partículas de restos celulares
permanecen en la fase ligera. La fase pesada normalmente se resuspende y se
vuelve a centrifugar dos o tres veces para alcanzar un alto grado de pureza de los
cuerpos de inclusión. A menudo se practica la resuspensión en una solución de baja
concentración de un agente caotrópico, como un detergente, para facilitar la
eliminación de otros contaminantes. El pH y la fuerza iónica de la solución se
ajustan para reducir la hidrofobicidad de las partículas de restos celulares y mejorar
su eliminación en la fase ligera. La pureza del producto final superior al 70% es
bastante común.

Extracción/adsorción del producto

La separación del producto soluble de los restos celulares se puede llevar a cabo
mediante extracción y/o adsorción. Los solventes orgánicos se usan comúnmente
como extractantes para productos de bajo peso molecular, como varios antibióticos.
Los sistemas acuosos de dos fases han encontrado aplicaciones para la
recuperación de proteínas. Los criterios para la selección del extractante son los
siguientes: (a) el coeficiente de partición del producto debe ser mayor que el
coeficiente de partición de los contaminantes, (b) el extractante no debe degradar el
producto, (c) el extractante no debe ser costoso y debe ser fácil de recuperar o
desechar (consulte el Capítulo 6 para obtener información más detallada sobre la
extracción). Alternativamente, la separación del producto de los desechos y la
concentración simultánea se pueden lograr mediante técnicas de adsorción [10].
Pueden usarse adsorbentes de varios tipos (p. ej., intercambio iónico, fase inversa,
afinidad). Este tipo de purificación requiere que las células rotas y el producto se
mezclen en un tanque agitado con un adsorbente. Un paso de lavado, en el que la
mayoría de las partículas de desechos celulares y los contaminantes se eliminan,
sigue a la adsorción del producto. La cromatografía de adsorción en lecho
expandido (EBA) es una tecnología alternativa para separar las proteínas de las
partículas de desechos celulares [11]. La alimentación se bombea hacia arriba a
través de un lecho expandido. Las proteínas diana se unen al adsorbente mientras
pasan los restos celulares y otros contaminantes. Un paso de lavado elimina todo el
material débilmente retenido. Sigue un paso de elución que libera y purifica aún más
el producto (consulte el Capítulo 7 para obtener información más detallada sobre la
adsorción)

Recuperación de Productos Extracelulares

Eliminación de biomasa

De acuerdo con la segunda heurística genérica (Eliminar primero las impurezas más
fáciles de eliminar), la eliminación de biomasa suele ser el primer paso del
procesamiento posterior de los productos extracelulares. Este paso se puede lograr
mediante el uso de una (o más) de las siguientes operaciones unitarias: filtración
rotatoria al vacío, centrifugación de disco apilado o decantador, filtración de prensa,
microfiltración, ultrafiltración y flotación. Dado que cada operación unitaria tiene
ventajas y desventajas para diferentes productos y microorganismos, la selección de
la(s) mejor(es) operación(es) unitaria(s) para un sistema dado puede ser difícil.
Filtración rotatoria al vacío. La filtración rotatoria al vacío, especialmente con
precapa, es el método clásico para la eliminación de organismos miceliales [12]. Los
filtros de vacío rotativos pueden funcionar continuamente durante largos períodos de
tiempo (consulte el Capítulo 4). Además, el caudal de filtrado en estas unidades
suele ser superior a los 200 litros m2 h y puede alcanzar los 1000 litros m2 h. La
desventaja más importante de este tipo de unidad es el problema con la eliminación
de la mezcla de ayuda de filtración y biomasa. El auxiliar de filtración se agrega en
cantidades iguales o mayores que la biomasa. Las estrictas leyes ambientales han
hecho que sea costoso deshacerse de tales materiales sólidos. Por lo tanto, si el
costo de eliminación de la ayuda de filtración es relativamente alto donde se va a
construir una nueva planta, se deben considerar operaciones unitarias alternativas
para la separación de biomasa. Sin embargo, si el costo de eliminación del auxiliar
de filtración es relativamente bajo, un filtro de vacío rotatorio es una buena opción.
El proceso de ácido cítrico, que se describe más adelante en este capítulo, ofrece
un ejemplo en el que se utiliza la filtración rotatoria al vacío para la eliminación de
biomasa.

Centrifugación. Las centrífugas de disco y decantador se utilizan con frecuencia a

gran escala [13, 14]. Las centrífugas de pila de discos funcionan a velocidades de
rotación más altas y eliminan microorganismos más pequeños y livianos. Sin
embargo, con el uso de agentes floculantes, el rendimiento de la centrífuga
decantadora mejora y la elección entre los dos tipos se vuelve más difícil. Parece
que el único criterio que se aplica cuando se elige la pila de discos en lugar del
decantador es la capacidad de eliminar los microorganismos pequeños y ligeros. La
centrifugación no requiere ayuda de filtración, lo cual es una ventaja significativa
sobre la filtración rotatoria al vacío. En general, la pasta centrífuga contiene de 40 a
60 % v/v de líquido extracelular. Para recuperar el producto disuelto en ese líquido,
se suele lavar y volver a centrifugar la pasta. Filtración por membrana. Con los filtros
de membrana (micro y ultrafiltros), el producto extracelular pasa a través de la
membrana mientras que la biomasa y otros componentes de partículas permanecen
en el concentrado. La concentración suele ir seguida de diafiltración para evitar la
degradación del producto y/o mejorar el rendimiento del paso siguiente. (consulte el
Capítulo 4 para obtener más información sobre el modo de funcionamiento de los
filtros de membrana). Los filtros de membrana se utilizan para la eliminación de
biomasa principalmente en la recuperación de productos de bajo peso molecular,
como los antibióticos del micelio. Para productos de alto peso molecular, la
formación de una capa de gel a menudo limita la aplicación a casos en los que la
cantidad de sólidos es bastante pequeña (p. ej., cultivo celular).

Etapas Intermedias de Recuperación

Las etapas de recuperación primarias que acabamos de describir son seguidas por
las etapas intermedias, en las que el producto se concentra y se purifica más. La
recuperación intermedia tiene similitudes con las etapas de aislamiento del producto
discutidas en el Capítulo 1 (Tabla 1.10). Si el producto es soluble, la concentración
del producto suele ser el primer paso. Si el producto está desnaturalizado e
insoluble, primero se disuelve y repliega y luego se concentra y purifica.

Concentración de producto Después de la separación primaria, el producto suele

estar en una solución diluida. La reducción de volumen por concentración está de
acuerdo con las heurísticas 1 y 2. Las opciones de concentración comunes incluyen
ultrafiltración, ósmosis inversa, evaporación, adsorción, precipitación, extracción y
destilación.

Ultrafiltración La ultrafiltración se utiliza ampliamente para la concentración de

soluciones de proteínas. El límite de peso molecular de la membrana se selecciona
para retener el producto mientras permite que las impurezas indeseables
(principalmente solutos de bajo peso molecular) pasen a través de la membrana. La
baja temperatura de operación y la purificación lograda junto con la concentración
son algunas de las ventajas de la ultrafiltración sobre la evaporación. La presión
transmembrana de operación típica es de 2 a 5 bar y el flujo promedio es de 20 a 50
litros mh.

Osmosis inversa Las membranas con tamaños de poro más pequeños se utilizan
para filtros de ósmosis inversa. El proceso de ósmosis inversa se puede utilizar
cuando se concentran productos de peso molecular medio a bajo (p. ej., antibióticos,
ciertos aminoácidos).

Evaporación Los evaporadores de película agitada pueden operar a temperaturas

relativamente bajas (40 a 50 C) bajo vacío. Estas unidades compiten en el mercado
con la ultrafiltración y la ósmosis inversa para concentrar compuestos de bajo y alto
peso molecular. Sin embargo, a diferencia de la ultrafiltración, la evaporación carece
de la capacidad de proporcionar purificación durante la concentración. Las ventajas
incluyen la capacidad de concentrarse a una concentración final de sólidos más alta
y la capacidad de manejar grandes rendimientos. 1151 Consulte el Capítulo 10 para
obtener más información sobre los diferentes tipos de evaporados.
Precipitación La precipitación se utiliza a menudo para la concentración y la
purificación. El fraccionamiento de proteínas sanguíneas (consulte el Capítulo 8) y la
producción de ácido cítrico (consulte más adelante la Sección 12.6.1) constituyen
aplicaciones típicas. La adición de sales, solventes y polímeros y los cambios en el
pH, la fuerza iónica y la temperatura se usan comúnmente para precipitar
selectivamente Diseño y Economía de Bioprocesos 451 compuestos de interés [16].
La precipitación a menudo sigue a una extracción llevada a cabo en un sistema
acuoso bifásico de polimerasal (por ejemplo, PEG y fosfato de potasio). Cuando el
producto se recupera en la fase rica en polímeros. la precipitación se logra mediante
la adición de más polímero. Es importante por razones económicas recuperar y
reciclar los materiales precipitantes. La precipitación también se utiliza para eliminar
contaminantes (ácidos nucleicos 1.c.) mediante la adición de sulfato de manganeso
(MnSO4) y sulfato de estreptomicina,
Destilación El proceso de destilación se utiliza para concentrar y purificar
compuestos volátiles y de bajo peso molecular, como acetona, etanol, butanol, ácido
acético, etc.

Pervaporación Este proceso basado en membranas ha encontrado aplicaciones en

biocombustibles para la deshidratación de etanol y otros alcoholes. Un componente
de una mezcla líquida penetra selectivamente a través de una membrana,
impulsado por un gradiente en la presión de vapor parcial y sale de la membrana
como vapor [17]. La deshidratación de los solados azeotrópicos de agua con etanol
(alrededor del 90 % de etanol) se facilita mediante el uso de membranas hidrófilas
se utilizan para la eliminación/recuperación de pequeñas cantidades de compuestos
orgánicos de soluciones acuosas.

Renaturalización de productos Las proteínas eucariotas producidas por

microorganismos procariotas a menudo forman cuerpos de inclusión insolubles en la
célula huésped. Los cuerpos de inclusión (IB) se pueden disolver rápidamente
usando soluciones de caotropos fuertes, como clorhidrato de guanidina 6 M o urea,
en presencia de un agente reductor, como 2-mercaptoetanol 0,5 M o ditiotrictol 50
mM [18]. A continuación, se permite que la proteína disuelta vuelva a plegarse a su
conformación nativa eliminando los agentes caotrópicos mediante diafiltración,
dilución o cromatografía, con concentraciones finales de proteína en el intervalo de
10 a 100 mg/litro. La dilución es necesaria para minimizar las interacciones
intermoleculares, que ocurren durante el replegamiento del producto y pueden
conducir a la inactivación del producto. La adición de pequeñas cantidades de tioles
como glutatión reducido (1-5 mM) y glutatión oxidado (0,01-0,5 mM) y la incubación
a 35 a 40 C durante 5 a 10 h completa el proceso de replegamiento. Por lo tanto,
elegir un proceso aguas arriba que forme IB implica tener en cuenta los grandes
volúmenes que se producen y, por tanto, los grandes flujos de residuos. Se puede
encontrar más información sobre la solubilización de IB y el replegamiento de
proteínas en el ejemplo de insulina (ver más adelante la Sección 12.6.2) y también
en "Solubilización y replegamiento de proteínas en cuerpos de inclusión en la
Sección 14.81 12.3.3

Etapas de Purificación Final

Los pasos finales de purificación dependen de la pureza requerida del producto

final. La purificación final incluye las etapas de purificación y pulido discutidas en el
Capítulo 1 (Tabla 1101) Los productos farmacéuticos requieren alta pureza, mientras
que los industriales los productos requieren menor pureza. Para productos de
pureza relativamente baja, como las enzimas industriales, el paso final de
purificación es la deshidratación o, más generalmente, un paso de eliminación del
solvente. Para productos de alta pureza, las etapas finales de purificación suelen
incluir una combinación de etapas cromatográficas y de filtración [19]. Si el producto
final se requiere en forma sólida, sigue un paso de deshidratación o eliminación del
solvente.

Cromatografía La cromatografía generalmente se realiza más adelante en un

proceso de acuerdo con la tercera heurística genérica (hacer que las separaciones
más difíciles y costosas duren). Con los pasos de separación anteriores, se elimina
una gran fracción de los contaminantes, lo que reduce el volumen de material que
debe tratarse más. Por lo general, se requiere una secuencia de pasos
cromatográficos para lograr la pureza del producto final deseada, y las heurísticas
genéricas cuarta y quinta son buenas guías para seleccionar y secuenciar dichos
pasos [20]. Por ejemplo, según la quinta heurística, un paso de intercambio iónico
no debe ir seguido de otro paso del mismo tipo. En su lugar, debe ser seguido por
una fase reversa, afinidad o cualquier otro tipo de cromatografía que aproveche una
fuerza impulsora de separación diferente. Las unidades de adsorción de membrana
combinan el alto flujo de los filtros de membrana con la unión selectiva de resinas
cromatográficas [21. 22]. Como resultado, tienen ventajas en comparación con la
cromatografía en columna tradicional cuando funcionan en modo de flujo continuo
para eliminar pequeñas cantidades de contaminantes específicos. La membrana
retiene ciertas impurezas (por ejemplo, fragmentos de moléculas de ADN) mientras
que las moléculas del producto pasan a través de la membrana. Dichos sistemas de
membrana se utilizan típicamente como el último paso de los procesos de
purificación de proteínas biofarmacéuticas. La cromatografía de lecho móvil
simulado (SMB) es el método de elección para manejar grandes volúmenes de
material [23, 24]. Ha encontrado aplicaciones en la purificación de aminoácidos,
jarabe de maíz alto en fructosa, proteínas de suero de queso, ácido láctico, ácido
succínico, etc. En sistemas SMB. múltiples columnas operan fuera de fase utilizando
un complejo sistema de válvulas. La corriente de alimentación generalmente pasa a
través de dos columnas, lo que resulta en un mayor rendimiento y resolución. Una
columna siempre está fuera de uso para la limpieza Los sistemas SMB pueden
manejar corrientes de alimentación de flujo continuo, que es el método de operación
preferido para la producción de bioquímicos de alto volumen. Los pasos de filtración
por membrana se emplean comúnmente entre los pasos cromatográficos para
intercambiar tampones y concentrar las soluciones de productos diluidos. Consulte
el Capítulo 7 para obtener información detallada sobre los métodos de separación
cromatográfica y el Capítulo 4 para los pasos intermedios de filtración por
membrana. Los ejemplos de insulina y anticuerpos monoclonales que se presentan
más adelante en este capítulo brindan información adicional sobre la selección y el
funcionamiento de las unidades de separación cromatográfica y operación de
unidades de separación cromatográfica.

Cristalización y Precipitación Fraccionada La cristalización y la precipitación

fraccionada a veces pueden resultar en una purificación significativa. ficación
Debido a que estos procesos son más baratos de operar que la cromatografía,
siempre debe ser considerado. La forma cristalina de un bioproducto es
especialmente Diseño y Economía de Bioprocesos 453 ventajoso, ya que la pureza
puede ser bastante alta y los cristales generalmente se pueden almacenar durante
largos periodos de tiempo. Consulte los capítulos 8 y 9 para obtener una discusión y
un análisis detallados de la precipitación y la cristalización. El proceso del ácido
cítrico que se analiza más adelante en este capítulo es un buen ejemplo de un
producto que se recupera y purifica mediante precipitación y cristalización.

Deshidratación o Eliminación de Solventes La deshidratación o eliminación de

solventes se logra con secadores. Los secadores por aspersión, de lecho fluidizado
y de bandeja se utilizan cuando los productos pueden soportar temperaturas de 50 a
100 C. Los liofilizadores se utilizan para productos que se degradan a altas
temperaturas. Los secadores por congelación requieren altos gastos de capital y
deben evitarse si es posible. Consulte el Capítulo 11 para obtener información
detallada sobre el secado del producto.

12.3.4 Emparejamiento de operaciones unitarias en la síntesis de

procesos

Además de usar reglas empíricas, o heurísticas, para sintetizar procesos de

bioseparación. a menudo es ventajoso considerar cómo se pueden combinar dos
operaciones unitarias para mejorar eficiencia del proceso. La siguiente sección
enumera algunos ejemplos de operaciones que son lógicas para emparejar.

Extracción y Precipitación El bioproducto se extrae con un solvente y luego se

precipita. Para aumentar el rendimiento, a menudo es deseable concentrar el
extracto antes de la precipitación. El principal obstáculo a superar para este
emparejamiento es encontrar un solvente que funcione tanto con la extracción como
con la precipitación.
Cromatografía de precipitación e interacción hidrofóbica El emparejamiento de
la cromatografía de precipitación e interacción hidrofóbica es habitual. aliado logrado
para la purificación de proteínas mediante el uso de sulfato de amonio para
precipitar las impurezas, dejando el bioproducto deseado en las aguas madres. El
sulfato de amonio se agrega a una concentración justo por debajo de la necesaria
para precipitar el bioproducto. Después de eliminar las impurezas precipitadas, las
aguas madres se pueden aplicar directamente a una columna de cromatografía de
interacción hidrófoba, que se equilibró con la concentración de sulfato de amonio en
las aguas madres antes de la carga. El bioproducto se adsorbe a la columna en
estas condiciones. La columna se eluye con un gradiente inverso de sulfato de
amonio y el bioproducto deseado se recupera en una fracción de la elución.

Filtración y Extracción Cuando el bioproducto está contenido en el filtrado

después de la filtración, a menudo se puede extraer con un solvente inmiscible.
Para la extracción de moléculas pequeñas como los antibióticos con solventes
orgánicos, el pH generalmente se debe ajustar para obtener el bioproducto en su
forma de base libre o de ácido libre para que se divida en el fase orgánica. Para la
extracción bifásica acuosa de proteínas, se deben agregar dos polímeros o una sal
y un polímero. Si las adiciones al filtrado se pueden realizar en línea. los pasos de
filtración y extracción se pueden realizar simultáneamente, reduciendo el tiempo de
procesamiento.