Departamento de Bioquímica y ENZIMOLOGÍA CURSO 2010/11

Biología Molecular
CINÉTICA MULTISUSTRATO

TIPOS DE REACCIONES Bi-Bi

Las reacciones de transferencia de grupos catalizadas por enzimas se clasifican en
2 tipos mecanísticos principales

1) Reacciones secuenciales (o de desplazamiento simple)

Todos los sustratos deben combinarse con la enzima antes de que la reacción tenga
lugar y se liberen los productos. En estas reacciones el grupo transferido pasa directamente
desde un sustrato al otro dando los productos.

Secuencial al azar (o estadístico): el orden de adición de los sustratos es indiferente.

A B P Q

EA EQ
E EAB EPQ E
EB EP
B A Q P

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Secuencial al ordenado: existe un orden obligado de adición de los sustratos. En el

mecanismo ordenado aparentemente se requiere la fijación del primer sustrato (sustrato
conductor) para que la enzima forme el sitio de fijación para el segundo sustrato, mientras
que en el mecanismo estadístico ambos sitios están presentes en la enzima libre.

A B P Q

E EA EAB EPQ EQ E

2) Reacciones Ping-Pong (o de doble desplazamiento)

Los mecanismos en que se liberan uno o más productos antes de que se hayan
incorporado todos los sustratos, se conocen como reacciones Ping-Pong.
A P B Q

E EA FP F FB EQ E

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Para conocer el mecanismo de una reacción bisustrato se utilizan tres tipos de estudios
1) Estudios cinéticos (variando la concentración de sustrato)
1.a variando la concentración de un sustrato y manteniendo constante la del otro
1.b variando la concentración de ambos sustratos en una proporción fija
1.c utilizando sustratos alternativos
2) Estudios de inhibición por
2.a análogos de sustrato
2.b los propios sustratos (añadidos en exceso)
3.c los productos de la reacción
3) Estudios de intercambio isotópico

ECUACIONES DE VELOCIDAD

Significado físico de los parámetros cinéticos

En muchas reacciones bisustrato catalizadas por enzimas, si fijamos la concentración

de uno de los sustratos, la cinética obtenida con concentraciones variables del otro sustrato
suele ser del tipo Michaelis-Menten. En una reacción bisustrato que sigue una cinética de
Michaelis-Menten

V o Vmax: Es la velocidad máxima cuando la concentración de A y B es saturante.

KmA: Es la concentración de A necesaria para alcanzar una velocidad mitad de la

máxima cuando la concentración de B es saturante.

KmB: Es la concentración de B necesaria para alcanzar una velocidad mitad de la máxima

cuando la concentración de A es saturante.

KA : Es la constante de disociación de A de la enzima libre.

KB: Es la constante de disociación de B de la enzima libre.

KAB: Es la constante de disociación de B del complejo EAB

KBA: Es la constante de disociación de A del complejo EAB

A las constantes KA, KB, KAB y KBA, en ocasiones, como en algunos de los diagramas que
se muestran más adelante, se las representa como Kia, Kib, αKB y αKA, respectivamente.

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1) Mecanismo secuencial al azar

Cualquier ecuación de velocidad puede derivarse según la hipótesis del equilibrio rápido o
la hipótesis del estado estacionario. La ecuación de velocidad para el mecanismo Bi-Bi al
azar obtenida según la hipótesis del estado estacionario es muy compleja (Cornish-Bowden,
2004). En el caso especial en que ambos sustratos estén en equilibrio rápido e independiente
con el enzima, es decir, la conversión EAB → EPQ sea limitante de la velocidad (condición
del equilibrio rápido) la ecuación de velocidad obtenida es
[A] [B]
v αK A K B V [A ] [B]
= de donde v=
V [A ] + [B] + [A] [B] K A αK B + αK B [A ] + αK A [B] + [A ] [B]
1+
KA KB αK A K B
Nótese que cuando mantenemos constante la concentración de uno de los sustratos (por
ejemplo [B]) y variamos la del otro ([A]), la enzima sigue una cinética de Michaelis-Menten

[A] V
⎛ αK B ⎞
⎜1 + ⎟
V [A ] ⎜
⎝ [B ] ⎟
⎠ Vap [A ]
v= = =
⎛ K ⎞ ⎛ αK B ⎞ ⎛ K ⎞ + [A ]
αK A ⎜⎜1 + B ⎟⎟ + [A ] ⎜⎜1 +
Km
⎟ ⎜1 + B ⎟
⎟ ⎜ ⎟
A ap

⎝ [B] ⎠ ⎝ [B] ⎠
αK A ⎝
[B] ⎠ [ ]
+ A
⎛ αK B ⎞
⎜1 + ⎟
⎜ [B] ⎟⎠
⎝

⎛ K ⎞ ⎛ K ⎞
⎜1 + B ⎟ ⎜1 + B ⎟
⎜ [B] ⎟ ⎜ [B] ⎟
= αK A ⎝ ⎠ =K ⎝ ⎠
V
donde Vap = y Km
⎛ αK B ⎞ A ap
⎛ αK B ⎞
mA
⎛ αK B ⎞
⎜1 + ⎟ ⎜1 + ⎟ ⎜1 + ⎟
⎜ [B] ⎟⎠ ⎜
⎝ ⎝ [B] ⎟⎠ ⎜
⎝ [B] ⎟⎠
Es interesante observar que cuando la concentración de B es saturante ([B] = ∞) la Km
aparente para A es la Km real, de modo que, de acuerdo con la definición, KmA = α KA, siendo
α el factor de interacción entre A y B (ver esquema). Si α = 1, la unión de A y B es
independiente, si es menor de 1, la unión de un sustrato favorece la del otro, y si es mayor de

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1 la unión de un sustrato perjudica la del otro (ver esquema). Con el mismo razonamiento
podríamos demostrar que KmB = α KB.

De modo que la ecuación de velocidad para un mecanismo secuencial al azar, derivada según
la hipótesis del equilibrio rápido, podemos escribirla como

Vmax [A ] [B]
v=
K A K m + K m [A ] + K m [B] + [A ] [B]
B B A

y en forma de dobles recíprocos:

1 1 K mA 1 Km 1 KAKm 1
= + + B
+ B
v V V [A ] V [B] V [A ] [B]

2) Mecanismo secuencial ordenado

La derivación de la ecuación de velocidad según la hipótesis del equilibrio rápido resulta en

[A] [B] [A] [B]

v K A αK B KA Km V [A ] [B]
= = B
y v=
V
1+
[A] + [A] [B] 1+
[A ] +
[A] [B] K A K m + K m [A ] + [A ] [B]
B B
KA K A αK B KA KA Km
B

donde KmB = αKB = KAB, ecuación que en forma de dobles recíprocos queda

1 1 K mB 1 K A K mB 1
= + +
v V V [B] V [A] [B]

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Sin embargo, si se emplea la hipótesis del estado estacionario la ecuación obtenida tiene la
misma forma que la obtenida para el mecanismo Bi-Bi secuencial al azar, es decir,

V [A ] [B]
v= que en forma de dobles recíprocos queda
K A K m + K m [A ] + K m [B] + [A ] [B]
B B A

1 1 K mA 1 Km 1 KA Km 1
= + + B
+ B

v V V [A ] V [B] V [A] [B]

3) Mecanismo Bi-Bi Ping-Pong

La ecuación de velocidad del mecanismo Bi-Bi Ping-Pong es distinta a la que se obtiene

en los mecanismos secuenciales, debido a que no se forma el complejo ternario EAB. La
derivación según la condición del estado estacionario da lugar a

V [A ] [B] 1 1 K mA 1 Km 1
v= o lo que es lo mismo = + + B

K m [A ] + K m [B] + [A ] [B] v V V [A ] V [B]

B A

que tiene una forma distinta a la del mecanismo secuencial. Esto hace que podamos distinguir
cinéticamente si un mecanismo es secuencial o Ping-Pong.

REPRESENTACIONES GRÁFICAS
En efecto, en un mecanismo Ping-Pong si representamos en un diagrama de dobles
recíprocos la velocidad cuando variamos la concentración de B y mantenemos constante la de
A, obtenemos una recta caracterizada por
Km 1 K mA 1
pendiente: B
corte con el eje de ordenadas: +
V V V [A ]

Si representamos varias rectas que difieren en la concentración de A obtenemos una serie

de líneas paralelas, ya que la pendiente no depende de la concentración de A. Del mismo
modo, si variamos la concentración de A fijando la de B obtendremos una familia de rectas
Km
A
paralelas de pendiente
V

Por el contrario, si el mecanismo es secuencial obtenemos una serie de rectas que se cortan
a la izquierda del eje y, ya que las pendientes de las rectas dependen de la concentración del
sustrato fijo. Reordenando la ecuación que hemos obtenido con los mecanismos secuenciales
para hacerla depender de [A] tenemos

1 1 ⎛⎜ K m B ⎞ Km
⎟+
⎛ KA Km ⎞ 1
⎜1 + B ⎟
= 1+ A

v V⎜
⎝
[B] ⎟
⎠
V ⎜
⎝
K m [B] ⎟ [A ]
A ⎠

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Si reordenamos la ecuación para hacerla depender de la concentración de B, la ecuación es

distinta
1 1 ⎛⎜ K m A ⎞ Km
⎟+ ⎛ KA ⎞ 1
= 1+ B
⎜⎜1 + ⎟⎟
v V⎜
⎝
[A] ⎟
⎠
V ⎝ [A ] ⎠ [B]

En cualquier caso, e independientemente del tipo de mecanismo, es posible calcular los

valores de V, , KmB, haciendo una representación derivada de la de dobles recíprocos. Si
representamos el corte con el eje de ordenadas respecto al inverso de la concentración del
sustrato fijo, independientemente de que el mecanismo sea secuencial o Ping-Pong,
obtenemos una recta que corta el eje de ordenadas en 1/V y el de abcisas en -1/ KmA(si A es el
sustrato fijo) o en -1/ KmB (si es B el sustrato fijo).

En las figuras siguientes se muestra el tipo de representación obtenido con cada uno de los
mecanismos descritos. Obsérvese que las representaciones obtenidas con los mecanismos
secuenciales no son simétricas para ambos sustratos.

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MECANISMOS BI-BI SECUENCIALES (ORDENADO Y AL AZAR)

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MECANISMO BI-BI PING-PONG

Estudios de inhibición
La inhibición por producto es un método diagnóstico muy útil para identificar el
mecanismo de una reacción multisustrato. Ofrecen mucha información del tipo de mecanismo
e incluso sobre el orden de entrada y de salida de los sustratos y productos.

Inhibición por producto

Para realizar los estudios de inhibición añadimos

a) uno de los sustratos a concentración fija (que puede ser o no saturante)

b) el otro sustrato a concentración variable
c) uno solo de los productos a distintas concentraciones

y medimos la velocidad inicial de la reacción en esas condiciones.

El tipo de inhibición que ejerce un producto depende del mecanismo de la reacción y

puede determinarse a partir de la ecuación de velocidad correspondiente derivada según las
hipótesis del equilibrio rápido o del estado estacionario. Sin embargo, es posible averiguar el
tipo de inhibición mediante la simple inspección del mecanismo siguiendo las reglas

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propuestas por Cleland. Estas reglas nos indican el tipo de representación que obtendremos
en un diagrama de dobles recíprocos al estudiar la inhibición. En estas representaciones:

1) El corte de las rectas con el eje de ordenadas se modificará si sustrato e inhibidor se

unen a formas distintas de la enzima.

2) La pendiente de las rectas se modificará si sustrato e inhibidor se unen a la misma forma

de la enzima o a formas reversiblemente relacionadas. Se dice que dos formas de la
enzima están relacionadas reversiblemente si entre ellas no se encuentra un paso
irreversible. En este contexto se consideran etapas irreversibles la liberación de un
producto cuya concentración en el medio sea nula o la adición de concentraciones
saturantes de un sustrato (lo que provoca que la reacción transcurra de hecho en un solo
sentido).

Si el producto se une a una sola forma de la enzima, se obtienen patrones de inhibición

sencillos (inhibiciones lineales). La inhibición es competitiva si sólo varía la pendiente,
incompetitiva si únicamente varía el corte con el eje y mixta si varían ambos parámetros. Si
el producto puede unirse a varias formas de la enzima hay que aplicar consecutivamente las
reglas 1) y 2) y pueden resultar inhibiciones hiperbólicas, de modo que se obtengan curvas en
un diagrama de dobles recíprocos. En este caso la inhibición por producto puede ser menos
informativa.

Como ejemplo del análisis de inhibición por producto consideremos una reacción del tipo
A+B+C P + Q + R que siguiera el siguiente mecanismo

A B P C Q R

E EA EAB FP F FC EQR ER E

En la notación de Cleland éste sería un mecanismo Bi Uni Uni Bi Ping Pong (es un
mecanismo Ping Pong porque P sale antes de que se incorpore C). En este caso la inhibición
que ejerce cada producto puede conocerse de un modo sencillo

P como inhibidor, A como sustrato variable; P reacciona con F mientras que A lo hace con
E, de modo que varía el corte con ordenadas. P y A están relacionados reversiblemente a
través de la secuancia reversible E-EA-EAB-FP-F de modo que la pendiente también variará
y la inhibición obtenida es de tipo mixta. Este sería el resultado obtenido utilizando una
concentración subsaturante de B y de C. Sin embargo, si se fija la concentración de B en un
valor saturante (mucho mayor que KmB), variará el corte con el eje de ordenadas pero no la
pendiente, ya que se interrumpirá la secuencia reversible entre A y P, y P actuará como un
inhibidor de tipo incompetitivo. Por otra parte, si saturamos con C, P no inhibirá ya que no
existe F libre (se habrá transformado en FC).

P como inhibidor, B como sustrato variable; P y B reaccionan con distintas formas de la

enzima, de modo que el corte con el eje de ordenadas varía. La secuencia EA-EAB-FP-F es

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reversible, de modo que también varía la pendiente, de modo que P sería un inhibidor mixto.
Si se satura con A no cambia nada (inhibición mixta), pero si se satura con C entonces P no
inhibe (como antes).

P como inhibidor, C como sustrato variable; P y C reaccionan con la misma forma de la

enzima, de modo que la pendiente, pero no el corte con ordenadas, varían, resultando una
inhibición competitiva. La saturación con A o B no tiene ningún efecto.

Q como inhibidor, A como sustrato variable; Q y A reaccionan con la distintas formas de

la enzima, de modo que el corte con el eje varía. La secuencia ER-E se encuentra
interrumpida por la liberación de R (no presente en el medio) y la secuencia E-EA-EAB-F-
FC-EQR-ER por la liberación de P (que tampoco está presente), de modo que la prendiente
no varía y la inhibición es de tipo incompetitiva. La saturación con B o C no tiene ningún
efecto en la inhibición ejercida por Q.

Q como inhibidor, B como sustrato variable; Q y B reacionan con distintas formas de la

enzima, de modo que el corte con el eje de ordenadas varía. Las secuencias entre ellas están
bloqueadas por la liberación de P y R, como en el caso anterior, de modo que la inhibición es
de tipo incompetitivo. La saturación con A o C no tiene ningún efecto.

Q como inhibidor, C como sustrato variable; Q y C reaccionan con distintas formas de la

enzima de modo que varía el punto de corte varía. La secuencia F-FC-EQR-ER es reversible,
de modo que la pendiente también varía, resultando en una inhibición mixta. La saturación
con A o B no tiene efecto alguno.

R como inhibidor, A como sustrato variable; A y R reaccionan sólo con E, de modo que la
pendiente y no el punto de corte varían, dando lugar a una inhibición competitiva.

R como inhibidor, B como sustrato variable; R y B reaccionan con diferentes formas de la

enzima, de modo que varía el punto de corte. La secuencia E-EA es reversible, de modo que
la pendiente también varía y la inhibición es mixta. La saturación con A elimina la inhibición
por R (ya que la concentración de E se reduce a 0), mientras que si saturamos con C no se
observa ningún efecto.

R como inhibidor, C como sustrato variable; R y C reaccionan con diferentes formas de la

enzima, de modo que varía el corte con el eje. Las secuencias entre La secuencias entre R y
C no están conectadas reversiblente por la liberación de P y Q, de modo que la pendiente no
varía y la inhibición es incompetitiva. La saturación con A elimina la inhibición por R
mientras que la saturación por B no tiene ningún efecto.

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Este patrón de inhibición puede resumirse en el siguiente cuadro:

A B C
ByC B sat. C sat. AyC A sat. C sat. AyB A sat. B sat.
subs. subs. subs.

P M I no inh. M M no inh. C C C

Q I I I I I I M M M

R C C C M no inh. M A no inh. A
C: competitiva; I: incompetitiva; M: mixta; no inh: no inhibe

Utilizando la misma estrategia pueden obtenerse los patrones de inhibición por producto
para las reacciones de tipo Bi Bi. En este caso los patrones de inhibición obtenidos son

Mecanismo Bi Bi secuencial al azar

A B
B subsat. B satur. A subsat. A sat.

P C no inh. C no inh.

Q C no inh. C no inh.

Mecanismo Bi Bi secuencial ordenado

A B
B subsat. B satur. A subsat. A sat.

P M I M M

Q C C M no inh.

Obsérvese que la inhibición por producto permite discernir entre un mecanismo secuencial
ordenado del secuencial al azar. Además nos indica el orden de adición de sustratos y

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productos (la única inhibición competitiva aparece entre el primer sustrato, A, y el último
producto, Q).

Existe un tipo especial de mecanismo secuencial ordenado, el mecanismo

THEORELL-CHANCE, que da un patrón de inhibición por producto diferente. Este es un
mecanismo secuencial ordenado pero no existe una concentración apreciable del complejo
ternario. En este caso el mecanismo quedaría

A B P Q

E EA EQ E

A B
B subsat. B satur. A subsat. A sat.

P M no inh. C C

Q C C M no inh.

Mecanismo Bi Bi Ping-Pong

A B
B subsat. B satur. A subsat. A sat.

P M no inh. C C

Q C C M no inh.

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