Los espectros de impedancia se trazaron en forma de impedancia

gráfico plano (gráfico de Nyquist) representando el biosensor-electrolito

interfaz de solución como un equivalente convencional de cuatro componentes

circuito representado en la Fig. 2A. La impedancia compleja se puede presentar

como la suma de las componentes real (Zre) e imaginaria (Zim) que

se originan a partir de la resistencia y la capacitancia de la celda. El diámetro

del semicírculo que se encuentra sobre el Zre corresponde a la transferencia de electrones

resistencia (Ret) de la sonda redox en la interfaz del electrodo, que

refleja el comportamiento de bloqueo de la superficie del electrodo para el par redox y, por lo
tanto, podría usarse para caracterizar cada modificación

pisar la superficie del electrodo para la fabricación del estrógeno

biosensor Con base en el circuito equivalente que se muestra en la Fig. 2A, se realizaron
simulaciones para determinar con precisión Ret.

los

Se obtuvieron gráficos de Nyquist del electrodo de oro en cada paso de modificación en presencia
de K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6 5,0 mM (1:1, v/v)

solución preparada en tampón fosfato (pH 7,0). Un cambio significativo

en los espectros de impedancia se pudo observar en los procesos de inmovilización paso a paso en
el electrodo de oro con 3-MPA, EDC y

NHS, receptor de estrógeno-a y BSA en comparación con el del desnudo

electrodo de oro que mostraba una línea casi recta que indicaba una

proceso típico de difusión limitada (Fig. 2A, a). La formación de una monocapa autoensamblada de
3-MPA en un electrodo de oro desnudo resultó en un aumento de Ret de 0,26 kX a 4,79 kX (Fig.
2A, b). En

Además, el electrodo de oro modificado con 3-MPA SAM condujo a un pico de reducción
dramáticamente reducido de 9.01 105 A (Fig. 2B, a) a

5.67 105 A (Fig. 2B, b). Estos resultados indican que el 3-MPA

SAM se ha formado bien en un electrodo de oro desnudo y los aniones carboxilato de los SAM de
3 MPA estrechamente organizados en la superficie del electrodo de oro perturbaron las tasas de
transferencia de electrones interfaciales

entre la superficie del electrodo y la sonda redox en el electrolito

solución. Después de que el electrodo modificado 3-MPA fuera activado por EDC

y NHS, el receptor de estrógeno-a se unió covalentemente al

electrodo de oro modificado. El diámetro del semicírculo (Fig. 2A, c)

se amplió significativamente de 4,79 kX (Fig. 2A, b) a 12,4 kX A

y el pico de reducción se redujo de 56,7 lA ((Fig. 2A, b)

a 8.40 lA (Fig. 2B, c) porque el receptor de estrógeno inmovilizado actúa como una capa aislante
que inhibe la pareja redox para alcanzar

el electrodo de oro modificado. Con el fin de eliminar los no específicos

enlaces, la albúmina de suero bovino se unió covalentemente a

los sitios de unión restantes del receptor de estrógeno-a-inmovilizados

electrodo. La presencia de BSA en el electrodo modificado resultó en

el aumento de Rct de 12,4 kX a 22,8 kX (Fig. 2A, d) y el pico de reducción no se pudieron observar
en el presente CV experimental

condiciones (Fig. 2B, d) porque la proteína BSA también funciona como una capa aislante. Los
resultados obtenidos de las mediciones de EIS y CV

confirmar la fabricación exitosa del biosensor de estrógeno.

Como se muestra en la Fig. 4A, se encontró el diámetro de las parcelas de Nyquist

aumentar linealmente a medida que aumentaba la concentración de 17b-estradiol debido a la

unión del 17b-estradiol al inmovilizado

receptor de estrógeno-a del biosensor de estrógeno obstaculizó en gran medida la

difusión del par redox hacia la superficie del biosensor. Con el fin de

normalizar los datos, el cambio de impedancia, DRet = Ret(i) Ret(0), fue

utilizado en el análisis de datos, donde Ret(i) y Ret(0) representan la resistencia a la transferencia

de electrones después y antes de la unión del 17b-estradiol al biosensor de estrógeno,
respectivamente
La constante de unión obtenida en este estudio confirma que la

el receptor de estrógeno-a estaba bien formado en la superficie del electrodo de oro

no solo con una alta densidad sino también con la especificidad a su correspondiente 17b-
estradiol.

Para estudiar la cinética de unión entre 17b-estradiol y

receptor de estrógeno-a, el biosensor de estrógeno se expuso a la

Solución de 17b-estradiol a temperatura ambiente durante un período determinado

tiempo (de 10 a 240 min) y luego la impedancia relativa, Ret(i)/

Ret(0), se midió en función del tiempo de unión. En el experimento, soluciones de 17b-estradiol

con dos concentraciones diferentes de

Se utilizaron 1.0 1012 M y 1.0 1013 M

Es de interés evaluar si el presente biosensor de estrógeno exhibe

buena selectividad frente a sustancias que interfieren con similar

estructura química como 1-aminoantraquinona y 2-metoxinaftaleno. La respuesta del presente

biosensor de estrógenos a

1-aminoantraquinona y 2-metoxinaftaleno fueron casi

insignificante (menos del 3,5%). El resultado indica que el presente

biosensor de estrógeno tiene buena selectividad.

La estabilidad operativa y la estabilidad a largo plazo se consideran como

uno de los factores clave en el rendimiento del biosensor. Primero, se probó la estabilidad
operativa del biosensor mediante mediciones repetitivas en el rango de concentración 1.0 1013–
1.0 109 M. El

valores de resistencia de electrones fueron reproducibles con el relativo de

desviación estándar (RSD) de 8,6% (n = 3). La estabilidad al almacenamiento a largo plazo se

estudió durante un cierto período de tiempo mediante el control de su

resistencia a la transferencia de electrones del biosensor de estrógeno en el PBS

solución con uso intermitente (cada 2-3 días). El presente biosensor exhibió una buena estabilidad,
en la que el biosensor retuvo

88% de su actividad inicial tras 3 semanas de almacenamiento en tampón fosfato 50 mM a pH 7,0.

Esta estabilidad es mejor que las reportadas
anteriormente en la literatura. Por ejemplo, el inmunosensor de estrógenos basado en
anticuerpos antiestrógenos retuvo el 44 % de su capacidad inicial.

actividad después de 2 semanas de almacenamiento [12] y el biosensor de estrógeno

basado en el receptor de estrógeno combinado con bicapa lipídica y Au

las nanopartículas conservaron el 70% de su actividad inicial después de 8 días de

almacenamiento [18].

Para demostrar el uso práctico del presente biosensor, el

prueba de recuperación de 17b-estradiol enriquecido en una muestra de orina humana ha

sido realizado. La muestra de orina se purificó con un cartucho C-18 antes de la medición de la
impedancia.

El resultado de la prueba fue satisfactorio con una recuperación promedio de 101 ± 6 % para un

1,0 1010 M 17b-estradiol. Se espera que el presente biosensor pueda emplearse para la
determinación de 17b-estradiol en condiciones reales.

muestras tales como orina y posiblemente muestras de suero.