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REPORTE TÉCNICO

Control óptico genéticamente dirigido de la actividad neuronal en una escala de

tiempo de milisegundos

Edward S Boyden1, Feng Zhang1, Ernst Bamberg2,3, Georg Nagel2,5 y Karl Deisseroth1,4

El control no invasivo y con precisión temporal de la actividad en poblaciones
neuronales bien definidas es un objetivo perseguido desde hace mucho tiempo
por la neurociencia de sistemas. Adaptamos para este propósito la proteína de
algas natural Channelrhodopsin-2, un canal catiónico sensible a la luz de
activación rápida, mediante el uso de la entrega de genes lentivirales en combinación
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con el cambio óptico de alta velocidad para fotoestimular las neuronas de los
mamíferos. Demostramos un control confiable en escala de tiempo de milisegundos
de picos neuronales, así como el control de la transmisión sináptica excitatoria e
inhibitoria. Esta tecnología permite el uso de la luz para alterar el procesamiento
neuronal a nivel de picos únicos y eventos sinápticos, lo que genera una herramienta
En el tejido cerebral intacto han proporcionado muchos conocimientos sobre la función
de los subcampos del circuito (por ejemplo, véanse las referencias 1 a 3), las neuronas
que pertenecen a una clase específica a menudo están escasamente incrustadas en
el tejido, lo que plantea desafíos fundamentales para resolver el papel de una neurona
en particular. tipos en el procesamiento de la información. Un método de base genética,
no invasivo y de alta resolución temporal para controlar la actividad neuronal permitiría
dilucidar los patrones de actividad temporal en neuronas específicas que impulsan la
dinámica, la plasticidad y el comportamiento del circuito.
A pesar del progreso sustancial realizado en el análisis de la geometría de la red
neuronal por medio de técnicas no específicas del tipo de célula, como la liberación de
corriente
(pa)

de amplia aplicación para neurocientíficos e ingenieros biomédicos.
La computación neuronal depende de los patrones de picos temporalmente diversos
de diferentes clases de neuronas que expresan marcadores genéticos únicos y
demuestran propiedades de cableado heterogéneas dentro de las redes neuronales.
Aunque la estimulación eléctrica directa y el registro de neuronas
glutamato (por ejemplo, consulte las referencias 4–7), aún no se ha inventado ninguna
herramienta con la resolución espaciotemporal necesaria para sondear codificación
neuronal a la resolución de picos individuales. Además, los métodos ópticos previos
codificados genéticamente, aunque elegantes8–10,11, han permitido el control de la
actividad neuronal en escalas de tiempo de segundos a minutos, quizás debido a sus
mecanismos para efectuar la despolarización. Una cinética aproximadamente mil
veces más rápida permitiría el control remoto de

Tiempo
(ms)

Figura 1 ChR2 permite la activación de neuronas

impulsadas por la luz. ( a ) Neuronas del hipocampo
a b 1,000 C
que expresan ChR2-YFP (barra de escala de 30 mm).
( b ) Izquierda, corriente hacia adentro en la neurona sujeta
500
a voltaje evocada por 1 s de luz de longitud de onda GFP 400 pA
(indicada por una barra negra); derecha, datos de población 500ms 100 pA
(derecha; media ± sd trazada a lo largo; n = 18). Recuadro, 0
2 segundos

400 pA Cima
fase inicial ampliada del transitorio de corriente. ( c ) Diez 100 ms
trazos de corriente superpuestos registrados desde una Estado estable
neurona del hipocampo iluminada con pares de pulsos de
luz de 0,5 s (indicados por barras grises), separados por d mi
intervalos que varían de 1 a 10 s. ( d ) Trazas de voltaje que 10 5ms
muestran la despolarización de la membrana y picos en una
neurona hipocampal sujeta a corriente (izquierda) evocada
5
por períodos de luz de 1 s (barra gris). Derecha, propiedades
10 ms
del primer pico obtenido (n = 10): latencia al umbral del pico,
latencia al pico del pico y fluctuación del tiempo del pico. (e) 0
40mV
Trazas de voltaje en respuesta a breves series de pulsos de
Hora de
luz, con pulsos de luz (barras grises) que duran 5 ms (arriba), 100ms
Tiempo hasta el umbral Pico de pico de pico
de fluctuación de fase 15 ms
10 ms (medio) o 15 ms (abajo). 100mV
500ms

1Departamento de Bioingeniería, Universidad de Stanford, 318 Campus Drive West, Stanford, California 94305, EE. UU. 2 Instituto Max-Planck de Biofísica, Departamento de
Química Biofísica, Max-von-Laue-Str. 3, D-60438 Fráncfort del Meno, Alemania. 3Departamento de Bioquímica, Química y Farmacia, Universidad de Frankfurt, Marie-Curie-Str. 9, 60439
Fráncfort del Meno, Alemania. 4Departamento de Psiquiatría y Ciencias del Comportamiento, Facultad de Medicina de Stanford, 401 Quarry Road, Stanford, California 94305, EE. UU.
5Dirección actual: Julius-von-Sachs-Institut, Universidad de Wu¨rzburg, Julius-von-Sachs-Platz 2–4, D-97082 Wu¨rzburg, Alemania. La correspondencia debe dirigirse a KD
(deissero@stanford.edu).

Publicado en línea el 14 de agosto de 2005; doi:10.1038/nn1525

NATURE NEUROSCIENCE VOLUMEN 8 [ NÚMERO 9 [ SEPTIEMBRE 2005 1263

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REPORTE TÉCNICO

picos individuales o eventos sinápticos. Por lo tanto, hemos ideado una nueva estrategia después del inicio del pulso de luz (media ± sd informado en todo el artículo, n = 18; Fig.
utilizando un canal iónico de un solo componente con una cinética de apertura de 1b, izquierda). Las corrientes internas medias de células enteras fueron grandes: 496 pA
submilisegundos, para permitir la fotoestimulación dirigida genéticamente con una ± 336 pA en el pico y 193 pA ± 177 pA en estado estacionario (Fig. 1b, derecha).
resolución temporal fina. Nunca se observaron respuestas provocadas por la luz en células que expresan YFP solo
Dos rodopsinas en el alga verde unicelular Chlamydomonas rein hardtii (datos no mostrados). De acuerdo con el espectro de excitación conocido de ChR2 (ref.
fueron identificadas recientemente de forma independiente por tres grupos12–15. 12), la iluminación de las neuronas que expresan ChR2 con luz de espectro YFP en el
Uno de ellos es un canal de protones activado por la luz (Channelrhodopsin-1; ref. 13), ancho de banda de 490 a 510 nm (lámpara de xenón de 300 W filtrada con filtro de
mientras que el otro, Channelrhododopsin-2 (ChR2), es un canal de cationes activado por excitación Chroma HQ500/20) resultó en corrientes que eran más pequeños (en un 42%
la luz12. Los 315 aminoácidos N-terminales de ChR2 son homólogos a la estructura de ± 20%) que los evocados con los filtros GFP. A pesar de la inactivación de ChR2 con
siete transmembranas de muchas rodopsinas de tipo microbiano; componen un canal con exposición a la luz sostenida (Fig. 1b y ref. 12), observamos una rápida recuperación de
conductancia dependiente de la luz (como se propuso anteriormente16). Las corrientes las fotocorrientes máximas de ChR2 en las neuronas (Fig. 1c; recuperación t = 5.1 ± 1.4
internas en las células que expresan ChR2 podrían evocarse dentro de los 50 ms después s; trayectoria de recuperación ajustada con el algoritmo de Levenberg-Marquardt ;n = 9).
de un destello de luz azul en presencia de trans retinal12, lo que sugiere la posibilidad de
que la estimulación neuronal ultrarrápida sea posible con equipos comúnmente utilizados Esta rápida recuperación es consistente con la conocida estabilidad de la base de Schiff
para visualizar la proteína fluorescente verde (GFP) . Por lo tanto, ChR2 combina algunas (la lisina en la hélice transmembrana siete, que se une al retinal) en las rodopsinas de tipo
de las mejores características de los métodos de fotoestimulación anteriores, incluida la microbiano, y la capacidad del retinal para volver a isomerizarse al estado fundamental
velocidad de un canal iónico monolítico9 y la eficacia de la maquinaria de transducción de totalmente trans en una reacción oscura, sin necesidad de otras enzimas. Las amplitudes
luz natural11. de corriente evocadas por la luz permanecieron sin cambios en las neuronas sujetas con
parche durante 1 h de exposición a la luz pulsada (datos no mostrados). Por lo tanto,
Descubrimos que ChR2 podría expresarse de manera estable y segura en neuronas ChR2 pudo mediar de manera sostenible fotocorrientes de gran amplitud con una cinética
de mamíferos y podría impulsar la despolarización neuronal. Cuando se activa con una de activación rápida.
serie de breves pulsos de luz, ChR2 podría mediar de manera confiable trenes definidos A continuación, examinamos si ChR2 podría impulsar el aumento de las neuronas en
de picos o eventos sinápticos con una resolución temporal de escala de tiempo de modo de abrazadera de corriente, con el mismo protocolo de iluminación constante que
milisegundos. Esta tecnología lleva así el control óptico al régimen temporal ocupado por usamos para provocar corrientes inducidas por ChR2 (Fig. 1d, izquierda).
los bloques de construcción fundamentales de la computación neuronal. Al principio de una época de iluminación constante, los picos neuronales individuales se
provocaron rápida y confiablemente (8,0 ± 1,9 ms de latencia hasta el pico del pico, n =
10; Fig. 1d, derecha), en consonancia con los rápidos tiempos de subida de las corrientes
RESULTADOS de ChR2 descritas anteriormente. Sin embargo, cualquier pico posterior provocado durante
La cinética rápida de ChR2 permite la conducción de picos únicos Para la iluminación constante estuvo mal sincronizado (Fig. 1d, izquierda). Por lo tanto, la
obtener una expresión de ChR2 estable y confiable para acoplar la luz a la despolarización iluminación constante no es adecuada para controlar la sincronización de los picos en
neuronal, construimos lentivirus que contenían una proteína de fusión de proteína curso con ChR2, a pesar de la confiabilidad del primer pico. Estudios anteriores de patch-
fluorescente amarilla ChR2 (YFP) para la modificación genética de las neuronas. La clamp utilizando inyección de corriente somática mostraron que los tiempos de pico eran
infección de neuronas CA3/CA1 de rata cultivadas condujo a la expresión de ChR2 más confiables durante los períodos de aumento rápido del potencial de membrana que
localizada en la membrana durante semanas después de la infección (Fig. 1a). La durante los períodos de inyección de corriente constante de alta magnitud17. Esto es
iluminación de neuronas positivas para ChR2 con luz azul (ancho de banda de 450–490 consistente con nuestro hallazgo de que la iluminación constante evocó un solo pico
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nm a través del filtro de excitación Chroma HQ470/40; lámpara de xenón de 300 W) indujo cronometrado de manera confiable, seguido de picos irregulares.
corrientes de despolarización rápida, que alcanzaron una tasa de aumento máxima de 160 En la búsqueda de una estrategia para provocar series de picos cronometrados con
± 111 pA/ms en 2,3 ± 1,1 ms precisión con ChR2, notamos que el pico único provocado de manera confiable por constante

a Una neurona: serie de pulsos repetidos b 100% C 10

(milisegundo)
Figura 2 Trenes de picos realistas impulsados por una
juicio
a serie de pulsos de luz. (a) Trazas de voltaje que muestran
repetibilidad,

50% 5
prueba
Jitter,
de
a
picos en una sola neurona del hipocampo sujeta a corriente,
en respuesta a tres entregas de un tren de Poisson (con
0% 0
intervalo medio l ¼ 100 ms) de pulsos de luz (guiones
ÿ = 100
ÿ = 200 ÿ = 100ÿ = 200
grises). (b) Repetibilidad de prueba a prueba de los trenes
de picos provocados por la luz, medidos comparando la
d 100%
mi i yo

20
presencia o ausencia de un pico en dos ensayos repetidos
de un tren de Poisson (ya sea l ¼ 100 ms o l ¼ 200 ms)
milisegundo

50% 10 entregados al misma neurona (n = 7 neuronas). (c)

Fluctuación de picos de prueba a prueba, a través de
transmisión
picos
de

60mV
Porcentaje
fidelidad
de

0% 0 repetidos trenes de picos evocados por la luz. ( d )

1s 100
l= 200
l= 100
l= 200
l=

F ÿ = 200
ÿ = 100 Porcentaje de fidelidad de la transmisión de picos a lo largo
Tres neuronas diferentes: de toda la serie de pulsos de luz de 8 s. (e) Latencia de los
Tiempo Jitter
misma serie de pulsos a lo largo
tren del
de picos picos a lo largo de cada serie de pulsos de luz (i) y
fluctuación de los tiempos de los picos a lo largo del tren
(ii). (f) Trazas de voltaje que muestran picos en tres
gramo
h 10
neuronas del hipocampo diferentes, en respuesta al mismo
ÿ = 100, ÿ = 200, (milisegundo)

estímulo de luz con patrón temporal (guiones grises) utilizado

59 picos 46 picos
30 30 5
en a. (g) Histograma que muestra cuántas de las siete
20 20
picos
de
#

neuronas se dispararon en respuesta a cada pulso de luz

10 10
neurona
neurona
Jitter,
a

0 0 en el tren de Poisson. ( h ) Fluctuación de neurona a neurona

0246 00246 de picos evocados por estimulación de luz.
ÿ = 100ÿ = 200
# de neuronas disparando un pico dado

1264 VOLUMEN 8 [ NÚMERO 9 [ SEPTIEMBRE 2005 NATURALEZA NEUROCIENCIA

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exceso
picos
de
#
a b
20
5 herzios
10
10 Hz 0 0 10 20 30
Frecuencia de estímulo
(Hz)
C mi
20 hercios 20
10
60mV
30 Hz 1s
0 0 10 20 30
Frecuencia de estímulo
(Hz)
la iluminación tuvo una fluctuación temporal extremadamente baja de una
prueba a otra, como se refleja en la pequeña desviación estándar de los
tiempos de pico entre las pruebas (Fig. 1d, derecha; 0.5 ± 0.3 ms, promedio
de n = 10 neuronas). Esta observación nos llevó a idear una estrategia de luz
pulsada que aprovecharía la baja fluctuación del único pico confiable evocado
al inicio del pulso de luz. Para que esto funcione, la conductancia y la cinética
de ChR2 tendrían que permitir picos de corriente de amplitud suficiente para
alcanzar el umbral de pico, durante un pulso de luz de duración más corta que
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el intervalo deseado entre picos. Descubrimos que múltiples pulsos de luz con
períodos de oscuridad intercalados podrían provocar trenes de múltiples picos
(Fig. 1e; se muestra para una serie de 25 Hz de cuatro pulsos). Los pulsos de
luz más largos evocaron picos únicos con mayor probabilidad que los pulsos
de luz cortos (Fig. 1e). En los experimentos descritos aquí, utilizamos duraciones heterogeneidad de diferentes neuronas, por ejemplo, en su capacidad de
de pulsos de luz de 5, 10 o 15 ms. Trece neuronas de alta expresión dispararon
picos confiables, y cinco neuronas de baja expresión podrían despolarizarse
de manera confiable a niveles subumbrales. La capacidad de alterar fácilmente
la duración del pulso de luz sugiere que un método sencillo para provocar
picos, incluso en múltiples neuronas que tienen diferentes densidades de
corriente de ChR2, implicaría valorar la duración del pulso de luz hasta que se
obtengan picos únicos de manera confiable en todas las neuronas que se
iluminan. La modulación de la intensidad de la luz también permitiría este tipo
de control.
Trenes de picos precisos provocados por una serie de pulsos
de luz El control preciso descrito anteriormente planteó la posibilidad de
generar patrones de picos arbitrarios, incluso imitando la actividad neuronal
natural. Para probar esta posibilidad, generamos una serie de pulsos de luz,
cuyos tiempos se seleccionaron de acuerdo con una distribución de Poisson,
comúnmente utilizada para modelar picos naturales. Una sola neurona del
hipocampo podría disparar trenes de picos repetibles en respuesta a múltiples
entregas de la misma serie de pulsos de luz con distribución de Poisson (Fig.
2a; respuesta a una serie repetida de pulsos de luz de 59 pulsos de duración,
con cada pulso de 10 ms). duración, y con un intervalo medio entre impulsos de l ¼picos
100 ms).
de 5 a 30 Hz (Fig. 3a; aquí probado con series de veinte pulsos de luz de
Estos trenes de picos impulsados ópticamente fueron muy consistentes en
entregas repetidas de la misma serie de pulsos de luz: en promedio, el 495%
de los pulsos de luz en una serie provocaron picos durante un ensayo si y solo
si provocaron picos en un segundo ensayo, para ambos la serie l ¼ 100 ms
(Fig. 2a) y una segunda serie (intervalo medio l ¼ 200 ms) que comprende 46
picos (Fig. 2b; n ¼ 7 neuronas). Aumentamos la duración del pulso de luz
hasta que se obtuvo un pico confiable: usamos trenes de pulsos de luz de 10
ms para cuatro de las siete neuronas y trenes de pulsos de luz de 15 ms para
las otras tres (para los análisis de la Fig. 2, todos los datos fueron agrupados).
El jitter de prueba a prueba para cada pico individual fue muy pequeño a través
de entregas repetidas de la misma serie de pulsos de luz de Poisson (en
y la ;Figura
promedio, 2,3 ± 1,4 ms y 1,0 ± 0,5 ms para l ¼ 100 ms y l ¼ 200 ms, respectivamente latencia2c).
A lo largo de una serie de pulsos, se mantuvo la eficacia de provocar picos a
lo largo del tren (76% y 85% por ciento de pulsos de luz
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(milisegundo)
hora
pico
de
REPORTE TÉCNICO
Figura 3 Dependencia de frecuencia del
d acoplamiento entre la entrada de luz y la salida de
10
picos. (a) Trazas de voltaje que muestran picos en una
5
neurona del hipocampo sujeta a corriente provocada
por trenes de pulsos de luz de 5, 10, 20 o 30 Hz
0 0 10 20 30 (guiones grises). ( b ) Datos de población que muestran
Frecuencia de estímulo
el número de picos (de 20 posibles) evocados en las
(Hz)
neuronas del hipocampo sujetas a corriente. ( c ) Número
20 de picos extraños evocados por los trenes de pulsos de
luz, para el experimento descrito en b. ( d ) Fluctuación
10
de los tiempos de pico en todo el tren de pulsos de luz
para el experimento descrito en b . (e) Latencia al pico de
0 0 10 20 30
pico a lo largo del tren de pulsos de luz para el
Frecuencia de estímulo
(Hz) experimento descrito en b.
picos evocados con éxito, respectivamente; Fig. 2d), con pequeñas latencias
(Fig. 2e). Como otra indicación de la precisión con la que se pueden generar
picos a lo largo de toda una serie de pulsos, medimos la desviación estándar
de las latencias de cada pico en todos los picos del tren. Esta fluctuación de
pico de 'tren completo' fue bastante pequeña (3,9 ± 1,4 ms y 3,3 ± 1,2 ms; Fig.
2e), a pesar de la presunta inactivación del canal durante la entrega de una
serie de pulsos. Por lo tanto, la activación óptica pulsada de ChR2 provoca
trenes de picos precisos y repetibles en una sola neurona, a lo largo del tiempo.
Incluso en diferentes neuronas, una serie particular de pulsos de luz podría
provocar el mismo tren de picos preciso (que se muestra para tres neuronas
del hipocampo en la Fig. 2f). Aunque se puede esperar que la gran
membrana (68,8 ± 22,6 pF) y resistencia (178,8 ± 94,8 MO), introduzca una
variabilidad significativa en sus respuestas eléctricas a la fotoestimulación, la
fuerte no linealidad de el acoplamiento de picos de luz dominó esta variabilidad.
De hecho, diferentes neuronas respondieron de manera similar a una serie de
pulsos de luz dada, con 80–90% de los pulsos de luz en una serie provocando
picos en al menos la mitad de las neuronas examinadas (Fig. 2g). Para
comparar cuantitativamente la confiabilidad de la provocación de picos en
diferentes neuronas, para cada pulso, calculamos la desviación estándar de las
latencias de picos (inestabilidad) en todas las neuronas. Sorprendentemente,
esta fluctuación entre neuronas (3,4 ± 1,0 ms y 3,4 ± 1,2 ms para los pulsos en
los trenes de l ¼ 100 ms y l ¼ 200 ms, respectivamente; Fig. 2h) fue similar a
la fluctuación intraneuronal medida a lo largo del serie de pulsos de luz (Fig.
2e). Por lo tanto, poblaciones heterogéneas de neuronas pueden controlarse
en conjunto, prácticamente con la misma precisión observada para el control
de neuronas individuales a lo largo del tiempo.
Habiendo establecido la capacidad de ChR2 para impulsar trenes de picos
naturalistas sostenidos, a continuación probamos la respuesta de frecuencia
del acoplamiento de picos de luz. ChR2 permitió la conducción de trenes de
10 ms). Fue más fácil evocar más picos en frecuencias más bajas que en
frecuencias más altas (Fig. 3b; n = 13 neuronas). Los pulsos de luz emitidos a
5 o 10 Hz podrían provocar trenes de picos largos (Fig. 3b), con una
probabilidad de picos que cae a frecuencias de estimulación más altas. Para
estos experimentos, los pulsos de luz utilizados fueron de 5 ms (n ¼ 1), 10 ms
(n ¼ 9) o 15 ms (n ¼ 3) de duración (los datos de las 13 celdas se agruparon
para los análisis de población de la Fig. 3 ). Como se esperaba de la
observación de que los pulsos de luz generalmente provocaban picos únicos
(Figs. 1d y 2), casi no se produjeron picos extraños durante la entrega de trenes de pulsos de
Incluso a frecuencias más altas, la fluctuación temporal en todo el tren de la
sincronización de los picos se mantuvo muy baja (típicamente o5 ms; Fig. 3d)
al pico se mantuvo constante en todas las frecuencias (B10 ms en
todo; Fig. 3e). Por lo tanto, ChR2 puede mediar picos en un rango
fisiológicamente relevante de frecuencias de activación.
1265
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REPORTE TÉCNICO

239,3 ± 113 MO para células ChR2; figura 5a; P4 0,45; n =

a Respuestas de subumbral C Transmisión sináptica excitatoria +NBQX
18 cada uno) o potencial de reposo (60,6 ± 9,0 mV para
5 herzios
5 herzios células ChR2+ versus 59,4 ± 6,0 mV para células ChR2;
Fig. 5b; P 4 0,60), cuando se mide en ausencia de luz. Esto

100 pA sugiere que en las neuronas, ChR2 tiene poca actividad

10 Hz 1s eléctrica basal o capacidad pasiva de derivación de
10 Hz
corriente. También sugiere que la expresión de ChR2 no
20mV
1s comprometía la salud celular, como indica la medición

20 hercios eléctrica de la integridad de la membrana. Como medida

20 hercios
b d
Transmisión sináptica inhibitoria
independiente de la salud de las células, tiñemos las
neuronas vivas con yoduro de propidio, un colorante que se
une al ADN y no permeable a la membrana. La expresión
+Gabazina
de ChR2 no afectó el porcentaje de neuronas que

5 herzios
absorbieron yoduro de propidio (1/56 neuronas ChR2+
frente a 1/49 neuronas ChR2; P 4 0,9 mediante la prueba

500 pA w2 ).
1s
10 Hz
Tampoco vimos núcleos picnóticos, indicativos de
degeneración apoptótica, en células que expresan ChR2
40mV
(datos no mostrados). También buscamos alteraciones en
500ms 20 hercios las propiedades eléctricas dinámicas de las neuronas. En
la oscuridad, no hubo diferencia en el cambio de voltaje
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resultante de 100 pA de corriente inyectada, ya sea en la
Figura 4 Transmisión sináptica simulada y natural evocada a través de ChR2. (a) Trazas de voltaje que muestran trenes hiperpolarización (22,6 ± 8,9 mV para las neuronas ChR2+
de despolarizaciones por debajo del umbral en una neurona del hipocampo sujeta a corriente en respuesta a trenes de versus 24,5 ± 8,7 mV para las neuronas ChR2 ).
pulsos de luz (guiones grises). ( b ) Los pulsos de luz repetidos indujeron despolarizaciones confiables. (c) Transmisión
sináptica excitatoria impulsada por pulsos de luz. El bloqueador selectivo de la transmisión glutamatérgica NBQX suprimió
neuronas; P 4 0,50) o despolarizante (+18,9 ± 4,4 mV para
estas respuestas sinápticas (derecha). (d) Transmisión sináptica inhibitoria impulsada por pulsos de luz. El bloqueador
ChR2+ frente a 18,7 ± 5,2 mV para las neuronas ChR2; P
de transmisión GABAérgico selectivo gabazina abolió estas respuestas sinápticas (derecha).
4 0,90). Tampoco hubo ninguna diferencia en el número de
picos provocados por una inyección de corriente de 0,5 s de
Activación remota de subumbrales y respuestas sinápticas Para muchos procesos +300 pA (6,6 ± 4,8 para neuronas ChR2+ versus 5,8 ± 3,5 para neuronas ChR2– ; Fig. 5c; P
neurocientíficos celulares y de sistemas (y para neuronas no activas en especies como 4 0,55).
Caenorhabditis elegans), las despolarizaciones subumbrales transmiten información Por lo tanto, ChR2 no pone en peligro significativamente la salud celular o las propiedades
fisiológicamente significativa. eléctricas basales de la neurona que se expresa.
Por ejemplo, las despolarizaciones subumbrales son potentes para activar la señalización También medimos las propiedades eléctricas descritas anteriormente, 24 h después de
de sinapsis a núcleo18, y el momento relativo de las despolarizaciones subumbrales y exponer las neuronas ChR2+ a un protocolo de pulso de luz típico (1 s de 20 Hz, 15 ms,
supraumbrales puede determinar la dirección de la plasticidad sináptica19. Pero en destellos de luz, una vez por minuto, durante 10 min). Las neuronas que expresan ChR2 y
comparación con la activación de picos, en principio es más difícil impulsar despolarizaciones expuestas a la luz tenían propiedades eléctricas basales similares a las neuronas ChR2+
(MOhm)

subliminales confiables y de tamaño preciso. El umbral agudo para la producción de potencial sin flash : las células tenían una resistencia de membrana normal (178 ± 81 MO; Fig. 5a; P
Resistencia
membrana
de Potencial
reposo
(mV)
de

de acción facilita el pico inducido por ChR2 confiable, y la dinámica de todo o nada del pico 4 0,35; n = 12 y potencial de reposo (59,7 ± 7,0 mV; Fig. 5b; P 4 0,75). La exposición a la provocados
inyección
corriente
+300
Picos
(0,5
pA)
por
de
s,
la

produce formas de onda prácticamente idénticas de pico a pico (como se ve en las Figs.
1-3), incluso en presencia de neuronas significativas. Variabilidad entre neuronas en las
propiedades eléctricas. Por el contrario, las despolarizaciones por debajo del umbral, que
operan en un régimen más lineal de voltaje de membrana, carecerán de estos mecanismos
de normalización intrínsecos. Sin embargo, las despolarizaciones subumbrales evocadas
por pulsos de luz repetidos se evocaron de manera confiable en un rango de frecuencias
(Fig. 4a), con despolarizaciones repetidas espaciadas que dieron como resultado un
coeficiente de variación de 0.06 ± 0.03 (Fig. 4b; n = 5). Por lo tanto, ChR2 se puede usar
para impulsar despolarizaciones por debajo del umbral de amplitud confiable.
luz tampoco predispuso a las neuronas a la muerte celular, según lo medido por la absorción
de yoduro de propidio de células vivas (2/75 neuronas ChR2+ frente a 3/70 neuronas ChR2-;
P 4 0,55 mediante la prueba w2 ).
Finalmente, las neuronas que expresaban ChR2 y expuestas a la luz también tenían
recuentos de picos normales provocados por la inyección de corriente somática (6.1 ± 3.9;
Fig. 5c; P 4 0.75). Por lo tanto, la integridad de la membrana, la salud celular y las
propiedades eléctricas eran normales en las neuronas que expresaban ChR2 y estaban expuestas a la luz.
aBC
400 –70 15

300 10
200
Finalmente, la transmisión sináptica también se controló fácilmente con ChR2. 5
100
De hecho, tanto los eventos sinápticos excitadores (Fig. 4c) como los inhibidores (Fig. 4d)
0 0 0
podrían evocarse en las neuronas negativas para ChR2 que reciben información sináptica ChR2+ChR2– ChR2+ChR2– ChR2+ ChR2–
ChR2+ parpadeó ChR2+ parpadeó ChR2+ parpadeó
de las neuronas que expresan ChR2.

La expresión de ChR2 tiene efectos secundarios mínimos
Llevamos a cabo amplios controles para probar si la simple expresión de ChR2 alteraría las
propiedades eléctricas o la supervivencia de las neuronas.
La expresión lentiviral de ChR2 durante al menos 1 semana no alteró la resistencia de la
membrana neuronal (212 ± 115 MO para células ChR2+ versus
Figura 5 Propiedades eléctricas basales y dinámicas de neuronas que expresan
ChR2. (a) Resistencia de la membrana de las neuronas que expresan ChR2 (negro; n =
18), que no expresan ChR2 (blanco; n = 18) o que expresan ChR2 y medido 24 h
después de la exposición a un protocolo típico de pulso de luz (gris; n = 12) . (b) Potencial
de reposo de membrana de las mismas neuronas descritas en a. ( c ) Número de picos
evocados por una despolarización de 300 pA de las mismas neuronas descritas en a.

1266 VOLUMEN 8 [ NÚMERO 9 [ SEPTIEMBRE 2005 NATURALEZA NEUROCIENCIA

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DISCUSIÓN Al
combinar los mejores aspectos de enfoques anteriores que utilizan la luz para
impulsar los circuitos neuronales, la tecnología descrita aquí demuestra un control
de voltaje significativamente más rápido que los métodos previos de fotoestimulación
genéticamente codificados8–11. En particular, el método ChR2 no se basa en
sustratos químicos sintéticos ni en la ortogonalidad genética del transgén y el
organismo huésped. Aunque la molécula de ChR2 requiere el cofactor todo trans
retinal para la transducción de luz12, no se agregó todo trans retinal al medio de
cultivo ni a la solución de grabación para ninguno de los experimentos descritos
aquí. Los niveles de fondo de retinal pueden ser suficientes en muchos casos;
además, el suplemento de medio de cultivo de uso común B-27 que se usa aquí
(ver Métodos) incluye acetato de retinilo, y la suplementación adicional con todo
trans retinal o sus precursores puede ayudar en la aplicación de ChR2 para el
estudio de circuitos neuronales en diversos entornos de tejido.
Utilizamos la entrega de luz pulsada para aprovechar al máximo la cinética rápida
y la alta conductancia de ChR2. Esta estrategia fue posible con interruptores ópticos
rápidos, pero también serían suficientes otros equipos cada vez más comunes,
como los láseres pulsados. A diferencia de la estimulación eléctrica, la liberación de
glutamato20–22 y los métodos de excitación con láser de alta potencia23, el ChR2
puede orientarse genéticamente para permitir el sondeo de subclases de neuronas
específicas dentro de un circuito neuronal heterogéneo, evitando las fibras de paso
y la estimulación simultánea de múltiples tipos de células.
Debido a que ChR2 está codificado por un único marco de lectura abierto de
solo 315 aminoácidos, es factible expresar ChR2 en subpoblaciones específicas de
neuronas en el sistema nervioso a través de métodos genéticos que incluyen
vectores lentivirales (como hemos hecho) y en ratones transgénicos, lo que permite
el estudio de la función de tipos individuales de neuronas en circuitos neuronales
intactos e incluso in vivo. Los promotores específicos de células permitirán la
orientación de ChR2 a varios subtipos neuronales bien definidos, lo que permitirá la
exploración futura de su función causal en la conducción de la actividad neuronal
aguas abajo (medida mediante técnicas electrofisiológicas y ópticas) y el
comportamiento animal. ChR2 también podría usarse para resolver la conectividad
funcional de neuronas particulares o clases de neuronas en circuitos intactos en
respuesta a trenes de picos naturalistas (Fig. 2) o actividad rítmica (Fig. 3), por
ejemplo, mediante el uso de preparaciones de cortes agudos después de virus
intracraneales. inyecciones
Artículos recientes han explorado los temas de la conectividad de microcircuitos
estáticos y dinámicos utilizando imágenes de calcio de actividad espontánea24,
parche de múltiples neuronas25,26 y liberación de glutamato6.
Estos estudios han reportado conexiones sorprendentemente refinadas y precisas
entre las neuronas. Sin embargo, la disección a escala más fina de microcircuitos,
a nivel de clases de neuronas definidas molecularmente (como las neuronas
corticales que expresan receptores de cannabinoides, las interneuronas positivas
para parvalbúmina o las neuronas moduladoras colinérgicas) se facilitaría en gran
medida mediante el uso de una herramienta genéticamente precisa y temporalmente
precisa. como ChR2. Esto es válido también para experimentos recientes de
microestimulación que han demostrado profundas influencias de un grupo de
neuronas en el control de la atención, la toma de decisiones o la acción2,3,27,28.
Comprender con precisión qué tipos de células contribuyen a estas funciones podría
proporcionar una gran comprensión de cómo se calculan a nivel de circuito. Debido
a que la potencia de luz requerida para la activación de ChR2 (8–12 mW/ mm2) es
bastante baja, es posible que ChR2 sea una herramienta eficaz para estudios in
vivo de mapas de circuitos y comportamiento, incluso en mamíferos. Finalmente, la
transducción de luz eficaz y segura con un solo componente biológico natural
también podría satisfacer las necesidades biotecnológicas, en estudios de alto
rendimiento de transducción de señales dependientes de la actividad y programas
de expresión génica, por ejemplo, para guiar la diferenciación de células madre29 y
la detección de fármacos que modulan respuestas neuronales a la despolarización.
Por lo tanto, la tecnología descrita aquí puede cumplir el objetivo buscado durante
mucho tiempo de un método para la detección no invasiva, genéticamente dirigida y temporalmente
registro. La solución intracelular constaba de (en mM) 97
NATURE NEUROSCIENCE VOLUMEN 8 [ NÚMERO 9 [ SEPTIEMBRE 2005
REPORTE TÉCNICO
control preciso de la actividad neuronal, con aplicaciones potenciales que van desde
la neurociencia hasta la ingeniería biomédica.
MÉTODOS
Construcciones de plásmidos. El gen ChR2-YFP se construyó mediante la fusión en marco de
EYFP (Clontech) con el extremo C de los primeros 315 residuos de aminoácidos de ChR2
(número de acceso de GenBank AF461397) a través de un sitio NotI. El vector lentiviral pLECYT
se generó mediante amplificación por PCR de ChR2-YFP con cebadores 5¢-
GGCAGCGCTGCCACCATGGATTATGGAGGCGCCCTGAGT-3¢ y 5¢-
GGCACTAGTCTATTACTTGTACAGCTCGTC-3¢ y unión en pLET (obsequio de E. Wexler y T.
Palmer, Universidad de Stanford) a través de los sitios de restricción AfeI y SpeI. El plásmido
se amplificó y luego se purificó usando kits MaxiPrep (Qiagen).
Producción viral. Se produjeron lentivirus pseudotipados VSVg mediante transfección triple de
células 293FT (Invitrogen) con pLECYT, pMD.G y pCMVDR8.7 (obsequios de E. Wexler y T.
Palmer) utilizando Lipofectamine 2000.
El protocolo de producción de lentivirales es el mismo que el descrito anteriormente30 excepto
por el uso de Lipofectamine 2000 en lugar de la precipitación con fosfato de calcio.
Después de la cosecha, los virus se concentraron por centrifugación en un rotor SW28
(Beckman Coulter) a 20 000 rpm durante 2 ha 4 1C. FACS determinó que el título viral
unidades infecciosas estaba entre 5 (UI) por ml. 108 y 1 concentrado 109
Cultivo de células de hipocampo. Se retiraron los hipocampos del día postnatal 0 (P0) de ratas
Sprague Dawley (Charles River) y se trataron con papaína (20 U/ml) durante 45 min a 37ºC.
La digestión se detuvo con 10 ml de MEM/sales de Earle sin L-glutamina junto con glucosa 20
mM, extensor de suero (1:1000) y suero bovino fetal inactivado por calor al 10 % que contenía
25 mg de albúmina de suero bovino (BSA) y 25 mg de inhibidor de tripsina. El tejido se trituró
en un pequeño volumen de esta solución con una pipeta Pasteur pulida al fuego y se sembraron
células B100.000 en 1 ml por cubreobjetos en placas de 24 pocillos. Los cubreobjetos de vidrio
(prelavados durante la noche en HCl seguido de varios lavados con etanol al 100 % y
esterilización con llama) se recubrieron durante la noche a 37 °C con Matrigel 1:50 (Collaborative
Biomedical). Las células se sembraron en medio de cultivo: Neurobasal que contenía 2 B-27
(Life Technologies) y Glutamax-I 2 mM (Life Technologies). El suplemento de medio de cultivo
B-27 contiene acetato de retinilo, pero B-27 no estuvo presente durante el registro y no se
añadió todo trans retinal al medio de cultivo o al medio de registro para ninguno de los
experimentos descritos.
La mitad del medio se reemplazó con medio de cultivo al día siguiente, dando una concentración
sérica final de 1,75%.
Infección viral. Los cultivos de hipocampo se infectaron el día 7 in vitro (DIV 7) usando
diluciones en serie cinco veces de lentivirus (B1 106 UI/ml). Se agregaron diluciones virales a
cultivos de hipocampo sembrados en cubreobjetos en placas de 24 pocillos y luego se incubaron
a 37 °C durante 7 días antes de la experimentación.
Imágenes confocales. Las imágenes se adquirieron en un microscopio confocal Leica TCS-SP2
LSM utilizando una lente de inmersión en agua 63. Se tomaron imágenes en vivo de las células
que expresaban ChR2-YFP usando la configuración del microscopio YFP, en una solución de
Tyrode que contenía (en mM) NaCl 125, KCl 2, CaCl2 3, MgCl2 1, glucosa 30 y HEPES 25 (pH
7,3 con NaOH).
La tinción con yoduro de propidio (Molecular Probes) se llevó a cabo en células vivas
agregando 5 mg/ml de yoduro de propidio al medio de cultivo durante 5 min a 37 1C, lavando
dos veces con solución Tyrode y luego contando inmediatamente el número de células ChR2+
y ChR2 que tomaron . yoduro de propidio. A continuación, los cubreobjetos se fijaron durante 5
min en PBS + paraformaldehído al 4 %, se permeabilizaron durante 2 min con Triton X-100 al
0,1 % y luego se sumergieron durante 5 min en PBS que contenía 5 mg/ml de yoduro de
propidio para la detección de núcleos picnóticos. Se examinaron al menos ocho campos de
visión por cubreobjetos.
Electrofisiología y métodos ópticos. Las neuronas del hipocampo cultivadas se registraron
aproximadamente en DIV 14 (7 días después de la infección). Las neuronas se registraron por
medio de pinza de parche de células enteras, utilizando amplificadores Axon Multiclamp 700B
(Axon Instruments) en un alcance invertido Olympus IX71 equipado con una lente de 20
objetivos. Las resistencias de las pipetas de vidrio de borosilicato (Warner) fueron B4 MO,
rango 3–8 MO. La resistencia de acceso fue de 10 a 30 MO y se controló durante todo el
1267
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REPORTE TÉCNICO
gluconato de potasio, 38 KCl, 0,35 EGTA, 20 HEPES, 4 ATP de magnesio, 0,35 GTP de sodio, 6
NaCl y 7 fosfocreatina (pH 7,25 con KOH). Las neuronas se registraron en solución de Tyrode
(arriba). Todos los experimentos se realizaron a temperatura ambiente (22–24 1C). Para todos los
experimentos, excepto los datos de transmisión sináptica que se muestran en la Figura 4b,c,
parcheamos células fluorescentes sumergidas en una solución de Tyrode que contenía NBQX 5
mM y gabazina 20 mM para bloquear la transmisión sináptica.
Las fotocorrientes se midieron mientras se mantenían las neuronas en tensión de fijación a 65
mV. La recuperación de la inactivación se midió midiendo fotocorrientes mientras se iluminaban
las neuronas con pares de pulsos de luz de 500 ms de duración, separados por períodos de
oscuridad que duraban de 1 a 10 s.
El pico se midió mientras se inyectaba corriente para mantener el voltaje de la celda en
aproximadamente 65 mV (corriente de mantenimiento que oscilaba entre 0 pA y 200 pA).
Para los experimentos de transmisión sináptica, parcheamos neuronas no fluorescentes cerca de
las neuronas que expresan ChR2, sumergidas en solución de Tyrode que contenía gabazina 20
mM para aislar la respuesta postsináptica excitatoria o en NBQX 5 mM para aislar la respuesta
postsináptica inhibitoria. Para confirmar si los potenciales evocados fueron realmente impulsados
sinápticamente, después de la fotoestimulación, bloqueamos todos los receptores postsinápticos
con una solución que contenía gabazina 20 mM y NBQX 5 mM y volvimos a realizar la
fotoestimulación.
Se usó el software pClamp 9 (Axon Instruments) para registrar todos los datos, y se usó un
interruptor óptico de alta velocidad DG-4 con lámpara de xenón de 300 W (Sutter Instruments) para
entregar los pulsos de luz para la activación de ChR2. Se usó un conjunto de filtros Endow GFP
(filtro de excitación HQ470/40, dicroico Q495LP;
de ChR2.
Chroma)
YFPpara
se visualizó
suministrar
con
luzunazul
conjunto
para ladeactivación
filtros
YFP estándar (excitación HQ500/20, dicroico Q515LP, emisión HQ535/30 m; Chroma). A través de
una lente de objetivo 20, la densidad de potenciaun
demedidor
la luz azul
de potencia
fue de 8 a(Newport).
12 mW/mm2, medida con
Las series de pulsos se sintetizaron mediante un software personalizado escrito en MATLAB
(MathWorks) y luego se exportaron a través de pClamp 9 a través de una placa Digidata (Axon)
conectada a una PC. Los trenes de Poisson se generaron en MATLAB mediante la creación de
series de pulsos con intervalos entre pulsos seleccionados de forma independiente de una
distribución de Poisson con media l. Los trenes de Poisson tenían 8 s de largo, con un intervalo
medio de l ¼ 100 o 200 ms. Para el realismo biofísico, se impuso un período refractario mínimo de
10 ms entre pulsos de luz consecutivos.
La resistencia de la membrana se midió en modo de fijación de voltaje con pasos de
despolarización de 20 mV que duraron 75 ms. Las tasas de picos debido a la inyección de corriente
continua se midieron con pasos de corriente de 300 pA que duraron 0,5 s.
Análisis de los datos. Los datos se analizaron utilizando Clampfit (Axon) y un software personalizado
escrito en MATLAB. Los picos se extrajeron buscando cruces de voltaje de un umbral (típicamente
60 mV por encima del potencial de reposo), y las latencias se midieron desde el inicio del pulso de
luz hasta el pico del pico. Los picos extraños se midieron como el número de picos adicionales
después de un solo pulso de luz, más cualquier pico que ocurriera después de 30 ms después del
inicio de un pulso de luz.
La fluctuación se calculó como la desviación estándar de las latencias de los picos, medida en
todos los picos a lo largo de un tren de picos (jitter de "entrenamiento completo"), o para un pico
particular en diferentes trenes (al medir la confiabilidad de prueba a prueba, o a través de diferentes
neuronas). Para la visualización de los datos de población, se promediaron la fluctuación de fase a
lo largo del tren y la fluctuación de prueba a prueba en todas las neuronas, y la fluctuación de
neurona a neurona se promedió en todos los picos. Para todos los análisis de fluctuación, se
ignoraron los pulsos de luz que no lograron provocar un pico. Para el análisis de fluctuación entre
neuronas que se muestra en la Figura 2h, se ignoraron los pulsos de luz que no provocaron picos
en las siete neuronas (dejando 31/59 pulsos de luz para el estímulo de l ¼ 100 ms y 30/46 pulsos
de luz para el estímulo de l ¼ estímulo de 200 ms).
AGRADECIMIENTOS Nos
gustaría agradecer a L. Meltzer y N. Adeishvili por su asistencia experimental; C. Niell, C. Chan
y JP Levy por sus útiles debates y D. Ollig por su ayuda técnica. EB y GN cuentan con el apoyo
de Max-Planck-Society y reconocen una subvención de la Fundación Alemana de Investigación
(DFG) en la unidad de investigación 472 (Molekulare Bioenergetik). ESB cuenta con el apoyo
de la Fundación Helen Hay Whitney, la Fundación del Premio Dan David y el Instituto Nacional
de Sordera y Otros Trastornos de la Comunicación, y FZ cuenta con el apoyo de una beca
predoctoral de los Institutos Nacionales de Salud de EE. UU. KD cuenta con el apoyo del
Instituto Nacional de Salud Mental, el Departamento de Bioingeniería de Stanford, el
Departamento de Psiquiatría y Ciencias del Comportamiento de Stanford, el Departamento de
Neurociencia
1268
Institute de Stanford, la Alianza Nacional para la Investigación de la Esquizofrenia y la
Depresión y las Fundaciones Culpeper, Klingenstein, Whitehall, McKnight y Albert Yu y Mary
Bechmann.
DECLARACIÓN DE INTERESES EN
COMPETENCIA Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Recibido el 12 de mayo; aceptado el 26 de julio
de 2005 Publicado en línea en http://www.nature.com/natureneuroscience/
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