Bacillus Cereus Icmsf

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CALLAO
Facultad de Ingeniera Pesquera y de Alimentos

Escuela Profesional de Ingeniera de Alimentos
MICROBIOLOGIA GENERAL
TEMA
DOCENTE
GUIA PRCTICA
MICROBIOLOGIA
DE ALIMENTOS
Recuento de Bacillus cereus
Blgo. - Ing. Arturo Garca Merino
Blgo.-Mblgo.: ARTURO GARCIA MERINO

1.
INTRODUCCIN
Es un bacilo formador de esporas responsable de intoxicaciones alimentarias, siendo su hbitat natural

el suelo, contamina con frecuencia cereales, leche, budines, cremas pasteurizadas y especias, entre otros
alimentos.
La Organizacin Mundial de la Salud (OMS) estima que las enfermedades causadas por alimentos
contaminados constituyen uno de los problemas sanitarios ms difundidos en la actualidad ( 1)
Los casos de intoxicaciones o enfermedades por alimentos mal preparados o contaminados por este
microorganismo suelen ser frecuentes a pesar de que son perfectamente evitables; la primer descripcin de
un brote de gastroenteritis data de principios de 1900 (2.)
En nuestro pas casos de brotes de ETA denunciados y confirmados, por este tipo de microorganismos
han sido espordicos, 3 brotes en los ltimos 9 aos ( 3)
B. cereus puede producir dos enterotoxinas: la toxina diarreica y la toxina emtica. Los sntomas de la
toxiinfeccin tienen dos formas de presentacin con presencia de diarrea, dolores abdominales y vmitos.
Su perodo de incubacin vara de 4 a 16 horas luego de la ingesta del alimento contaminado.
Los Laboratorios de Microbiologa Alimentaria de los Municipios con infraestructura y capacidad
analtica han realizado un seguimiento preventivo de este tipo de microorganismos en los alimentos que por
su naturaleza pueden representar un vehculo de contaminacin.
La resistencia trmica de esporas de B. cereus en un medio con elevado contenido de agua vuelve a
este microorganismo un potencial peligro para el desarrollo de una intoxicacin, si las medidas higinico
sanitarias y de elaboracin no son las adecuadas.
Taxonoma.
La familia Bacillaceae contiene una diversidad de bacterias formadoras de esporas incluyendo desde
aerobios estrictos hasta anaerobios obligados, cocos y bacilos, tanto psicrfilos como termfilos (4).
Es un microorganismo gram positivo en los cultivos jvenes y a medida que envejece puede verse
como gram variable o gram negativo. Las esporas aparecen claras en la tincin de gram y verdes con la
tincin de esporas estas pueden estar dentro de la pared bacteriana o puede deformar la pared.
Las temperaturas de crecimiento: mnima estn entre 15C a 20C y la mxima es entre 40C a 45C
con una ptimo de 37C. (5)
Tiene una morfologa celular similar a la del B.anthracis pero a diferencia de ste, en general es mvil y
no es susceptible a la penicilina o al fago gamma.(5)
La produccin de esporas en presencia de oxgeno es un rasgo que define el gnero, as como su
morfologa. Son saprofitos ampliamente distribuidos en el ambiente natural en suelos de todo tipo, y puede
ser encontrado en el polvo y en el aire, por lo tanto tiene considerable oportunidad para estar presente en o
sobre los alimentos. Las esporas fcilmente sobreviven la distribucin en polvos y aerosoles siendo
vehiculizadas desde estos lugares a otros habitats. Los alimentos secos como condimentos, leche en polvo
y harinas pueden estar contaminados con esporas. ( 5 )
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Intoxicacin alimentaria:
Nos referiremos esencialmente al papel del Bacillus cereus en la intoxicacin alimentaria dejando de
lado las actividades purulenta y necrotizante cutneas que pueden verse. Bacillus cereus causa
intoxicaciones alimentarias a travs de la ingesta de alimentos contaminados. En general se admite que,
debido a la levedad del cuadro y a que la deteccin microbiolgica de esta bacteria no se realiza
rutinariamente en pacientes diarreicos, la incidencia real puede ser superior a la estimada. Mas si tenemos
en cuenta, que el cuadro clnico se confunde a menudo con los producidos por Staphylococcus aureus y
Clostridium perfringens, dependiendo de que toxina est involucrada.
La intoxicacin alimentaria puede ocurrir cuando los alimentos son preparados y mantenidos sin la
adecuada refrigeracin durante horas antes de ser servidos. El consumo de alimentos que contienen 105
B.cereus/g o ms puede 103 provocarla. (5). Los alimentos vinculados a brotes han sido carne y verduras
cocidas, arroz frito o hervido, crema de vainilla, sopas, leche y brotes de vegetales crudos.( 2 )
Bacillus cereus produce dos enterotoxinas durante su crecimiento exponencial: la toxina diarreica y la
toxina emtica que dan lugar a dos formas clnicas distintas de intoxicacin alimentaria.
El sndrome emtico est producido por una toxina preformada y termoestable, al igual que la de
S.aureus. Se asocia frecuentemente con arroz frito contaminado, tiene un perodo de incubacin corto,
habitualmente de 1 a 6 horas y predominan los sntomas gastrointestinales altos manifestados por nuseas
y vmitos. Este hecho ha llevado a confundir la intoxicacin por B.cereus y atribuirla a S.aureus. El
sndrome diarreico por el contrario, est producido por la ingestin de alimentos inadecuadamente
refrigerados. Resulta de la esporulacin del organismo in vivo y de la produccin de una enterotoxina
diferente de la anterior, preformada y termolbil tiene un perodo de incubacin ms largo que promedia
entre 10 y 12 horas y las manifestaciones se relacionan con la afectacin gastrointestinal baja similar a la
intoxicacin por Clostridiun perfringens. Los sntomas son dolor abdominal, diarrea acuosa profusa, tenesmo
y nauseas que generalmente duran 12-24 hrs. y en algunos pacientes pueden durar ms tiempo, de 2 a 10
das.(6)
El aislamiento de Bacillus cereus de las heces de los pacientes no es documentacin suficiente del
brote, a menos que se obtengan cultivos negativos de materia fecal de un adecuado grupo control. (7) Se
puede realizar tipificacin serolgica para estudios epidemiolgicos de disponer de los antisueros.
La intoxicacin alimentaria por Bacillus cereus es autolimitada y no requiere tratamiento antimicrobiano,
el tratamiento es sintomtico yocasionalmente es necesario rehidratacin.( 6)
2.
OBJETIVOS
Familiarizarse con la metodologa especfica para la determinacin de B. cereus a partir medios con
yema de huevo que contienen manitol y rojo fenol; B. megaterium s produce zonas de estas caractersticas
y su actividad hemoltica es tambin peculiar, lo que permite su deteccin y recuento en agar sangre a partir
de poblaciones mixtas. de una muestra de alimento.
Aislar B. cereus a partir de una muestra de alimento
Numeracin y verificacin de B. cereus por conteo de placa.
Detectar el nmero de unidades formadoras de colonias (ufc) o de esporas de Bacillus cereus en el
alimento.
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3. MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS
a.
Materiales
1. Pipetas estriles de 1, 5 y 10 mL graduadas en 0,1 mL.
2. Propipetas
3. Placas Petri estriles 15 x 100 mm.
4. Asas desechables de nicrom o platino de aro 2 mm y 3 mm de dimetro.
5. Tubos estriles de 13 x 100 mm y tubos de 16 x 125 mm.
6. Jarra anaerobiosis, Anaerogen o Gas Pack con generador de H2 + CO2 y catalizador.
4.
b.
Medios de Cultivo y Reactivos

1. Caldo soya tripticasa con polimixina
2. Solucin de polimixina B al 0,15 %
3. Agar Manitol-Yema de huevo y Polimixina (MYP).
4. Agar Tirosina.
5. Agar nutritivo para Bacillus cereus
6. Caldo Glucosa-Rojo fenol
7. Caldo Nitrato
8. Caldo Rojo de Metilo-Voges Proskauer (RM-VP)
9. Caldo lisozima
10. Solucin de Polimixina 0.1% para agar MYP
11. Solucin de naftol 0,5% en cido actico 5M
12. Solucin de cido sulfanlico 0,4% en cido actico 2,6M
13. Solucin de naftol 5% en etano
14. Solucin de KOH al 40%
15. Emulsin de Yema de Huevo al 50%
16. Reactivos para tincin de Gram
17. Zinc en polvo
18. Agua de dilucin de Butterfield en tubos con 9 mL 0,2 mL y de 450 mL
19. Cristales creatina
20. Solucin de tincin Fucsina bsica
21. Metanol
22. Medio movilidad B cereus
c.
Equipos
1. Estufas de incubacin reguladas a 30 2 C y 35 2 C
2. Refrigerador
3. Vortex
4. Bao de agua 48-50 C.
TECNICAS
A. Preparar las muestras de alimento por el mtodo propuesto en la presente gua para la
preparacin de los homogeneizados de alimentos. Preparar las diluciones de 10 -1 a 10-4, o ms
altas si fuera preciso.
B. Sembrar uniformemente por estra 0,1 ml de cada una de las diluciones decimales en la superficie
seca de placas de agar yema de huevo polimixina rojo fenol (MYP), agar yema de huevo sal
polimixina cloruro de trifeniltetrazolio o de agar sangre de caballo (previamente secados),
utilizando dos placas para cada dilucin.
C. Si se observase el crecimiento de microorganismos del gnero Proteus, con su caracterstico
crecimiento extendido por la placa, o se sospechase su existencia en el alimento en estudio, inhibir
su difusin aadiendo sobre la superficie de cada placa de medio 1 ml de alcohol etlico del 96 % y
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dejar que se evapore dentro de la estufa, o bien aumentar la concentracin de cloruro sdico en
los medios hasta aproximadamente el 1,5 %.
D. Incubar las placas de agar yema de huevo polimixina rojo fenol o de agar yema de huevo sal
polimixina cloruro de trifeniltetrazolio durante 24 horas, y la placa de agar sangre de caballo
durante 24-48 horas. Frecuentemente, los microorganismos contaminantes enmascaran las
colonias de B.cereus despus de las 24 horas de cultivo en estos medios (Kim y Goepfert, 1971
a,b).
E. Dar como recuento de presunto B. cereus las colonias con las reacciones caracterticas
siguientes : (a) en agar yema de huevo polimixina rojo fenol amplias zonas de precipitado sobre un
fondo rojo-violeta, (b) en agar yema de huevo sal polimixina cloruro de trifeniltetrazolio colonias de
color rojo-prpura brillante, con una amplia zona de precipitado, (c) en agar sangre de caballo
hemlisis alfa o beta.
F. Prepare diluciones seriadas de 10 -2 a 10 -6 mediante la transferencia de 10 ml de muestra
homogeneizada (dilucin 1:10) a 90 ml de dilucin en blanco, mezclando bien con agitacin
vigorosa, y continuando hasta 10 -6 dilucin se alcanza. Inocular las placas duplicadas PAI agar
con cada dilucin de la muestra (incluyendo 1:10) mediante la difusin de 0,1 ml de manera
uniforme sobre la superficie de cada plato con una varilla de vidrio estril difusin. Incubar las
placas 24 horas a 30 C y observar las colonias de la zona rodeada por precipitado, lo que indica
que se produce lecitinasa. B. Colonias cereus son normalmente de color rosa que se vuelve ms
intenso despus de una incubacin adicional. (ICMSF)
G. Si las reacciones no son claras, las placas se incuban durante 24 h adicionales antes del recuento
de colonias. Seleccionar las placas que contienen un estimado de 15 a 150 eosina rosa, lecitinasa
productores de las colonias. Parte inferior de las placas de la marca en zonas con rotulador negro
para facilitar el conteo y recuento de colonias que son tpicos de B. Cereus. Este es el recuento
en placa de presuncin de B. Cereus. Pick 5 o ms colonias presuntamente positivo de las placas
de agar del PAI y la transferencia de inclinaciones de agar nutritivo para su confirmacin como B.
Cereus. Confirmar los aislamientos como B. Cereus como se describe en F y G, a continuacin.
Calcular el nmero de B. Cereus clulas / g de la muestra, basada en el porcentaje de las colonias
de prueba que se confirman como B. Cereus. Por ejemplo, si el recuento de media obtenida con
10 -4 dilucin de la muestra fue de 65 y 4 de 5 colonias de prueba fueron confirmados como B.
Cereus, el nmero de B. Cereus clulas / g de alimento es de 65 x 5.4 x 10.000 x 10 = 5.200.000.
(NOTA: El factor de dilucin es diez veces mayor que la dilucin de la muestra, ya que slo 0,1 ml
fue probado).
5. DESARROLLO
a. Recepcin de la muestra en el laboratorio 339
1. Recibir la dilucin 10-1 de la muestra procesada en el laboratorio de Recepcin de muestras
segn PRT-712.01-002.
2. Preparar a partir de dilucin 10-1 diluciones seriadas hasta 10-3 , transfiriendo 1 mL a 9 mL de
diluyente.
3. Si es necesario realizar diluciones adicionales si se sospecha de una poblacin de B. cereus que
excede 103 / g.
4. Anotar en la hoja de registro la inscripcin de muestras del laboratorio, la clave, N, fecha de
recepcin, naturaleza de la muestra, fecha de anlisis y analista.
5. En el caso de muestras de brotes de ETA, anotar la informacin adicional que se disponga, si la
hay.
6. El perodo transcurrido entre la preparacin del homogeneizado de la muestra y la siembra no
debe superar los 20 minutos.
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b. Siembra recuento de clulas viables de Bacillus cereus
1. Inocular 3 tubos de caldo soya tripticasa con polimixina al 0,15 % con 1 mL de la dil 10-1.
4. Incubar los tubos por 48 2 h a 30C. y observe un denso desarrollo, el cual es tpico para B.
cereus.
c. Lectura Enumeracin presuntiva clulas viables B. cereus.
1. Registre la combinacin de tubos positivos en la hoja de Registro de anlisis del laboratorio RG
712.00-081
2. De cada tubo positivo sembrar por separado en estra en placas agar MYP.
3. Incube las placas 24 - 48 h a 30 C.
d. Traspaso
1. Seleccionar las placas de agar MYP que presenten desarrollo de colonias rosadas (manitol
negativas y una zona de precipitacin alrededor de la colonia (lecitinasa positiva).
2. Traspasar al menos 1 o ms colonias a agar nutritivo tendido para realizar la confirmacin de B.
cereus.
3. En caso de no tener colonias aisladas, proceder como sigue:
4. Tomar una porcin de cultivo con asa.
5. Sembrar por agotamiento en una placa de agar MYP previamente seca.
6. Incubar las placas invertidas a 30 C 2 C por 24 horas.
7. Registrar las caractersticas de este cultivo en la hoja de Registro de anlisis del laboratorio RG712.00-081.
8. Realizar pruebas bioqumicas a las colonias seleccionadas
6.
CONFIRMACIN DE B. CEREUS
Adems de B. cereus, otras especies dan reacciones positivas o dbilmente positivas en medios con yema
de huevo (Gordon y col., 1973). Tanto el cido formado a partir del manitolcomo las enzimas reductores del
cloruro de trifeniltetrazolio pueden difundir en el medio hasta colonias negativas. Finalmente, la actividad
hemoltica no es exclusiva de B. cereus. Por estas razones, deben someterse a confirmacin colonias
representativas procedentes de estos medios.
Sin embargo, en las pruebas de rutina son suficientes frecuentemente los recuentos, en particular si las
reacciones tpicas aparecen bien marcadas. Si ests no fuesen completamente tpicas, llevar a cabo pruebas
confirmatorias.
Por ejemplo, confirmar las colonias que son yema de huevo y manitol positivas, e inversamente aqullas
que son yema de huevo y manitol negativas. Siguiendo el esquema de identificacin de Gordon y col. (1973),
confirmar todas las colonias que producen hemlisis alfa en agar sangre.
a. Pruebas Confirmativas
1. Del agar nutritivo tendido realizar Gram y observar microscpicamente. B. cereus aparece
como bacilo largo Gram positivo, en cadenas cortas a largas; de esporas elipsoidales de
disposicin central o subterminal y el esporangio no engrosado.
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2. Transferir cultivo con asa de 3 mm a tubos de 13 x 100 mm que contienen 0,5 mL de agua de
dilucin buffer fosfato, suspenda el cultivo y mezcle en vortex. Use esta suspensin para inocular
los siguientes medios confirmatorios:
3. Prueba de Fermentacin de glucosa: Inocular con asa de 2 mm el cultivo en 3 mL de caldo
glucosa rojo fenol e incubar en anaerobiosis por 24 horas a 35C 2 C.
4. Prueba RM-VP: Inocular el cultivo en 5mL de medio VP con el cultivo, utilizando asa de 3mm de
dimetro. Incubar por 482 h a 35 C.
5. Prueba lisozima: Inocular el cultivo con asa de 2 mm en 2,5 mL de caldo nutritivo que contenga
0,001% de lisozima. Tambin inocular en 2,5 mL de caldo nutritivo como control positivo. Incubar
por 24 horas a 35C 2 C.
6. Prueba tirosina: Inocular con asa de 3 mm, en toda la superficie del agar tirosina tendido.
Incubar por 48 horas a 35C 2 C. Incubar los tubos que no presenten crecimiento hasta por 7
das antes de considerar el resultado como negativo.
7. Prueba de reduccin de nitratos a nitritos: Inocular en 5 mL de caldo nitrato con el cultivo,
utilizando asa de 3 mm. Incubar por 24 horas a 35 C 2 C.
8. Agar MYP: puede ser omitido si los resultados son determinantes en el MYP original o inicial. Si
no es as dividir la placa en 6-8 secciones iguales y rotular cada seccin e inocular con asa de 2
mm el cultivo en la superficie del agar en un rea de 4 cm 2 de agar Incubar a 35C 2 C por
24 horas.
b. Pruebas adicionales para diferenciar otros miembros del B. cereus: B. mycoides, B,
thuringiensis y B. anthracis
1. Prueba de la motilidad: Inocular en medio BC motilidad en picadura en el centro del tubo con asa
de 3 mm con cultivo de una suspensin de 24 horas. Inocule 18 a 24 horas a 30 C y examine
crecimiento a lo largo de la lnea de inoculacin.
Alternativamente, aada 0,2 mL de agua destilada estril a la superficie de agar nutritivo tendido
e inocule con asa de 3 mm del cultivo de una suspensin. Incube 6 a 8 horas a 30 C 2 C y
suspenda con asa de 3 mm el lquido a acumulado en la base del agar tendido en una gota de
agua estril sobre un portaobjeto, ponga un cubreobjeto y observe al microscopio.
2. Desarrollo rizoidal: en agar nutritivo (18 a 20 mL) en placa, dejar secar completamente a
temperatura ambiente por 1 a 2 das. Inocular suspensin del cultivo con asa de 2 mm
suavemente slo tocando la parte central del agar en la placa. Incubar a 30 C 2 C por 48 a 72
horas.
3. Actividad hemoltica: en un placa de agar soya tripticase co sangre de cordero inocular con asa
de 2 mm una suspensin de 24 horas, se pueden usar cuas de agar. Incubar a 35 C 2 C por
24 horas.
4. Prueba de cristales de protena txicos: inocular en agar nutritivo tendido con asa de 3 mm una
suspensin de un cultivo de 24 h .Incube a 30 C 2 C por 24 h y dejar a temperatura ambiente
por 2 a 3 das. Preparar extendido o frotis con agua destilada estril en un porta objeto. Secar al
aire y fijar con la llama de un mechero Bunsen. En un soporte de tincin inunde con metanol,
deje por 30 segundos, elimine el metanol y seque al aire. Ubique nuevamente el porta objeto en
el soporte de tincin e inunde completamente con fucsina bsica al 0,5 % o con colorante
carbolfucsina de TB. Caliente con un pequeo mechero Bunsen hasta que se desprenda vapor.
Espere 1 a 2 min y repita este paso, deje 30 segundos, elimine el colorante y enjuague
profundamente con agua corriente. Deje secar y examine al microscopio en inmersin.
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c.
Lectura de las pruebas bioqumicas

1. En caldo Fermentacin de glucosa, agitar vigorosamente el tubo y observar desarrollo por
incremento de la turbiedad y viraje del indicador de rojo a amarillo, lo que indica que el cido ha
sido producido anaerbicamente desde la glucosa, un cambio parcial de color rojo a naranjado
puede ocurrir incluso en los tubos de control sin inculo debido a la reduccin de pH debido a la
exposicin del medio a CO2 formado en la jarra de anaerobiosis. Asegurarse usar controles
positivos y negativos para distinguir reacciones falso-positivo.
2. La prueba en RM - VP para la produccin de acetilmetil-carbinol es positiva al pipetear 1 mL y
transferirlo a tubos de 16 x 125 mm, luego aadir 0,6 mL de solucin de alfa-naftol al 5% en
etanol y 0,2 mL de NaOH al 40% .Agitar y se puede aadir unos pocos cristales de creatinina.
Despus de una hora a temperatura ambiente se puede observar la aparicin de color rosado
intenso o violeta lo que indica que la reaccin es positiva.
3. En caldo lisozima se observa desarrollo por la presencia de turbidez por desarrollo positivo. Si la
lectura fuese negativa incubar por 24 horas adicionales antes de descartar.
4. En el agar tirosina se observa una zona clara en el medio cerca o alrededor de desarrollo de B.
cereus. Incubar por un total de 7 das antes de considerar la prueba como negativa.
5. En caldo nitrato observar la paricin color rojo anaranjado al agregar 0,25 mL de cido sulfanlico
al 0,8 % en cido actico 5 N y 0,25 mL de naftol al 0,5% en cido actico 5N, un cambio de
color a anaranjado indica que la prueba es positiva, si no aparece color naranjo dentro de 10
minutos, indica que la prueba es negativa y se debe agregar polvo de Zn, no debe observarse
cambios para interpretar la prueba como positiva, de lo contrario si al agregar Zinc en polvo se
presenta coloracin anaranjada, se debe interpretar la prueba como negativa.
6. En agar MYP observar la produccin de lecitinasa indicada por una zona de precipitacin
alrededor de las colonias. El manitol no es fermentado por lo tanto las colonias son rosadas.
7. Interpretacin de los resultados: B. cereus es un bacilo Gram positivo con esporas, produce
lecitinasa y no fermenta manitol en agar MYP, crece y produce cido en condiciones anaerbicas
a partir de la glucosa, reduce nitratos a nitritos, produce acetilmetil-carbinol, descompone la
tirosina, y crece en presencia de lisozima la 0,001%.
d.
Pruebas adicionales:
1.
PAI agar. Esta prueba puede ser omitido si los resultados fueron claros con originales platos de
agar del PAI y no hubo interferencia de otros microorganismos que estaban presentes. Parte
inferior de una placa de marca en 6-8 partes iguales con rotulador marca y la etiqueta de cada
seccin. Inocular premarcado 4 cm cuadrados de rea de la placa de agar PAI tocando
suavemente la superficie de agar con asa de 2 mm de la cultura. (Seis o ms culturas se
pueden probar de esta manera en un plato.) Permitir que el inculo se absorba completamente
antes de incubar durante 24 horas a 35 C. Verifique las placas para la produccin de lecitinasa
segn lo indicado por la zona de crecimiento de la precipitacin alrededores. Manitol no es
fermentado por aislar y si el crecimiento medio que la rodea son eosina rosa. (Color amarillo
indica que el cido es producido a partir de manitol). B. Colonias cereus son por lo general
lecitinasa-positivas y negativas-manitol en agar PAI.
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2.
Motilidad de prueba. Inocular medio de BC motilidad por apualamiento en el centro con 3 mm

de asa de cultivo en suspensin 24 horas. Incubar los tubos 18-24 horas a 30 C y examinar
para el tipo de crecimiento a lo largo de la lnea de arma blanca. Organismos mviles producen
crecimiento difuso hacia el medio lejos de la pualada. Organismos no mviles producen slo en
el crecimiento ya lo largo de arma blanca. Por otra parte, aadir 0,2 ml de agua destilada estril
a la superficie inclinada de agar nutriente y la inclinacin inocular con 3 mm de asa de cultivo en
suspensin. Incubar inclinacin 6-8 horas a 30 C y la suspensin de 3 mm de asa de cultivo
lquido de la base de la inclinacin en una gota de agua estril en el portaobjetos del
microscopio. Aplicar cubierta de vidrio y examinar inmediatamente con el microscopio de la
motilidad. Informe o no de las cepas aisladas eran mviles. La mayora de las cepas de B.
Cereus y B. Thuringiensis son mviles mediante flagelos peritricoso. B. Anthracis y todos,
excepto unas pocas cepas de B. Mycoides son inmviles. A, B pocos. Cepas de Bacillus cereus
son inmviles.
Tabla 1. Caractersticas diferenciales de la gran clula del Grupo I de la especie Bacillus
Caracterstica
B.
B.
B.
Cereus Thuringiensis Mycoides
Reaccin de Gram
+ (A)
Catalasa
+
Motilidad
+ / - (B)
Reduccin de
+
nitratos
Tirosina
+
descompuesto
Lisozima resistentes
+
La yema de huevo
+
reaccin
La utilizacin
+
anaerbica
de la glucosa
VP reaccin
+
cido que se
produce a
partir de manitol
Hemlisis (oveja
+
RBC)
Patogenicidad
produce
conocida (e) /
entero
caracterstica
toxinas
B.
Megaterium
+
+
+/- (D)
+
+
+/+/
- (C)
+
+
+
+
+/-
- (D)
+/-
+
+
+
+
+
+
+
-
+
-
+
-
- (D)
cristales de
endotoxina
patgenos
para los
insectos
+
+
B.
Anthracis
crecimiento patgenos
rhizoidal
para
los animales
y
los seres
humanos
+, 90-100% de las cepas son positivas.

+ / -, 50-50% de las cepas son positivas.
c
-, 90-100% de las cepas son negativas.
d
-, La mayora de las cepas son negativas.
e
Vase la Seccin H, las limitaciones del mtodo de B. cereus.
b
2.
Crecimiento rizoide. Vierta 18-20 ml de agar nutriente en el estril 15 x 100 mm platos petri
agar y permitir secar a temperatura ambiente durante 1-2 das. Inocular tocando suavemente la
superficie del medio, cerca del centro de cada plato con 2 mm de asa de cultivo en suspensin
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24 horas. Permita que el inculo sea absorbido y se incuban las placas 48-72 horas a 30 C.
Examine para el desarrollo del crecimiento rizoide, que se caracteriza por la produccin de las
colonias con el pelo largo o la raz-como las estructuras que pueden extenderse varios
centmetros desde el sitio de la inoculacin. spero en forma de galaxias colonias son a menudo
producidos por B. Cepas de Bacillus cereus y no debe ser confundido con un crecimiento tpico
rizoide, que es la caracterstica definitiva de B. Mycoides. La mayora de las cepas de esta
especie tambin son inmviles.
3.
Prueba de la actividad hemoltica. Parte inferior de una placa de marca en 6-8 partes iguales
con rotulador marca y la etiqueta de cada seccin. Inocular un rea de 4 cm premarcado
cuadrados de tripticasa de soja ovejas placa de agar sangre tocando suavemente la superficie
media de 2 mm de asa de cultivo en suspensin 24 horas. (Seis o ms culturas se pueden
probar de forma simultnea en cada plato.) Incubar las placas 24 horas a 35 C. Examinar las
placas para la actividad hemoltica. B. Culturas cereus por lo general estn fuertemente
hemoltico y produce 2.4 mm de la zona de crecimiento completo hemlisis () que rodean. La
mayora de B. Thuringiensis y B. Cepas mycoides tambin -hemoltico. B. Anthracis cepas son
generalmente hemolticas despus de 24 h de incubacin.
4.
Prueba para los cristales de toxina de la protena. Inocular inclina agar nutritivo con 3 mm
loopfuls de 24 suspensiones h de cultivo. Incubar se inclina 24 horas a 30 C y luego a
temperatura ambiente 2-3 das. Preparar frotis con agua destilada estril en el microscopio. Aire
seco y ligeramente calor-fix al pasar diapositivas a travs de la llama de mechero Bunsen. Lugar
de diapositivas sobre una rejilla de las manchas y las inundaciones con metanol. Deje reposar
por 30 s, se vierte el metanol, y permitir que la diapositiva se seque al aire. Retorno de
diapositivas para gradilla de tincin y las inundaciones por completo con el 0,5% fucsina bsica o
la tuberculosis carbolfucsina ZN mancha (Difco). Deslice suavemente el calor desde abajo con
pequeas mechero Bunsen hasta que el vapor que se ve. Espere 1-2 minutos y repetir este
paso. Deje reposar por 30 s, se vierte la mancha y enjuague de diapositivas cuidadosamente
con agua corriente limpia. Diapositivas en seco sin borrones y examinar con aceite de inmersin
para la presencia de esporas libres y oscura manchada tetragonal (forma de diamante) los
cristales de toxinas. Los cristales son generalmente un poco ms pequea que las esporas.
Cristales de toxina suelen ser abundantes en un 3 - a la cultura de 4 das de edad de B
thuringiensis, pero no pueden ser detectados por la tcnica de maquillaje hasta la lisis del
esporangio se ha producido.. Por lo tanto, a menos que las esporas libres se puede ver, los
cultivos deben mantenerse a temperatura ambiente durante unos das ms y volver a examinar
los cristales de la toxina. B. Thuringiensis produce generalmente cristales de protena toxina que
puede ser detectado por la tcnica de tincin ya sea en forma de cristales libres o cuerpos
parasporal inclusin en el exosporium. B. cereus y otros miembros de la B. cereus grupo no
producen cristales de protenas de toxinas.
1. Interpretacin resultados pruebas adicionales: B. cereus es mvil, presenta una marcada hemlisis, no presenta desarrollo rizoidal y no produce cristales txicos de protena.
i. Clculo y expresin de resultados

1. Anotar lo resultados de las pruebas bioqumicas y morfolgicas en RG-712.00-081.
2. Confirmar como B. cereus las colonias que cumplen con los puntos 7.7.7 y 7.7.8.5.
3. Realizar el clculo de NMP de B. cereus / g o mL de muestra basado sobre el nmero de tubos
cada dilucin que obtuvo confirmacin de al menos una colonia de B. cereus.
Recuento confirmado = Promedio obtenido en dilucin x N colonias confirmadas x dilucin x 10
N colonias repicadas
7.8 Informe de resultados

7.8.1 El resultado se expresa en ufc de Bacillus cereus por g o mL de producto analizado
segn corresponda.
MICROBIOLOGIA
DE ALIMENTOS

Referencias bibliogrficas.
1. COMISION DEL CODEX ALIMENTARIUS
http://www.fao.org/WAICENT/OIS/PRESS_NE/PRESSSPA/2001/prsp0143.htm
[consultado 2 de abril 20002]
2. Food-borne Patogens . Monograph N4 Clostridium perfringens Bacillus cereus; Oxoid ,1998
3. INPPAZ OPS/OMS VIGILANCIA DE ENFERMEDADES TRASMITIDAS POR ALIMENTOS
http://intranet.inppaz.org.ar/nhp/ve/ehome.asp [consultado 10 demarzo]
4. Logan N Turnbull P Bacillus and Recently Derived Genera en Manual of Clinical Microbiology Murria
Baron Pfaller Tenover Yolken 7ma edition American Society for Microbiology (Washington DC), 2000
5. Bacteriological Analytical Manual Chapter 14 Bacillus cereus January 2001
http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-14.html
6. Tauxe R Foodborne disease in Mandell Douglas and Benetts Principes and Practice of Infectius
Diseases 2000
7. Bradley R Tilton R Weissfeld A Laboratory Diagnosis of Bacterial Diarrhea Cumith 12 October 1980.
8. INTERNATIONAL COMMISSION ON MICROBIOLOGICAL SPECIFICATIONS FOR FOODS ( ICMSF) 2 da
Edic. 1983 Vol 1. Parte II, (traduccin de la versin 1988) Reimpreso el 2000. Editorial Acribia. Pp: (285286).
Manual de anlisis bacteriolgicos

Captulo 14 Bacillus cereus
MICROBIOLOGIA
DE ALIMENTOS

Numeracin de Bacillus cereus por siembra en placa UFC/ g
Mtodo FDA
De enero de 2001 Actualizado febrero 2012
l. Recuento Presuntivo
10
ml
10
ml
10
ml
Contro
les
Muestra: 50
g + Agua
Butterfield:
450 ml
Licuar / 2
minutos
Dilu
y.
A.
Butt
.
90
ml
10-1
(+
)
Agar
MYP
15 ml
Yema
0.1
ml
de
Huevo
Polimixi
na rojo
fenol
10-2
10-3
10-4
(-)
0.1 ml
0.1 ml
0.1 ml
0.1 ml
Incubacin: 36 +/- 1C / 24h

Lectura: Colonias rosadas con halo de
precipitacin
blanco por actividad de la
lecitinasa.
MICROBIOLOGIA
DE ALIMENTOS
PC
0.1 ml
OGY
Ambiental

II. Pruebas Confirmativas: Picar 5 colonias ms de las colonias positivas en MYP y

transferir por estra a placas de Agar nutritivo para confirmacin
30 + 2C / 24 h.
MICROBIOLOGIA
DE ALIMENTOS
Incubar:

Transferir cultivo a tubos

que contienen 0,5 mL de
agua de dilucin buffer
fosfato, suspenda el
cultivo y mezcle en
vortex. Use esta
suspensin para inocular
Coloracion: Bacilo largo

Gram positivo, en cadenas
cortas a largas; de esporas
elipsoidales de disposicin
central o subterminal y el
esporangio no engrosado.
Pruebas Bioqumicas
MICROBIOLOGIA
DE ALIMENTOS

lII. Pruebas Bioqumicas
Caldo Glucosa rojo

de fenol (anaerbiosis)
Caldo lisozima
al 0.001%
control (+)
a
b
c
d
Control
es
M-VP
modificado
Aadir: en tubo vacio

a. 1 ml de cultivo y luego
b. 0,6 ml de -naftol al 5%
c. 0,2 ml de KOH al 40% .
Agitar y
d. aadir unos cristales de
creatina.
Observar resultados
despus de 1 h. a
T. Ambiente.
+ Incubar:
35 + 2C/24h.
35 + 2C/24h.
35 + 2C/24-48
h.
Lectura:
Amarillo
intenso o violeta
Controles
(+)
turbidez por
Crecimiento
( - )
(+)
Si lectura fuese
( - )
incubar : 24 h.
mas
antes de
descartar
MICROBIOLOGIA
rosado
DE ALIMENTOS
(+)
Por la
produccin de
acetilmetilcarbinol

lII. Pruebas Bioqumicas
Agar tirosina
Lectura:
Se observa una zona
clara en
el medio cerca o
alrededor de
desarrollo de Bacillus
cereus.
Incubar por un total
Incubar: 35 + 2C/24h. 7 dias.

Caldo nitrato
Aadir 0,25 ml
Rx:A
Rx:B
MICROBIOLOGIA
DE ALIMENTOS

A. agregar 0,25 mL de cido sulfanlico al 0,8 % en cido actico 5 N y
B. agregar 0,25 mL de naftol al 0,5% en cido actico 5N,
Un cambio de color rojo-anaranjado indica que la prueba es (+)
Si no aparece color rojo-naranjo dentro de 10 minutos, indica que la
prueba es negativa (-) y por consiguiente se debe agregar polvo
de Zn, y dejarlo actuar 1 hora.
El viraje de un color rojo al aadir el zinc (sustancia reductora)
indica que est presente el nitrato por no haber sido reducido
previamente por los grmenes.
MICROBIOLOGIA
DE ALIMENTOS

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Es un bacilo formador de esporas responsable de intoxicaciones alimentarias, siendo su hbitat natural

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Motilidad de prueba. Inocular medio de BC motilidad por apualamiento en el centro con 3 mm

+, 90-100% de las cepas son positivas.

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