DETERMINACIÓN DE BACILLUS CEREUS EN ALIMENTOS

I. INTRODUCCION

Bacillus cereus es un bacilo Gram positivo, anaerobio facultativo y móvil debido a la presencia de
flagelos perítricos; forma esporas resistentes a condiciones adversas del medio, como altas temperaturas,
deshidratación y radiación, y produce diversas toxinas que contaminan gran variedad de alimentos. Es capaz de
crecer en un amplio rango de temperaturas, desde los 4 °C a 48 °C, a pHs de 4,9 a 9,3 y soporta concentraciones
de NaCl en el medio hasta del 7 %. La actividad acuosa (aw) mínima para su desarrollo es 0,93. La capacidad de
esporular es una característica importante, porque estas estructuras confieren a la bacteria resistencia a
condiciones adversas, de esta manera pueden seguir viables a pesar de que las células vegetativas hayan sido
destruidas. Luego, si las condiciones son las apropiadas, la espora germina y el microorganismo puede crecer. La
espora se desarrolla en forma central o subterminal sin deformación del esporangio. Para la germinación de las
esporas, algunas cepas necesitan activación por calor (shock térmico), una opción es por calentamiento a 80°C
durante 10 minutos. Las esporas son resistentes a bajas condiciones de humedad y a tratamientos térmicos como
la pasteurización o procesos de cocción de los alimentos y al ácido clorhídrico presente en el estómago, lo que
constituye un peligro potencial para la salud humana.

II. OBJETIVOS
III. MATERIALES Y MÉTODOS

IV. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

A. Generalidades
B. cereus es un bacilo Gram positivo, formador de esporas, aerobio facultativo, habitante saprófito del
suelo que se encuentra ampliamente distribuido en el ambiente. Debido a esta amplia distribución es que se
facilita su acceso a los alimentos. Dentro de sus principales reservorios en el ambiente se encuentra la materia
orgánica en descomposición, agua dulce y salada, vegetales, fómites y el tracto gastrointestinal de invertebrados.
La patogenicidad de esta bacteria, ya sea en infecciones intestinales o extraintestinales, se encuentra
íntimamente asociada con la producción de exoenzimas o toxinas. Dentro de estas toxinas se describen cuatro
hemolisinas, tres fosfolipasas, una toxina emética (cerúlida), y tres enterotoxinas formadoras de poros: la
hemolisina BL (Hbl), la enterotoxina no hemolítica (Nhe), y la citotoxina K. La patogénesis por B. cereus en el
tracto gastrointestinal se debe a que las células vegetativas ingeridas, producen y secretan las enterotoxinas que
inducen el síndrome diarreico (Hbl, Nhe y citotoxina K); o a que la toxina emética, un péptido cíclico codificado
por un plásmido, que es producida en los alimentos e ingerida ya preformada.

Principales factores de virulencia

Bacillus cereus tiene la capacidad de producir diferentes toxinas que afectan la salud humana cuando se
consumen alimentos contaminados por el microorganismo en dosis de 105 a 108 UFC por gramo de alimento. Las
toxinas generadas dependen de las cepas de B. cereus, la toxina emética, se caracteriza por causar vómito, y las
enterotoxinas como la hemolítica, la no hemolítica y la citotoxina K, inducen permeabilidad vascular por la
formación de poros en el intestino delgado y por consiguiente, diarrea.
Toxina emética; La toxina emética es producida bajo condiciones aeróbicas o microaerofílicas. Se
caracteriza por ser altamente hidrofóbica y termoestable, solo se inactiva a 121ºC por 90 minutos y es activa en
un rango de pH entre 2 y 11. La toxina emética es resistente a la digestión de las enzimas proteolíticas del tracto
intestinal y a los ácidos presentes en el estómago humano; tras ser ingerida en el alimento, se une al receptor
5–HT3 en el estómago provocando el vómito. Se ha sugerido que existe una baja probabilidad de que la toxina
emética se produzca en alimentos refrigerados, debido a que las cepas productoras crecen a temperaturas
superiores a 15 °C, por tanto, se asume que los alimentos refrigerados estarían libres de la toxina mientras se
conserve la cadena de frío. Sin embargo, se ha encontrado que algunas cepas de B. weihenstephanensis,
microorganismo psicrófilo, pueden generar esta toxina a bajas temperaturas, debido posiblemente a la
transferencia horizontal del plásmido entre las diferentes cepas. La toxina involucrada es llamada cereulida o
vomitoxina. Los síntomas se presentan entre una y cinco horas después de realizada la ingesta, predominando
náuseas y vómitos. El malestar dura de 6 a 24 horas.
Enterotoxinas Las enterotoxinas son producidas después de la colonización del intestino delgado por B.
cereus; allí forman poros en las membranas de las células epiteliales, generando un desbalance osmótico que
induce la diarrea en el humano. Entre las enterotoxinas más relevantes producidas por B. cereus se encuentran
la toxina hemolítica, la toxina no hemolítica y la citotoxina K. El síndrome diarreico se debe a la germinación in
vivo de las esporas de la bacteria en el intestino con la consecuente producción de enterotoxinas termolábiles.
Suelen aparecer en alimentos mal refrigerados. Los síntomas aparecen entre las 6 y 8 horas de realizada la ingesta
y duran entre 12 y 24 horas. La sintomatología principal consiste en diarrea y dolor abdominal y, ocasionalmente,
náuseas y vómitos.

Alimentos susceptibles de contaminación

Bacillus cereus puede presentar diferentes grados de toxicidad de acuerdo a la cepa. Los alimentos más
susceptibles de ser contaminados por cepas de B. cereus incluyen, harinas, carnes, leches, quesos, verduras,
pescados, arroz y sus derivados. En general, se ha evidenciado que B. cereus se encuentra frecuentemente
contaminando alimentos con alto contenido de almidón, debido a que B. cereus produce enzimas del tipo
amilasas que le permiten hidrolizar dicho carbohidrato y utilizarlo como fuente de carbono para su crecimiento.
Se ha reportado la relación de algunos alimentos con determinados tipos de toxinas; por ejemplo, el síndrome
emético causado por la toxina emética se ha asociado principalmente con el arroz frito y cocido, mientras que el
síndrome diarreico causado por las diferentes enterotoxinas se ha relacionado con carnes, vegetales y leche.
En la industria lechera, B. cereus puede constituir un serio problema debido a que tanto la leche líquida
como en polvo tienen un alto contenido de grasa, condición que favorece la adhesión de las esporas, dificultando
su eliminación, además puede formar biopelículas en las tuberías de ordeño y equipamiento debido a los ácidos
grasos que se presentan durante la lipólisis grasa de la leche. Adicionalmente, de acuerdo al tipo de industria
alimenticia se pueden establecer diferentes “nichos térmicos” para B. cereus, por lo cual en plantas donde se
trabajan con procesos térmicos como la deshidratación y pasteurización se pueden encontrar cepas
termoresistentes y en plantas donde emplean cadenas de frío, prevalecen las cepas psicrófilas, haciendo difícil
su eliminación. También las especias son un importante vehículo de transmisión ya que las esporas son muy
resistentes a la desecación. En productos cárnicos, la incidencia suele ser mayor debido a que en muchos de ellos
se incorporan aditivos, como las especias, que incrementan el número de Bacillus cereus. Alimentos que poseen
leche en polvo en su composición pueden estar altamente contaminados con esporas, esto es especialmente
importante en el desarrollo de fórmulas para lactantes y niños. Otros alimentos de los que fue aislada la bacteria
son té, postres, legumbres, salsas, sopas,
entre otros.
No se transmite de persona a persona, pero sí puede multiplicarse en el alimento. Se sabe que gran parte
de los alimentos e ingredientes están contaminados con esta bacteria, pero no alcanzan la dosis infectiva, la cual
es de aproximadamente 105 UFC/g . Se considera que un alimento que contenga más de 104 UFC/g de B. cereus
podría no ser seguro para su consumo.

V. MATERIALES Y METODOS
5.1 Materiales
5.2 Métodos
Preparación de la muestra y diluciones sucesivas

Inoculación e incubación
- Transferir por medio de una pipeta estéril, 0.1 ml de la muestra si el producto es líquido ó 0.1 ml de la
suspensión inicial (dilución 1/10), por duplicado, a placas de agar MYP. Si es necesario repetir el procedimiento
para las sucesivas diluciones decimales.
- Distribuir el inóculo tan pronto como sea posible sobre la superficie del medio sin tocar los bordes de las
placas con una espátula estéril. Invertir las placas e incubarlas a 30°C entre 18 y 24 horas.
 - Si no hay colonias claramente visibles, incubar las placas por 24 horas adicionales antes del conteo.

Recuento y selección de las colonias

- Después de la incubación por el período especificado, seleccionar las placas, preferiblemente en dos diluciones
sucesivas, en las que el Bacillus cereus recuento sea menor a 150 colonias, contar en cada placa las colonias con
características de colonias presuntas de Bacillus cereus.
- Las colonias presuntas son grandes, rosas (indicando que no ocurre fermentación del manitol, y generalmente
rodeadas de una zona de precipitación (producción de lecitinasa). Si hay menos de 15 colonias características en
las placas inoculadas con el producto líquido o con la menor dilución de los otros productos, es posible realizar
un recuento estimado.

Confirmación
- Selección y purificación de las colonias para confirmación: Elegir cinco colonias presuntas de cada placa. Si
hay menos de cinco colonias en la placa, tomar todas las colonias presentes. Si las placas están con
sobrecrecimiento y no es posible seleccionar colonias bien aisladas, estriar 5 colonias presuntivas en placas con
el medio selectivo (MYP). Incubar las placas a 30°C durante 18 h a 24 h.
- Seleccionar de cada placa al menos una colonia bien aislada.

Confirmación por el test de hemólisis en agar sangre de oveja

Estriar, pinchar o sembrar como mancha las colonias seleccionadas a partir de las placas de MYP en la
superficie de agar sangre de oveja de modo de obtener colonias aisladas que permitan una buena
interpretación de la reacción de hemólisis.
Incubar a 30°C durante 24 h y leer la reacción de hemólisis.
Cada colonia rodeada de una zona clara se considera hemólisis positiva.

3.2 Solución de sulfato de polimixina B: Disolver 0,1 g del sulfato

de polimixina B en 100 ml de agua destilada. Esterilizar por
filtración.

3.3 Emulsión de yema de huevo al 50%:

VI. RESULTADOS

6.1 Interpretación de resultados.

Recuento de colonias de presunto Bacillus cereus

Informar el recuento de presunto Bacillus cereus en la porción de muestra analizada (por gramos o
mililitros para muestras líquidas).
- Placas sin colonias, Si las dos placas correspondientes a la muestra sembrada (productos
líquidos) o a la suspensión inicial (otros productos) no contienen colonias de presunto Bacilus cereus
informar el resultado como sigue:
Si se sembró 0.1 ml en cada placa
- Menos de 10 microorganismos / ml (productos líquidos) ó
- Menos de 10/d microorganismos / g (otros productos) donde d es el factor de dilución de la
suspensión inicial.

1. Método de cálculo Para que un resultado sea válido, se suele considerar necesario que el recuento de colonias
se realice al menos en una placa que contenga un mínimo de 15 colonias sospechosas (de acuerdo a la norma
específica ISO 7932 para recuento de Bacillus cereus en placa)

2. Método de cálculo después de la confirmación. En este método donde se requiere de una confirmación para
el recuento, se identifica un número de colonias sospechosas (A) que se someten a confirmación. Tras la
confirmación se calcula el número de colonias de cada placa (a)que cumplen con los criterios de la confirmación,
utilizando la ecuación (1):

Donde: b: es el número de colonias que cumplen con los criterios de confirmación dentro de las colonias
sospechosas A que se someten a confirmación ; C: es el número total de colonias sospechosas contadas en cada
placa

El número de microorganismos N presentes en la muestra de análisis se calcula reemplazando ΣC por Σa en la

ecuación general

Donde: V: es el volumen de inóculo utilizado en cada placa, en mililitros d: es la dilución correspondiente a la

primera dilución elegida (d = 1 cuando se utiliza el producto líquido sin diluir)
CUESTIONARIO

1. Realizar un mapa conceptual de las características de Bacillus cereus

2. Explicar la función de cada uno de ingredientes del agar MYP para la detección de Bacillus cereus
3. Explicar la presencia de Bacillus cereus en los alimentos expuestos en los cuadros siguientes según la
RM 591 -2008 – MINSA