CAPITULO 18

Enzimas de 'oxidaeiOB-reducci6n y~e"eledrODieo

A continuaci6n veremos c6mo los pares de electrones procedentes de los intermediarios del ciclo de los acidos tricarboxilicos y de otres=sustretos circulan a 10 largo de la cadena respiratoria hasta el oxigeno molecular, el mas Importante aceptor en la respiraci6n. Este proceso, llamado transporte electronico. es ·18 . fuente principal de las actividades celulares, ya que libera una gran cantidad de energia libre, Ia mayor parte de la cual se conservaen forma de energia del enlace Eosfat.o. del.ATP. en el.proceso denominado loslonlado" @ .. dativa.(vease. fig- .17 .. 1. pag. 455).

Los enzimas de •• oxidacica-reduccicn, especialmente aqueJ~ que participan en el transporte electronico, son generalm.eate mas complejps tanto en su estructura como en su mecanismo y menos conocidos que. otras clases de enzimas. La' mayOtia de los. miembrosde la cadena de transporte electr6nico estill Incrustados, eJl la membrana mitocondrial intema y resulta muy di£icil su extracci6n en forma soluble asi cosaeeu purificaci6n. Tampoco comprendemos aun plenamente c6mo la liberaci6n de energia libre qll¢ se produce durante el transpo~e electr6nico se conserva y se transforma en la energia del enlace fosfato durante el proceso de 1a fosforilaci6n oxidativa. Por estas razones, tanto el transporte electr6nico como la fosforilaci6n oxidativa constituyen todavia areas sumamente atractivas para la investigaci{m bioqllimica.

En este capitulo consideearemos, en primer lugar. las clases principales de enzimas de oxidaclon-reduccion, y despues veremos c6mo participan en la corriente principal del transporte electr6nico en las celulas aer6bicas. Estudiaremos tambien, brevemente. laspropiedades de otros tipos de reacciones de oXidaci6neSpeciCilizadas en diferentes finalidades. A continuacion, en el capitulo siguiente. veremos c6mo Ia energia liberada pot' el trans porte electr6nico es empleada para produclr A TP en el proceso de la fosforilaci6n oxidativa.

Reacciones de oxidad6n-reducci6n (u oxidorreducci6n) Aunque se han descnto ya diversas reacciones enzimatfcaa deoxidaci6n .. reducci6n (pags. 437 y 460). estas seran ahora ohjeto de un estudlo mas sistematico a fin de que puedan compararse sus mecanismos. equilihrios y relaciones energeti-

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PARTE 2 CATABOLISMO Y PRODUCCI6N DE LA ENERGiA DEL ENLACE POSPATO

cas. Las reacciones de oxidacion-reduccion, [tambien 'llamades reacciones de oxidorreduccion, oxidorreducciones 0 reacciones redox) son aqueHas que se verifican con transferencia de electrones desde un dador electronico (el agente reductor, 0 reductor) a un aceptor electronico (el agente oxidante u oxidante) . En algunas reacciones de oxidacion-reduccion, la transferencia de uno 0 mas electroneSserealiza mediantetrans~ ferencia de hidrogeno: entonces la deshidr?~enac,ion es,. por tanto, equivalente a la oxidacion. A menudo, los terminos equivalentes de reduccion 0 equivalentes electronicos se emplean para referirse a los electrones y/o a los atomos de hidrogeno que participan en lasoxidorreducciones.

Los agentes oxidantes y reductores actuan como pares redox con;ugados, 0 parejas, integrados por un dador electronico y su aceptor conjugado, de la misma manera que los acidos y bases de Bronsted actuan como pares conjuqados acido-base.

Reacciones acido-base:

Dador de protones ;: H+ + aceptor de protones

Reacciones de oxtdo-reduccion:

Dador electronico ;: e: + aceptor electrenico

Del mismo modo que los acidos difieren en su tendenclaa disociarse y a ceder protones (pag. 49), tambien difieren los agentes reductores en su tendencia a perder electrones, La tendencia de un agente reductor a perder electrones (0 de un agente oxidante a ganar electrones) viene dada por su poten~ cial de oxidorreducci6n estitndar, que se define como la fuerza electromotriz (fern), expresada en voltios, de un semi-elemento en el queel reductor y el oxidante se hallan presentes en concentraci6n 1 M, a 25°C y pH 7,0, en equilibrio con un electrodo que puede aceptar reversiblemente, electrones de las especies reductoras (fig. 18~1). Sequn acuerdo adoptado, Ia ecuacion del electrode se escribe en la direcci6n

Oxidante + ne- ;::! reductor

enla que n indica el mimero de electrones transferidos. Tambien segun acuerdo, el potencial de oxldorreduccion estandar de la reaccion del electrodo de hidrogeno

se emplea como potencial de referencia. Se Iija su valor como 0,0 cuando la presion del H2 gas es de 1,0 atm, [H+] es 1.0 M (es decir a pH = 0,0), y la temperatura es de 25°C. Cuando se corrige este valor para pH 7,0, ([H+] = 1 X 10-7 M), eI pH de referenda adoptado en todos los calculos bioquimicos, el potencial de oxidorreduccion estandar del electrodo de hi-, drogeno es de -0,42 V.

Los potenciales de oxidorreduccion estandar (Hamados tambien potenciales redox estandar ) de algunos pares redox de importancia biol6gica, se consignan en la tabla 18~ L En los pares redox que poseen un potencial iestandar mas negativo que el par 2H+ ~H2' el reductor posee una mayor tendencia a

488

FIGURA 18-1

Medicion del potencial de oxidorreduccion. La di&olucion que contiene las formas oxidada y reducida del compuesto que se examina se coloca en el recipiente de la izquierda; se equilibran con el electrodo inerte. BI puente salino que contiene ~olucion saturada de KCI proporciona la conexion electrice: con un electrodo de referencia de potencial conocido (derecha). A partir de la fem total observada y de

la fem conocida del e/ectrodo de reierencie, se calcula la [em del electrodo de le

celule de la izquierda que contiene la mezcle de oxidante y teductor. Cuando

el oxidante y el reductor son de igual concemrecion, el potencial del semielemento de la izquierda es el potencial estilndar,

o potencial de oxidorreduccion del punta intermedio.

Sistema para medir la fem

Puente salina

Disoluci6n que contiene una mezcla de las especies oxidada y reducida del compuesto que se examina

Semielemento de referencia de fem conocida

FIGURA 18-2

Curves de velorecion de oxidorreduccion, de tres pares redox conjugados con dilerentes potenciales estender, 0 de punta medio, los cuales pueden extrapolarse mediante las perpendiculeres trazadas desde el punta medic a la ordenada.

+0,5,..-------------.

o

50

75

100

25

Porcentaje de oxidaci6n

Capitulo 18 Enzimas de oxidscion-reduccion y transporte electronico

perder electrones que el hidroqeno molecular; reciprocamente, en los pares con un potencial mas positive, el reductor tiene una tendencia menor a perder electrones que el hldroqeno. Observese que la pareja oxiqeno-aqua posee un potencial estandar fuertemente positivo, + 0,82 V. EI oxigeno mole .. cular tiene, por tanto, una afinidad muy grande por los e1ec .. trones, siendo tambien un agente oxidante muy bueno. Reciprocamente, e1 agua tiene muy poca tendencia a perder e1ec .. trones, yes, por tanto, un agente reductor muy debil.

Al igual que en la ecuacion de Henderson-Hasselbalch (pag. 52) se expresa la relacion cuantitativa entre la constante de disociacion de un acido, su pH y la concentracion de sus especies dadoras y aceptoras de protones, una relacion formalmente semejante, Ia ecuacic5n de Nernst. expresa la re .. lacion entre eI potencial redox estandar de un determinado par redox, su potencial observado, y la relacion de concentraciQies entre sus especies dadora y aceptora de electrones. La ecuacion de Nernst es lasiguiente

, 2,303RT 1 [aceptor de electrones]

Eh = Eo + og .!:__2'-- '--'---_....:.

n.% [dador de electrones]

(1)

en la que E'o es e1 potencial redox estandar (PH = 7,0, T = 25°C, 0 298 -K, todas las concentraciones 1,0 M), E« es el potencial de electrodo observado, R es la con stante de los gases (8,31 J grado-I mol+), T la temperatura en grados Kelvin, n el numero de electrones que se transfieren, y g; el faraday (23062 cal V-I = 96406 J V'-I). A '25 °C (298 oK) el termino 2,303 RT jng;, posee el valor de 0,059, cuando n = 1 y 0,03 cuando n = 2. Puesto que es costumbre calcular los equilibrios de los pares redox bioloqicos referidos a la transferencia de un par de electrones, la ecuacion de Nernst se simplifica,

1 [aceptor de electrones]

s, = E~ + 0,03 og [d d 1 ]

a or de e ectrones

(2)

La ecuacion de Nernst expresa matematicamente la forma de una curva de val ora cion de un dador electronico determinado con un agente oxidante fuerte (fig. 18~2). A medida que avanza Ia valoracion, una fraccion creciente del dador eIec .. tronico se transforms en su forma oxidada, provocando de esta manera un aumento de la relacion [aceptor electronico]

I [dador electronico ], hasta que en el punto medio de la valoracion, se alcanza que [aceptor electronico] = [dador electronico]. En este punto, esta claro que el termino 0,03 log ([ aceptor electronico] / [dador electronico ] ), es igual a cero, y la ecuacion de Nernst se simplifica

El potencial redox estandar es, por tanto, la fern expresada en voltios del semielemento precisamente en el punto media de la curva de valoracion de un reductor determinado, a pH 7,0, 25°C y 1,0 atm. 10 mismo que e1 pK' de un acido se iguala al pH en el punto medio de la curva de valoracion acido-base. E'o. que es el potencial redox estandar, se llama Irecuentemente el potencial del punto medio. A diferencia de las valoraciones acido-base. que son reacciones ionicas ra pidasque

489

PARTE 2 CATABOLISMO Y PRODUCCI6N DE LA. ENERGiA DEL ENLACE FOSFATO

TABLA 18-1. Potenciales de oxidorreducci6n estandar de algunos pares redox conjuqados, expresados sobre la base de transferencias de dos electrones, a pH 7.0 y temperaturas entre 25 y 30°C.

Los potenciales estandar de los citocromos y de la ubiquinona varian algo sequn su estado, es decir, sequn si se halIan aislados 0 presentes en la membrana mitocondrial interna; para este ultimo caso se dan

los valores.

Ecuecion del electrode

E' ••

V

Acetato + 2H+ + 2e- .= acetaldehido 2H+ + 2e- .= H,

e-oxoqlutarato + CO, + 2H+ + 2e- .= isocitrato Acetoacetato + 2H+ + 2e- .= ,8-hidroxibutirato NAD+ + 2H+ + 2e- .= NADH + H+

NADP+ + 2H+ + 2e- .= NADPH + H+ Acetaldehido + 2H+ + 2e- .= etanol

Piruvato + 2H+ + 2e- .= lactato

Oxalacetato + 2H+ + 2e- .= malato

Fumarato + 2H·'+ 2e-.= succinato

Ubiquinona + 2H+ -I;, 2e- .= ubiquinol

2 citocromo bK(ox) +)2e- .= 2 citocromo bK("d) 2 citocromo Cox + 2e-.= 2 citocromo C"d

2 citocromo a3(ox)+ 2e- .= 2 citocromo a3("d) %0, + 2H+ + 2e-.= H,O

-0.58

-0.421

-0.38

-0.346

-0.320

-0.324

-0.197

-0.185

-0.166

-0.031

+0.10 +0.030 +0.254 +0.385 +0.816

no precisan de catalizador, las reacciones de oxidorreducci6n de los compuestos organicos, son bastante lentas y precisan de un catalizador 0 de un enzima para asegurar que el equilibrio se alcance con rapidez.

Los potenciales redox estandar de varios sistemas de oxidacion-reduccion bioloqicos, nos permiten la prediccion de la direccion hacia la que tenderan a desplazarse los electrones desde un par redox a otro en las condiciones estandar, 10 mismo que ocurre con el potencial de transferencia del grupo fosfato (pag. 413). que nos permite predecir la direccion en la que los grupos fosfato seran transferidos enzimaticamente. Por ejemplo, podemos. deducir de los potenciales de oxidorreduccion de la tabla 18-1. que el par NAD+-NADH tendera a perder eIectrones que cedera al par oxalacetato-malato cuando los cuatro componentes esten presentes en sus concentraciones estandar de 1.0 M. ya que el par NAD+-NADH posee un potencial mas neqativo, y por tanto. una pi,esion electronica mayor. que el par oxalacetato-malato, el cual posee a su vez una mayor afinidad por los electrones. Asl, si se parte de concentraciones 1 M de todos los componentes, el equilibrio de la reacci6n

NADH + H+ + oxalacetato ~ NAD+ + malato

se hallara hacia la derecha. Observese que esta reaccion no se prcducira a una velocidad mensurable a menos que' afiadamos un catalizador, por ejemplo, el enzirna malato-deshidroqenasa (pag. 471). Aunque esta reaccion tendera a desplazarse hacia la derecha en condiciones estandar, puede conseguirse un desplazamiento hacia la izquierda si se ajustan apropiadamente las concentraciones de todos los componentes, es decir, si se reduce la concentracion de los reaccionantes y /0 se aumenta la concentraci6n de los productos. En realidad, en la mitocondria, esta reaccion, que es una etapa del cielo de los acidos tncarboxtlicos (pag. 456). va normalmente hacia la

490

TABLA 18-2. Propiedades de los sistemas de deshidrogenasas piridln-dependientes.

EstereoE'o del especiiicided

par de por la

sustratos posicion 4

Sistema

NAD-dependientes

Isocitrato -0,38

D-,8-Hidroxibutir~to -0,346

Gliceraldehido-

-3-fosfato -0,29

Dihtdrolipoil -0,29

L-,8-Hidroxiacil-CoA -0,238

Etanol -0,197

Lactato -0,185

3-Fosfato de glicerina -0,19

L-Malato -0,166

NADP-dependientes Isocitrato Glucosa-f-fosfato

-0,38

-0,32

NAD 0 NADP t-Glutamato

-0,14

B

AoB B

A A

B

A

A B

Capitulo 18 Enzimas de oxidecion-reducclon y transporte electronico

izquierda, ya que el oxalacetato se elimina muy rapidamente, de modo que su concentracion es por 10 general muy baja en comparacion con la de los otros componentes de la reaccion.

Las concentraciones en el equilibrio de los cuatro componentes de una reaccion de oxidorreduccion pueden calcularse a partir de los potenciales estandar de los sistemas que interactuan, asl como de las concentraciones totales de todos los componentes.

Clases de enzimas transferidores de electrones

En la corriente principal del transporte electronico desde los sustratos orqanicos al oxigeno molecular, participan cuatro tipos de enzimas de oxido-reduccfon 0 de proteinas de transferencia electronica. Son los siguientes: 1) las deshidrogenasas piridindependientes que necesitan NAD 0 NADP como coenzima, 2) las deshidrogenasas flavin-dependientes, que contienen flavin .... adenin-dinuclectido (FAD) 0 flavin mononucleotide (FMN) como grupo prostetico, 3) ferro-sulfo-proteinas y 4) cltocromos, que contienen un grupo prostetico Ierro-porfirina. Ademas de estas proteinas, actua tambien en el transporte electronico la ubiguinona 0 coenzima Q, de naturaleza lipo-soluble. Describiremcs a continuacion todos estos componentes.

Deshidrogenasas piridin-dependientes

Dado que los miembros de esta clase de deshidrogenasas necesitan como coenzimas al NAD 0 al NADP, los cuales contienen nicotinamida (pag. 347), que es a su vez un derivado de la piridlna, reciben, en general. el nombre de deshidrogenasas piridin-dependientes. Conocemos unas 200. y actuan en diferentes aspectos del metabolismo; en la tabla 18-2 se han reunido algunos ejemplos import antes de elIas. Catalizan las reacciones generales.

Sustrato reducido + NAD+ ~

sustrato oxidado + NADH + H+ (3)

o bien.

Sustrato reducido + NADP+ ~

sustrato oxidado + NADPH + H+ (4)

sequn cual sea el nucleotide de piridina que precisen 0 preIieran. Estas reacciones comprenden la transferencia reversible de dos equivalentes de reduccion del sustrato en forma de un ion hidruro (H-) a la posicion 4 del anillo de nicotinamida (en forma oxidada) del nucleotide de piridina; el otro hidroqeno <lie separa del sustrato en forma de ion H + libre (fig. 13-6, pag. 348). Se ha podido comprobar la trans Ierencia directa de un atomo de hidroqeno desde el sustrato al NAD+, mediante el empleo de molecules de sustrato cuyos atom os de hidroqeno, que se separan normalmente por accion de las deshidroqenasas, fueron marc ados previamente con deuterio 0 tritio. Despues de la deshidroqenacicn enzimatica del sustrato marcado, se recupero uno de los atom os de hidroqeno marc ados en la posicion 4 del anillo de piridina del NADH formado sin dilucion por el H+ del agua del medio.

491

PARTE 2 CATABOLISMO Y PRODUCCION DE LA ENERGIA DEL ENLACE FOSFATO

Los nucleotidos de piridina se hallan unidos de modo no covalente a la proteina de la deshidrogenasa, con una union relativamente debil. Tanto el NAD como el NADP deben considerarse, por tanto. no como grupos prosteticos Hjos, sino como sustratos, ya que en muchos casos se unen y se disocian del centro activo durante el cicIo catalitico. Los nucleotidos de piridina actuan asi como transportadores disociables de elec ... trones (pag. 437).

Muchas de las deshidrogenasas piridin-dependientes han po dido obtenerse ya en forma pura y cristalizada; tenemos entre ell as la gliceraldehido-3-fosfato-deshidrogenasa (pagi.,. na 437). Algunas deshidrogenasas piridln-dependientes, por ejemplo la p-hidroxibutirato-deshidrogenasa. estan localizadas en las mitocondrias, otras, como la lactato-deshidroqenasa se encuentran en el citosol, y alqunas, como la malato-deshidrogenasa. estan presentes en ambos compartimientos. En las celulas animales, el NAD se da generalmente en cantieades mucho mayo res que el NADP. En el hiqado, cerca del 60 % del NAD total se haIIa presente en las mitocondrias, y el resto en el citoplasma extramitocondriaI. El contenido de NADP de las celulas se halla en proporcion con su actividad biosintetica, Las deshidrogenasas NAD-dependientes. intervienen de manera primordial en la respiracion, por ejemplo, en la trans Ierencia de electrones desde los sustratos hasta el oxiqeno, mientras que las deshidrogenasas NADP-dependientes intervienen principalmente en la transferencia de electrones desde los intermediarios del catabolismo hasta los intermediarios de la biosintesis (pags. 383. 478 y 678). En disolucion, se encuentran el NAD+ y el NADP+ libres con dos tipos de conformacion: la abierta 0 extendida y la forma cerrada 0 api/ada. en la cual los anillos plana res de nicotinamida y de adenina son paralelos. Las formas apiladas predominan en disoluclon, pero cuando el NAD+ se une a algunas deshidrogenasas entonces adopta la conformacion abierta. La mayor parte de las deshidrogenasas piridin-dependientes, son especificas tanto para el NAD como para el NADP. pero algunas de ellas, como por ejemplo la glutamato-deshidrogenasa. pueden reaccionar con ambos coenzimas (tabla 18-2).

Muchas deshidrogenasas piridtn-dependientes contienen iones metalicos divalentes intimamente unidos: la alcohol-deshidrogenasa, por ejemplo, contiene Zn2+.

Determinacion de las deshidrogenasas piridin-dependientes La reduccion enzimatica del NAD+ y del NADP+ [ecuaciones (3) y (4)] va acompafiada de tres cambios caracteristicos. que son utiles para la medida de la actividad de las deshidrogenasas piridin-dependientes. Ni la forma oxidada ni la reducida de ambos coenzimas absorben la luz en la zona del visible. pero ambos la absorben muy fuertemente en la zona del ultravioleta, cerca de los 260 nm, que es el maximo 'de absorcion del anillo de adenina (pag. 320). Cuando el NAD+ y el NADP+ se reducen, aparece un nuevo maximo de absor ... cion a 340 nm (fig. 18-3). El incremento a 340 nm refleja la reduccion del anillo aromatico de la piridina de la porcion de nicotinamida. La aparicion 0 desaparicion de la absorcion a 340 nmse emplea para seguir el curso de las reacciones catalizadas por las deshidrogenasas piridin-dependientes.

492

FIGURA 18-3

Espectros de ebsorcion del NAD+ y del NADH. A es la ebsorbencie, log 10/1. EI coeficiente de ebsorcion molar

(vease fig. 12-7. pag. 320) del NADH a 340 nm, es 6.23 X 10' em' mol'",

A

Reducldo

250

300 350 400

nm

FIGURA 18-4

Formes oxidada y reducide del NAD.

En la forma oxidede, el atomo de hidrogeno de la posicion 4 se halla en el plano del anillo de piridiruu en la forma reducide, los dos atomos de hidroqeno de la

posicion 4 estan [uere del plano del anillo. Cuando el NAD se reduce enzimeticemenie mediante un sustreto marcado can

deuterio, el deuterio se combina can el atomo de carbona 4 desde uno de los dos lados segun sea el tipo de deshidtoqenese, para [ormer uno de los dos p~tos posibles, uno can deuterio saYre - el lado A. a el otro can deuterio sabre el ledo B

del plano del anillo. Obseevese el nitrogeno cueternerio en la forma oxidada y el sistema quinoideo de enlaces en la forma reducide.

H

I

HC/~"""C-CONU'

115 31 ''2

HC~~H I

R

NAD+, forma oxidada

Lado A Lado B H~ .... H HC/~"C-CONH

II II •

HC....... /C N

I

R

NADH, forma reducida

TABLA 18-3. Valores aproximados

de KM para la lactato-deshidroqenasa de corazon de buey.

Cada uno de ellos fue determinado estando los otros reaccionantes en concentraci6n saturante.

Sustreto KM,
roM
Lactato 9,0
NAD+ 0,Q75
Piruvato 0.14
NADH 0,001 Capitulo 18 Enzimas de oxidecion-reduccion y trensporte electronico

Las oxidorreducciones dependientes de la piridina pueden seguirse tam bien por medidas de la variaci6n de pH, ya que la reducci6n del NAD (0 del NADP) ocasiona la formaci6n de un ion H + [ecuaciones' (3) y (4 )1]. Otro metodo se bas a en la medici6n de la fluorescencia, y. aunque es muy sensible, esta sometido a debilitaciones 0 interferencias debidas a cierto numero de factores.

El NAD+ y el NADP+ pueden reducirse no enzimaticamente por reductores tales como el ditionito s6dico 0 el borohidruro sodico. EI NADH y el NADPH pueden, a su vez, ser reoxidados, no enzimaticamente, por el ferricianuro, pero no son oxidados directamente por el oxigeno molecular a pH 7,0.

Estereospeciiicided de las deshidtoqeneses piridin-dependientes

Las deshidrogenasas de este tipo pueden ser estereoespecificas en dos sentidos. Muchas de elIas son especificas para uno de los estereois6meros de sus sustratos; por ejemplo, la lactatedeshidrogenasa es especifica para el t-Iactato. Sin embargo, muchas deshidrogenasas dependientes de la piridina son estereoespecificas en otro sentido. Si se reduce el anillo de piridina del NAD+ 0 del NADP+ por medios no enzimaticos, el atomo de hidr6geno .que es transferido al atomo de carbono 4 del anillo de nicotinamida puede aproximarse por ambos lados del anillo, para dar cantidades iguales de las dos posibles formas estereois6meras (fig. 18-4). Sin embargo. cuando elanillo de piridina se reduce enzimaticamente por una deshidrogenasa, el atomo de hidr6geno del sustrato es transferido estereoespecificamente a un solo lado del anillo. La tabla 18-2 muestra que algunas deshidrogenasas transfieren hidr6geno al lado A del anillo mientras otras 10 hacen al lado B. Este tipo de estereoespecificidad por el anillo de piridina se ha establecido utilizando molecules de sustrato marcadas por tritio 0 con deuterio. Solamente se conoce una deshidrogenasa que no muestra estereoespecificidad por el anillo de la nicotinamida, a saber, la dihidrolipoil-deshidrogenasa (pag. 461). Estas observaciones indican que ambas moleculas, la del sustrato y la del NAD+, deben poseer una especifica orientaci6n estereoquimica mutua en el centro catalitico del enzima.

""""

Cinetic8 y mecenismo de las deshidroqeneses

piridin-dependientes

Estas deshidrogenasas muestran un comportamiento caracteristico de Michaelis-Menten tanto con el sustrato como con el nucleotide piridinico. Se han establecido las constantes de Michaelis para los sustratos oxidado y reducido. asi como para los nucleotidos de piridina oxidados y reducidos por los metodos generales ya descritos (pag. 195) para cierto numero de deshidjoqenasas: en la tabla 18-3 se muestra un ejemplo.

Casi todas las deshidrogenasas piridin-dependientes examinadas hasta ahora muestran el comportamiento cinetico tipico de las reacciones ordenadas bisustrato, en las que existe una secuencia obligatoria para la adici6n del sustrato y del coenzima al centro activo (pag. 208). EI nucleotide piridinico es el sustrato conductor (pag. 210). y debe ser el primero en unirse al centro activo, uniendose a continuaci6n el sustrato. Des-

493

PARTE 2 CATABOLISMO Y PRODUCCION DE LA ENERGiA DEL ENLACE FOSFATO

FIGURA 18-5

Mecanismo de la reaccron de le lecteto-deshidroqenese. Bste enzima (PM 140000) contiene cuatro subunidades ideniices, cada una de las cueles se une, en primer luqe«, al coenzima nicotinamida-adenin-dinuc1eotido (NAD) (pag. 209), uniendose a continuecion el sustteto, La estructura

de los centres del NAD+ y de los sustratos se ha deducido mediante analisis POl' rayos X de los complejos inactivos del enzima-NAD+-piruvato.

Representacion esquemeiice del centro de unIOn para le forma abierta

del NAD+ mostrendo las interacciones de union especilices con los

restos eminoecidos del centro activo. EI segundo sustreto, que es en realidad la forma enolice del piruvato (pag. 416), aparece covalentemente unido mediante su qrupo metileno a le posicion 4 delanillo de la nicotinamida. La His 195, que es esencial para la actividad cetalitice, epetece unida mediante enlace de hidroqeno el oxigeno cetbonilico de la nicotinamida. [Adaptado de M. ,. Adams y 11 coleboredores de los leboretorios c.;? M. G. Rossmann y N. O. Kaplan, «Structure-Function Relationships in Lactate Dehydrogenase», Proc. Nat!. Acad. Sci. (U.S.), 70: 1970 (1973)j.

Posible mecanismo de teeccton para la [otmecion del iniermedierio piruoeto-nicotinemide mostrsndo la perticipecion de His 195. Una vez este resto se ha protonedo, puede desplezer su posicion para formal'

un enlace de hidrogeno con el oxigeno cerbonilico de la nicotinamide.

tal como se ha representedo enteriormente.

Enolpiruvato

NAD+

494

Capitulo 18 Enzimas de oxidecion-reduccion y transporte electronico

pues de la transferencia de equivalentes de reduccion del sustrato al coenzima sabre el centro activo, el sustrato oxidado es el primero en Iiberarse, seguido del coenzima reducido. Debido a esta obligada secuencia de interacciones, existen normalmente dos complejos binarios. E-NAD+ y E~NADH, y dos complejos temarios,

y

que participan en el ciclo catalitico.

Se ha obtenido import ante informacion para la lactato-deshidrogenasa, como puede apreciarse en la figura 18~5, yacerca de la geometria del centro activo y el mecanismo de reaccion, mediante diversas aproximaciones experlmentales, entre eIIas el anal isis par rayos X de la estructura del enzima cristalizado, la secuencia aminoacida y los estudios de la resonancia nuclear maqnetica (pag. 156) de los cam bios de conformacion de las moleculas de NAD+ y de NADH al unirse a la proteina de la deshidrogenasa, cuya estructura tridimensional se ha obtenido.

Equilibtios de las deshidrogenasas pitidin-dependientes

La direccion de la reaccion y la composicion de equilibria de los sistemas de oxidorreduccion piridin-dependientes, pueden predecirse a partir de los potenciales de oxido-reduccion estandar del par NADH~NAD+ (NADPH~NADP+) (Bfo = = -0.32 V). y del par sustrato reducido-sustrato oxidado. La tabla 18~2 muestra los potenciales de oxldo-reduccion estandar de algunos pares redox que reaccionan can las deshidrogenasas piridin-dependientes. Los sustratos que poseen un potencial estandar mas negativo que el par redox NAD (0 NADP) tienden a perder eIectrones del sustrato reducido, que ceden a la forma oxidada del coenzirna, mientras que los que poseen un potencial estandar mas positivo tienden a aceptar electrones del NADH a del NADPH. cuando se en sayan en condiciones estandar y concentracion 1.0 M de tad as los reaccionantes y de los productos.

EI sistema NADH-NAD+ puede asi transferir electrones desde un par de sustratos a otro, en virtud de la capacidad del NADH de actuar como intermediario comun compartido par dos reacciones piridin-dependientes, cada una de elIas catalizada par una deshidrogenasa especifica. Par ejemplo, en la secuencia glucolitica (pag. 432). el gliceraldehido 3-fosfato es oxidado par el piruvato sequn las siguientes reacciones. que comparten NADH ~en color) como intermediario comun:

Gllceraldehido-Lfosfato + Pi + NAD+ ~

1.3-difosfoglicerato + NADH + H+ (5)

NADH + H+ + piruvato ~ NAD+ + lactato -(6)

Suma:

Gliceraldehldo-Sefosfato + Pi + piruvato ~

1.3-difosfogliceratcr + lactato (7)

495

PARTE 2 CATABOLISMO Y PRODUCCI6N DE LA ENERGiA DEL ENLACE FOSFATO

.'

Si iniciamos este conjunto de reacciones con concentraciones

equimoleculares de todos los componentes a pH 7,0, la direccion del flujo de los electrones se desarrollara desde el par del gliceraldehido~3~fosfato, el mas negativo (E'o = - 0,29 V), hasta el par mas positive lactato-piruvato (E'o = -0,19 V), independientemente del potencial estandar del NAD transportador electronico intermedio (en los calculos termodinamicos solo se tom an en cuenta los est ados inicial y final y no el camino seguido). El equilibrio iglobal se hallara, por tanto, muy desplazado en la direccion del lactato.

Puesto que siempre se forma 0 se absorbe un proton en las reacciones ligadas a la piridina, su equilibrio variara con el pH del sistema. El potencial estandar de oxidorreduccion de la pareja NADH~NAD+ es 0,03 V mas neqativo para cada unidacl de pH por encima de pH 7,0, y 0,03 V mas positive para cad a unidad de pH por debajo de pH 7,0.

Deshidrogenasas y oxidasas flavin-dependientes

Estos enzimas contienen como grupos prosteticos Hrmemente unidos, un flavin~mononucle6tido (FMN), 0 un flavin~ade~ nin~inucle6tido (FAD) (pag. 346). La porcion act iva del FMN 0 del FAD que participa en la oxidorreduccion es reversiblemente reducido (fig. 18~6). La reaccion se muestra formalmente como una transferencia directa de un par de atomos de hidroqeno del sustrato, para rendir las form as reducidas, designadas como FMNH2 y FADH2•

SH2 + E-FMN ~ S + E-FMNH2

S~ + E-FAD ~ S + E-FADH2

Las deshidrogenasas mas importantes ligadas a la £lavina en la corriente principal de la respiracion y del trans porte electronico se hallan todas localizaclas en las mitocondrias y son 1) la N ADH ~deshidrogenasa, que contiene FMN y cataliza la transferencia de electrones desde el NADH al siguiente

TABLA 18-,4, Propiedades de algunas deshidrogenasas y oxldasas flavindependlentes.

Deshidroqenssss

Peso Nucle6tidos
molecular flavinicos Metal
~300000t FMN Fe
78000* FMN Fe
100000 FAD Fe
FAD Ninguno
FAD Ninguno
FAD Ninguno
FAD Fe
100000 FAD Ninguno
154000 FAD Ninguno
300 000 FAD Fe, Mo
280000 FAD Fe, Mo
115000 FMN, FAD Fe «Corriente principal» NADH-deshidrogenasa

Succlnato-deshldroqenasa Dthidrollpoil-deshldroqenasa Acil-CoA-deshidrogenasa Flavoproteina de transferencia

electronica

Otras Glicerin-3-fosfato-deshidrogenasa o-amtnoactdo-oxidasa Glucosa-oxidasa

Xantin-oxidasa

Aldehtdo-oxidasa Dfhldroorotato-oxldasa

t Particulada. * Soluble.

496

FIGURA 18-6

Reducci6n del anillo de isoaloxacina de los nucleotidos de flavina. R represente el testo de la molecule del flavin-nucleotido. Vease la figura 13-3 (pag. 345) para las formulas estructureles completes,

Forma oxidada

1

H 0

H I II

C"N C

CH -C""" 'C 'C/ 'NH

3 I II II I

CHa-C~ /C, _/C, /C=O C N N

H I I

R H

Forma reducida

FIGURA 18-7

Enlace co valente del FAD a un resto histidilo en la succineto-deshidroqenese, R indica el resto de la molecule de FAD.

Resto hlstidilo de la cadena polipeptidica

FIGURA 18-8

Dos ~colorantes reducibles utilizados como aceptores artificiales de electrones de las [levin-deshidroqeneses,

~N~ ~N~ I

CHa

Metosulfato de fenacina

Cl

-o-«> N~CH3

~ CH3

Cl

2.6-Dic1orofenolindofenol

Capitulo 18 Enzimas de oxidecion-reduccioti y transporte electronico

termino de la cadena de transporte electronico, 2) la succinato~ deshidroqenese, activa en el ciclo de los acidos tricarboxilicos (pag. 469), 3) la dihidrolipoil-deshidroqenese, componente de los sistemas del piruvato (pag. 461) y de la a~oxoglutarato~ deshidrogenasa (pag. 468), y 4) la acil~Co·A~deshidrogenasa:, que cataliza la primera etapa de deshidroqenacion durante la oxidacion de los acidos grasos (pag. 560). Existen muchos otros enzimas que contienen £lavina, los cuales catalizan oxidorreducciones especializadas que no se hallan en la corriente principal del transporte electronico: por ejemplo, la D~aminoacido~ oxidasa (pag. 578), la xantin~oxidasa (pag. 751), la orotato~ reductasa (pag. 746), y la aldehido~oxidasa (tabla 18~4).

Las deshidrogenasas Ilavin-dependientes difieren siqnificativamente de las piridin-dependientes en que el nucleotido flavinico se halla muy estrechamente unido al enzima y funciona, por tanto, como un grupo prostetico, en vez de hacerlo como un coenzima (pag. 191); el flavin-nucleotido no abandona al enzima ni durante ni despues del ciclo catalitico. En la mayor parte de las Havin-deshidrogenasas. incIuida la NADH~ deshidrogenasa, el nucleotide de £lavina se halla unido de modo no covalente y las constantes de disociacion estan comprendidas en el intervalo de 10-8 a 10-11 M. Estos flavoenzimas pueden disociarse, a veces, al ser expuestos a la accion de una fuerza ionica elevada 0 de un pH bajo. Sin embargo, en otros flavln-enzimas tales como la succinato-deshidreqenasa, el nucleotide flavinico se halla covalentemente unido por un enlace entre el anillo de la isoaloxacina del FAD y un res to aminoacido de la proteina (fig. 18~7).

Los enzimas de oxidorreduccion flavinicos pueden dividirse en do~ases, deshidrogenasas y oxideses, sequn su capacidad para reaccionar con los aceptores electronicos, En las flavindeshidrogenasas tales como la NADH~deshidrogenasa y la succinato-deshidroqenasa, hay poca 0 ninguna tendencia de la forma reducida del flavin-nucleotide a ser reoxidado por el oxigeno molecular. Las flavin-oxidasas reducidas, por el contrario, son reoxidadas por el oxigeno para dar peroxide de hidrogeno. En los miembros de este grupo, entre los que se incluye la o-aminoacido-oxidasa y la xantin-oxidasa, el nucleotide de £lavina se halla unido a la proteina de tal manera que la forma reducida del nucleotide se halla disponible para reaccionar conel oxigeno. En la celula, el aceptor de electrones inmediato de las Havin-deshidroqenasas es la ubiquinona (coenzima Q) de la cadena de transporte electronico, como ya veremos. Sin embargo, las flavin-deshidroqenasas reducidas se reoxidan tambien por ciertos aceptores electronicos artificiales tales como el ferricianuro 0 por colorantes reducibles tales como el azul de metileno (pag. 457), el metosulfato de fenazina 0 el 2,6~diclorofenolindofenol (fig. 18~8). Estos colorantes experimentan cambios en sus espectros de absorcion cuando son reducidos por las Havin-deshtdroqenasas: constituye un ejemplo la reaccion con azul de metileno:

E-FADH2 + azul demetileno.; ~

E - FAD + azul de metlleno.g,

(Azul) (Incoloro)

Debido a esta propiedad. los aceptores electronicos artificiales se emplean con frecuencia para la determinacion cuantitativa de las deshidroqenasas Havin-dependientes.

497

PARTE 2 CATABOLISMO Y PRODUCCION DE LA ENERGiA DEL ENLACE FOSFATO

En su forma completamente oxidada, varias flavin-deshidrogenasas son amarillas, rojas, pard as 0 verdes. y generalmente. exhiben un os amplios picos de absorcion en las proximidades de 370 y 450 nm (fig. 18~9). Cuando se hallan totalmente reducidas, ya sea por metod os enzimaticos 0 quimicos, se decoloran con perdida de la absorcion a 450 nm. Durante el ciclo de oxidacion-reduccion de algunos enzimas Havinicos se producen variaciones caracteristicas de Iluorescencia,

Aunque algunas £lavoproteinas pasan de su forma completamente oxidada a la completamente reducida y viceversa por transferencia simultanea de dos electrones, otras solamente transfieren un electron cada vez en su ciclo catalitico normal, pudiendo, por 10 tanto, escindir pares de electrones. La transferencia de un solo electron 0 de un solo atomo dehidrogeno a una molecula .de FAD 0 de FMN (0 la perdida de un hidrogeno 0 de un electron por una molecula de F~DH2 0 de FMNH2). conduce a la Iormacion de la semiquinona 0 forma semi reducida del Ilavin-nucleotido, Estas Iormas, que son radicales libres, pueden ponerse de manifiesto bien por sus espectros de absorcion caracteristicos. 0 mediante la espectros~ copia de resonancia de espin electronico, la cual sefiala la presencia de radicales libres, es decir. molecules con espines electronicos desapareados gracias a su comportamiento caracteristico en un campo maqnetico.

Algunas Ilavoproteinas, ademas del nucleotide de flavina, contienen metales, particularmente hierro y molibdeno: tales componentes metalicos son esenciales para la actividad catalitica (tabla 18~4). Los £lavoenzimas que conti en en hietro (ejemplos de los mismos son la succinato-deshidroqenasa y la NADH~deshidrogenasa) contienen tambien atomos de azufre muy reactivos. Si las flavoproteinas ferro~sulfuradas se tratan con acidos, podemos comprobar que se desprende H2S. Debido a que no existen grupos hemo en tales proteinas, el hierro recibe el nombre de hierro no hemittico. Los atomos de hierro en las £lavoproteinas ferro-sulfuradas experimentan cambios de Fe(II) a Fe(III). y participan en la transferencia electronica hacia 0 desde el grupo prostetico flavinico. Otros enzimas flavin-dependientes. tales como la xantinoxidasa y la aldehidooxidasa, contienen mollbdeno, asi como hierro.

La NADH~deshidrogenasa. que es un miembro importante de la cadena de trans porte electronico, ha sido estudiada por muchos investiqadores, pero queda mucho por saber acerca de su estructura y de su mecanismo. El enzima de la membrana mitocondrial interna, a la cual se halla estrechamente unido, se ha aislado en dos formas diferentes. Una de elias es un complejo particulado de peso molecular elevado, que contiene hasta 18 atom os de hierro y de azufre acido-labil, asi como lipidos: esta forma puede reducir al coenzima Q como aceptor, y es inhibida por la rotenona y el amital (pag. 507). La forma de peso molecular bajo (Pm 78000) contiene solamente cuatro atomos de hierro y de azufre acido-labil por molecule, posee ademas una sensibilidad alterada para los inhibidores, y reacciona hacia los aceptores electronicos artificiales, con especificidad diferente que la forma de peso molecular elevado. Probablemente la forma de bajo peso molecular es unasubunidad de la forma nativa, y mayor. del enzima, tal como se encuentra en la membrana interna.

Los cuatro centres Ierro-sulfurados de la NADH~deshidro~

498

FIGURA 18-9

Espectro de absorci6n de la forma totalmente oxidada de una flavindeshidrogenasa. La reducci6n del enzima provoca la perdido del pico de absorci6n proximo a 450 nm,

300 350 400 450 500 550 Longitud de onda, nm

FIGURA 18-10

Estructura postulada para los Momos

de hierro y de ezulce acido-labiles en las proteines [ecrosulhimdes. Los atomos de hierro aparecen en color, y los atomos de azufre son grises. [De L. H. Jensen

y al. Biochem. Soc. Trans .. 1: 27 (1973).]

Capitulo 18 Enzimas de oxidecion-reduccion y trensporte electtonico

genasa poseen diferentes potenciales estandar de oxidorreduc-

- cion. Se cree que todos participan en el trans porte electronico experimentando transiciones Fe(II) ~Fe(III). Recientes investigaciones apuntan la posibilidad de que uno de estos centres puede servir para transferir electrones desde el NADH al grupo prostetico FMN; los restantes centros hierro-azufre estan implicados en el trans porte electronico desde el FMNH2 hasta el aceptor esencial, la ubiquinona.

Proteinas Ierro-sulfuradas

Este tipo de proteinas contienen hierro y azufre acido-labil en cantidades equirnolares. La primera que se descubrio, la lsiss: doxina, Iue haIIada en la bacteria anaerobica Clostridium pasteurienum, que es capaz de fijar el nitrcqeno atmosferico. Mas tarde se aislaron proteinas semejantes de plantas superiores. donde aparecen en los cloroplastos participando en el transporte electronico fotosintetico. Tambien se han encontrado protein as Ierro-sulfuradas en otros microorganismos y en tejidos animales, particularmente en las mitocondrias. Ademas, se encuentran grupos de hierro-azufre en ciertas fIavoproteinas (vease mas arriba), donde reciben el nombre de centr~s hierroazufre.

Los pesos moleculares de las proteinas Ferro-sulfuradas oscilan entre 6000 y 100 000 0 mas (tabla 18-5). Estas proteinas actuan como transportadores electronicos, experimentando transiciones reversibles Fe(II) -Fe(III). Las formas Fe(III) son rojas 0 verdes, y por reduccion experimentan una decoloracion parcial. Las formas reducidas, 0 Fe(II) , de la mayor parte de las Ierro-sulfo-proteinas muestran un espectro de resonancia de espin electronico a temperaturas muy bajas· (4 a 100 K) con una sefial caracteristica situada entre 1,90 Y 2,10 gauss (G), indicativa de los electrones no apareados de la forma Fe(II). La figura 18-10 rnuestra una de las est rueturas postuladas para los' grupos hierro-azufre de estas proteinas.

Los potenciales estandar de oxidorreduccion de las diferentes proteinas Ierro-sulfuradas varian dentro de un margen amplio, desde la Ierredoxina, que es muy electronegativa, del Chrometium (E'o = -0,49 V), una bacteria fotosintetica,

TABLA 18-5. Propiedades de algunas proteinas 0 centros ferro-sulfurados,

Potencial Numero de de oxido-

Tipo

centros Peso hierro-ezujre molecular pot molecule

reduccion estsnder V

Mitocondrial

NADH-deshidrogenasa Succinato-deshidrogenasa Proteinas ferro-sulfuradas de alto potencial (con citocromo C1)

Otras fuentes

Ferredoxina (Chromatium) Ferredoxina (espinaca) Adrenoxina (corteza adrenal) Putidarredoxina (Pseudomonas putida)

Ferredoxina (Clostridium) ..

78000 100000

4 2

-0,30. +0.03 0.00

+0.22

10000 12000 16000

4 2 2

-0.49

-0.42

-0.27

12000 40000

2 2

-0.24

-0.39

499

PARTE 2 CATABOLISMO Y PRODUCCI6N DE LA ENERG1A DEL ENLACE FOSFATO

hasta el centro ferro-sulfurado muy electropositivo hallado en las mitocondrias del corazon de buey (vease mas adelante], en el cual E'o = +0,22 V.

En 1a cadenamitocondrial desde elNADH hasta el oxigeno existen, pOI' 10 menos, siete distintos centres hierro-azufre detectables pOl' resonancia de espin electronico.cCuatro de ellos se hallan localizados en el complejo de 1a NADH .. deshidroqenasa, otros dos estan asociados alcitocromo b y el res .. tante al citocromo el (pag. 503). Aunque no hay duda de la importancia que tienen en el transporteelectronico, su funcion precisa no se conoce todavia.

Citocromos

Los citocromos son proteinas transferidoras de electrones que contienen grupos ferro-porfirina: se encuentran solamente en las celulas aerobicas. Algunas se hallan localizadas en la membrana mitocondrial interna, donde actuan secuencialmente para transportal' Ios -electrones originados en varios sistemas de deshidroqenasas, hasta el oxigeno molecular. Otros citocromos se encuentran en el reticule endoplasmatico, en el que desempefian un papel en las reacciones de hidroxilacion especializadas (pag. 511). Todos ellos experimentan cambios reversibles de valencia Fe(II)~Fe(III) durante sus ciclos cataliticos. Sus formas reducidas no pueden ser oxidadas pOI' el oxiqeno molecular, con excepcion delcitocromo terminal de la respiracion mitocondrial, es decir, el citocromo a3 0 citocromo C oxidasa, que tambien contiene cobre intimamente unido a el. En la membrana interna de las mitocondrias de los animales superiores, cuya cadena respiratoria se ha estudiado de modo mas complete, se han Identificado, pOI' 10' menos, cinco citocromos: b, CI, c, a Y a3. Uno de ellos pOI' 10 menos el citocromo b, se encuentra en dos 0 mas formas (pag. 508). Ademas de. los citocromos presentes tan solo en la membrana interna mitoeondrial, otro tipo, el citocromo bs, se encuentra en el reticulo endoplasmatico (pag. 35). Las celnlas de los animales y de las plantas contienen otros hemoenzimas tales como la peroxi~ dasa (pag. 568) y la catalasa (pag. 514).

El anillo de porfirina se halla presenteno solo en varias hemoproteinas, sino tambien en las clorofilas de las, celulas de las plantas verdes. POI' su estructura, las porfirinas pueden considerarse como derivados de un compuesto tetrapirroltco original. la porfina (fjg. 18~ 11 ). Las porfirinas se designan y clasifican basandose en los sustituyentes que forman las cadenas laterales; pOI' ejemplo, etiopor{irinas, mesoporfirinas, uroporfirinas. coproporfirinas y protoporfirinas. De todas ellas, las protoporfirinas son,con mucho, las mas abundantes. Contienen cuatro grupos metilo, dos grupos vinilo y dos grupos de acido propionico, Pueden escribirse quince protoporfirinas isomeras, las cuales difieren en la secuencia de' sustituci6n de los. grupos arriba mencionados, en las ocho posiciones dis .. ponibles para las cadenas Iaterales. De todas las form as posibles, solamente una, la protoporfirina IX (fig. 18 .. 11) se en .. cuentra en la naturaleza: se halla en la hemoqlobina, en la mioglobina y en la mayor parte de los citocromos,

La protoporfirina forma complejos quelatos tetradentados con iones hierro, magnesio, cine, niquel, "cobalto y cobre, en los que el metal se mantiene unido pOI' cuatro enlaces coordi ..

500

FIGURA 18.11

Estruetures de la pot/ina, ptotopot/irina y hemos.

1 2

:~ ~~:

HC==i'- -~CH ')' Ll i3

6 5 Porfina

/-~~N

N I~N

x.rev) Hemocromo

Protoporfirina IX

Capitulo 18 Enzimas de oxidecion-reduccion y trenspotte electt6nico

Modele> espacial compacto de protohemo

THa TH" TH3

/q~. ~C" /q~. ~C" /q~. ~C" /CH2CH CH. CH CH. CH CHa

HO-CH

CHa

HaC

CH=CH2

O-C I H

CH2

I

HOOC-CH2

Hemo A (grupo prostetico del citocromo aa1)

nados, EI quelato complejo de la protoporfirina c~n el Fe(II) se llama protohemo 0 mas sencillamente hemo; un complejo similar con el Fe(III) se llama hemina 0 hematina. En el hemo, los cuatroligandos de Ia porfirina forman un complejo planarcuadrado con el hierro; las restantes posiciones de coordinacion del hierro, la quinta y la sexta, son perpendiculares al plano del anillode porfina. Cuando las posiciones quinta y sexta del hierro se hallan ocupadas la estructura resultante es un hemocromoo hemocromogeno (fig. 18~11). En las hemoproteinas mioglobina y hemoglobina, la quinta posicion se halla ocupada por un grupo imidazol de un resto de histidina, mientras que la sexta esta 0 bien no ocupada (desoxihemoqlobina y desoximiogl6bina), 0 bien ocupada por el oxigeno (oxihemoglobina y oximioglobina), 0 por otros ligandos tales como el monoxide de carbono. En casi todos los citocromos, por otra parte, embes posiciones quinta y sexta del hierro, se hallan ocupadas por grupos R de restos aminoacidos especificos de las proteinas. Estos citocromos no pueden, por tanto, unirse a ligandos como el oxigeno, el monoxide de carbono o el cianuro; constituye una excepcion importante el citocro-

501

PARTE 2 CATABOLISMO Y PRODUCCI6N DE LA ENERGIA DEL ENLACE POSFATO

mo a3. que en su funci6n bioloqica, se une, normalmente, al oxigeno.

En la funci6n normal de la hemoglobinayde la mioglobina, el atomo de hierro no experimenta cam.bi()ide valencia cuando se une 0 se pierde eloxigeno;pe:rwaneceen estado de· Fe(II) . Sin embargo, tanto lahemoglobina com.oJamioglobina pueden ser oxidadas a la forma Fe(UI), 0 hemina, por agentes OXiM dantes tales como el ferricianuro.experimentando un cambio de color del rojo al pardo. Los productos respectivos, que no funcionan reversiblementecomotransportadores de oxigeno, reciben el nombre de. metahemoglobil1a .yde metamioglobina. Sin embargo, en los citocromos el atom<idihiel'ro experimenta cambios reversibles entre las form as Fe(II ) yFe(IlI); los citocromos actuan de transportadores electronicos, mientras que la hemoglobina y la miQglobina actua,ncQlllo transportadores

de ligando (oxigeno). . '. . "

Los citocromos fueron descubiertos ydesignadoscon el nombre de histohematinas por C. MacMunn, en 1866 pero su significado en .las oxidaciones bio16gicasno qued6 claro hasta 1925, en que fueron redescubiertos por el inqles D. Keilin. Con un sencillo espectroscopio manual, Keilinobserv6 directamente en musculos intactos de insectos, cierto numero de band as de absorci6n parecidas a las de las hemoproteinas. Demostr6 que estas bandas aparecian y desaparecian en relaci6n con la actividad muscular. Ketlin, redenomino a estos pigmentos respiratorios como citocromos, y postul6 que aetnaban en una cadena para el trans porte de electrones desde las moleculas nutritivas hasta el oxigeno, agrupandolos en tres clases principales, a, b y c, sequn las posiciones caracteristicas de sus bandas de absorci6n en su estado reducido. Cada tipo de citocromo en estado reducido exhibe tres bandas de absorci6n caracteristicas en la zona del espectro visible, la a./3 y y 0 bandas de Soret (fig. 18-12; tabla 18M6).

Con una sola excepci6n, los citocromos se hallan muy estrechamente unidos a la membrana mitocondrial, Y son dificiles de obtener en forma soluble y homoqenea. La excepci6n es el citocromo c, que puede extraerse facilmente· de las mitocondrias mediante disoluciones salinas concentradas. Se han obtenido citocromos c de muchas especiesen forma -cristahna y se han determinado sus secuencias aminoacidas(pag. 114), EI grupo Ierro-protoporfirma del citocromOc se halla.covaleas temente unido a la proteina mediante puentes tioeter entre el anillo de la porfirina y dos restos de cisteina.ide la cadena peptidica. EI citocromo c es la unica-hemo-proteina corriente en la que el grupo hemo se halla unido a laproteina mediante

TABLA 18·6. Propiedades de los citocromos mitocondrlales.

M ilximo . de. ebsotcion de la forma eeducide om

Citocromo Pm E'o,V It f3 y
.bg 25000 +0,030 563 532 429
c, 37000 +0,225 554 524 418
c 12500 +0,235 550 521 415
a 200000 +0.210 600 439
83 +0,385 603.5 443
502 FIGURA 18·12

Espectro de absorci6n del citocromo e,

. (1,0 em de recorrido luminoso; disoluciones 10 pM; pH 7,0). El coeiicienie de absorci6n molar del pico a (550 nm) de

la forma reducide es 27,7 em' mol".

A

0,5

Reducido

Oxidado

300

500

400

600

Longitud de onda, nm

Capitulo 18 Enzimas de oxidecion-reduccioti y transporte e1ectr6nico

enlace covalente. Tanto en la hemoglobina como en la mioglobina. y al igual que en los citocromos b y a, el anillo de porfirina esta unido no covalentemente, pudiendo separarse de la proteina acidificada por extraccion con piridina y tambien con otros disolventes. Las posiciones quinta y sexta de coordinacicn del hierro en el citocromo c se cree que estan ocupadas por las cadenas laterales de un res to de histidina y otro de metionina.que impiden que el citocromo c reaccione conel oxigeno 0 con el monoxide de carbono a pH 7.0. En la tabla 18~6 se resumenalgunas propiedades de diversos citocromos,

Loscitocromos a ya3. que reciben el nombre con junto de f;i'oc.tomo~c~oxidasa, enzima respiratorio 0 ferricitoc.romo~c oxi[Jeno~reduc.tasa, merecen una atencion especial. En lugar de protohemo contienen heme A, que diflere del protohemo en que posee un grupo formilo en lugar de un grupo metilo en Ia posicion 8. no tiene gtupo metilo en la posicion 5. yen lavposicion 2 existeuna cadena lateral isoprenoide de 17 carbonos. larga e hidrofoblca. en vez de un grupo vinilo (figu~ ra 18~ 11 ). La porfirina A se halla estructuralmente relacionada conla porfirina de la clorofila, (pag. 608). la cual tambien posee una prolongada cadena lateral isoprenoide.

Existe todavia cierta incertidumbre acercade la estructura y mecanismo de accion de los citocromos a Y a3. Durante muchos afios. se creyo que constituian dos .entidades separadas, ya que sus. hemos reaccionan de modo diferente con el cianuro y con eLmonoxido de carbono y poseen diferentes espectros. Sin embaego •. se tieneya por cierto, que los citocromos a y a~ se hallen-combinados en unamisma gran molecule proteica gligomera. cuyoshemosson quimicamente identicos, pero difiet(~.nen su readividadhacia ciertos ligcmdos. Este complejo se conoce como.citocromo aaJ. Su peso molecular es de cerca de 200 000 y contiene cierto numero de subunidades.de diferentetamafio molecular. EI enzima posee dos moleculasde hemoA;y dos atomosde cobre. Los electrones procedentes del crtocromo c. son recibidos por el hemo a y transferidos despuesal hemo B-3. Secree que los dos atomos de cobre de la citocromo-c ... oxidasa, que dan sefiales de resonancia de espin electronico caracteristicas y experimentan transiciones Cu(U) '" Cu(I) durante el transporte electronico, catalizan la transferencia. de electrones desde el heme a3 al oxigeno. El cianuro inhibe la reoxidacion del citocromo a3 reducido por el oxigeno; el sulfuro de hidrogeno ejerce una ace ion similar. El citocromo a3. al igual que .la . hemoqlobina, se combina can el monoxide de carbona. probablemente en el centro ocupado normalmente por el oxigeno. La inhibicion de la citocromo-oxidasa por el monoxido de carbone se invierte por iluminacion con luz visible. La accion del citocromo aa3 se estudiara mas adelante (pag. 506).

Ubiquinona (Coenzima Q)

Ademas de las proteinas transferidoras de electrones, descritas anteriormente. un coenzima transportador de electrones liposoluble, la ubiquinona 0 coenzima Q, participa tambien en el transporte de electrones desde los sustratos orqanicos hasta el oxigeno en la cadena respiratoria de las mitocondrias. Este coenzima, que es una quinona reversiblemente reducible con

503

PARTE 2 CATABOLISMO Y PRODUCCION DE LA ENERGIA DEL ENLACE FOSFATO

una larga cadena lateral isoprenoide (fig. 18~ 13 ). Iue descubierto por R. A. Morton. quien 10 llamo ubiquinona debido a su ubicua presencia en los animales, en las plantas y en los microorganismos. Mas tarde. F. L. Crane y sus colaboradores hallaron una quinona liposoluble en las mitocondrias, y postularon que actuaba en el trans porte electronico: la llamaron coenzima Q (de quinona). Mas tarde se descubrio su identidad con la ubiquinona.

En realidad, se conocen divers as ubiquinonas, las cuales difieren solamente en la longitud de la cadena lateral isoprenoide, que posee 6 unidades isoprenoides en algunos microorganismos y 10 en las mitocondrias de los. tejidos animales (fig. 18~13). En los tejidos vegetales. las plestoquinones, estrechamente relacionadas con aquellas, efectuan funciones analogas en el transporte electronico fotoslntetico.

La ubiquinona posee una banda de absorcion de la luz caracteristica a 270~290 nm, que desaparece cuando se reduce a su forma quinol; esta variacion espectral se utiliza para medir la oxidacion y la reduccion de la ubiquinona,

Ruta del transporte electronlcoi Cadena respiratoria

EI concepto de que una cadena de transportadores electronicos es la -responsable-de Ia transferenciade electrones. desde las moleculas del sustratoal oxigeno molecular. representa la confluencta de dos lineas de investigacion. Losprimeros investigadores sobre oxidaciones biologrcas, durante elperiodo de 1900 a 1920. particularmente T. Thunberg.rhabtan descubierto las deshidrogenasas, quecatalizan la separacion de atemos de hidrcgeno de diferentes metabolitos en ausencia completa de oxigeno. A partir de tales experimentos, H.Wielandpos~ tulo mas tarde que la activacion de los atomos .de hidrogeno es el proceso basico implicado en la oxidacien bioloqica, 'Y que d oxigeno molecular no precisa ser activado parareaccionar con los atomos de hidrogenoactivos que proporcionan las deshidrogenasas. Sin embargo, en 1913, O. Warburg descubrio que el cianuro, a concentraciones muy bajas, inhibecasi por completo el consumo deoxigeno por las celulas ypor los tejidos que respiran. Dado que el cianuro no, inhibe a las deshidrogenasas pero S1 forma complejos muy : establescon el hierro (un ejemplo es el ferricianuro), postuloWarburg que la oxidacion biologica precisaba de un enzima que contenga hierro(el «enzima respiratorio»); a su pareeer, la activacien del oxigeno por este enzima era el mecanisme baS!FO implicado en la oxidacion biologica. Los diferenres rpuntos de vista de Wieland y de Warburg. es decir, la activacion del hidrogeno frente a la activacion del oxiqeno, fueron reunidos, posteriormente, por el hungaro Szent-Gyorgyt. quien postulo que ambos procesos tienen Iuqar, y que las fIavoproteinas desempefian un papel de transportadores intermediarios de electrones entre las deshidrogenasas y el «enzima respiratorio». Keilin demostro tambien que los citocromos actuan como una serie consecutiva de transportadores electronicos. Este y otros investigadores, entre los que se encuentran D. E. Green. K. Okunuki, T.Singer, T. King y E. Racker, efectuaron reconstrucciones «in vitro» de segmentos de la cadena de transporte electr6nico a partir de componentes purificados.

La secuencia de las reacciones de transferencia de electro-

504

FIGURA 18-13

Ubiquinona 0 coenzima Q. La forma oxidada 0 quinoidea ebsorbe [uertemenie

a 290 nm. El CoQ. se halla presente en algunos microorganismos y el COQIO en las mitocondrias de la mayoria de mamiferos. Para CoQ.. n = 6; para C;oQ,o. n = 10.

o II

/C,

CH30C C-CH3 CH3

II II I

CH30C, /C-(CH2-CH=C-CH2l.H C

II

o Forma oxidada

-2e- + 2e-

- 2H+ + 2H+

OH I

C

Cl-lOC/ """C-CH

'<3 II I 3

CH30C, .",.C-R C

I

OH Forma reducida

FIGURA 18-14

Cadena respiratoria de las mitocondries de memileros (derecha}. Se muestran los puntos de entrada de electrones procedentes de verios sustretos, as; como loscentros

de inhibici6n del- transporte electronico

y los centres pro babies de conservaci6n de la energia en forma de ATP. El simbolo FP representa a la flavoproteina; FP,

es la NADH-deshidrogenasa. Fe-S indica los centres hierro-ezuire, sus posiciones en la cadena son todavia inciertas. Q es la ubiquinone (coenzima Q).

Capitulo 18 Bnzimas de oxidecion-reducciot: y transporte electronico

TABLA 18-7. Reacclones secuenclales del transporte electr6nico desde el NADH hasta el oxiqeno, escritas en forma igualada.

No se incluyen todos los transportadores conocidos tales como el citocromo Cl y diversos centros ferro-sulfurados: observese particularmente la formaci6n y la utilizaci6n de iones H+ (en color) en, algunas de las reacciones.

NADH + H+ + FMN ~ NAn; + FMNH2 FMNH2 + 2Fe'S(II) +- FMN* 2Fe'S(II1) + 2H+ 2Fe'S(II) + 2W + Q ~ 2Fe'S(III) + QH2

QH, + 2 citocromo b(III) ~ Q + 2H+ + 2 citocromo b(II)

2 citocromo b(lI) + 2 citocromo c(III) ~ 2 citocromo b(lII) + 2 citocromo c(lI) 2 citocromo c(II) + 2 citocromo a(I1I) :;= 2 citocromo c(lIl) + 2 citocromo a(lI) 2 citocromo 'a(lI) + 2 citocromo a,(III) ;#. 2 citocromo a(III) + 2 citocromo a,(II) 2 citocromo a,(II) + %02 + 2r{+:;= 2 citocromo a,(IlI) + H20

Clave: FMN = grupo prostettco de la NADH-deshidrogenasa; Fe'S = gropo prostetico

de una proteina 0 centro ferro-sulfurado: Q = ubiquinona: los numerales romanos II. y III se refieren a los estados de oxidorreducci6n del hierro.

nes en la cadena respiratoria desde el NADH hasta el oxigeno que se muestra en la figura 18-14 y en la tabla 18-7. queda ahora bastante establecida. EI NADH es la forma en la que se recogenlos electronesprocedentes de muchos sustratos diferentes a traves de la acclon de las deshidrogenasas NADdependientes.Estos .• electrones se canalizan hacia Ia cadena por Ia via de la flavoprotein-NADH-deshidrogenasa. Per otra parte. otrossustratos se deshidrogenan por las Ilavin-deshidrogenasas tales como la succmato-deshidrogenasa y la acil-CoAdeshidrogenasa (pag. 560). que encamina los electrones enla cadena por la via de la ubiquinona (fig. 18-14). EI NAD+ y Ia ubiquinona sirven; asi, para recoger los equivalentes de tedUccion de los sustratos respiratorios oxidados por las deshidtogenasasligadas a laflavina y a la piridina,respectivamente, 10 que constituyeunanueva ilustraciondel principle de convetgenciaen las rutas catab61icas(pag. 380).

Lasecuenciadesde el NADhasta el oxigeno,que aparece enla figura 18 ... 1+, estabasadaen diversas lineas de evidencia. En primer lugar,escompatible con los potenciales de oxide ... treducci6n estandar de los diferentes transportadores electroni¢os, que se hacen mas positives a medida que los electrones pasan desdeel sustrato al oxigeno (tabla 18-1). En segundo luqar, las experiencias de reconstruccion «in vitro» con

a-Oxoglutarato Piruvato \

~ FP6

Succinato

-,

FPs FP2

Mrua,\ \ \ _ I~r ~ 1:;1' !:7p II:

Isocitrato~\ \ ~ \ , .

NAD~ FP1(4Fetl~Q -+ (2Fe'Sl -- citb (Fetlcitcl -- citc -- ctt aa, -.02

Glutamato/7 Rote~onla, Antimicina A Cianuro

. amltal//

3-Hidroxiacil-CoA FP3

A~il(graso) -CoA _;;; FP4 Glicerofosfato

505

PARTE 2 CATABOLISMO Y PRODUCCI6N DE LA ENERGiADEL ENLACE POSPATO

FIGURA 18~15

Espectro diferencial de los transportadores electronicos totalmente reducidos en las mitocondrias intactas de. higado.de rata. La suspension que ectu« de blanco, 0 control, se mantiene plenamente saturada con oxiqeno, y en ella los transportadores se hellen en sus estedos oxidados. Frente a este control se lee una segunda suspension mitocondrial

cugos transportadores se mantienen en estedo plenamente reducido, al hecer {We le .1lJJ1iDi'-t:11'.W.O _'«'.8 .8.tllJPJ'£>bk.a pL11' I» pn#oda fit> ».0 esceso de sustrato respiratorio. Los picos del citocromo c, reducido no se muestran; pueden diferenciarse de los del citocromo c solamente a temperatures mug bajas.·

0,03

0,02 AA

0,01

-0,01

nm

transportadores electronicos aislados han demostrado que el NADH puede reducir a la NADH."deshidrogenasa, -pero. no puede reducir directamente a los citocromosb. co .al citocro" mo aa3. Analogamente, la NADH."deshidrogenasareducida,no puede reaccionar dtrectamente conel citocromoc, sino quese necesita la presencia de la ubiquinona ydeJos citocrom.osb Y C!. Por ultimo, se han aislado de las mitocondrias unos complejos que contienen grupos de transportadores ligados funcionalmente: por ejemplo,un complejo de los citotromos b ycrcon una Ierro-sulfo-protetna, asicomo uncomplejo .. de la NADH."deshidrogenasa con una .. ovarias ferro .. sulfo .. proteinas.

La evidencia directa Y mas importante quizas provenga de las medidas de est ado de oxidorreduccion de los transportadores electronicos individuales, tal como actuan en las mitocondrias intactas por medicion del espectro diferencial. procedimiento que fue desarrollado por B. Chance Y G. R. Williams. Como las suspensiones mitocondriales son turbias y absorben Y difunden mucho la luz, el espectro de absorcion de los trans." portadores electronicos en las mitocondrias intactas no puede medirse por espectrofotometria directa. Sin embargo, resulta posible medirlas cantidades de los transportadores en su estado reducido en las suspensione~r turbias, por lectura de su absorcion optica con un espectrofotometro sensible, frente a un blanco 0 suspension-control de mitocondrias cuyos trans." portadores se hallen en su estado oxidado, neutralizando, de este modo. la gran absorcion debida a la turbiedad de la sus." pension (fig. 18." 15). Si se deja que una suspension de mitocondrias aisladas en estado estacionario aerobico oxide a los intermediarios del ciclo de los acidos tricarboxilicos, las dife-

506

Capitulo 18 Bnzimss . de oxidecion-teducciott y trans porte' . electronico

rencias espectrales muestran queel transportador electronico mas cercanoal reductor osustrato final de la cadena (NAD) es-el. termino masr.educido de la cadena en el estado estacionarie aer6bico.mientrasque· el transportador eiectronico en el extremodeloxigeno(citocromos)} sehalla casi por complete ensuiforma oxidada. Los transportadores electronicos intermedios de-la.cadena, en la direccion del sustrato al oxlqeno, se ". hallan . presentes en formes- sucesivamente mas oxidadas en. el .: estado estacionario aerobico, indicando con ella que los electrones cireulan a 10 largo de un gradiente desde el NAD hastaeLoxigeno. En otro conjunto de experirnentos espectrofotometricos· se han efectuado mediciones de la velocidad y de la, secuencia de. reoxidacion . de los transportadores admitiendo.oxigeno a unasuspensienanaercbica de mitocondrias en presencia de un exceso de sustrato. En condiciones anaerobtcas todos los transportadores se hallan completamente reducidos;?ladIllitirel ()xigeno -. el citocromo aaJ es el que se oxida primero, seguido del citocromo c y despues del citocromo b .• que. a. su vez.ies .sequido por la reoxidacion del NADI-i. Es importantehacer resaltar que un espectro dife .. renciaLrio es.elespectro de la forma reducida del transpor» tador el~c:.tr6nico;, sino Ia diferencia entre el espectro de las formasoXidaday .reducida.

En .. el,<:apitulo19.seestudiaran otros aspectos de la dinamicadeltraI);sporte.e1edronico. despues de considerar la fosforiladon -oxidativa.

FIGURA 18-16

lnhibidores del trsnspotte electronico.

Inhibidores diltranspotte electrenico

Losinhibidores quebloquean a los transportadores especificos de la<:adenade transporte' electoonico han proporcionado iro'" portantes datos sobre la secuencia de los transportaderes electro~icos en. Ia cadeI);8 r~piratoria. Se han encontrado tees inhibidores . que bloquean el trans porte electronico entre el NADHy la ubiquinona: .Ia rotenone. sustancia vegetal sumamen~ U1Ji.ica;util~ada por los indioasudamericanes como venen-a para .: l,Qs peC,es Yen ,.·lC:1·,actualidad como insecticida: el a11lUal. .. Utl.. ~Aturico.y 4a • pierici4ins, . que. es un antiblonco que;~paf'eCeensuestruetll.ra a laubiquinona, y puede, por taIlto.co.IUpetj,r. conella.Se cree que..estos. compuestos (figu~ ra JS..,19)C'\ct\lC:1n .soPreJa NADH~deshidrogenasa. Otro inhi ..

OH

CH30~CH3 .yH

CH30JL_ .J-CHzCH=CCH=CHCH2C=CHCH~CHC ,'. CHCH3

. N .' I I II ,.

CH3 CH3 CH. CH3

Plerlctdlna

C=CHz

l_---,..,.- I

H' CH3

o 0

" 0 CH. "

NC-NH0o~OCCH2CH(CH3)2

yOHCH3~~R

HN 0

I

CHO

Rotenone

Antimicina AI; R = n-hexilo

Amital

507

pARTE 2 CATABOLISMO Y PRODUCCI6N DE LA ENERGiA DEL ENLACE FOSFATO

bidor caracteristico es la antimicina A, aislada del Streptomices griseus, que bloquea el transporte electronico entre el citocromo b y el c. Una tercera clase de inhibidores bloquea el transporte electronico desde el citocromo aa~ al oxigeno: en este tipo se encuentran el cianuro, el sulfuro de hidroqeno y el monoxide de carbono. Se ha establecido el lugar en que actuan est os Inhibidores por medicion espectrofotometrica de los estados de oxidacion y reduccion de los diferentes transportadores electronicos antes y despues de la aplicacion del inhibldor a las mitocondrias en respiracion activa, 10 cual produce un «punto de interrupcion» (fig. 18~17). Estos puntos son utiles para la identificacion de la etapa limitante de la velocidad en una secuencia plunenzfmanca: mas adelante se estudiara otro ejemplo delempleo de los puntos de interrupcion (pag. 548).

Intercambios protonicos durante el transporte electronlco Otra importante propiedad caracteristica de lacadena de transporte electronico es la formaclon 0 utilizacien de lones hidroqeno en algunas de las reacciones secuenciales del transporte deelectrones (tabla 18~ 7) . Algunos transportadores electronicos tales como el NADH y laubiquinona transportan electrones en forma de atomos de hidrogeno, mientras que los citocromos transportan electrones como tales y, aparentemente, no toman ni pierden iones H+. Hasta hace un os pocos afios, se habia pasado completamente por alto la posible siqnificacion de estos intercambios de protones. Sin embargo, veremos ahora que estas reacciones productoras y absorbentes de protones parecen desempefiar un importante papel en la censerva cion de la energia del transporte electronico (pag. 536).

Incertidtunbres en la cadena de transporte electronico de las mitocondrias

Aunque parece evidente la implicacion de las proteinas 0 centroshierrc-azufre en divers os puntos de la cadena de transportadores eleetrcnicos desde el NADH hasta el oxigeno (fjg. 18~ 14), su localizacion precisa y su funcicn son todavia de~conocidas. Debe sefialarse tambien que se sabeahora que el, citocromo b, se presenta en dos formas, dtocromobK y citocrolIlo b-, que difieren en sus potenciales de oxidorreduccion estandar, La Iuncion de estas dos formas no esta clara todavia.aunque se ha postulado que el citocromo bT Iunciona en el mecanisme de transduccion de 1a energia durante el transporte electroalco.

El numero.ide electrones transferidos en cada etapa del transporte de la cadena respiratoria es otro de los aspectos rodeados deincertidumbre. En general, se cree que el transporte electromco se produce enetapas de doselectrones entre el NAD y la ubiquinona, y en etapas mono-electronicas desde el citocromo b hastael oxigeno (fig. 18~ 18). Por otra parte, la reduccion de una moleculade oxigeno a dos moleculas de agua precisa de un total de cuatro electrones. No se conoce todavia el modo comoSecoordina el flujo electronico en la cadena respiratoria, para que rinda cuatro electrones que aseguren la reduccioncompletade una molecula de O2, Una sugerencia es la de que ·108 . citocromos pueden

508

FIGURA 18-17

Analogias hidreulices del estado de reduccion de los transportadores electtonicos en el estado estecionetio eerobico, como consecuencia de la inhibicion. La inhibicion produce un punto de intertupcion: los trenspottedores de la izquierde del

punta se reducen mas, mienires que los

de la derecha se oxidan mas. Este [enomeno de intertupcion se emplea [recuentemente para identificar los puntos de tequlecion en sistemas multienzimidicos,

.5 100 'u

g

l

~

.~ 50

~

~

o

Estado estacionario aeroblco

100
s::
'0
'u
u
::s
"'0
<II
....
<II
"'0 50
<II
2'
s::
<II
U
....
&
0 Inhibici6n por antimicina A

FIGURA 18-18

Modelos de transferencia electronics.

En (A) las trensierencies electronices tienen lugar, en etapas de dos electrones hasta el coenzima Q, y en etapas

de un solo electron, despues de el. En (B), todas son etapas de dos

electrones. r.;

A B
Sustrato Sustrato
11 11
NAD NAD
11 11
FP FP
11 11
Q Q
1 11
b bb
1 11
c) c c)
1 11
c OOa
1 11
a o,
1
Qa
1
O2 Capitulo 18 Enzimas de oxidecion-teduccioti y transporte electronico

fundonar por pares. Constituye est a una cuestion de la mayor importancia, ya que la reduccion parcial de la molecula de oxigeno da lugaraproductos sumamente toxicos. La reduccion por un solo electron origina el radical superoxido O2-, mientras que la reduccion por dos electrones produce peroxide de hidrogeno. Ambos productos son muy reactivos y potencialmente son capacesde destruir algunos tip os de grupos funcionales presentes en las biomoleculas. En la actualidad se va creyendo mas cada vez que el superoxido y el peroxide de hidrogeno, se produce de hecho durante la reduccion del oxigeno en los tejidos animales (vease mas aba jo, pag. 514).

Energetica del transporte electronico

La varlacion de energia libre estandar que se produce al reaccionar entre si dos pares redox conjugados de potenciales de oxidorreduccion estandar conocidos, viene dada por la ecuacion

en la que n es el mimero de electrones transferldos, /F, el faraday (23 062 cal), y AE'o es el E'o del par aceptor de elec ... trones . menos el E'odel par dador de electrones. Mediante esta relacion podemos calcular Ia variacion de enerqia libre estandar cuando se transfiere un par de equivalentes electronicos desde el NADH (E'o = -0,32 V) hasta el oxigeno molecular (E'o = 0,82), es declr, a 10 largo de toda la cadena respiratoria:

AGo' = -2 X 23062 X [0,82 - (-0,32)]

_ -52700 cal mol-' = -52,7 kcal mol"!

Este calculo termodinamico es, por supuesto, independiente de la ruta seguida por los electrones, y no precis a del. conocimiento de las molecules que intervienen en el trans porte electronico, Se produce, de este modo, una disminucion muy grande de energia libre, unas 53 kcal, durante el transporte de un par de equivalentes electronicos desde el NADH hasta el oxigeno molecular a traves de la cadena respiratoria. Este valor puede compararse con la energia libre estandar de formacion del ATP a pH 7,0, a partir de ADP y de fosfato:

Pi + ADP~ATP + H20

AGo' = + 7,3 kcal mol:'

Queda claro que la disminucion de energia libre durante el paso de un par de electrones desde el NADH hasta el O2 molecular es 10 suficientemente grande como para hacer postble la sintesis no solamente de una sino de varias moleculas de ATP, procedentes del ADP y del fosfato, en condiciones estandar, siempre que se disponga de un mecanisme. para el acoplamiento de la energia. Sabemos en la actualidad que se producen tres molecules de A TP durante el paso de un par de electrones a 'traves . de 18 cadena respiratoria desde el N ADH hasta el oXlgeno en el proceso de fosforilaci6n oxidativa, 0 de fosforilaci6n de 'la cadena sespiretorie, que se estudiara en el capitulo siguiente (pag. 524). Sin embargo, el mecanismo preciso de esta conversion de la energia no se

509

PARTE 2 CATABOLISMO Y PRODUCC16N DE LA ENERGiA DEL ENLACE FOSFATO

conoce todavia con una com pl eta certeza. Quesepamos basta ahora, ninguno de los componentes que transfierenelectrones en Ia cadena respiratoria, estan en forma .. fosfoxilada. De hecho, no se ha podido demostrar todaviaque ningunodelos transportadores electronicos aislados hasta ·la Ieeha contenga un grupo quimico capaz de actuar· como dador deenergia para la sintesis del ATP. No obstante, hay dos caraeteristicas del proceso de transporte electronico que son import antes para el mecanisme de la conservaeion dela energia.durante el mismo: 1) el hecho de que se hallen involucradas un- gran niimero de eta pas secuenciales de transferencla. deelectrones, 10 que sugiere que la liberacion de energia se realiza escalonadamente, y 2) el hecho de que se produzca unaahsorcton y liberacion de iones H+ en algunas de estas etapas, lo cual hace pensar en una implicacion de intercambios pr9tonicos. en la conversion de energia.

Piridin~nucleotido~transhidrogenasa

Tanto los tejidos animales como los microorganismos contienen enzimas que cat ali zan la reaccion general

NADPH + NAD+~NADP+ + NADH

Esta reaccion permite la utilization .de. loseqllivalentes de reduccion del NADPH por lacaoena re~piratoria.]a cual normalmente acepta electrones del NADHcom~ oaOor. inmediato. En la direccion-inversa, permite la reduccion delNA.D~+ para fines biosintetlcos. Los enzimas. de este tipo recibe~el nombre de piridin~nucle6tido 0 NAD!P)+~transhidr0genasas.

En los tejidos animales, laNAD(P)+-tr~nshidrogenasa se halla localizada en la membrana mitocondrial. de la que puede extraerse con detergentes. La direccion. de 1a reaccion de .la transhidrogenasa en las mitocondrias. intaotas ·.depend~. de la energia generada por el transporte .eIect~onico y de la presencia de ATP. La velocidad de lareacci6n desde.el NADPH al NAD+ es, por 10 general.· mayor que Iayeloddad. dela reaccion inversa. Sin embargo,. cuando se eS.tA. g~?er<lnd~ energia por la cadena de trans porte. electr6nico,y. enpr~sencia de un exceso de ATP, los electrones tienen tendencia.8 pasar desde eI NADH al NADP+ para dar NADPH .enconcen~ traciones que exceden a las predichas a partir de la constante de equilibrio. Mientras que el mecanisme de este efecto permanece todavia en la oscuridad, el NADPH producido de este modo desempeiia un papel importante como reductor en las reacciones biosinteticas.

Transporte electronico en otros sistemas demelJ,l~ranl:1

Et transporte electronico tiene lugarnosolamente en -Iasmitocondrias, sino tambien en otros tiposdesistemas membranoses. Las bacterias heterctrofasvefectuarr un transporte electronico que es muy semejante, en principio. al de-Iasmitocondrias, los transportadores electtonicos,que .induyena las .flavoproteinas, las proteinas ferro-sulfuradasy los cito ... cromos, se hall an localizados en Ja membranacelitlar. En rea ... Iidad, tanto la . membrana celular de . las bacterias) heterotreficas comO la membrana mitccondrial. interna .peseen funciones bomelogas, heche que .aporta un Iuerte apoyoa lahip6tesis

510

Capitulo 18 Bnzimas de oxid8cion-reducciOn y transporte electronico

de que las raitocondrias surgieron de las bacterias en el transcurso de.Ia evoluci6n de las celulas eucariotas (pag. 962). La mayor parte de lasbactenas aerobicas gram~negativas utilizan a la uhiquinona (pag. 503) como si fuera un «colector» de electrones desde las flavoptoteinas, mientras que las bacterias gram .. positivasemplean vitamina K 0 uno de sus derivados (pa~ gina 365) para .este objeto. E. coli contiene a ambas, la ubiquinona y la vitamina K3•

En los organismos fetosinteticos, tanto procariotas como eucanceas, las. cadenas de transportadores electr6nicos que contienen flavoproteinas, proteinas hterro-azufre y citocromos, participan en el transporte e1ectroni'co /otosintetico inducido por la luz(pag. 616).

Se cree que el transporte electr6nico se produce en el nucleo de las celulas eucariotas, aunque solamente en pequefias cantidades en comparacion con la respiracion mitocondrial. EI ATP producido durante el transporte electr6nico nuclear puede utilizl.lrse para la biosintesis de los acidos nucleicos,

Los peocesos .de transporte electrcnico mitocondrial, bacterianoy fotosint~~ico, van acompafiados de la Iosfomlacion ~plada.del Al)P cemomedio de conservaci6n de la energia de .·1a r, oxidaciqn.· Sill. embargC), comoveremos ahora, existen otr()s .. tipos deprocesos de transporte electr6nico especializados qu.e. conducen ala. reducci6n del oxigeno, y que no van acorn~ados de. fosforilacion.

Empleo del oxigefio por las oxigenasas

Aunql1ela mayor parte del oxigeno molecular consumido por las .: c~lulas aerobtcas se reduce a agua a expensas de los eleetrones que fluyen a 10 largo de la cadena respiratoria de las mitocondrias, se emplean cantidades pequefias de oxigeno en reacciones enzlmaticas en las que uno 0 ambos atomos de la molecula de oxigeno se insertan directamente en la molecula .del-sustsato oi-ganico para formar grupos hidroxilo, Los eneimas que catalizan tales reacciones .se Haman oxigenasas, de las quee:xisten dos clases. Las dioxigenasas, que catalizan lainserci6n de ambos cfltomos de la molecula de oxigeno en la molecula del sustrato organico, y las monoxigenasas que insertan solamente uno.

Dioxiqensses

Las dioxigenasas, tambien llamadas oxigeno~transferasas, catalizan reacciones del tipo

en las que la molecule de AH2 es el sustrato, y la de A(OHh es su forma dihidroxilada: por 10 general, los dos grupos hidroxilo introducidos de esta manera son adyacentes 0 vecinos. En este tipo de reacciones, el producto- A(OH h es frecuentemente inestable y experimenta espontaneamente la ruptura del enlace carbono-carbono entre los grupos hldroxilo, El hecho de que los dos atomos de oxigeno del oxigeno molecular se insertan directamente en el sustrato, ha podido comprobarse mediante la utilizaci6n del is6topo 180 como trazador.

511

PARTE 2 CATABOUSMO Y PRODUCCI6N DE LA ENERGiA DEL ENLACEPOSPATO

Se ha obtenido un cierto numero de diexigenasas en forma muy purificada. Parece que todas contienen hierro, ya sea en Ia forma labil del enlace hierro-azufre (pag. 499) ,0' como heme; algunas contienen tambien cobre. Censtituye un ejemplo importante la tript6fano-pirrolasa, cuyo nombre reciente ... mente recomendado es tript6fano,;,2,3 ... dioxigenasa, hemo-enzima que cataliza una etapa de la degradacion oxidativa del triptofano (pag. 585). En esta reaccion se introducen des atemos de oxigeno en el anlllo de seis miembros del triptofano, para producir un producto dihidroxilico vecine mestable, el cual se descompone espontaneamente con escision del anillo aromatico para dar L-lormilquinurenina (fig. 18-19). Mas adelante se describen otros ejemplos de diexigenasas (paginas 582 y 585).

M onooxiqensses

Las monooxigenasas 0' hidroxilasas catalizan la insercton de un atomo rde oxiqeno del oxiqeno molecular en el sustrato orqanico: el otro atomo de exigeno se reduce a agua. Las monooxiqenasas precisan de un segundo sustrato para ceder electrones para la reduccion del segundO' atomo deexigene en la molecula de oxigeno: el primero se reduce a agua. Per dicha razon las monooxlqenasas se Haman tambien oxigenasas de lunci6n mixta. La ecuacion general de tales reacciones es

AH+XH2+ 02-AOH+~O+X

en la cual AH es el sustrato que experimenta la hidroxilacien, XH2 es el dador electronice, AOH es el sustrato hidroxilado y X el dador electronico oxidado. UnO' de los des atomesde la molecula de oxlgeno (encolor) se recupera enel producto hidroxilado y el otro en el agua Formada: elheche fue establecido utilizando el isotopo 180cemo trazador,

En la mayoria de reacciones de las menooxigenasas,el sequndo sustrato que aporta electrones para reducirun ateme de exigeno al agua es, en ultimO' termino, el NADHeel NADPH; sin embargo, se emplean diferentes transportadores de electrones para transferirlos desde el NADPH 0' el NAOH hasta el oxigeno.

Las monooxigenasas mas simples, las de las bacterias, sen fIavopreteinas que contienen FAD y catalizan la secuencia de reacciones siguiente

NAD(P)H + E-FAD - NAD(P)+ + E-FADH2 E-FADH2 + AH + O2- E-FAD + AOH + H20

en dende E represent a a la proteina de la exigenasa, AH el sustrato, generalmente· un compuesto aromatico, y AOH su producto hidroxilado.

Un tipo alqo mas complejo de reaccion de las monooxiqenasas es la catalizada per el enzima hepatica fenilalanina hidroxi ... lasa, cuyo nuevo nombre recomendado es fenilalanina-4-monoexigenasa. En esta reaccion el dador esencial de electrones que se precisa para reducir uno de los atomosde oxiqeno a aqua es el NADPH, pero los equivalentes dereduccion son transIeridos mediante la tetrahidrebiopterina (pag. 582), un coen ... zima cuya estructura se parece a la del tetrahidrefolato

512

FIGURA 18-19

Reacci6n de la tript6fano-oxigenasa ... mostrando la insercion en el sustrato de ambos atomos de la molecule de oxiqeno.

coo+ I HaN-CH

I

~.

VN1

TriP~6fano-l~ O.

oXlgenasa

coo+ I

HaN-CH

I

CH.

I

CXC=o

#0 N-C,:r

I I

H H

t-Trlptofano

N-Formilt-quinurenina

FIGURA 18-20

Mecanismo postulado para la hidroxilecion de sustratos organicos por el sistema P450 microsomico del higado. EI sustrato A se combina primeto con la forma Fe3+

del P450. que se reduce entonces pot un electron del NADH a la forma Fe2+.

Esta ultima se oxiqene, y un segundo electron del NADH convierte el oxiqeno unido en el radical 0-2, Se produce una oxidorreduccion interna con [ormecion del sustrato hidroxilado y eque, que contiene los atomos de oxigeno que se introdujeron como 0,. Se regenera P450 libre en su forma- Fe3+. En a/gunas celules, una proteine ferrosulfurada transfiere electrones desde el FADH2 al P450.

Capitulo 18 Enzimas de oxidecion-teduccion y transporte electronico

(pag. 353). Lasecuencia completa de reacciones se describira mas adelante (pag. 580).

Transporte electronico micros6mico

Muchas reacciones de hidroxilacion en los tejidos animales utilizcan enzimas mas complejos que las monooxigenasas y las dioxigenasas anteriormente descritas. EI reticule endoplasmatico, es decir, la fraccion microsomica, contiene sistemas de transporte electronico no fosforilante unidos a la membrana, que participan no solamente en reaeciones de hidroxilacion, sino tambien en reaeciones de desaturacion. Uno de los sistemas mlcrosomicos de transporte electronico del higado (fi~ gura . 18~20) . esta eonstituido por una flavoproteina Hamada NADPM.~citocromo~P450~reductasa, y un citocromo microsomico especializado, el citocromo P450, designado Irecuentemente como P450; en algunos organismos. participa tambien una proteina ferrc-sulfurada. En la primera etapa, un equivalente electronico es transferido desde el NADPH a la forma semiquinpna (pag. 496) de la Ilavoproteina, a Ia que reduce por complete, Los electrones son transferidos desde la flavoproteina reducida a la forma oxidada, 0 Fe(IlI). del P450. que se eneuentra solamente en los microsomas de .lascelulas hepaticas. y se halla ausente de las mitoeondrias del higado; posee una banda a a 420 nm y es un citocromo de la clase B. EIP450 (P de pigmento) se identifico por primera vez gracias a que el derivado con mono xi do de carbono de su forma reducida, presenta un maximo de absorcion a 450 nm. La forma reducida, Fe(II). del P450. reacciona con el oxigeno molecular. de tal modo que uno de los atomos de oxigeno se reduce a agua y el otro se introduce en el sustrato orqanico (fig. 18~20).

Los mierosomas del higado catalizan la hidroxilacion de muchas c1ases de sustratos diferentes, inc1uidos los esteroides (pag. 699) . los acidos grasos (pag. 680). el escualeno (pagina 694) y algunoa.aminoaeidcs. Promueven tambien la hidroxilacien de. diversos farmaeos. por ejemplo el fenobarbital. la morfina. Ia vcodeina, las. anfetaminas y los hidrocarburos carcinogenicos como el metilcolantreno. La hidroxilacion de estas sustancias normalmente extrafias constituye una etapa de su metabolismo. La flavoproteina y el P450 son Inducibles, es decir, su eoncentracion en el higado de los ani males aumenta en gran manera al series administrados barbituratos y otros farmacos. De heche, estos agentes estimulan la proliferacion de la porcion lisa (pag. 35) del reticulo endoplasmatico del hiqado, probablemente como adaptacion protectora 0 defensiva.

"P450-A~

~e"+.02- A-OH + H20

~___ (Sustrato

P450-A~ P450 hidroxilado)

~e"+' O2 ~e:H

/ __ ~ P450-A ;;°2

I

Fe"+ ;_.--A

(Sustrato)

P450-A

I

Fe'1+

513

PARTE 2 CATABOLISMO Y PRODUCCI6N DE LA ENERGiA DEL ENLACE FOSFATO

Los microsomas del higado poseen un segundo- tipo de cadena de transporte electronico no fosforilante, Ia cual comprende a la fIavoproteina citocromo~bs~reductasa y al cito~ cromo bs• citocromo que se encuentra en. elretlculo e:p.doplas~ matico pero no en la membrana mitocondrial interna. Ambas proteinas hart sido muy purificadas y se. han estudiado con gran detalle. Este tipo de cadena de transporte electr6nico microsomico se muestra particularmente activa en Iadesatu> racion de los acidos grasos (pag. 680).

Superoxido .. dismutasa y catalase

Durante el transporte electronico al oxiqeno molecular a tra .. ves de la cadena respiratoria mltocondnai, asicomo en dfversas reacciones de hidroxilacion y de oxiqenacion; se pueden for" mar productos toxicos en la reduccion parcial deloxigeno, probablemente como Intermediaries transitorios sobre los cen" tros activos de tales enzimas. Los mas itllportantes·· son·· el anion superoxido O2- (vease mas atras, pag. 508) Y el pe .. roxido de hidrogeno, que son altamentereactivosycapckes de lesionar irreversiblemente a diversas biomOlecubis;

Gracias a las investigaciones de I. FridoVich ysus colabO .. radores, se ha descubierto que las celulas aer6bicas contienen; generalmente, el enzima superoxido .. dismutasa,· que convierte al superoxido en peroxide de hidr6geno y ·en oxigeno molecular:

La superoxidc-dismutasa se encuentraen dos, formas,),1:p.a, en el citosol extramitocondnal, y otra,. en lao mitQCon.dria.:La superoxido-dismutasa mitocondrialde los eucClJ;i9taSes .s-eme~ jante a lasuperoxido-dismutasa de muchas pacterias,. porlo que se refiere a su contenido caracteristica-de Mn2+ y ala homologia. de sus secuencias amin.<>ilcidas.:La .forma d-e .Ja superoxido-dismutasa del .citosol tiene, poratra .parte, una estructura completamente diferente, y contieneCu2;ty·Zn2+, Estos enzimas se hallan presentes en concelltraci(meleYaAay son. extraordinariamente .activos, sugjrienqo.. que losrqdicales superoxido se estan produciendo continuamente dueante lar-e~ duccion enzimatica del oxigeno, par parte. dediversose:p.zimas y sistemas enzimaticosvy son rapidamente. eliminaAos.

El peroxide de hidrogeno Iormado por la superoxidadis .. mutasa y par las oxidasas Ilavtno-dependtentesjpaq, 496) se descompone por la catalasa, . hemo-enzima que cataliza la reaccion

La catalasa se encuentra en los microcuerpos (pag. 579) de las celulas animales, tambien llamados pe:roxisamas (pag. 477).

La accion protectora de la superoxido-dismutasa y de la catalasa esta probablemente favorecida por el aeido ascorbico, el glutation y la vitamina E, que aceptan facilmente electrones y pueden ejecutar una funcion de apoyo eliminando radicales libres.

514

Capitulo 18 Enzimas de oxidecion-eeduccion y trensporte electronico

Transformacion de la energla de oxidorreduccien en bioluminiscencia

Losot'ganismos Iuminiscentes comprenden a algunas bacterias, protozoos,hongos, gusanos Y crustaceos, y particularmente a la luciernaga. En muchos de estos organismos se producen oxidprreducciones enzimaticas, cuya variaci6n de energia libre es utilizada para excitar una' molecule hasta un est ado de energia elevada (pag. 607). Ello va seguido por el retorno de la molecula excitada al estado basieo. proceso que viene acompafiado de la emisi6n de luz visible; el fen6meno reclbe elnombre . de bioluminiscenda..

Los-eomponentes moleculares y el mecanisme de la luminiscencia-de laluciernagahansido investigados por W. D. McElroy y celaboradores. Los dos componentes necesarios, unfenol.heterocidico teemoestable, la luciferina (fig. 18~21) Y un enzima termoIabil, la lueiferasa. han sido extraldos de las luciernagas y han sido cristalizados.· La luclferasa (Pm ~ 100000) no posee grupo prostetico, En la primera etapa, la luciferina (LH2)' y el ATP reaccionan para formar adenilato de luciferilo (LH2 - AM P), que permanece fuertemente unido al centro catalltico de la luciferasa:

Mg"

LH2+ATP+E· E-LH2-AMP+PP1

Cuando esta forma del enzima se expone al oxigeno molecu~ lar, elenzima unido al adenilato de luciferilo se oxida para dar oXiluciferfna (L). que emite luz al volver a su estado basico

E-LH2 __ AMP + 02~ L + H20 + bioluminisceneia

Por cada molecula de luciferina oxidada se emite un cuanto de luz (pag. 607) .Sesupone que se forma un peroxide como producto intermedio. EI color de la luz emitida viene determinado.pol' la protetna enztmatica, ya que las diferentes espedes de lueiernaqas poseen la misma luciferina pero emiten luz decoloresdiferentes; Este tipo infrecuente de transformacion energetica constttuye en la luciernaqa una sefial para el apareamiento. La reacci6n luciferina-luciferasa, seguida en un fot6metro con registro, se emplea frecuentemente como un metodo dedeterminaci6n cuantitativo y de alta sensibilidad para el ATP.

FIGURA 18-21

Componenies de le reeccion de la luciierese.

~N~N~COOH HO~S/ ""S~H

Luciferina (LH,)

~~N)-COOH HO~S/ ""s)L_H OXiluciferina (L)

N N:tH.H ?H Aderina

X . C-O-P-O-Ribosa

... HI! I!

HO S S HO 0

Luciferil-adenilato

515

PARTE 2 CATABOLISMO Y PRODUCCION DE LA ENERGiA DEL ENLACE FOSFATO

Resumen

En las reacciones de oxidorreducci6n se transfieren electrones desde el reductor, 0 dador de electrones, al oxidante, 0 aceptor de electrones. La tendencia de cualquier reductor biol6gico a ceder electrones viene dada por el potencial de oxidorreduccion estandar, E'o. que es la fern de un reductor 1.0 M en presencia de la especie oxidante 1.0 M frente a un electrodo Inerte, a 25°C y pH 7.0. EI valor E'« de cualquier par redox conjugado permite la predicci6n de la direcci6n del flujo electr6nico neto en su reacci6n con otro par redox.

Existen cuatro c1ases principales de enzimas de oxidorreducci6n. 1) Las deshidrogenasas ptridlno-dependlentes, que catalizan la transferencia reversible de electrones desde los sustratos a los coenzimas NAD+ y NADP+, debllmente unidos, para formar NADH y NADPH. respectivamente. La reducci6n enzimatica del anillo de piridina del NAD+ 0 del NADP+ va acompaiiada de un cambio espectral y es estereoespecifica. 2) Las deshidrogenasas flavino-dependientes contienen FMN 0 FAD fuertemente unido como grupos prosteticos, y frecuentemente. un metal. En sus formas oxfdadas aparecen intensamente coloreadas, pero por reducci6n completa se decoloran. Las flavlno-deshidroqenasas mas importantes son la succinato-deshidroqenasa y la NADH-deshidrogenasa. 3) Las proteinas ferrosulfuradas contienen de dos a ocho atomos de hierro e igual numero de atomos de azufre acldo-labtles: los atomos de hierro experimentan trans lciones Fe(Il)-Fe(II1). 4) Los citocromos. que actuan en series. transfieren electrones desde las Flavoproteinas al oxigeno. Contienen grupos prostetlcos ferro-porifirtnlcos, experimentando transiciones reverstbles Fe(Il)Fe(I1I). que pueden seguirse espectrofotometricamente.

La cadena respiratoria de las mitocondrias esta constituida por la secuencia NADH. NADH-deshidrogenasa. proteina ferro-sulfurada, ubiquinona y citocromos b. cr. c. a y a,; participan tambien otros diversos centros, 0 protelnas, hierro-azufre. EI transporfe electronico es caracteristicamente inhibido en puntos especlficos por la rotenone, la antimicina A y el cianuro. Las observaciones espectrofotometricas hacen posible el estudio de Ia secuencia de transportadores electr6nicos. Algunas reacciones del transporte electr6nico van acompaiiadas de absorci6n 0 formaci6n de iones H+. EI transporte electr6nico desde el NADH hasta eloxigeno se realiza con una gran disminuci6n de energia Iibre, que se conserva, parcialmente, gracias a la fosforllaclon acoplada del ADP a ATP.

Existen tambien cadenas de trans porte electr6nico en la membrana celular de las bacterias, en los c1oroplastos y en los nucleos celulares. EI oxigeno molecular se utiliza tambien para la hldroxtlaclon de una gran variedad de metabolitos orgfmicos. Las dioxigenasas insertan ambos atomos de oxlqeno-del 0, en el sustrato, mientras que las monooxlqenasas insertan solamente uno. Las cadenas de transporte electr6nico especializadas del reticule endoplasmatico, que contiene bien citocromo PHO. o bien citocromo bs, se muestran tambien activas en cierto numero de reacciones de hidroxilaci6n enzlmatlcas.

Bibliografia

Veanse tambien las referencias del capitulo 19.

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Problemas

1. Calculese 1a fuerza electromotriz, expresada en voltios, registrada por un electrodo sumergido en una disoluci6n que contenga las siguientes mezc1as de NAD+ y de NADH. a pH 7,0 y 25°C. con referencia a la semi-celula de 0.00 V.

a) 1.0 mM de NAD+ y 10 mM de NADH.

b) 1.0 mM de NAD+ y 1.0 mM de NADH.

c) 10 mM NAD+ y 1.0 mM de NADH.

2. Ordenar las siguientes sustancias sequn su tendencia creciente a ceder electrones: a) cit. C"d. b) NADH. c) H2• d) ubiqutnol, e) lactato.

3. Ordenar las siguientes sustancias sequn su tendencia creciente a aceptar electrones: a) .a-oxoglutarato + CO2• b) oxalacetato, c) O2• d) NADP+.

517

PARTE 2 CATABOLISMO Y PRODUCCI6N DE LA ENERGiA DEL ENLACE FOSFATO

4. tCual de las reacciones siguientes podra producirse en la dtreccion mostrada en las condiciones estandar, suponiendo que se hallan presentes los enzimas apropiados para catalizarlas?

a) Malato + NAD+ ~ oxalacetato + NADH + H+.

b) Acetoacetato + NADH + H+ ~ ,B-hidroxibutirato + NAD+.

c) Plruvato + NADH + H+ ~ lactato + NAD ".

d) Plruvato + ,B-hidroxibutirato .~ lactato + acetoacetate.

e) Malato + piruvato ~ oxalacetato + 1actato.

f) Acetaldehido + fumarato ~ acetato +succinato.

5. Calculese la variaclon de energia libre estandar-.al pasar un par de equivalentes electronicos desde a) isocitrato al NAD+, b) succinato al citocromo b. c) malato al NAD+' d) NADH al citocromo c. [Suponqase pH 7.0 y 25°C).

6. Partiendo de los potenciales de oxidorreducclon restandar, calcalese las constantes de equilibrlo, a 25°C y pH 7.0. para lasreacciones

a) Malato + NAD+ ~ oxalacetato + NADH + H+.

b) Acetoacetato + NADH + H+~ ,s.hidroxibutirato + NAO+.

7. Calculense las concentraciones de equilibrio del malato, del oxalacetato, del NAD+ y del NADH.en la reaccion

Malato + NAD+ ~ oxalacetato + NADH + H+

cuando la reaccion se efectua a pH 7.0 y 25°C y la concentraclon inicial de cada componente es 10 mM.

8. Calculense las concentracionesdeequilibrio del. malato Y: del oxalacetato en la reaccion global

,B-hidroxibutirato + oxalacetato. ~ acetoacetate + .. malate catalizada por la ,B-hidroxibutirato-deshidrogenasall la malato-deshidrogenasa.en presencia de NAO. Suponqase que lareCiccion tiene lugar a 25°C y pH 7.0. hallandose inicialmente presentes el ,B,.p.idroxibutirato y el acetoacetate. a concentraclon 10 mM. y el oxalacetato y el malato a concentraclon 20 mM.

9. Llttlizando los potenciales estandar, calcular Ta rvariacton deenel'gia libre estandar para la oxidacicn del succinato a fumarato por a) una flavoproteina, tal como. en la celula, yb) POl' eI·· NAD+.

10. La conversion del 25-hidroxicalciferol (25-hidroxi- vitam inn 03) en 1.25-dihidroxicakiferol en el rilion es.·· cataltzada porul'la oxidasa de funcion mlxta, que precisa de un plridln-nucleotldo. Escribir una ecuacion igualada para la reacclon.

11. EI dideuteroetanol (CH'{::D,OH) se oxldo en presencia de alcoholdeshidrogenasa de levadura y de NAO. EI. plridln-nucleotido reducido resultante se incubo despues con el sustrato A en presencia de una deshidrogenasa NADH-dependiente especifica.· EI compuesto reducido AH,. no contenia deuterio. mientrasque eINAO+ contenia un atom~ de deuterio por molecule. lEs mas probable que la deshidrogenasa csdel sustrato A transfiera htdroqeno desde el lado A 0 desde el lade B del NADH?

12. Conslderese una reaccion de una deshidrogenasa tipica, en la que interviene un piridln-nucleotldo:

AH, + NAO+ ~ A + NADH + H+

a) LQue forma tendran las representaciones de l/vo frente a l/[AH,] para dlferentes concentraciones de NAD(P)? b) LQue relacion-cinetica se espera que prevalezca entre el NAD+ y el NADH? Vease

elcapitulo 8. J' J

13. Predecir los estados de oxidorreduccion del NAD. NAOH-deshidroqenasa, citocromo b, citocromo c y citocromo a, de las mitocondrias hepaticas si disponen de abundante isocitra~ como sustrato, Pi. ADP y. oxiqeno, pero estando inhibidos p~ll) rotenona, b) antimi-

cina A y c) cianuro. ,~.

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