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http://dx.doi.org/10.1590/1678-4162-9774

Arco Brasil Medicina. veterinario zootecnia., v.70, n.5, p.1521-1528, 2018

Diferenciación morfométrica entre larvas deAmblyomma escultorBerlés, 1888 y

Amblyomma dubitatumNeumann, 1899

[Diferenciación morfométrica entre larvas de Amblyomma sculptum Berlese,

1888 y Amblyomma dubitatum Neumann, 1899]

jBrites-Neto1.2, jBrasildos, GACTakeda3, CAGuillén4,

MEGABYTElabruna5, A.pintor3

1Facultad de Agricultura Luiz de Queiroz/USP Piracicaba, SP

dosDepartamento de Salud ˗ Americana, SP
3Superintendencia de Control de Enfermedades Endémicas ˗ São Paulo, SP
4UniversidadFederal de Paraná Curitiba, PR
5 Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia/USP ˗ São Paulo, SP

RESUMEN
-

Las garrapatas están involucradas en los procesos biológicos de una amplia variedad de organismos patógenos.
El géneroambliomaes el más importante desde el punto de vista médico, con la especieAmblyomma escultor
Berlese, 1888 involucrado en el ciclo de transmisión de la fiebre maculosa brasileña (BSF). En este estudio, el
objetivo fue la validación molecular para una diferenciación en la característica morfométrica y en el tamaño
idiosoma de larvas de dos especies de garrapatas,Amblyomma dubitatumNeumann, 1899 y
A. escultura. Las larvas no alimentadas se recolectaron en dos áreas de transmisión de FMB,
utilizando la técnica de trampa de atracción de CO.dos. Se identificaron a nivel de especie por
morfometría comparativa, análisis molecular por PCR y secuenciación genómica, con validación por
análisis de concordancia mediante la prueba Kappa. las larvas deA. dubitatummostró una longitud
significativamente mayor que las larvas deA. escultura. Aunque ninguna otra especie del género
ambliomaha sido probada en este estudio, esta técnica se puede utilizar en lugares donde estudios
acarológicos previos, basados en las etapas de ninfa y adulto, indicaron la presencia de soloA.
esculturayA. dubitatum,generalmente mantenido por capibaras. Es de destacar que esta condición
es muy común en las áreas endémicas de FMB en la región sureste de Brasil.

Palabras clave: garrapatas, idiosoma, taxonomía, secuenciación genética, capibaras, fiebre maculosa

RESUMEN

Las garrapatas están involucradas en los procesos biológicos de una amplia variedad de organismos patógenos. El
género Amblyomma presenta la mayor importancia médica, con la especie Amblyomma sculptum Berlese, 1888
involucrada en el ciclo de transmisión de la fiebre maculosa brasileña (BSF). En este estudio realizamos una validación
molecular de la diferenciación morfométrica basada en la longitud idiosomal de las larvas de A. dubitatum y A. sculptum.
Las larvas no alimentadas se recolectaron en dos áreas de transmisión de BSF, utilizando el atractivo COdostécnica de
trampa. Las larvas se identificaron a nivel de especie por morfometría comparativa, análisis molecular por PCR y
secuenciación genómica, con validación mediante análisis de concordancia por la prueba Kappa. Las larvas de A.
dubitatum mostraron una longitud idiosomal significativamente mayor que las larvas de A. sculptum. Aunque en este
estudio no se ha probado ninguna otra especie del género Amblyomma, esta técnica se puede aplicar a lugares donde
vigilancias acarológicas previas basadas en estadios de garrapatas adultas y ninfales han indicado la presencia
únicamente de A. sculptum y A. dubitatum, generalmente sostenidos por capibaras. Cabe destacar que esta condición es
muy común entre muchas áreas endémicas de BSF en el sureste de Brasil.

Palabras clave: garrapatas, idiosoma, taxonomía, secuenciación genética, capibaras, fiebre maculosa

Recibido el 31 de enero de 2017

Aceptado el 5 de julio de 2017 Correo
electrónico: samevet@yahoo.com.br
 Brites-Neto et al.
INTRODUCCIÓN
Las garrapatas intervienen en procesos biológicos en
la transmisión de una gran variedad de organismos
patógenos, siendo superiores a cualquier otro grupo
de artrópodos, aunque los mosquitos pueden
transmitir patógenos que infectan a un mayor
número de personas y provocan enfermedades con
mayor potencial de gravedad en animales y seres.
humanos (Sonenshine y Roe, 2014). Entre estas
enfermedades, las zoonosis son las principales
causas de morbilidad y mortalidad en el mundo,
siendo las garrapatas vectores más activos que
cualquier otro grupo de invertebrados (Pfäffleet al.,
2013).
Las garrapatas Ixodidae están distribuidas por
todo el mundo, con especies del género
amblioma Kock, 1844, observó en muchos
casos de parasitismo humano (Guglielmoneet
al., 2014). En Brasil, el géneroambliomaes el de
mayor importancia médica, con 32 especies
endémicas distribuidas en diferentes regiones
del país (Dantas-Torreset al., 2009; Krawczaket
al., 2015; Martínet al., 2016). Dos de estas
especies, Amblyomma escultorBerlés, 1888 yA.
aureolato(Pallas, 1772), están involucrados
como vectores importantes en el ciclo de
transmisión de la fiebre maculosa brasileña
(BSF), una antropozoonosis de declaración
obligatoria, causada por la bacteriaRickettsia
rickettsii, que tiene características
epidemiológicas de alta endemicidad y alta
letalidad, debido a factores relacionados con el
tratamiento tardío, el uso de antibióticos
menos efectivos y la incidencia de cepas más
virulentas deR. rickettsiien la población
humana del estado de São Paulo (Ogrzewalska
et al., 2012; labruna et al., 2014).
Esta zoonosis se caracteriza por una
enfermedad infecciosa aguda de gravedad
variable, con un período de incubación de dos
a 14 días, y signos clínicos evidenciados por
fiebre continua, escalofríos, postración,
malestar general, mialgias, artralgias, cefalea,
erupciones maculopapulares y trastornos
hemostáticos ( pintoret al., 2011), con una tasa
de letalidad que oscila entre el 20 y el 40%, que
en casos no tratados puede llegar al 80%
(Parolaet al., 2013; Labruna, 2013).
En cuanto a su principal vector, estudios recientes
han reevaluado laestadotaxonómica de
1522
especiesA. Cajennensemediante análisis
morfológicos y moleculares, estableciéndose un
complejo de seis especies:A. Cajennenseen sentido
estricto,Amblyomma toneliaeEmbarcacionet al.,2014,
Amblyomma interandinumBeatiet al.,2014,
Amblyomma PatinoiLabruna., 2014,
Amblyomma mixtumKoch, 1844 yA. escultura
(Beatiet al., 2013; Estrada Peñaet al., 2014;
Embarcacionet al., 2014). Dentro de este
complejo, las especies fueron validadas para
BrasilA. cajennense sensu strictoyA. escultura,
y para el estado de São Paulo, sólo la especieA.
escultura. Por lo tanto, la especieA. escultura
tiene el capibara (hidrochoerus hidrochaeris
Linnaeus, 1776) como huésped principal de
todas sus etapas parasitarias (Krawczaket al.,
2014), jugando un papel importante en la
epidemiología de la enfermedad como
amplificador competente de la circulación del
agente etiológico en el ambiente (Souzaet al.,
2009).
Otra especie de este género,A. dubitatum,
tiene un papel indeterminado como vector de
FMB y se ha asociado con una rickettsia de
patogenicidad aún no demostrada para
humanos,rickettsiassp. cepa Pampulha
(Almeidaet al., 2011), y otro no patógeno y no
perteneciente al grupo de las fiebres
maculosas,R. bellii(sakaiet al., 2014). No
obstante,A. dubitatumtambién puede
eventualmente parasitar a las personas, ya que
Labrunaet al.(2007) observó infestación por
todas las etapas de esta especie en humanos.
carpinchos infestados deA. esculturaa menudo
están co-infestados conA. dubitatum, que
también tiene a este roedor como huésped
principal (Navaet al., 2010; Labruna, 2013), lo
que plantea una mayor investigación en cuanto
a su relación conA. esculturay las bacteriasR.
rickettsii(Szaboet al., 2013; Matíaset al., 2015).
Los estudios acarológicos realizados para estudiar
especies de ixódidos en regiones endémicas de
FMB del estado de São Paulo requieren
referencias técnicas eficientes y prácticas para la
identificación taxonómica de todas las etapas de
vida de las garrapatas prevalentes en las áreas de
transmisión. Para las formas adultas de las
especies de amblioma, hay claves dicotómicas
traducidas y modificadas por Onofrioet al. (2006),
y para las formas inmaduras, se encuentra la
clave de identificación para ninfas de Martinset al.
(2010).
Arco Brasil Medicina. veterinario zootecnia., v.70, n.5, p.1521-1528, 2018
 Diferenciación morfométrica...
Sin embargo, hay pocas especies descritas en
estado larvario, en las que los caracteres
morfológicos son poco informativos y las
descripciones basadas en quetotaxis no son
suficientes para separar las especies. Aunque los
avances han sido prometedores a través de claves
de identificación de larvas basadas en porotaxis,
en cuanto a la forma, número y topografía de los
poros, los procedimientos actuales se basan en
técnicas en las que los estados inmaduros de
garrapatas recolectadas naturalmente se crían en
animales de laboratorio hasta la etapa adulta.
para su correcta identificación, ya que las claves
de identificación de larvas están incompletas
(Barbieriet al., 2006; Palliniet al., 2007).
Considerando estas limitaciones, el presente
análisis tuvo como objetivo la validación
molecular para una diferenciación en la
característica morfométrica y en el tamaño
idiosoma de larvas de dos especies de garrapatas,
A. dubitatumyA. escultura, en áreas con
prevalencia de adultos de estas especies, en
regiones de transmisión para FMB.
MATERIAL Y MÉTODOS
Larvas de garrapatas del géneroamblioma
fueron recolectados previa autorización para
actividades con fines científicos, SISBIO nº
Figura 1. Visualización de la diferencia morfométrica entre los ejemplares larvales deA. escultura(a) yA.
dubitatum(B).
Arco Brasil Medicina. veterinario zootecnia., v.70, n.5, p.1521-1528, 2018
20562, en dos áreas de transmisión para FMB,
ubicadas en el estado de São Paulo. Estas áreas se
caracterizan por los bosques ribereños del río
Jaguari y del río Piracicaba y están ubicadas en la
localidad de Sobrado Velho (22°41'16”S y
47°15'09”WO; 516m) y Carioba (22°41' 75” S y
47°19'30” WO; 496m), respectivamente, en zona
rural y periurbana del municipio de Americana.
La investigación acarológica se llevó a cabo
utilizando la técnica de trampa de atracción de CO.dos
(Wilsonet al., 1972; sucursaleset al., 2014). El
uso de trampas de COdoses sensible y eficiente
para la recolección de todas las etapas deA.
esculturayA. dubitatum(Souzaet al., 2006).
En el período del 04/08/2011 al 06/08/2013 se
distribuyeron 88 trampas de COdosen varios
puntos de ambas zonas, con un tiempo medio de
permanencia en tierra de 1h30.
Las larvas recolectadas se identificaron a nivel de
especie, en un estereomicroscopio binocular a 30
aumentos, con base en el tamaño corporal de cada
individuo. Para ello, se utilizó la identificación
morfométrica comparativa, considerando que las
larvas deA. dubitatumson notablemente más
grandes en comparación con las larvas deA.
escultura(Brites-Netoet al., 2013) (fig. 1).
1523
 Brites-Neto et al.
Las larvas se separaron en dos grupos. El primero
contenía larvas identificadas comoA. escultura,
mientras que el segundo contenía larvas
identificadas comoA. dubitatum.
De cada uno de los dos grupos, se seleccionaron
aleatoriamente 30 larvas y se transfirieron
individualmente a microtubos de 0,5 ml (Axygen,
marca de ciencias de la vida, EE. UU.) que
contiene alcohol isopropílico.
Las larvas se retiraron del alcohol isopropílico,
se dejaron secar sobre toallas de papel durante
10 minutos y se transfirieron individualmente a
cubreobjetos de vidrio desechables. Los
cubreobjetos se examinaron en un
estereomicroscopio con una cámara adjunta y
conectada a una computadora consoftware
análisis de imagen (NIS-Elements F, Nikon,
Japón). La medición individual de la longitud
longitudinal del idiosoma se realizó con las
larvas colocadas en posición prona.
Las larvas se transfirieron individualmente a
microtubos nuevos de 0,5 mL previamente
llenados con 50 microlitros de tampón Tris-HCl 10
mM, pH 7,4 y EDTA 1 mM, pH 8,0 (TE). Las larvas
se maceraron con un micropistilo de plástico
desechable y todos los tubos se transfirieron al
termociclador (Mastercycler Gradient®
Eppendorf©) y expuesto a 99OC durante un
período de 15 minutos. En este paso, hubo una
desnaturalización e inactivación de enzimas y
otras proteínas que tienen el potencial de inhibir
la reacción de PCR y alterar las células y exponer
el ADN genómico y mitocondrial.
La PCR se llevó a cabo utilizando elequipo
comercial (Mezcla maestra Qiagen©). La cantidad
de reactivos utilizados por microtubo siguió el
protocolo del fabricante, que consistió en 12,5 µL
demezcla maestra; 0,5 µl deprimer delanteroa 10
nM; 0,5 µL de imprimaciónreversoa 10 nM; 9.5µl
de agua proporcionada en elequipocomercial y
2µL de muestra, componiendo un volumen total
de 25µL. Para el control negativo de PCR se utilizó
una muestra de agua destilada, y para el control
positivo, material genético deA. aureolato
probado previamente.
Se utilizó la metodología de amplificación y
secuenciación del gen ribosómico-
mitocondrial 16S rRNA. El ADN extraído de
cada larva de garrapata se
1524
sometidos individualmente a la reacción de
PCR. Los cebadores de oligonucleótidos
específicos para amplificar un fragmento de
460 pares de bases fueron, ADELANTE:
5 - ́CTGCTCAATGATTTTTTAAATTGCTGTGG-3
(16S +1, Black and Piesman, 1994) y REVERSO: 5
-́CCGGTCTGAACTCAGATCAAGT-3 (16S
- 1, Black y Piesman, 1994), como lo describe
Mangoldet al.(1998).
La reacción en cadena se llevó a cabo en un
termociclador y se utilizó el programa de
amplificación sugerido por Mangold.y otros.
(1998), adaptado a los requisitos del fabricante
del reactivomezcla maestra, agregando un paso
de 15 minutos a 95OC al protocolo original.
Al final de la reacción, se añadieron 2 µL del tampón
de carga “colorante de carga azul” en una alícuota de
8 µL de cada muestra. El volumen final de 10µL se
aplicó individualmente en pocillos con gel de agarosa
al 1,5%, previamente preparados con una solución
de Tris/ácido bórico/EDTA (TBE) y tratados con el
reveladorGelRed®.
Para la comparación con el estándar de masa,
se utilizó el marcador de masa molecular DNA
Ladder.Invitrogen®, siempre aplicado a la
primera columna de cada gel. Luego, el gel fue
sometido a electroforesis por 40min, bajo
corriente eléctrica de 0.05A y voltaje de 6v/cm.
Una vez finalizada la electroforesis, el gel se
sometió a la incidencia de luz ultravioleta (UV)
en un transiluminador.DyNA Light Labnet®,
con el fin de revelar los fragmentos de ADN
amplificados, así como el marcador molecular
utilizado.
Las muestras amplificadas fueron purificadas
con el reactivo EXOSAP, siguiendo el protocolo
del fabricante, y enviadas para secuenciación
en el Centro de Estudios del Genoma Humano
de la USP, donde la reacción utilizada fue el
método didesoxi-terminal, según Sangeret al.
(1977), con reactivos de laKit BigDye ABI
PrismTM Dye Terminator Ciclo Secuenciación
Lectura Reacción – Applied Biosystems.
Con los datos de secuenciación genómica, los
cromatogramas sentido y antisentido generados
se alinearon por muestra, utilizando el programa
informáticoGeneious 10.0.2 Biomatters Ltd.
Arco Brasil Medicina. veterinario zootecnia., v.70, n.5, p.1521-1528, 2018
 Diferenciación morfométrica...
Las secuencias de consenso se alinearon y
compararon con la base de datos GenBank en el
Centro Nacional de Información Biotecnológica
(NBCI), utilizando el programaHerramienta básica de
búsqueda de alineación local (BLAST).
Los datos de medición longitudinal de las larvas se
compararon mediante la prueba U de Mann-
Whitney, y la concordancia del resultado de
secuenciación con el resultado de microscopía óptica
se comparó mediante la prueba Kappa, y las pruebas
estadísticas se realizaron en el programa.SOFA 1.4.3
Paton-Simpson & Associates Ltd.
RESULTADOS
Durante el proceso de recolección de la
trampa de COdos, 4.347 larvas de
Tabla 1. Medidas del idiosoma de larvas identificadas comoA. dubitatumyA. escultura
Grupo Promedio (mm)* mediana (mm)
A. dubitatum 0.609los 0.607
A. escultura 0.469B 0.474
* Letras diferentes representan diferencia estadística evaluada en la prueba U de Mann-Whitney, valor de P <0.001 y U = 0.
Hubo una diferencia significativa entre las
medidas del tamaño del idiosoma de los grupos y
el grupo de larvas identificado comoA. dubitatum
presentado con una longitud de idiosoma más
larga (P<0.001; U= 0) que el grupo identificado
comoA. escultura(Higo. dos).
Primero se evaluó individualmente la
secuenciación de parte del gen mitocondrial
16S rRNA de cada una de las 60 larvas,
eliminando manualmente la secuencia
referente alcebadoresy seleccionó parte de la
secuenciación que obtuvo alta calidad en la
definición de las bases en el cromatograma.
Posteriormente se realizó un agrupamiento
entre las secuencias en las que había un
alineamiento local del 100%.
Las 30 secuencias consenso de larvas previamente
identificadas comoA. dubitatum alineados entre sí
con 100% de similitud, formando una secuencia
consenso de 301 pares de bases. Esta secuencia
mostró una gran similitud con las secuencias deA.
dubitatum disponible enBanco Genético,estando al
100% con el
Arco Brasil Medicina. veterinario zootecnia., v.70, n.5, p.1521-1528, 2018
garrapatas Siguiendo los identificación
análisis morfométrico, se identificaron 3.812
larvas comoA. escultura, y 535 larvas comoA.
dubitatum.
Larvas previamente identificadas en un
estereomicroscopio óptico como pertenecientes a
la especieA. dubitatumpresentó un
longitud media del idiosoma de 0,609 mm
(0,554 mm - 0,666 mm), con un valor medio de
0,607 mm y una desviación estándar de ±0,03
mm. Larvas previamente identificadas como
pertenecientes a la especieA. escultura tenían
una longitud media de idiosoma de 0,469 mm
(0,42 mm - 0,498 mm), con un valor mediano
de 0,474 mm y una desviación estándar de ±
0,018 mm (Tabla 1).
máx. (mm) mín. (mm)
0.666 0.554
0.498 0.42
registro GU301912.1 y 99.6% con registro
KU894374.1.
Las 30 secuencias consenso de larvas
previamente identificadas comoA. escultura
alineados entre sí con un 100 % de similitud,
formando una secuencia consenso de 359
pares de bases. Esta secuencia mostró 100% de
similitud con secuencias deA. escultura
disponible enGenBank, siendo el 100% con
registros KT820361.1 y FJ424404.1. Vale la pena
señalar que el registro FJ424404.1 se describió
inicialmente comoA. Cajennense, siendo
anterior al artículo de Beatiet al.(2013), en
realidad tratando conA. escultura.
Tú Dado del secuenciación genético
concuerdan, por lo tanto, con los resultados de
los datos de medición del idiosoma de las larvas,
así como con la identificación morfológica previa,
habiendo presentado así un valor de
concordancia Kappa general igual a 1,0 con un
valor de P <0,001 y un intervalo del 95% confianza
de (0.747; 1.0).
1525
 Brites-Neto et al.
Figura 2. Longitud del idiosoma deA. esculturayA. dubitatum.
DISCUSIÓN
La identificación correcta de las especies de
garrapatas existentes en un determinado sitio
probable de infección (LPI) es de suma importancia y
puede cambiar significativamente el riesgo atribuido
a ese sitio con respecto a la aparición de FMB (Pinter
et al., 2016).
Este estudio demostró que es posible
diferenciar, con un alto grado de validación, las
especiesA. esculturayA. dubitatumen los
estadios larvales, ya que la selección de
ejemplares por el tamaño del idiosoma dio un
100% de aciertos de la especie de garrapata, al
compararlo con su confirmación por técnica de
biología molecular.
Los resultados de las mediciones de idiosomas
mostraron una gran diferencia entre las
mediciones deA. escultura,que, como máximo,
alcanzaba los 0,498 mm y las medidas deA.
dubitatum, que, al menos, registró 0.554mm,
dando un bajo grado de incertidumbre a la
clasificación de los ejemplares, entre las dos
especies de interés.
Es importante recalcar que el presente trabajo se
basó en mediciones de ejemplares que fueron
colectados en la naturaleza. En ese caso, el
1526
La longitud del idiosoma es un carácter
taxonómico muy estable, ya que todas las
larvas se originaron a partir de huevos de
tamaño típico para cada especie (Barbieriet al.,
2006). En el caso de larvas ya alimentadas,
recogidas de huéspedes, la medida del
idiosoma pierde su carácter discriminatorio
entre las dos especies de garrapata, ya que
una larva deA. esculturaen la etapa final de
alimentación sería mucho más larga que unaA.
dubitatumen la fase inicial de alimentación. Así,
las medidas tendrían que basarse en
estructuras no expansivas del idiosoma, como
por ejemplo el escudo o el gnatosoma.
Aunque ninguna otra especie del género amblioma
ha sido probado en este estudio, esta técnica puede
ser utilizada en lugares donde es necesaria la
vigilancia acarológica, como una propuesta de
identificación donde estas especies prevalentes ya
son conocidas, y el capibara es el huésped principal,
en áreas con riesgo de transmisión de BMB, en el
estado de São Paulo y en el sureste del país.
Oportunamente, vale la pena señalar que, en
muchas áreas endémicas para FMB asociada con
carpinchos en el estado de São Paulo,A. esculturayA.
dubitatumhan sido las únicas especies del género
ambliomaidentificados en estudios acarológicos
(Pintery otros., 2011).
Arco Brasil Medicina. veterinario zootecnia., v.70, n.5, p.1521-1528, 2018
 Diferenciación morfométrica...
CONCLUSIÓN
La aplicación de esta técnica de identificación
morfométrica fue validada con significancia
estadística (P<0.001), siendo recomendada
exclusivamente para la diferenciación entre
larvas de la especieA. dubitatumyA. escultura
(recolectados en la naturaleza) en LPI para FMB
que presentan una ixodofauna ya conocida,
constituida básicamente por solo estas dos
especies deamblioma,tener carpinchos como
huéspedes principales.
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