Bioquímica Agrícola: Manual de Prácticas (2022) M. Olivares de la Cruz, M. Salazar C.

PRACTICA DE LABORATORIO Nº 7
DEMOSTRACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LA CADENA RESPIRATORIA:
INDICADORES DE ÓXIDO-REDUCCIÓN Y EFECTO DE INHIBIDORES

I. INTRODUCCIÓN
A parte de los microorganismos anaeróbicos y de los vegetales durante la
fotosíntesis, casi todos los seres vivos necesitan en forma obligada o absoluta del
suministro de oxígeno para la respiración. La respiración consiste en la transferencia
o transporte de electrones generados por la oxidación de sustratos, desde moléculas
reducidas del tipo NADH y del FADH2 hasta el O2 como aceptor final. Los productos
finales de esta cadena respiratoria son el agua y un gradiente electroquímico de
protones utilizados para generar energía libre en forma de ATP a través del
acoplamiento de la fosforilación oxidativa.
La cadena respiratoria está constituida por cuatro grandes complejos enzimáticos
firmemente unidos dentro de la membrana mitocondrial interna y que actúan en
estrecha asociación física. El complejo I está representado por la NADH: ubiquinona
óxidorredeuctasa y su función específica es transportar electrones del NADH a la
coenzima Q y bombear protones al espacio intermembranal. El complejo II está
formado por la succinato: ubiquinona oxidorreductasa y su función es transportar
electrones del succinato a la coenzima Q. El complejo III está conformado por la
ubiquinol: ferricitocromo C oxidorreductasa y su función es transferir electrones de la
dihidroubiquinona al citocromo C. El complejo IV está constituido por la citocromo
oxidasa (ferrocitocromo: oxígeno óxidorreductasa) y su función es transferir sus
electrones al oxígeno para formar agua en la última etapa de la respiración.
Diversas sustancias inhiben la cadena respiratoria, tanto en mitocondrias aisladas,
células intactas, como en tejidos, produciendo por tanto deficiente oxidación de los
sustratos y por ello deficiente respiración celular. En suma, existen tres tipos de
inhibidores de la cadena respiratoria o de la fosforilación oxidativa. Los inhibidores
específicos de lugar bloquean las reacciones específicas asociadas a los complejos I,
III y IV de la cadena respiratoria; los inhibidores no específicos de lugar
(antibióticos como la oligomicina, glucósidos vegetales tóxicos, etc.) bloquean
directamente la fosforilación, lo cual puede conducir a la inhibición de la oxidación;
los desacopladores de la fosforilación oxidativa (salicilato libre como un
metabolito de la aspirina, 2,4 – dinitrofenol, bilirrubina, etc.) debilitan o destruyen
completamente el firme acoplamiento normal entre oxidación y fosforilación.
Medicamentos como los barbitúricos, demerol y mercuriales, el antibiótico
pierecidina A, y el veneno de peces rotenona, actúan, al parecer en el mismo sitio,
inhibiendo el complejo I; por tanto bloquean la oxidación de los sutratos que
requieren de NAD, FMN y FeS. El complejo II es inhibido tanto, a nivel de
transferencia de equivalentes reductores desde el FAD, FeS a la CoQ, por la
carboxina y la 2´ tenoil–fluorato acetona (TIFA: agente quelante del hierro), y a nivel
de la succinato deshidrogenasa por el malonato (inhibidor competitivo).

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El complejo III se inhibe por medio del antibiótico antimicina A, HQNO,

mixotiazol y 2,3 dimercaptopropanol (BAL). El complejo IV se inhibe por los
venenos KCN (cianuro), CO y H2S. En suma, el estudio del efecto de los inhibidores
permite la comprensión de las causas de toxicidad de estos compuestos y, finalmente,
permite obtener información sobre la estructura y función de la cadena respiratoria.

II. COMPETENCIA
Demuestra la actividad de la cadena respiratoria, la acción de indicadores de óxido-
reducción y el efecto de inhibidores, empleando con responsabilidad enzimas de
óxido-reducción presentes en las células de un homogenizado hepático.

III. MATERIAL
1. Material biológico: Homogenizado de hígado de pollo, perro, rata o cobayo.
2. Material y equipo de laboratorio:
• Gradillas para tubos (2). Tubos de ensayo de 13 x 100 mm (11).
• Pipetas de vidrio de 1 mL (3), 2 mL (2) y 5 mL (2).
• Jeringa de vidrio y/o descartable.
• Balanza. Tijera o cuchillo.
• Mortero y gasa de algodón.
3. Reactivos y soluciones:
• Solución de KCl 0.154 M.
• Buffer fosfato de sodio 0.1 M, pH 7.4
• 2,6 diclorofenol indofenol 0.02%.
• Solución de succinato 0.1 M.
• Solución de malonato 0.1 M.
• Solución de cianuro de potasio 0.1 M.
• Solución de barbiturato de sodio 0.1M.
• p-Fenilendiamina 1% en KCl 0.154 M.

IV. PROCEDIMIENTO
A) Sistema de incubación con el sustrato oxidable succinato:
TUBOS
COMPONENTES (mL)
1 2 3 4 5 6
Buffer fosfato de sodio 0.1 M, pH 7.4 1.5 1.2 1.0 0.5 0.5 0.5
2,6 diclorofenolindofenol 0.02% 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
Succinato 0.1 M 0.2 --- 0.2 0.2 0.2 0.2
Malonato 0.1 M --- --- --- 0.5 --- ---
Cianuro de sodio 0.1M --- --- --- --- 0.5 ---
Barbiturato de sodio 0.1M --- --- --- --- --- 0.5
Homogenizado hepático al 10% --- 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
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Mezclar suavemente y dejar en reposo a temperatura ambiental por espacio de 15

minutos.
Observar, registrar e interpretar los resultados según la decoloración del
indicador en cada uno de los tubos, pasados los 15 minutos: Azul (oxidado) →
Incoloro (reducido). El succinato se oxida al ceder los H y e– al indicador.

B) Sistema de incubación con el sustrato indicador p-Fenilendiamina:

TUBOS
COMPONENTES (mL)
1 2 3 4 5
Buffer fosfato de sodio 0.1 M, pH 7.4 1.5 1.2 1.0 0.5 0.5
Cianuro de sodio 0.1M --- --- 0.5 --- ---
Malonato 0.1 M --- --- --- 0.5 ---
Barbiturato de sodio 0.1M --- --- --- --- 0.5
p-Fenilendiamina 1% en KCl 0.154 M 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Homogenizado hepático al 10% --- 0.5 0.5 0.5 0.5

Mezclar suavemente y dejar en reposo a temperatura ambiental durante 15

minutos.
Observar, registrar e interpretar los resultados según los cambios de color del
sustrato-indicador en cada uno de los tubos, pasados los 15 minutos: Incoloro
(reducido) → Grosella oscuro/Marrón (oxidado). La p-Fenilendiamina se oxida
al ceder los H y e– al complejo IV.

V. RESULTADOS
A) Sistema con el sustrato oxidable succinato:

EVIDENCIA / TUBOS
INDICADOR 1 2 3 4 5 6

Color inicial

Color final (después

de 15 minutos)
Ocurrió óxido-
reducción: (SI / NO)
Ocurrió inhibición:
(SI / NO)

Interpretación:
Tubo 1: ---------------------------------------------------------------------------------------------
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Tubo 2: ---------------------------------------------------------------------------------------------
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Tubo 3: ---------------------------------------------------------------------------------------------
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Tubo 4: ---------------------------------------------------------------------------------------------
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Tubo 5: ---------------------------------------------------------------------------------------------
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Tubo 6: ---------------------------------------------------------------------------------------------
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B) Sistema con el sustrato indicador p-Fenilendiamina:

EVIDENCIA / TUBOS
INDICADOR 1 2 3 4 5

Color inicial

Color final (después

de 15 minutos)
Ocurrió óxido-
reducción: (SI / NO)
Ocurrió inhibición:
(SI / NO)

Interpretación:
Tubo 1: ---------------------------------------------------------------------------------------------
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Tubo 2: ---------------------------------------------------------------------------------------------
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Tubo 3: ---------------------------------------------------------------------------------------------
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Tubo 4: ---------------------------------------------------------------------------------------------
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Tubo 5: ---------------------------------------------------------------------------------------------
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VI. DISCUSIÓN
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VII. CONCLUSIONES
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VIII. CUESTIONARIO
1. De manera general, en cada sistema de incubación de óxido-reducción, A (el tubo
3) y B (el tubo 2), indicar si es que se reducen o se oxidan tanto el succinato, el
2,6–diclorofenol indofenol (2,6-DFIF) y la p-fenilendiamina:
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2. Elaborar un gráfico de la cadena respiratoria en las mitocondrias hepáticas.

Identificar e indicar a sus componentes naturales (complejos enzimáticos,
citocromos, etc.) y a los aceptores y dadores de electrones (sustratos, NADH,
FADH2). Señalar la vía de entrada (nivel en el que ingresan) el succinato y otros
sustratos, el 2,6-DFIF y la p-fenilendiamina. Señalar el nivel en el que actúan sus
inhibidores (naturales o artificiales), así como el de los inhibidores y
desacopladores de la fosforilación oxidativa.
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3. Escribir las reacciones de óxido-reducción en las que participan el sustrato

succinato y el indicador 2,6-DFIF en la cadena respiratoria mitocondrial del
hígado. Explicar su decoloración.
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4. Escribir la reacción de óxido-reducción en la que participa el sustrato-indicador p-

fenilendiamina en la cadena respiratoria mitocondrial del hígado. Explicar su
cambio de color.
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5. ¿Cuáles son y qué función cumplen los grandes complejos enzimáticos de la
cadena respiratoria mitocondrial del hígado?
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6. Mediante un gráfico o esquema identifique los componentes o elementos generales
de un sistema de óxido-reducción biológica.
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7. Explicar puntualmente en qué consiste la fosforilación oxidativa.
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IX. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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2. ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
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3. ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
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