Universidad Autónoma Metropolitana

Unidad Xochimilco
DIVISIÓN DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y DE LA SALUD

PROYECTO:

Validación del método de cuantificación por espectrofotometría UV de la cafeína en

materia prima

INTEGRANTES DEL EQUIPO 4:

Marcelino Flores Perla

Limón Yáñez Samanta

Rosas Becerril Osmar Adrián

Santiago López Christopher Hazel

MÓDULO: Evaluación de materias primas para la producción de medicamentos

GRUPO: BF51Q

TURNO: Vespertino

DOCENTES:

Dra. Karina Sánchez Herrera

Dr. Juan Manuel Martínez Núñez

Validación del método de cuantificación por espectrofotometría UV de la cafeína en

materia prima
Resumen

La determinación de cafeína ha adquirido mucha importancia, debido a su uso en la

industria farmacéutica y en la industria de alimentos; ya sea como ingrediente en la
elaboración de refrescos y bebidas energéticas, o por su presencia en productos por
ende es muy importante llevar a cabo su control de calidad, determinar que se
encuentre en concentraciones adecuadas para producir los efectos deseados y así
evitar poner en riesgo la salud de los consumidores. Es por ello que se validará el
método de cuantificación por espectrofotometría UV de la cafeína en materia prima.

La presente investigación consta de una parte teórica, que trata sobre la validación
de los métodos de cuantificación espectrofotométrica UV. En la parte experimental,
se realizaron diferentes ensayos hasta obtener las condiciones óptimas en cada una
de las técnicas para la determinación cuantitativa de la cafeína,empleando una curva
de calibración a partir de diferentes disoluciones de un estándar de cafeína.

Una vez efectuadas todas las determinaciones de cafeína, trabajando siempre con
varias repeticiones para poder realizar un estudio estadístico de los valores obtenidos
y asegurar la fiabilidad de ellos. Tomando en cuenta los parámetros establecidos de
la guía de validación para la comparación de los resultados obtenidos con respecto a
la linealidad exactitud, precisión y precisión del método o reproducibilidad.

Introducción

La presente investigación hace referencia al tema de validación del método de

cuantificación por espectrofotometría UV de la cafeína en materia prima. La validación
es la verificación de los parámetros determinados de un método en la que los
requisitos especificados como: la linealidad, exactitud, precisión y reproducibilidad,
tienen la finalidad de demostrar que el método es idóneo para un uso previsto, usando
un valor de referencia, es decir, un valor cuantitativo que se utiliza como base para la
comparación con valores cuantitativos del mismo tipo.(Duffau et al., 2010)

En la industria farmacéutica, la validación de métodos analíticos es primordial no sólo

para garantizar que los análisis que se realicen en el laboratorio se mantengan
exactos, precisos, reproducibles, sino también, para validar el proceso de producción,
la validación de limpieza, dicho de otra manera, es importante realizar estos métodos
de validación para el aseguramiento de calidad en el punto de vista del mercado.
(Díaz et al., 2015)

Por lo tanto, se tiene como objetivo validar el método propuesto de cuantificación de

la pureza del principio activo cafeína por espectrofotometría UV. Así mismo, se
proporcionará de forma detallada su linealidad, exactitud, precisión y reproducibilidad,
con sus curvas de calibración respectivas. Para ello, a lo largo de esta investigación
se realizará el método de cuantificación por espectrofotometría UV, siendo así una
técnica analítica que permite determinar la concentración de un compuesto en
solución, basándose en que las moléculas absorben las radiaciones
electromagnéticas y a su vez que la cantidad depende de forma lineal de la
concentración, de tal forma que se determina la longitud de onda de la luz que pasa
por una solución y medir la cantidad de luz absorbida por la misma, donde el espectro
de absorción entrega información al respecto. (Duffau et al., 2010; Díaz et al., 2015)
Esto se desarrollará con ayuda de un espectrofotómetro UV, proponiendo una
metodología para la preparación de la muestra de acuerdo a lo que dicta la FEUM en
su respectiva monografía del principio activo cafeína, realizando los cálculos
utilizando como herramienta Excel obteniendo así las curvas de calibración de los
resultados.

Marco teórico

La 3,7-Dihidro-1,3,7-trimetil-1H-purina-2,6-diona, con masa molecular de 194.19

g/mol, una fórmula C8H10N4O2, un pka de 14 (24ºC), punto de ebullición de 178°C, un
punto de fusión de 238°C y una densidad 1,23 g/cm 3, mejor conocida como cafeína
fue aislada por primera vez en 1819 por el químico alemán Friedrich Ferdinand Runge,
sin embargo, la estructura correcta de esta metilxantina fue establecida en la última
década del siglo XIX. (Espinosa et al., 2015; Tavares y Kimiko, 2012) De tal forma
que la cafeína se determina como una anhidra o que puede contener una molécula
de agua de hidratación, por lo que se describe como un polvo blanco cristalino o
agujas brillantes generalmente aglomeradas, donde su forma hidratada es
eflorescente al aire, siendo así soluble en agua y poco soluble en alcohol y éter
dietílico. (FEUM, 2014)

Ilustración 1. Fórmula estructural de cafeína.

La cafeína al ser un alcaloide derivado del grupo de las trimetilxantinas, sintetizado

en ciertas plantas a partir de la adenosina se correlaciona con las propiedades
estimulantes de la cafeína y de sus análogos. Lo que se puede considerar una de las
sustancias psicoactivas más utilizadas en el mundo, generando efectos en
innumerables funciones fisiológicas, incluyendo la resistencia física, el humor, el
sueño y el dolor. (Espinosa et al., 2015; Tavares y Kimiko, 2012)
Su consumo moderado, destacan aquellos sobre el sistema nervioso central, tales
como el estado de alerta y la mejoría de las funciones cognitiva, ya que la cafeína es
la más potente en cuanto a su acción sobre el sistema nervioso central, produciendo
un incremento en el rendimiento intelectual objetivo y subjetivo, aumentando la
capacidad de concentración y de atención, al igual mejora el rendimiento físico por
vasodilatación a nivel muscular, aumentando la respuesta contráctil al estímulo
nervioso y disminuyendo el cansancio y la fatiga. (Moratalla, 2008; Barreda et al.,
2011)

La cafeína se absorbe casi completamente en el tracto intestinal de forma rápida,

aproximadamente a los 45 minutos de su ingesta. La vida media de la cafeína está
entre 2,5 y 4,5 horas, de manera que la ingesta repetida en el curso del día aumenta
gradualmente los niveles plasmáticos de cafeína, incrementando con ello los efectos
que produce, Sólo entre un 1-2% de la dosis ingerida de cafeína se excreta sin
cambios en la orina. (Pardo et al., 2007; Moratalla, 2008; Barreda et al., 2011)

La dosis recomendada es de 300-400 mg/día para la población en general. La

Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) incluyó desde 1958 a la cafeína,
en la categoría de alimentos generalmente conocidos como seguros, siempre y
cuando se respete la dosis máxima. (Espinosa et al., 2015; Barreda et al., 2011)

Algunos medicamentos también contienen cafeína, generalmente en combinación

con otros principios activos, ya sean los que no requieren prescripción médica (OTC,
over the counter) o los de prescripción. Los contenidos oscilan habitualmente entre
15 y 200 mg, siendo mayor la dosis en los que no precisan receta. Existen
medicamentos en los que el único principio activo es la cafeína a dosis elevadas
(hasta 300 mg) (Pardo et al., 2007)

Respecto a los mecanismos de acción, se ha demostrado que los efectos

estimulantes de la cafeína se deben a su capacidad de antagonizar los receptores de
adenosina, que es un neuromodulador inhibitorio involucrado en la propensión al
sueño, teniendo efectos analgésicos, respiratorios, cardiovasculares,
musculoesqueléticos y otros efectos (endocrinos, digestivos y otros) donde provoca
un aumento dosis-dependiente del colesterol total, HDL, LDL y de los triglicéridos
(Pardo et al., 2007)

La determinación de cafeína ha adquirido mucha importancia, debido a su uso en la

industria farmacéutica y en la industria de alimentos; ya sea como ingrediente en la
elaboración de refrescos y bebidas energéticas, o por su presencia en
productos.(Gallignani et al., 2008) Las interacciones farmacológicas consisten en las
concentraciones de cafeína pueden aumentar si se inhibe su metabolismo juntando
con antimicóticos (fluconazol, ketoconazol), antiarrítmicos (diltiazem, verapamil),
antidepresivos (paroxetina, fluoxetina, fluvoxamina), antipsicóticos (clozapina,
olanzapina), metilxantinas (teofilina), anticonceptivos orales, cimetidina,
fenilpropanolamina, psoralenos, quinolonas y alopurinol. (Pardo et al., 2007)
La cafeína aumenta la absorción y biodisponibilidad de paracetamol, ácido
acetilsalicílico y ergotamina y por lo tanto su efecto analgésico, se utiliza junto a
analgésicos para potenciar la eficacia antiálgica y antimigrañosa. También está
indicada en el tratamiento de la narcolepsia. No obstante, la cafeína disminuye la
depuración de la teofilina e inhibe de forma competitiva el metabolismo de la clozapina
con el riesgo de incrementar sus concentraciones plasmáticas y la probabilidad de
aparición de efectos adversos. (Pardo et al., 2007)

En el caso de la cafeína, la espectrometría infrarroja transformada de Fourier (IRTF)

ofrece una opción sensible y selectiva, debido a las bandas de absorción que presenta
en el infrarrojo medio (IRM). Se han propuesto diversos métodos para su
determinación en productos farmacéuticos, refrescos, té y café. Estos métodos
utilizan diversos procedimientos analíticos que incluyen: técnicas de extracción o
lixiviado –manuales y fuera de línea– con disolventes orgánicos, extracción en fase
sólida (solid phase extraction, SPE) en sistemas de flujo, sistemas varios de
preconcentración, etc. Sin embargo, en todos ellos, la última etapa del procedimiento
contempla el análisis directo de la solución orgánica por IRTF. La cuantificación se
lleva a cabo en la banda de 1659 cm –1, utilizando diversos criterios de corrección, o
mediante análisis quimiométrico de la data espectral por PLS (partial least squares)-
IRTF. (Gallignani et al., 2008)

Para elegir una técnica de separación de la cafeína, además de tener en cuenta los
criterios económicos y de accesibilidad, las técnicas analíticas más empleadas en la
actualidad pueden englobarse en dos grandes grupos: técnicas de separación y
técnicas espectroscópicas. Las técnicas espectroscópicas proporcionan, para cada
compuesto analizado, una información compleja, relacionada con sus características
estructurales específicas, por otro lado las técnicas de separación se utilizan para
resolver los componentes de una mezcla y la señal obtenida puede utilizarse con fines
analíticos cuantitativos o cualitativos. En la actualidad, las separaciones analíticas se
efectúan fundamentalmente por cromatografía y electroforesis.( Carral. 2011)

La cromatografía no solo permite la separación de los componentes de una mezcla,

sino también su identificación y cuantificación. El análisis cualitativo está basado en
la medida de parámetros cromatográficos (tiempos y volúmenes de retención)
mientras que el análisis cuantitativo está basado en la medida de alturas o áreas de
picos cromatográficos que se relacionan con la concentración. (Carral. 2011)

La determinación de la cafeína se suele llevar a cabo mediante técnicas de

separación como HPLC (Cromatografía líquida de alta eficiencia), CE (Electroforesis
capilar), TLC (Cromatografía de capa fina) o GC (Cromatografía de gases) y
Espectroscopia UV-VIS. Estos métodos realizan la detección mediante técnicas
electroquímicas (potenciométricas, conductimétricas, amperométricas, etc.), ópticas
(espectrofotométricas, fluorimétricas, etc.) y otras (termoquímicas). ( Carral. 2011)
La validación es el proceso fundamental para asegurar que los resultados entregados
por dicho método son confiables. Es importante que para el proceso de validación se
asigne a un responsable de realizar dicha tarea. De manera que, la validación se
emplee de forma metódica, trazable y confiable. Del mismo modo es esencial,
conocer el método a validar y su aplicabilidad, es decir, el analito, su concentración y
la matriz (o matrices) en las cuales se desea utilizar, para ello también es necesario
establecer un plan de validación donde se consideran las pruebas o parámetros de
validación necesarios y el diseño experimental en base a los requerimientos del
método. (Duffau et al., 2010)

Para el desarrollo de las pruebas de validación, los analistas responsables deberán

conocer el procedimiento de método de ensayo y el número de ensayos o mediciones
a realizar de acuerdo con lo establecido en el plan de validación, donde estos tendrán
como fin de realizar las pruebas de parámetros de validación como son:(Duffau et al.,
2010)

● Selectividad: es el grado en que un método puede cuantificar o cualificar al

analito en presencia de interferentes.
● Linealidad: es la capacidad de un método de análisis, dentro de un intervalo,
de dar una respuesta o resultado instrumentales que sean proporcionales a la
cantidad del analito que se habrá de determinar en la muestra de laboratorio.
● Sensibilidad: es el cociente entre el cambio en la indicación de un sistema de
medición y el cambio correspondiente en el valor de la cantidad objeto de la
medición
● Límites: se debe tener en consideración los siguientes parámetros: Valor
crítico, límite detección (LOD) y límite de cuantificación.
● Exactitud: conjunto de resultados de un ensayo y supone una combinación de
componentes aleatorios y un componente común de error sistemático o sesgo.
● Precisión: podrá establecerse en términos de repetibilidad y reproducibilidad.
El grado de precisión se expresa habitualmente en términos de imprecisión y
se calcula como desviación estándar de los resultados.
● Robustez: Es una medida de la capacidad de un procedimiento analítico de no
ser afectado por variaciones pequeñas pero deliberadas de los parámetros del
método; proporciona una indicación de la fiabilidad del procedimiento en un
uso normal.
● Aplicabilidad: consiste en una declaración de las especificaciones del
rendimiento del método, que se entrega en el informe de validación.

Se deberá de evaluar para cada parámetro de validación, si los resultados de las

pruebas cumplen con los criterios de aceptabilidad en el plan, se considera que el
método es aceptable. (Duffau et al., 2010)
Planteamiento del problema

La cafeína es un antagonista competitivo de los receptores adenosínicos del sistema

nervioso central (SNC).Sus principales efectos son psicoestimulantes, respiratorios,
musculoesqueléticos y cardiovasculares (Pérez, 2020). Considerada la sustancia
psicoactiva más consumida en el mundo. Se estima que en países occidentales, el
consumo diario promedio total de cafeína por persona es de aproximadamente 210 a
238 mg (Barrada et al., 2017). Es comúnmente utilizado en medicamentos
analgésicos por ende es muy importante llevar a cabo su control de calidad,
determinar que se encuentre en concentraciones adecuadas para producir los efectos
deseados y así evitar poner en riesgo la salud de los consumidores. Es por ello que
se validará el método de cuantificación por espectrofotometría UV de la cafeína en
materia prima.

Pregunta de investigación

¿La propuesta del método de cuantificación por espectrofotometría UV de la cafeína

en materia prima cumple con los parámetros de validación?

Hipótesis

El método propuesto de cuantificación por espectroscopia ultravioleta para la

cuantificación de la cafeína cumple con todos los parámetros de validación
establecidos

Objetivos

1.-General

- Validar el método propuesto de cuantificación de la pureza del principio activo

cafeína por espectrofotometría UV.

2.-Objetivo(s) específico(s)

- Aplicar la espectroscopía UV para determinar el contenido en cafeína materia

prima.
- Calcular la pureza de cafeína a partir de los datos de absorbancia obtenida con
el espectrofotómetro.
- Determinar exactitud y precisión del sistema para la cuantificación de la cafeína
en materia prima.
Metodología

1. Preparación de curva de calibración

Preparación del blanco (ácido clorhídrico 0.1 mol/L)

Transferir 8.3 mL de ácido clorhídrico concentrado a un vaso de precipitados de 500

mL, aforar y transferir a una botella de ámbar. Añadir 500 mL de agua destilada para
llegar a un volumen total de 1000 mL.

Método de cuantificación de cafeína en materia prima.

1.- Pesar 100 mg de cafeína en materia prima y realizar una disolución en 200.0 mL
con ácido clorhídrico como disolvente, tomar una alícuota de 5.0 mL, transferir a una
matraz volumétrico de 50 mL llevándolo al aforo con ácido clorhídrico (stock 1).

Del stock 1 tomar alícuotas de 1.0 mL, 2.0 mL, 3.0 mL, 4.0 mL, 5,0. mL, los cuales
serán transferidos a matraces volumétricos de 10 mL, llevar al aforo con ácido
clorhídrico.

Ilustración 2. Diagrama de disoluciones

2. Diseño metodológico para la preparación de la muestra.

1.- Pesar 100 mg de muestra de cafeína y realizar una disolución en 200,0 mL con
ácido clorhídrico como disolvente, tomar una alícuota de 5.0 mL, transferir a una
matraz volumétrico de 50 mL llevándolo al aforo con ácido clorhídrico (stock 1).

Del stock 1 tomar una alícuota de 3.0 mL, la cual será transferido a un matraz
volumétrico de 10 mL, llevar al aforo con ácido clorhídrico.
 Ilustración 3. Diagrama de solución muestra.

Nota: la absorbancia de la muestra debe tener el valor igual a la de los valores

calculados en las curvas de calibración.

Análisis por espectrofotometría UV

1.- Configurar el espectrofotómetro a una cierta longitud de onda.

2.- En una celda de cuarzo colocar el blanco (ácido clorhídrico), se introduce en el

equipo, se analiza y se retira.

3.- En otra celda de cuarzo. Colocar la primera muestra, la cual contiene la menor
concentración de cafeína, se introduce en el equipo y se analiza las bandas de
absorción los cuales se encuentran en una longitud máxima de 273 nm
aproximadamente. Repetir la misma técnica con las siguientes muestras.

3. Validación del sistema

Linealidad del sistema

Se determina, construyendo una curva de calibración (absorbancia vs concentración)

utilizando por lo menos 5 disoluciones preparadas a partir de una misma solución
patrón y haciendo análisis cuando menos por duplicado para cada disolución.

El intervalo entre las concentraciones a analizar depende del propósito del método;
para control de calidad y de seguimiento de la estabilidad de un fármaco en una forma
farmacéutica, deberá estar incluida la concentración seleccionada como 100%

Nota: se considerará el 100% como la concentración de la muestra en la solución final

a analizar, que proporciona una respuesta adecuada dependiendo del método de
cuantificación.

Criterio de aceptación:

CV< 1.5%

r>0.99 r2=0.98
Precisión del sistema

Se determina por un analista el cual deberá preparar por lo menos un sextuplicado de

disolución a la concentración de analito que representa la concentración de la solución
de referencia utilizada, o en cierto caso, la concentración que represente el 100% de
la muestra procesada para su medición; preparadas por disolución. Medir la
respuesta analítica bajo las mismas condiciones.

Criterio de aceptación:

CV< 1.5% para métodos físico-químicos.

Exactitud

Se determina, cuando menos 6 muestras analíticas, cargados de manera

independiente con la cantidad necesaria de sustancia de interés para obtener la
concentración 100%, utilizando el método propuesto. Haciendo el análisis en las
mismas condiciones de operación y por el mismo analista.

Calcular el porcentaje de recobro de cada muestra, al obtener el coeficiente de la

cantidad recuperada respecto de la cantidad adicionada expresada en porcentaje

Calcular el promedio aritmético, desviación estándar, coeficiente de variación y el

intervalo de confianza para la media poblacional del porcentaje de recobro.

Criterio de aceptación:

97-103% si el método es químico o espectrofotométrico

El CV del porcentaje de recobro:

No mayor de 2% si es químico o espectrofotométrico.

Precisión del método

Se determina de una muestra homogénea del producto cercana al 100% de la

concentración teórica, analizada cuando menos por dos analistas, en dos días
diferentes y por triplicado.

criterio de aceptación:

CV<= 2%

Si fa es menor a Fgla/gld: 0.05 el método es reproducible por los analistas

Si fa es mayor a o igual a Fgla/gld: 0.05 el método no es reproducible por los analistas

Si fd es menor a Fgld/gle: 0.05 el metodo analitico es reproducible en distintos días
por un mismo analista

Si fd es mayor o igual a Fgld/gle: 0.05 el método analitico no es reproducible en

distintos días por un mismo analista.

Robustez

Se establecen aquellos factores instrumentales, y/o factores no instrumentales,

relacionados al propio método, que se considere crítico, en cada condición de
operación distinta; así como a la condición normal, analizar la misma muestra por lo
menos por triplicado.

Criterio de aceptación:

Si < 3% para métodos químicos y espectrofotométricos.

Tolerancia

Se debe establecer aquellos factores ajenos al método como diferentes equipos, lotes
de reactivos, columnas, etc., que se puedan presentar al reproducir el método en otras
condiciones de uso. Fijar por lo menos 2 condiciones y analizar una misma muestra
por lo menos por triplicado a cada condición.

Criterio de aceptación:

CV< 3% para métodos químicos y espectrofotométricos.

Límite de detección

Se considera como la mínima concentración de una sustancia en una muestra la cual

puede ser detectada, pero no necesariamente cuantificada, bajo las condiciones de
operación establecidas.

Límite de cuantificación

Se determina como la menor concentración de una sustancia en una muestra que

puede ser determinada con precisión y exactitud aceptables bajo las condiciones de
operación establecidas.

Estabilidad de la muestra

Es la propiedad de una muestra preparada para su cuantificación, de conservar su

integridad fisicoquímica y la concentración de la sustancia de interés, después de
almacenarse durante un tiempo determinado bajo condiciones específicas.
Resultados

Linealidad

C.T Encontrado x gorro Abs

0.0000257 0.0000259 0.293

0.0000514 0.0000515 0.527

0.0000772 0.0000769 0.759

0.000102 0.000101 0.984

0.000128 0.000128 1.23

R 0.999912847

R2 0.999825702

Los cálculos y datos completos se encuentran en el anexo 1.0.

Precisión de sistema

Cálculo final

CV 0.19196513

Las operaciones y datos completos se encuentran en el anexo 2.0.

Exactitud

CV 0.19196513%
IC 99.83% ± 0.1217%

Los cálculos y operaciones se encuentran en el anexo 3.0

Reproducibilidad (PM)

Fuente de Grados de Suma de Media de

variación libertad cuadrados cuadrados F cal F 0.05*

Analista (a) 1 0.021 0.021 0.686946116 38.51

Dia 2 0.061140167 0.030570083 1.518963179 6.06

Error 8 0.32201 0.04025125

Repetibilidad
del método
analítico

0.200627142 ±0.200627142

Coeficiente de
variación total

Ȓ 99.83941667

s 0.191668706

CV 0.191976989

Los cálculos y operaciones se encuentran en el anexo 4.0

 Absortividad molar (STD) 9869.96099

Ilustración 4. Espectro UV de cafeína

Absortividad molar
(muestra) 7509.62773

Ilustración 5. Absorbancia de solución muestra

Pureza (muestra)

(0.0000772mol/L)|(194.19g/1mol)|(0.01L)|=
Teórica 0.0001499 g
 0.1009g|(1mol/194.19g)|(1/0.2L)|(0.005/0.05)|(0.
Experimental 003/0.01)|= 0.0000779 mol/L

0.0000779 mol/L)|(194.19g/1 mol)|(0.01L)|=

0.0001512 g

p%= (g experimentales/ g
teóricos)*(100)

p%=
((0.0001512)/(0.0001499))*(100)
= 100.86%

Los cálculos, operaciones e IR se encuentran en el anexo 5.0

Discusión

De acuerdo con lo establecido en el plan de validación, donde se consideran las

pruebas y parámetros de validación necesarios y el diseño experimental con base en
los requerimientos del método aplicado, se determina que:

Linealidad: Ya que r >=0.9999, r2>= 0.9998, CV de 0.1919%, por lo tanto, sí cumple

con los criterios para la linealidad del sistema.

Precisión: Se cumple con el parámetro establecido para la precisión ya que el CV

obtenido es de 0.1919%.

Exactitud: Se cumple con los parámetros establecidos para la exactitud del método,
dado que el promedio de recobro para métodos cromatográficos 99.83%, el IC es
99.83% ± 0.1217% y el CV de 0.1919.

Precisión del método (Reproducibilidad): Como Fa (0.6869) es menor a Fgla/gld: 0.05

(38.51) el método analítico es reproducible por los analistas. Como Fd (1.5189) es
menor a Fgld/gle: 0.05 (6.06) este método analítico es reproducible por distintos días
por un mismo analista.

Considerando lo anterior se comprobó la validez del método analítico propuesto para

cuantificar la cafeína por espectrofotometría UV. Del mismo modo, durante la
experimentación se determinó que no existen interferencias significativas dando
lecturas correctas.
Por otro lado, la evaluación del blanco se realizó con HCl 0.1N, al ser el blanco no
mostró un pico definido, comprobando la no detección del analito.

Conclusión

Se puede determinar mediante fundamentos estadísticos que el método es adecuado

para los fines previstos, considerando que para el proceso de validación del método
analítico propuesto para cuantificar la cafeína es por espectrofotometría UV. Dando
así como resultado una linealidad y precisión, con un coeficiente de variación menor
del 1.5%, también obteniendo una exactitud y precisión del método dentro de los
parámetros que dicta la guía de validación por lo que se demuestra que la validación
se ejecutó de forma metódica, ordenada, confiable y reproducible.

En el trabajo experimental concluido, se pudieron relacionar diversos conceptos ya

antes manejados y estudiados, como lo es la relación entre absorbancia y longitud de
onda, o absorbancia y concentración de las soluciones

Anexos

Anexo 1.0

1er analista (día 1)

Encontrado x
C.T gorro Abs % Recobro

0.0000257 0.0000261 0.265 101.5564202

0.0000514 0.0000511 0.512 99.41634241

0.0000772 0.0000759 0.757 98.31606218

0.000102 0.000103 1.027 100.9803922

0.000128 0.000127 1.267 99.21875

R 0.999441538 99.8975934
 R2 0.998883387

Encontrado x
C.T gorro Abs % Recobro

0.0000257 0.0000265 0.225 103.1128405

0.0000514 0.0000503 0.463 97.85992218

0.0000772 0.0000766 0.726 99.22279793

0.000102 0.000102 0.988 100

0.000128 0.000127 1.237 99.21875

R 0.999554209 99.88286211

R2 0.999108617
 Encontrado x
C.T gorro Abs % Recobro

0.0000257 0.000026 0.275 101.1673152

0.0000514 0.0000507 0.522 98.6381323

0.0000772 0.0000768 0.784 99.48186528

0.000102 0.000103 1.049 100.9803922

0.000128 0.000127 1.289 99.21875

R 0.999543516 99.89729098

R2 0.999087241
1er analista (dia
2)

Encontrado x
C.T gorro Abs % Recobro

0.0000257 0.0000259 0.293 100.7782101

0.0000514 0.0000515 0.527 100.1945525

0.0000772 0.0000769 0.759 99.61139896

0.000102 0.000101 0.984 99.01960784

0.000128 0.000128 1.23 100

R 0.999912847 99.92075389

R2 0.999825702
 Encontrado x
C.T gorro Abs % Recobro

0.0000257 0.0000256 0.22 99.61089494

0.0000514 0.0000516 0.466 100.3891051

0.0000772 0.0000764 0.7 98.96373057

0.000102 0.000102 0.948 100

0.000128 0.000127 1.183 99.21875

R 0.999801081 99.63649611

R2 0.999602201
 Encontrado x
C.T gorro Abs % Recobro

0.0000257 0.0000262 0.202 101.9455253

0.0000514 0.0000511 0.434 99.41634241

0.0000772 0.0000764 0.67 98.96373057

0.000102 0.000102 0.91 100

0.000128 0.000128 1.152 100

R 0.999849121 100.0651197

R2 0.999698265
2do analista (dia Encontrado x
1) gorro Abs %Recobro

0.0000257 0.000026 0.372 101.1673152

0.0000514 0.000051 0.647 99.22178988

0.0000772 0.0000764 0.927 98.96373057

0.000102 0.0001032 1.223 101.1764706

0.000128 0.000127 1.491 99.21875

R 0.999588519 99.94961124

R2 0.999177207
 Encontrado x
2do analista C.T gorro Abs % Recobro

0.0000257 0.000026 0.205 101.1673152

0.0000514 0.0000506 0.431 98.44357977

0.0000772 0.0000765 0.669 99.09326425

0.000102 0.000103 0.921 100.9803922

0.000128 0.000127 1.133 99.21875

R 0.999092302 99.78066027

R2 0.998185428
 Encontrado x
2do analista C.T gorro Abs % Recobro

0.0000257 0.0000252 0.263 98.05447471

0.0000514 0.0000507 0.497 98.6381323

0.0000772 0.0000785 0.753 101.6839378

0.000102 0.000102 0.977 100

0.000128 0.000126 1.197 98.4375

R 0.999283839 99.36280897

R2 0.998568191
2do analista (dia
2)

Encontrado x
C.T gorro Abs % Recobro

0.0000257 0.0000262 0.198 101.9455253

0.0000514 0.000051 0.43 99.22178988

0.0000772 0.0000761 0.665 98.57512953

0.000102 0.000103 0.916 100.9803922

0.000128 0.000127 1.148 99.21875

R 0.999612084 99.98831737

R2 0.999224319
 Encontrado x
2do analista C.T gorro Absorbancia % Recobro

0.0000257 0.0000255 0.271 99.22178988

0.0000514 0.0000515 0.508 100.1945525

0.0000772 0.0000772 0.743 100

0.000102 0.000102 0.97 100

0.000128 0.000127 1.205 99.21875

R 0.999989092 99.72701848

R2 0.999978185
 Encontrado x
2do analista C.T gorro Absorbancia % Recobro

0.0000257 0.0000264 0.291 102.7237354

0.0000514 0.000051 0.519 99.22178988

0.0000772 0.0000764 0.754 98.96373057

0.000102 0.000101 0.986 99.01960784

0.000128 0.000128 1.238 100

R 0.999694598 99.98577274

R2 0.99938929
Anexo 2.0

Analista 1 Analista 2

Dia 1 99.887 99.949

99.882 99.78

99.897 99.362

Dia 2 99.92 99.983

99.636 99.727

100.065 99.985

599.287 598.786 1198.073

Cálculos preliminares

∑y 1198.073

∑y^2 1435378.91

Ȓ 99.8394167%

s 0.19165687

Cálculo final

CV 0.19196513%

Anexo 3.0

Analista 1 Analista 2

Dia 1 99.887 99.949

99.882 99.78

99.897 99.362

Dia 2 99.92 99.983

99.636 99.727

100.065 99.985

ΣR= 1198.073

ΣR2= 119615.3135
Ȓ=1198.073/ 12= 99.8394

DE= ((12(119615.3135) - (1198.073)2) / 12(12-1))1/2 = 0.1916

CV= (0. 1916/ 99.8394) (100) = 0.1919%

% Recobro (Ṝ) ± t95(s/Raiz(n)

99.8394 0.121781307

IC 99.83±0.1217

Anexo 4.0

Analista 1 Analista 2

Dia 1 99.887 99.949

99.882 99.78

99.897 99.362

Dia 2 99.92 99.983

99.636 99.727

100.065 99.985

599.287 598.786 1198.073

 Cálculos
1.- preliminares

y11 299.666

y12 299.621

y21 299.091

y22 299.695

Calcular la suma para cada

2.- analista

y1 599.287

y2 598.786

Calcular la suma
3.- total

y 1198.073

Calcular la suma del cuadrado de cada

4.- analista en cada dia

∑∑yi2j 358844.9745

Calcular las sumas del cuadrado de cada

5.- analista en los dos días
 (∑yi)2 717689.5822

Calcular la suma de cada dato elevado al

6.- cuadrado

∑∑∑yi2jk 119615.3135

Calcular la suma de
cuadrados de analista
(SCa), efecto del factor
7.- analista

SCa 119614.9304 119614.9094 0.021

Calcular la suma de
cuadrados del dia anidado
8.- en el analista (SCd)

SCd 119614.9915 119614.9304 0.061140167

Calcular la suma de cuadrados del error

9.- (SCe)

SCe 0.32201
Cálculos finales

Con datos anteriores construir la tabla de análisis de varianza

(ANADEVA)

Suma de
Grados de cuadrad Media de
Fuente de variación libertad os cuadrados F cal F 0.05*

Analista (a) 1 0.021 0.021 0.686946116 38.51

0.06114 0.03057008
Dia 2 0167 3 1.518963179 6.06

Error 8 0.32201 0.04025125

Repetibilidad del
método analítico

0.200627142 ±0.200627142

Coeficiente de
variación total

Ȓ 99.83941667

s 0.191668706

CV 0.191976989
Anexo 5.0

Absorbancia 0.585
Celda 1
Concentración 0.0000779
A=εbc
Muestra ε=A/bc
Absortividad molar (muestra) 7509.62773

Absorbancia 0.759
Celda 1
Concentración 0.0000769
A=εbc
STD ε=A/bc
Absortividad molar (STD) 9869.96099

Pureza (muestra)
Teórica (0.0000772mol/L)|(194.19g/1mol)|(0.01L)|= 0.0001499 g

0.1009g|(1mol/194.19g)|(1/0.2L)|(0.005/0.05)|(0.003/0.0
Experimental 1)|= 0.0000779 mol/L
0.0000779 mol/L)|(194.19g/1 mol)|(0.01L)|= 0.0001512 g

p%= (g experimentales/ g
teóricos)*(100)
p%=
((0.0001512)/(0.0001499))*(100)=
100.86%
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