Manual LMFFL 2022 - Final - Alumnos

Facultad de Farmacia
Imagen alusiva al manual correspondiente
Laboratorio Modular de
Formas Farmacéuticas Líquidas
Sexto Semestre
Autores:
M. C. Angélica Ortega García
M. C. Lorena Uribe Toledo
Dra. Angélica Meneses Acosta
Dr. Efrén Hernández Baltazar
M. C. Nancy Moreno Linares
Colaborador:
Dr. Jorge Armando Moreno Escobar
Universidad Autónoma del Estado de Morelos

Última modificación Agosto 2018
2 Manual del Laboratorio Modular de Formas Farmacéuticas Líquidas
INDICE
Presentación general del manual del laboratorio de Formas Farmaceúticas 7
Líquidas.
Contribución del laboratorio a las competencias del Licenciado en Farmacia 8
Reglamento para los Laboratorios de la Facultad de Farmacia de la UAEM 9
Medidas de seguridad para el desarrollo de las prácticas del Laboratorio 11
Modular de Formas Farmaceúticas Líquidas.
Consideraciones éticas y de sustentabilidad 11
Manejo de desechos 12
Organización del trabajo en el Laboratorio Modular de Formas Farmaceúticas 14
Líquidas.
Características del Registro de Resultados y Reporte del Laboratorio 15
Mecanismos de evaluación. 17
Práctica 1. Esterilización de material del vidrio y preparación de medio de 19
cultivo LB líquido y sólido
Práctica 2. Generación de un banco de células bacterianas competentes 28
Práctica 3. Verificación de la integridad de la construcción molecular. 39
Práctica 4. Transformación de células competentes, selección de clonas 53
positivas y evaluación de la integridad del plásmido.
Práctica 5. Ligación de Fragmentos de ADN. 67
Práctica 6. Cultivo para producción. 77
Práctica 7. Fabricación de solución inyectable 93
Práctica 8. Soluciones oftálmicas 104
Práctica 9. Jarabes 127
Práctica 10. Emulsiones y suspensiones 140
Práctica 11. Geles Farmaceúticos y cosméticos 153
Práctica 12 Sistemas no convencionales (matrices, reservorios y 170
micropartículas de liberación).
Facultad de Farmacia 2
Manual del Laboratorio Modular de Formas Farmacéuticas Líquidas 3
Práctica 12 B. Sistemas no convencionales (Reservorios) 177

Práctica 12C. Sistemas no convencionales (Micropartículas) 184
3 Facultad de Farmacia
PRESENTACIÓN GENERAL DEL MANUAL DEL LABORATORIO DE FORMAS

FARMACEÚTICAS LÍQUID AS
El Laboratorio Modular de Formas Farmacéuticas Líquidas integra los conocimientos
adquiridos en los cursos teóricos de Biotecnología Farmacéutica y de Formas Farmacéuticas
Líquidas a través del desarrollo de prácticas que contemplan tanto el desarrollo de un
proyecto biotecnológico como la aplicación de tecnología farmacéutica durante la formulación
del producto a lo largo de todo el semestre. Dicho proyecto comprende el análisis de cada una
de las etapas de un proceso biotecnológico a nivel laboratorio involucrando para la producción
de un biofármaco de interés así como su respectiva formulación. Consideramos que este
trabajo junto con las bases teóricas proporcionarán los conocimientos suficientes para cursos
posteriores de los Paquetes Terminales de Biotecnología Farmacéutica y Tecnología
Farmacéutica además de brindar información sobre procesos integrales de punta dentro del
área farmacéutica.
Este manual fue diseñando para que el alumno de sexto semestre sea capaz de comprender,
desarrollar y analizar de manera integral los datos generados por un proceso de un producto
biotecnológico a través de un proyecto que contemplará varias de las etapas involucradas a lo
largo del semestre. Para ello, las primeras prácticas consideran la etapa “upstream” o
“corriente arriba” de un proceso biotecnológico general, tales como la generación de la cepa o
línea celular recombinante, la preparación de material, la esterilización y la preparación de
medios de cultivo. El objetivo de esta etapa es que el alumno se familiarice con las técnicas
involucradas en la tecnología del ADN recombinante así como con el concepto de esterilidad y
que conozca los requerimientos nutricionales específicos del sistema biológico, ya que dichos
conceptos son la base del desarrollo de un buen proceso. Posteriormente, se plantea realizar
la bioconversión bajo diferentes condiciones de aireación para obtener como biofármaco un
plásmido de interés o una proteína recombinante. El sistema biológico empleado serán
bacterias por la facilidad de manipulación así como por el costo. El objetivo de esta etapa es
que el alumno conozca y caracterice las diferentes cinéticas de crecimiento y producción del
compuesto respectivo. Por último, se plantea el análisis experimental de los productos
generados durante la bioconversión mediante técnicas separación tales como la

electroforesis, así como el análisis matemático de los datos generados en la cinética de
crecimiento.
Una vez que el biofarmaco ha sido diseñado, el alumno tendrá la oportunidad de incorporarlo
en las formulaciones líquidas que están disponibles en el mercado. Aprenderán a analizarlas
bajo los parámetros establecido por la Farmacopea Mexicana y pondrán en marcha su
creatividad para el diseño de etiquetas.
Con ello, al finalizar el curso, el alumno habrá adquirido la habilidad de manejar un sistema
biológico para la obtención de biofármacos así como las respectivas fórmulaciones líquidas
que son empleadas actualmente dentro de la industria farmacéutica.
REGLAMENTO PARA LOS LABORATORIOS DE LA F ACULTAD DE FARMACIA.

ARTÍCULO 1. El presente Reglamento es aplicable en todos los laboratorios de la Facultad de
Farmacia en donde se realice trabajo experimental, sea de docencia o de
investigación. Su observancia es obligatoria para el personal académico,
alumnos y trabajadores administrativos y no excluye otra reglamentación que
resulte aplicable.
ARTÍCULO 2. Es necesario que el personal que trabaja en cada laboratorio conozca el
sistema de alertamiento, las zonas de seguridad, las rutas de evacuación, el
equipo para control de incendios y las medidas de seguridad establecidas en
cada laboratorio.
ARTÍCULO 4. Todas las actividades que se realicen en los laboratorios deberán estar
supervisadas por un responsable (Profesor, Técnico Académico, Coordinador de
Laboratorios, Investigador, etc.)
ARTÍCULO 5. Al realizar actividades experimentales, nunca deberá estar una persona sola en
los laboratorios. El mínimo de personas deberá ser, invariablemente, de 2. En
caso de que uno de ellos sea alumno, deberá haber siempre un profesor como
segunda persona.
ARTÍCULO 6. Las mesas de trabajo deberán estar libres de cualquier objeto extraño al
experimento (mochilas, libros, etc.). Los usuarios deberán abstenerse de dejar
en el lugar de trabajo, cosas de valor a la vista.
ARTÍCULO 9. En los laboratorios queda prohibido: fumar, jugar, consumir alimentos o
bebidas, el uso de lentes de contacto, el uso de zapatos abiertos.
ARTÍCULO 11. Todas las sustancias, equipo, materiales, etc., deberán ser manejados con el
máximo cuidado, atendiendo a las indicaciones de los manuales de uso o de los
manuales de seguridad, según el caso.
ARTÍCULO 12. Para transferir líquidos con pipetas, deberá utilizarse la pro-pipeta
correspondiente. Queda prohibido pipetear con la boca.
ARTÍCULO 13. Las puertas de acceso y salida de emergencia deberán de estar siempre
libres de obstáculos, accesibles y en posibilidad de ser utilizadas antes cualquier
eventualidad. El responsable del área (Coordinador de laboratorio, Técnico
académico, Investigador, Personal de Protección Civil), deberá verificar esto, al
menos una vez cada semana.
ARTÍCULO 22. Queda prohibido desechar sustancias al drenaje. Cualquier otro medio de
eliminación, requiere previa autorización del responsable del área
correspondiente.
ARTÍCULO 32. Cada laboratorio de investigación deberá tener un Reglamento Interno de
Higiene y Seguridad, complementario al presente Reglamento; los cuales serán
de observancia obligatoria.
MANEJO DE DESECHOS.
La Facultad de Farmacia maneja la disposición final de residuos generados en sus
laboratorios de docencia. En el Laboratorio Modular de Formas Farmaceúticas Líquidas se
generaran las siguientes categorías de residuos:
Residuos químicos líquidos, aquí se encuentran las soluciones amortiguadoras, soluciones
fisiológicas, residuos de alcohol (No tóxicos), soluciones de hidróxido, ácidos concentrados ó
diluidos, bromuro de etidio (Tóxico y corrosivos).
Residuos químicos sólidos, aquí se encuentran generalmente guantes, puntas que

contienen soluciones de hidróxido, ácidos concentrados ó diluidos, bromuro de etidio, (Tóxico
y corrosivos); las puntas que han sido utilizadas con soluciones amortiguadoras, soluciones
fisiológicas o alcohol, se lavan perfectamente con agua y jabón para ser reutilizadas para fines
de docencia.
Residuos Peligrosos biológicos infecciosos, aquí se encuentran generalmente cepas ó
restos celulares producto de la purificación de plásmidos.
Residuos sólidos sin ningún riesgo, aquí ubicamos el material biológico sobrante, es decir,
se llevó a las instalaciones de los laboratorios y no se usó, los estudiantes no desean
conservar, puede ser colocado en la basura municipal.
Los residuos líquidos deben ser colocados en un recipiente de plástico, separando los tóxicos
de los no tóxicos. Los residuos sólidos tóxicos y corrosivos se colocan en una bolsa de
plástico blanca o transparente; mientras que los residuos biológicos infecciosos deben ser
colocados en una bolsa roja y conservados en refrigeración. Todos los residuos deben ser
etiquetados de acuerdo a las especificaciones establecidas por el laboratorio en donde se
generan.
NOTA: Los experimentos de biología molecular que se llevarán a cabo, generarán residuos
que contienen bromuro de etidio (cancerígeno), es obligatorio disponer recipientes exclusivos
para su manejo, así como es obligatorio el uso de guantes destinados solo para esta
actividad. Eliminar residuos, puntas y tubos que hayan estado en contacto con bromuro de
etidio en bolsas plásticas para su disposición final. Evitar tocar mesas y material libre de
bromuro con guantes contaminados.
CARACTERISTICAS DEL REGISTRO DE RESULTADOS Y REPORTE DE

LABORATORIO.
Cada profesor establecerá su forma de trabajo, sin embargo el manual puede ser usado como
bitácora ya que tiene espacio suficiente para incluir anotaciones, y contiene tablas de
resultados. Por lo tanto en la bitácora debe estar anotada la fecha de trabajo, cálculos,
diagramas de flujo, observaciones, discusión de resultados, conclusiones, cuestionario

resuelto.
Los reportes de prácticas pueden ser entregados individual o en equipo, es a libre cátedra del
profesor. A continuación se presentan las características generales del informe final de una
práctica.
El informe final de una práctica tiene el objetivo demostrar que los estudiantes del equipo han
desarrollado un conjunto coordinado de actividades a partir de sus conocimientos teóricos del
tema de la práctica, que les ha permitido diseñar el experimento y realizar las mediciones
adecuadas; que luego han llevado a cabo el tratamiento y el análisis de sus datos para
obtener la discusión de resultados cuya validez son capaces de delimitar. A partir de esta
experiencia los estudiantes son capaces de discutir y elaborar sus conclusiones y
recomendaciones para mejorar la realización de la práctica o podrán, alternativamente,
laborar una crítica fundamentada para demostrar la invalidez de las teorías o de los
procedimientos seguidos en la realización de la práctica, de ser el caso. El reporte de cada
una de las prácticas será entregado por EQUIPO, el orden de las hojas será el siguiente:
a) Portada.
Debe incluir: nombre de la facultad, nombre de la materia, nombre y número de la práctica,
nombre del alumno, nombre de la profesora, fecha de realización de la práctica y fecha de
entrega de ésta.
b) Objetivo.
Son las metas a corto plazo que se deben cubrir durante el desarrollo de la actividad
experimental. Los objetivos están proporcionados en el manual.
c) Introducción.
Deberá contener el propósito de los experimentos, además del principio teórico de los
mismos. Este manual proporciona una introducción para cada una de las prácticas que deberá
ser COMPLEMENTADA por los alumnos. En esta sección se puede incluir la descripción
química y biológica del sistema utilizado. Debe ser considerada una investigación realizada en
la bibliografía, analizada y descrita de manera concreta con las ideas de los integrantes del
equipo.
d) Materiales y Reactivos.
Enlistar todos los materiales utilizados en la realización de la práctica. Anotar también el
material que fue utilizado de más del que ya venía en el manual proporcionado o sí éste fue
cambiado.
e) Procedimiento experimental (Metodología).
Deberá de ser breve, claro y suficientemente completo para que los experimentos puedan ser
reproducibles. De igual manera si es que hubo algún cambio en el método para realizar la
práctica anotar las modificaciones que se hicieron. Ya en conclusiones y discusión se anotará
el porqué del cambio. La Metodología tendrá que estar en forma de diagrama de flujo.
f) Resultados.
Los resultados pueden ser presentados en forma de texto, tabla y/o figura. Al analizar
detenidamente los resultados, el alumno decidirá qué forma de reporte es la más adecuada.
g) Discusión.
La discusión deberá de estructurarse a partir de la interpretación de los resultados. En esta
sección deberá de indicarse que resultados eran esperados, porqué, y los resultados
obtenidos como se comprarán a los esperados. Sí los resultados son diferentes, discutir los
factores que pudieran influir en los resultados. Para llevar a cabo la discusión, se debe revisar
de manera amplia información relacionada con el tema estudiado.
h) Conclusión.
La conclusión debe estructurarse tomando en cuenta el objetivo de la práctica, los resultados
obtenidos y la discusión.
i) Cuestionario.
Se deberán responder las preguntas generadas en al final de cada práctica, que está
relacionado con los fundamentos, la relevancia de los resultados o la metodología utilizada. Si
la práctica no incluye preguntas, cada integrante del equipo debe diseñar 3 con sus
respectivas respuestas.
j) Bibliografía.
Libros y páginas web consultadas, también se deben incluir artículos si fue el caso. La
bibliografía consultada para realizar la introducción y contestar el cuestionario, deberá de
incluir autor(es), título, editorial (o revista), edición (volumen y número cuando es revista),
editorial (sólo para libros), año de publicación y páginas consultadas. Consultar el formato
APA para usarlo como base.
PRACTICA 1. ESTERILIZACIÓN DE MATERIAL DE VIDRIO Y PREPARACIÓN DE

MEDIO DE CULTIVO LB LÍQUIDO Y SÓLIDO.
OBJETIVOS ACADÉMICOS:
 Conocer el manejo correcto de la autoclave así como la correcta preparación de
material que se utilizará bajo condiciones de esterilidad.
 Preparar y esterilizar el material de laboratorio así como el medio de cultivo para llevar
a cabo la propagación de las células bacterianas DH5α a utilizar para la producción de
plásmidos.
COMPETENCIAS PARTICULARES:
Aprende a expresar la concentración de una sustancia en una solución preparando soluciones
molares que serán útiles durante todas las prácticas. Así mismo, conoce los procesos que
garanticen trabajar bajo condiciones estériles, las cuales son necesarias para un asegurar un
proceso biotecnológico adecuado.
INTRODUCCIÓN:
De acuerdo a la OECD la biotecnología es la aplicación multidisciplinaria de diferentes
ciencias (biológicas, ingenieriles, económicas y legales) para la producción de un bien o
servicio utilizando organismos vivos silvestres, modificados o partes de ellos, los cuales son
útiles dentro de las áreas de la salud, de la alimentación y del medio ambiente.
La producción de compuestos en general ocupa sistemas vivientes en pueden ser desde una
bacteria hasta animales transgénicos pasando por hongos y levaduras, plantas, y cultivo de
células vegetales y de células animales, entre los más comerciales. Cada sistema tiene
requerimientos muy específicos de cultivo así como condiciones óptimas para su crecimiento,
por lo que al ser utilizados como organismos productores es necesario brindarles el ambiente
adecuado in vitro para que la generación de los compuestos sea posible. De ahí que el
estudio de los medios de cultivo sea una de las ramas más desarrolladas en biotecnología
(Fernández, 1994).
Además, para garantizar que solamente el sistema productor escogido sea el que se
desarrolle en el cultivo es necesario garantizar el trabajo con material estéril y en condiciones
asépticas. Este requerimiento diferencía a los procesos biotecnológicos de la industria
química y además incrementa los costos de producción. Si bien el calor húmedo y seco son
dos de los procesos más utilizados para esterilizar, actualmente el diseño de nuevos sistemas
de filtración estéril está ganando mercados en este tipo de industria (Romero, 2007; Tortora,
et al., 2007).
La esterilización involucra la eliminación de organismos contaminantes ya sea por medio de
su remoción (p. Ej. filtración) o causando su muerte (radiaciones,calor, uso de agentes
químicos). Este concepto se diferencía de la desinfección y (Murray et al., 2006; Stanier, y
Villanueva, 1996).
ACTIVIDADES PRELIMIN ARES:

Para comprender mejor algunos conceptos, revisa los siguientes videos:
 Preparación material esterilización: www.youtube.com/watch?v=Nw5DkCnVEWw
 Procedimientos de esterilización por autoclave:
www.youtube.com/watch?v=mqwDezAH59I
MATERIALES Y REACTIVOS:
CANTIDAD MATERIAL CANTIDAD REACTIVOS
2 Matraces de 250 mL 20 mL Etanol 70%

2 Vaso de precipitado 50 mL Agua destilada
Vaso de precipitado de 600
1 40 g Triptona de carne
mL
1 Pipeta de 10, 5 y 1 mL 20 g NaCl
2 Agitadores magnéticos 20 g Extracto de levadura
1 Espátula 75 L Kanamicina 50 mg/mL
10 Cajas de Petri estériles CaCl2

3 *Papel estraza Glicerol
1 *Algodón
1 Cinta testigo
6 *Gasas
Parrilla eléctrica con
1
calentamiento y agitación
1 Balanza analítica
1 Mechero Fisher
1 Agitador de vidrio
Refrigerador
Autoclave
Frasco de vidrio vacío (De
3
preferencia jugo jumex)
* Este material deberá ser proporcionado por el estudiante.
TOXICOLOGÌA:
Ninguno de los materiales utilizados es tóxico y dañino para el organismo.
METODOLOGÍA:
Actividad 1: Esterilización de material de vidrio.
1. Limpiar el área de trabajo con etanol 70%. Esto se debe llevar a cabo durante todas las
sesiones de laboratorio.
2. Lavar perfectamente todo el material de vidrio y enjuagar con agua destilada dos veces.
Escurrir el material por 30 min a temperatura ambiente.
3. Secar con calor seco a 80°C por 1 h.
4. Elaborar tapones de algodón para matraces e introducir algodón en la boquilla de las
pipetas.
5. Colocar algodón en el extremo de succión de las pipetas y envolverlas en papel de estraza

si no se cuenta con pipeteros. Indicar el volumen de cada pipeta sobre la envoltura.
6. Marcar todo el material con un pedazo pequeño de cinta testigo.
7. Esterilizar en una autoclave por 15 minutos a 120ºC y 15 psi.
Actividad 2: Preparación del medio líquido y sólido.

1. Formulación de 1 L de medio LB sólido: 10 g de peptona de carne, 5 g de NaCl, 5 g de
extracto de levadura y 15 de agar.
2. Preparar 50 mL de medio LB sólido sin antibiótico, 50 mL de LB sólido con antibiótico, 100
mL de medio LB líquido separado en: 6 tubos de cónicos de 50 mL con 5 mL de medio LB
cada uno; un matraz Erlenmeyer de 125 mL con 45 mL de medio LB; el resto del medio LB
esterilizarlo en un frasco de vidrio de reuso marca jumex de preferencia.
3. Pesar la masa necesaria de cada uno de los ingredientes para preparar el medio. Es
importante recordar que el medio líquido carece de agar.
4. Colocar en un vaso de precipitado de 250 mL, 100 mL de agua destilada. Adicionar cada
reactivo por separado. Una vez disuelto, adicionar el siguiente. Aforar al volumen final
correspondiente con agua destilada. El agar se adiciona en el matraz en donde se va
esterilizar el medio.
5. Colocar un tapón de algodón a cada matraz y cubrir con papel aluminio. Pegar un pedazo
de cinta testigo.
6. Esterilizar los matraces en una autoclave por 15 minutos 120ºC a 15 psi.
7. Cuando el medio sólido alcance una temperatura de 40°C (al colocar el matraz en la palma
de la mano, la temperatura de este debe ser soportable), vaciar 25 mL en una caja Petri en la
mesa bajo el mechero Fisher. Dejar a que el medio se solidifique. Sellar las cajas con
parafilm. Almacenar a 4°C hasta su uso.
8. Para preparar el medio sólido con kanamicina, se utiliza un stock a 50 mg/mL (50,000
g/mL). Cuando el medio sólido haya alcanzado una temperatura de 40°C (temperatura
soportable en la palma de la mano del operador). Adicionar la cantidad necesaria del Stock de
kanamicina a 50 mg/mL, para alcanzar una concentración final de 50 µg/mL. Dejar que el
medio se solidifique a temperatura ambiente. Sellar las cajas con parafilm. Almacenar a 4°C
hasta su uso. El antibiótico es estable por un mes.
Actividad 3: Preparación de CaCl2, NaCl y glicerol estéril.

1. Realizar los cálculos para preparar 20 mL de CaCl2 0.1 M. Preparar la solución y colocarlo
en un tubo de centrífuga de 50 mL. Esterilizarlo junto con el resto del material.
2. Realizar los cálculos para preparar 20 mL de NaCl 0.9%. Preparar la solución y colocarlo en
un tubo de centrífuga de 50 mL. Esterilizarlo junto con el resto del material.
3. En un tubo de centrífuga de 15 mL, colocar 3 mL de glicerol concentrado. Esterilizarlo junto
con el resto del material.
4. En un frasco de vidrio colocar aproximadamente 200 mL de agua destilada. Esterilizarlo
junto con el resto del material.
RESULTADOS:
Realizar un diagrama donde se explique todos los pasos que se llevaron a cabo durante la
práctica, mencionando la importancia de cada uno de ellos. Para ello los alumnos tendrán que
tomar fotografías de cada etapa.
CÁLCULOS
Registrar los cálculos que hayan sido necesarios realizar en el desarrollo del trabajo práctico.
MANEJO ESPECÍFICO DE RESIDUOS GENERADOS:

El papel, algodón o gasa que se genere como residuo y que no haya estado en contacto con
ningún residuo deberá ser depositado en la basura municipal, de lo contrario debe ser
dispuesto en la bolsa roja de Residuos Peligrosos Biológico Infecciosos.
Todo el medio líquido que no se esterilice debe ser depositado en un contenedor para
Residuos Líquidos Biológico Infecciosos. Si se llegase a generar un residuo que contiene
bacterias, adicionar cloro al 10% para inactivar por 30 min y finalmente disponerlo en el
contenedor Residuos Líquidos Biológico Infecciosos.
DISCUSIÓN DE RESULTADOS:
Hablar sobre la importancia de esterilizar material de laboratorio durante un proceso
biotecnológico. Cuáles son las ventajas de mantener la esterilidad de este tipo de procesos.
Discutir acerca de la importancia de colocar previamente cinta testigo a los materiales que se
esterilizan.
Definir los conceptos de limpieza, asepsia y esterilización, así como la importancia de
asegurar que los materiales y reactivos hayan sido correctamente esterilizados.
CONCLUSIONES:
Mencionar las diversas opciones con las que se cuenta el laboratorio para la esterilización de
material (si éstas han sido usadas).
Hacer hincapié en la limpieza previa que se debe realizar en la preparación de materiales, los
cuidados extremos que se deben tener cuando no se cuenta con una campana de flujo
laminar y las pruebas de esterilidad realizadas a los medios de cultivo preparados.
CUESTIONARIO:
1. ¿Por qué se utiliza algodón en las boquillas de las pipetas, y en los tapones de los
matraces?
2. ¿Por qué el proceso de esterilización está establecido en una autoclave a 15 minutos
120ºC a 15 psi? Investigar que organismos pueden utilizarse como estándares para
comprobar el funcionamiento de un autoclave.
3. Investigar las diferencias entre asepsia, desinfección y esterilización.
4. Comparar la composición del medio de cultivo que utilizaste (Luria Betani) con respecto a
los medios: Dextrosa Saboraud, Murashige y Skoog y DMEM-F12, especificando el tipo de
sistema biológico que se cultiva en cada uno de ellos.
BIBLIOGRAFIA:
Fernández M. (1994). Avances en ingeniería genética. Consejo Superior de Investigaciones
Científicas. Madrid, España.
Murray, P.R., Rosenthal, K.S., Pfaller, M.A. (2006). Microbiología médica. (5a Ed.). Barcelona,
España: Elsevier Mosby.
Romero CR. (2007). Microbiología y parasitología humana. Bases etiológicas de las
enfermedades infecciosas y parasitarias. (3a Ed.). México: Médica Panamericana.
Stanier, R. Y., Villanueva, J. R. (1996). Microbiología. (2a Ed.). España: Reverté.
Statistical Definition of Biotechnology, updated in 2005. Disponible en
http://www.oecd.org/sti/biotech/statisticaldefinitionofbiotechnology.htm
Tortora, G. J., Funke, B. R., Case, C. L. (2007). Introducción a la microbiología. (9a Ed.)
Argentina : Médica Panamericana.
PRACTICA 2. GENERACIÓN DE UN BANCO DE CÉLULAS BACTERIANAS

COMPETENTES
 Generar un banco de células competentes de Escherichia coli DH5alfa (E. coli DH5α)
usando CaCl2.
 Conocer y utilizar el método de congelación usando glicerol como crioprotector para la
conservación de la cepa de E. coli DH5α.
Aprende el concepto de estado de competencia bacteriana indispensable para que ocurra el
fenómeno de transformación, lo cual garantiza que el material genético exógeno pueda ser
introducido en una célula bacteriana. Así mismo, conoce los métodos y los agentes
comúnmente utilizados para preservar cultivos que garanticen la viabilidad y supervivencia de
los microorganismos por un periodo de tiempo considerable sin alterar la información genética
de dichas células.
INTRODUCCIÓN:
Una de las metodologías rutinarias en los laboratorios que desarrollan ingeniería genética es
la preparación de células competentes. Las células competentes reciben este nombre debido
a que la pared celular es disminuida al mínimo para poder permitir el paso del material
genético exógeno. Éstas pueden ser almacenadas y usarse para la propagación de vectores
de interés. Hay varios métodos para preparar células competentes pero el más utilizado es el
que se realiza con cloruro de calcio ya que es eficiente, barato y generalmente se obtienen
células con altos niveles de transformación. El principio de este método consiste en que el
calcio desestabiliza la membrana externa de bacterias Gram-negativas dejándolas
susceptibles a la entrada de macromoléculas (Pierce, 2009; Tortora et al., 2007).
Por otra parte, la criopreservación permite el mantenimiento de diferentes tejidos a

temperaturas bajas; su objetivo es minimizar el daño en los diferentes materiales biológicos,
como tejidos, células eucariotas, bacterias, hongos y virus durante la congelación y el
almacenamiento. Un principio básico de la criopreservación es que la cantidad del daño
provocado por la congelación depende de la cantidad de agua libre en el sistema y la
capacidad de dicha agua de cristalizar durante la congelación; el agua es el principal
componente de todos los sistemas vivos y debe estar presente dentro de la célula para que se
produzcan las reacciones químicas del metabolismo. Durante la congelación, la mayoría del
agua se transforma en hielo, cesando el metabolismo celular. La formación de hielo se inicia
en el medio extracelular, lo que provoca un aumento de la concentración de sales debido a la
disminución del agua cuando ésta se transforma en hielo, es decir, se produce un
desequilibrio osmótico. Entonces el agua sale de las células por ósmosis y se produce una
deshidratación celular, la cual puede ir en detrimento de una posterior recuperación celular.
Para evitar el daño celular por el congelamiento se utilizan agentes criopreservantes. Los
principales criopreservantes son el DMSO y el glicerol. Sin embargo también pueden usarse
sales, como el cloruro magnésico los dextranos, glicoles, el almidón o los azucares
(Hernández et al., 2003; Timmerhaus, 1972). Estos agentes crioconservantes protegen a las
células que se congelan lentamente mediante uno o más de los siguientes mecanismos:
Eliminando las elevadas concentraciones de sales.
 Reduciendo el encogimiento celular a una determinada temperaturas.
 Reduciendo la fracción de la solución congelada a una determinada temperatura.
 Minimizando la formación de hielo intracelular.
La formación de hielo puede eliminarse completamente tanto del interior de las células
como de la matriz extracelular mediante la utilización de criopreservantes a muy elevadas
concentraciones (al menos 50% v/v). La combinación de diferentes criopreservantes puede
producir un efecto sinérgico, provocando un incremento de la viabilidad celular (Baust y
Baust., 2007; Bronzino et al., 2005) y aunque todos ellos no poseen características
químicas comunes, se suelen dividir en dos categorías:
 Criopreservantes intracelulares con bajo peso Molecular que hacen permeables las
células; por ejemplo el glicerol o el dimetil sulfóxido a concentraciones entre 0,5M y 3M
son efectivos minimizando el daño celular (Bronzino, 2000).
 Criopreservantes extracelulares con pesos Moleculares relativamente altos
(mayores o iguales que el de la sacarosa) que no penetran en las células. Estos son
más efectivos protegiendo sistemas biológicos que se congelan a tasas muy rápidas.
Aunque algunos de estos agentes tienen un efecto protector sobre la membrana
celular, parece ser que el mecanismo primario de acción es la inducción de la
vitrificación: formación de cristales extracelulares (Baust y Baust, 2007; Bronzino,
2000).

Investigar que técnicas pueden ser empleadas para generar células competentes.
Investigar el funcionamiento que tienen el glicerol y el DMSO como agentes
criopreservadores.
1 Matraz de 125 mL esteril Etanol 70%

Micropipetas de 0.5-10 µL,
1 Agua destilada
20-200 µL y 100-1000 µL
Cajas de puntas para
1 Medio LB líquido
micropipetas
Tubos de centrífuga de 15 Medio LB sólido sin
5
mL antibiótico
1 Asa bacteriológica 20 mL CaCl2 0.1 M estéril
2 Celdas para Etanol absoluto
espectrofotómetro
Tubos de vidrio con Glicerol concentrado
5 20 mL
taparosca de 10ml estériles estéril
Vaso de precipitado de 250
1 20 mL NaCl 0.9% estéril
mL
microtubos de 1.5 mL
40 *Hielo
estériles
Cepa bacteriana: E. coli
Parafilm
DH5α
1 Piceta
1 Microcentrífuga
1 Ultracongelador -80°C
1 Incubadora
1 Agitador orbital
1 Espectrofotómetro
Mechero Fisher
Cinta testigo
*En caso de no contar con hielo el alumno deberá proporcionarlo, debido a la importancia para
el desarrollo de esta actividad.
TOXICOLOGÌA:
Ninguno de los insumos utilizados es tóxico o dañino para el organismo.
METODOLOGÍA:
Previo a la realización de los siguientes protocolos es importante revisar la parte de
actividades preliminares.
Actividad 1: Reactivación de cepas: DH5 y pVAX1 en medio sólido y líquido.
a) Reactivación en medio sólido (realizarlo en la primera práctica)

1. En la práctica 1, prepararán cajas Petri con medio LB con y sin antibiótico. El profesor les
proporcionará una caja con la cepa DH5 y otra caja con la cepa pVAX. Sembrar por estría
cruzada en cada una de las cajas de acuerdo a la cepa. Recuerda que la cepa DH5requiere
crecer en medio LB sin antibiótico y la cepa pVAX requiere LB con antibiótico.
2. Incubar las cajas a 37°C por 12 h. Posteriormente almacenar las cajas a 4°C hasta su
utilización.
b) Reactivación en medio líquido (realizarlo un día antes de la segunda práctica)

1. En condiciones estériles, inocular 5 mL de Medio LB con una colonia de células bacterianas
DH5α previamente reactivadas en medio LB sólido una semana anterior.
2. Crecer el cultivo por 12 h en una incubadora con agitación a 37°C a 200 rpm.
Actividad 2: Generación de un banco de células bacterianas competentes.

NOTA: todo el experimento debe llevarse a cabo con material estéril y se debe llevar
junto al mechero asegurando un área de trabajo estéril.
1. Adicionar 5 mL del cultivo bacteriano DH5α que creció durante toda la noche, a 45 mL de
medio LB líquido contenido en un matraz Erlenmeyer de 125 mL. Incubar a 37°C por 2 h.
2. Medir la absorbancia (A) del cultivo a 600 nm en un espectrofotómetro. El valor de la
Absorbancia (A) debería encontrarse entre 0.4-0.5 unidades. Registrar el valor de A indicado
por el equipo. Si los parámetros no se cumplen, aún así iniciar el protocolo para células
competentes.
3. Rotular 4 microtubos de 1.5 mL estériles con: nombre de cepa, fecha de elaboración,
número de equipo y grupo. Incluir el número de banco asignado al equipo. Colocar en hielo
molido para que se enfríen.
4. Colocar en cada microtubo 1.2 mL del cultivo en condiciones estériles. Centrifugar a 2500
rpm por 5 min a temperatura ambiente. Eliminar el sobrenadante, succionando con la punta de
la micropipeta.
5. Colocar los tubos conteniendo el botón celular en hielo. Añadir 500 L de CaCl2 0.1 M
estéril y frío.
6. Resuspender los tubos con mucho cuidado, utilizar solamente la yema del dedo índice.
Incubar en hielo por 15 min.
7. Centrifugar los tubos por 5 min a 2000 rpm a una temperatura de 4°C.
8. Colocar los tubos en hielo. Eliminar el sobrenadante, succionando con la punta de la
micropipeta.
9. Observa la tabla 2. En ella se propone el tratamiento asignado a cada banco. Este
tratamiento será asignado por equipo. El Banco 1, es el banco control. Por lo que el equipo
que trabaje con este banco deberá seguir las indicaciones al pie de la letra:
9a. Añadir 50 L de CaCl2 0.1 M frío. Resuspender los tubos con mucho cuidado,
utilizar solamente la yema del dedo índice.
9b. Añadir a los microtubos 10 µL de glicerol concentrado y estéril. Mezclar
suavemente. Colocar en hielo.
10. Para el resto de los bancos, los volúmenes no se modifican, pero el CaCl 2 0.1 M frío debe
ser reemplazado por NaCl 0.9% frío, y el glicerol es reemplazado por agua destilada estéril
fría.
11. Almacenar los tubos en un ultracongelador a -80°C.
12. Después de 2 meses de almacenamiento a -80°C o a -20°C en su defecto, colocar en
hielo por 5 min un tubo de cada banco.
13. Asegurándose que las células han sido descongeladas. Sembrar por el método de estría
cruzada, cada cepa en una caja de Petri con medio LB sólido. Es importante utilizar un aza
graduada.
14. Incubar las cajas a 37ºC por 12 h. Observar el crecimiento en cada una de las cajas.
Tabla 2. Propuesta de Bancos de las células DH5α para analizar el efecto del criopreservante.
Banco 1 (Control) Banco 2:
CaCl2 CaCl2
Glicerol Agua destilada
Banco 3: Banco 4
NaCl NaCl
Glicerol Agua destilada
NOTA: Para ver el efecto del CaCl 2 0.1 M frío, sobre la interacción del plásmido con las
células DH5α, y el efecto de glicerol en la preservación de las células se generaran cuatro
bancos diferentes. El CaCl 2 se sustituye por el NaCl y el glicerol se sustituye por el agua.
RESULTADOS:
Explicar los resultados relacionados con el crecimiento celular analizando las placas de cultivo
que fueron preservadas con glicerol, con respecto a las que no. Para ver el efecto del CaCl 2
0.1 M frío, sobre la interacción del plásmido con las células DH5a, recuerda utilizar todas las
células congeladas para la transformación.
Identifica si hay alguna diferencia entre el crecimiento de la cepa en función de las
condiciones de la preparación del banco células.
Es muy importante tomar fotografías de todos los pasos descritos en el protocolo, así como de
los resultados obtenidos.
CALCULOS

El papel, algodón o gasa que se genere como residuo y que no haya estado en contacto con
ningún residuo deberá ser depositado en la basura municipal.
Todo el medio líquido que no contenga bacterias debe ser depositado en un contenedor para
Residuos Biológico Infecciosos.
Todo medio, o material de plástico que estuvo en contacto con bacterias debe ser colocado en
un recipiente con una solución de hipoclorito de sodio al 10%. Incubar por 30 minutos y
desechar en contenedores dispuestos para Residuos Peligrosos Biológicos Infecciosos. Los
plásticos que hayan estado en contacto con cepas, puedes ser desechados a RPBI´s sólidos;
de lo contrario pueden ser lavados con agua y jabón, enjuagados con agua destilada para ser
reutilizados.
que fueron preservadas con glicerol, con respecto a las que no. Para ver el efecto del CaCl 2
0.1 M frío, sobre la interacción del plásmido con las células DH5α, recuerda utilizar todas las
células congeladas para la transformación.
Establecer la discusión con base a los métodos que se utilizan para transformar bacterias.
Considera el fundamento teórico y cuál es el más utilizado.
CONCLUSIONES:
Hacer hincapié en la importancia de utilizar un criopreservante y su efecto sobre la viabilidad
analizada bajo las condiciones experimentales del procedimiento utilizado.
Generar una hipótesis sobre la diferencia que existe entre el banco de células que contiene
CaCl2 y el resto para la aceptación del plásmido durante el proceso de transformación.
CUESTIONARIO:
1. ¿Cuáles son los métodos de criopreservación más comunes y con mayor aplicación en
Biotecnología?
2. ¿Por qué utilizamos a la bacteria E. coli DH5α? ¿Qué otras cepas de E. coli se pueden
utilizar?
3. ¿Por qué se utiliza CaCl2 en el procedimiento de preparación de células competentes?
4. Menciona las diferentes técnicas que existen para mantener las membranas porosas y
permeables al ADN (estado de competencia), para su posterior transformación.
BIBLIOGRAFIA:
Baust, J. G., y Baust, J. M. (2007). Advances in biopreservation, New York: Taylor and Francis
Group CRC,.
Bronzino, J. D. (2000). Biomedical Engineering Handbook. (2a Ed.) Florida, USA: CRC Press
publish in cooperation with IEES Press..
Fuller, B. J., Lane, N., y Benson, E. E. (2005). Life in frozen State. Washintong DC.: CRC
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Hernández, A., Alfaro, I., Arrieta, R. (2003). Microbiología Industrial. Costa Rica: Universidad
Estatal a Distancia EUNED.
Pierce, B. A. (2009). Genética: un enfoque conceptual. (3a Ed.). Madrid, España: Médica
Panamericana.
Timmerhaus, K. D. (1972). Advances in Cryogenic Engineering: A Collection of Invited Papers
and contributed papers presented at national technical meetings during 1970 and 1971.
Engineering Reseach Center, University of Colorado. Springer Science Business Media, pp
116.
Tortora, G. J., Funke, B. R., Case, C. L. (2007). Introducción a la Microbiología. (9a Ed.)
Madrid, España: Médica panamericana Introducción a la microbiología
PRACTICA 3. VERFICACIÓN DE LA INTEGRIDAD DE UN VECTOR PLASMÍDICO

DE EXPRESIÓN
 Realizar la purificación de un plásmido bacteriano utilizando el método de lisis alcalina.
 Determinar la cantidad y grado de pureza de plásmido obtenido mediante
espectrofotometría.
 Evaluar la linearidad y el patrón de digestión específico de la construcción molecular
utilizando enzimas de restricción y su verificación en un gel de agarosa.
Identifica y conoce la función de cada uno de los elementos génicos esenciales de los
vectores plasmídicos, que permite la construcción molecular correcta de un vector de
clonación o de expresión, los cuales pueden ser empleados para obtener un alto número de
copias del ADN recombinante o la generación de nuevos productos respectivamente. Así
mismo, conoce los procesos de purificación, cuantificación, análisis e identificación de ADN
plasmídico recombinante, lo cual permite optimizar los procesos de producción a nivel
industrial.
INTRODUCCIÓN:
Los plásmidos son moléculas de DNA extracromosómico, circular y generalmente de pequeño
tamaño que se encuentran en muchas especies bacterianas y que se pueden replicar de
manera independiente del DNA cromosómico. Estos elementos extracromosomales no son
necesarios para la viabilidad general de la célula, pero pueden contener genes que
contribuyen a la supervivencia en condiciones especiales, como los que confieren resistencia
a antibióticos, a metales, etc. Algunas clases de plásmidos poseen además la propiedad
conocida como "replicación relajada", esto es, están presentes en forma de muchas copias
por célula, lo que facilita enormemente su aislamiento y purificación (Brown, 2008).
Los plásmidos son de singular interés en Ingeniería Genética por ser uno de los sistemas
vectores más sencillos de usar. Un vector de clonación es un sistema que permite introducir
en una célula hospedera un fragmento de DNA que se pretende clonar; en esta célula
hospedera el vector se replica y/o expresa según sea la naturaleza del plásmido. La molécula
que resulta de la unión de un vector con el DNA de interés (denominado entonces "inserto")
se denomina molécula de vector recombinante (Berg et al., 2007; Murray et al., 2009).
Para ser utilizado como vector de clonación, un plásmido ideal debe poseer al menos tres
características: 1) Debe tener su propio origen de replicación y por tanto la capacidad de
replicación autónoma independiente del genoma del hospedero. 2) Debe tener sitios de
clonación múltiple que permitan la apertura del DNA con enzimas de restricción y hacer
posible la clonación de insertos de DNA en la forma y orientación determinada. 3) Debe
poseer marcadores genéticos seleccionables que permitan aislar las células hospederas que
contengan el vector; por ej. la presencia en el plásmido del gen de resistencia a ampicilina
permite seleccionar las bacterias que portan estos plásmidos, gracias a su capacidad para
crecer en presencia de dicho antibiótico (el gen de resistencia codifica una beta lactamasa,
enzima que degrada la ampicilina). La mayoría de los plásmidos naturales no cumplen todas
estas condiciones, por lo que por medio de Ingeniería Genética se ha realizado la
construcción de plásmidos artificiales, combinando en una misma molécula diversos rasgos
útiles procedentes de los plásmidos naturales (Brown, 2008).
La manera más común para hacer que el material genético de interés pueda ser unido al
plásmido vector es generando extremos compatibles. Para ello, una excelente herramienta es
el uso de enzimas de restricción. Las enzimas de restricción usadas en la generación de
cortes y mapas de restricción dentro de las técnicas de Ingeniería Genética, fueron
identificadas como los sistemas de restricción tipo II de algunas bacterias y tienen la función
de cortar el material genético al identificar una secuencia muy específica de pares de bases
en el ADN, la cual puede ir desde 4 hasta 12. Cada enzima de restricción reconoce una
secuencia característica, lo que ha permitido su uso en la ingeniería genética. Los cortes
realizados por dichas enzimas pueden dar extremos lisos (romos o truncados) o cohesivos.
Dependiendo del trabajo de ingeniería genética desarrollado es que se utilizan cualquiera de
ellos. Para lograr que el gen de interés sea insertado en el vector de interés es importante que
el corte se realice con la misma enzima de restricción para lograr la complementaridad de
bases (en el caso de tener extremos cohesivos) y que la construcción sea exitosa. Además,
las enzimas de restricción tienen otros usos tales como la identificación de las construcciones
moleculares con base al tamaño del fragmento y en la identificación de polimorfismos (Berg et
al., 2007; Sambrook y Russell, 2001; Puerta y Ureña, 2005).

Investigar los tipos de plásmidos utilizados en la ingeniería genética así como sus
propiedades.
Investigar las secuencias de reconocimiento de las siguientes enzimas de restricción: EcoRI,
XhoI, KpnI.
Micropipetas de 0.5-10 µL,

1 100 mL *Agua inyectable
20-200 µL y de 100-1000 µL
Caja de puntas para
1 20 mL * Solución I
micropipetas estériles
20 Microtubos de 1.5 mL 10 mL NaOH 10 N
10 Microtubos de 0.6 mL 10 mL SDS 10% p/v
1 Piceta 20 mL * Solución II
Celda cuarzo para
1 20 mL * Solución III
espectrofotómetro
1 Vaso de precipitado 250 mL 20 mL Etanol
Incubadora a 37°C 1 mL Kanamicina 50 mg/mL
Mechero Fisher 500 mL Buffer TAE 1X
Centrífuga para tubos de 15 Bromuro de etidio 10

20 L
mL mg/mL
Marcador de Peso
Microcentrífuga 10 L
Molecular (1Kb)
Fuente de poder para
100 L 5X Buffer de carga
cámara de electroforesis
Espectrofotómetro 4 mg Agarosa
Cámara de electroforesis Enzimas de Restricción
5 L
horizontal EcoRI y XhoI
Transluminador UV 2.4 g Tris Base
6 mL Ácido acético
10 g EDTA
*Solución I. Dextrosa 50 mM, Tris 25 mM y EDTA 10 mM. Ajustar pH 8 y Esterilizar en autoclave 15 psi por 20
minutos. Almacenar a 4oC.
*Solución II. (Se prepara en el momento de utilizarla). 400 µL Agua destilada, 500 µL SDS 10% y 100 µL NaOH
10 N.
*Solución III. Acetato de potasio 5 M 6 mL, Ácido acético 1.15 mL y Agua destilada 2.85 mL. Ajustar pH 4.8.
Esterilizar en autoclave 15 psi por 20 minutos. Almacenar a 4oC.
TAE 10X (500 mL):24.52 g Tris base, 5.7 mL Ácido acético, 10 mL EDTA 0.5 M pH 8.0
TOXICOLOGÌA:
BROMURO DE ETIDIO
Propiedades Físicas y Químicas Generales:
El bromuro de etidio es un agente intercalante usado comúnmente como marcador de ácidos
nucleicos. Cuando se expone esta sustancia a luz ultravioleta, emite una luz roja-anaranjada,
que se intensifica unas 20 veces después de haberse unido a una cadena de ADN.
El bromuro de etidio tiene la siguiente fórmula química C21H10BrN3, tal como la mayoría de los
compuestos fluorescentes, es una sustancia aromática, cuya apariencia es de color rojo.
Tiene un peso molecular de 394.294 g/mol. La mayor parte de la molécula es una estructura
tricíclica con grupos amino-benceno en cada lado de una molécula piridínica (seis átomos,
conteniendo nitrógeno y un anillo aromático). Esta estructura dibenzopiridínica es conocida
con el nombre de fenantridina.
Riesgos a la salud:
El bromuro de etidio es una sustancia fuertemente mutagénica y es irritante a los ojos, piel,
mucosas y el tracto respiratorio. Los efectos sanitarios de la exposición a este compuesto no
han sido todavía investigados profundamente. Posee efectos como agente cancerígeno y
teratogénico por su cualidad de mutagenicidad. Si se ingiere, se inhala o se absorbe por la
piel, esta sustancia puede tener efectos nocivos.
Primeros Auxilios:
Si se derrama sobre los ojos o la piel, lavar con abundante agua durante 15 minutos usando
una ducha de seguridad o un lavaojos. Si se inhala o se ingiere se debe buscar ayuda médica
urgentemente. Para derrames, use un absorbente para secar el bromuro de etidio. Limpiar
también cualquier traza de esta sustancia en estado sólido con mucha precaución e
intentando no crear polvo. Elimínese la sustancia en un contenedor hermético y entréguese,
debidamente etiquetado, al personal calificado en el manejo de residuos químicos.
METODOLOGÍA:
Es importante saber que el plásmido de expresión pVAX1/EGFP fue construido a partir del
vector PVAX1 (Figura 1), a continuación se describen algunas de sus características:
El vector pVAX1 (3.0 kb), contiene un gen del promotor CMV; un sitio del promotor T7; un sitio
múltiple de clonación; una señal de poliadenilación del gen de la hormona de crecimiento
bovino [(BGH) para eficientar la terminación de la transcripción y de poliadenilación del
ARNm]; un gen de resistencia a kanamicina; y, un sitio de replicación bacteriano (origen pUC).
El vector pVAX1/EGFP (3.8 kb) posee los mismos elementos que el vector pVAX1, además
del gen de la proteína verde fluorescente mejorada (EGFP, Enhanced Green Florescent
Protein).
Figura 1. Plásmido pVAX1 y plásmido pVAX1/EGFP
1 2 3 4 5
4000 pb
1000 pb
500 pb
Figura 2. Digestión del plásmido pVAX1/EGFP.

Se indica la muestra de cada carril: 1. Marcador de peso molecular de ADN: 1 kb marca Fermentas Cat.
SM0311; 2. Plásmido pVax1-EGFP sin digerir; 3. Plásmido pVax1-EGFP digerido con enzima Xho I; 4. Plásmido
pVax1-EGFP digerido con enzima EcoR I; 5. Plásmido pVax1-EGFP digerido con enzima Kpn I.
En la figura 2, se muestran el ensayo de restricción de 1 g de plásmido pVAX1/EGFP con las

enzimas XhoI, EcoR I y Kpn I. Los fragmentos recuperados corresponden a los tamaños
indicados en el mapa de la figura 1. Las enzimas Xho I y Kpn I, sólo tienen un sitio de corte.
Su uso da lugar a un plásmido linearizado. La imagen muestra que aún después de 3 h de
digestión, ésta fue parcial lo que significa que se debió utilizar menos cantidad de plásmido.
La digestión con la enzima EcoR I, da dos fragmentos uno correspondiente al vector (3000 pb)
y otro correspondiente al gen EGFP (761 pb).
Actividad 1: Purificación del Plásmido pVAX1/EGFP utilizando el método de lisis

alcalina.
1. Una noche antes de desarrollar la actividad colocar en dos tubos de centrífuga de 50 mL
estéril, 5 mL de medio LB con 50 µg/mL de kanamicina y una colonia de la cepa
pVAX1/EGFP.
2. Incubar a 37ºC con una agitación de 250 rpm durante 12 h aproximadamente.
3. Centrifugar 1 mL del cultivo en 2 microtubos de 1.5 mL a 12000 rpm durante 1 min a
temperatura ambiente.
4. Retirar el sobrenadante cuidadosamente de todos los tubos haciendo uso de la micropipeta.
Repetir los pasos 3 y 4 hasta que el volumen del cultivo se agote.
5. Resuspender el botón celular final en 150 µL de Solución I (Ver el apartado de Materiales y
Reactivos) e incubar 5 minutos a temperatura ambiente.
6. Agregar 150 µL de solución II preparada al momento(Ver el apartado de Materiales y
Reactivos). En esta etapa, se lleva a cabo la desnaturalización de proteínas y lisis celular.
Mezclar cuidadosamente por inversión tres veces. Incubar a temperatura ambiente por 5
minutos. Observar como el líquido se pone turbio.
7. Agregar 150 µL de la solución III previamente almacenada a 4ºC (Ver el apartado de
Materiales y Reactivos). Observar el aspecto del tubo, aparecerá una turbidez blanca al
precipitar las proteínas y el DNA cromosómico. Mezclar por inversión durante 10 segundos.
Incubar 5 minutos a temperatura ambiente.
8. Centrifugar por 5 minutos a 13000 rpm. Los restos celulares son recuperados en el fondo
del tubo. El sobrenadante contiene ADN plasmídico y RNA.
9. Recuperar el sobrenadante, con mucho cuidado para evitar llevarse residuos sólidos.
Colocar el sobrenadante en un microtubo de 1.5 mL estéril y limpio.
10. Agregar 1 mL de Etanol al 96% almacenado a 4ºC. Mezclar por inversión 6 veces. Incubar
a temperatura ambiente por 2 min. Centrifugar a 11,000 rpm durante 10 minutos.

11. Eliminar el sobrenadante por aspiración con la punta de la micropipeta. Asegurarse de que
no queda etanol en las paredes del microtubo.
12. Lavar el botón por inversión con 1 mL de etanol al 70% frío (4ºC) durante 60 s.
13. Centrifugar a 11,000 rpm durante 5 minutos. Eliminar cuidadosamente el sobrenadante
por aspiración con la punta de la micropipeta. Repetir el lavado del paso 12 una vez más.
14. Decantar el sobrenadante. Invertir los tubos sobre papel secante por 15 min a temperatura
ambiente, hasta que se haya evaporado cualquier residuo de etanol.
15. Resuspender el ADN plasmídico en 30 µL de Agua MiliQ estéril y adicionar 2 µL de una
solución de RNAsa a 20 µg/mL. Incubar a 37°C por 1 h.
16. Almacenar a -20ºC para su posterior utilización.
Actividad 2: Cuantificación de ADN plasmídico.

1. Para cuantificar la cantidad de ADN plasmídico obtenido es necesario realizar una dilución
1:100 con la suspensión de ADN obtenido en la Actividad 1 en agua milliQ estéril y leer en un
espectrofotómetro a una absorbancia a 260 nm y a 280nm. Utilizar agua milliQ estéril como
blanco y celdas de cuarzo. Tomar en cuenta que 1 unidad de densidad óptica (D. O.) a una
A260 nm corresponde a 50 g/mL de ADN plasmídico.
2. Para calcular el índice de pureza del plásmido purificado, calcular el siguiente cociente:
La proporción de las lecturas entre 260 nm/280 nm y 260/230 proporciona una estimación de
la pureza del ácido nucleico. Si hay contaminación con proteínas u otras soluciones
empleadas durante la extracción, no es posible cuantificar de manera precisa el DNA.
Para la relación ADN/proteínas: 260/280 nm, los valores óptimos son de ~1.8-2.0
Para la relación de ADN/sales: 260/230 nm, los valores óptimos son de 0.3-0.6
Actividad 3: Linearización del Vector PVax1-EGFP con la enzima de restricción Xho I

para la verificación del tamaño.
NOTA: La actividad 3 y 4 se deben preparar de manera simultánea.
1. Descongelar el ADN del plásmido previamente purificado y almacenado a -20oC, conservar

en hielo frappé.
2. Descongelar agua libre de DNAsas, 10X Buffer Red.
3. Preparar tres reacciones de digestión para verificar el tamaño del plásmido, dos con un
plásmido purificado durante la clase y otra con el plásmido purificado por el profesor.
4. Preparar la siguiente mezcla para una sola reacción (1X):
16.5 µL de Agua milliQ estéril libre de DNAsas o agua inyectable
2 µL de 10X Buffer Red
1 µL de ADN plasmídico. Ajustar el volumen del plásmido para alcanzar 1 µg. Por lo
tanto también se debe ajustar el volumen del agua.
0.5 µL Enzima Xho I
5. Incubar la reacción a 37°C por 1.5 a 3 h. Conservar la reacción a -20°C hasta que se vayan
a correr las muestras en un gel de agarosa al 1%.
Actividad 4: Identificación del patrón de restricción usando la enzima EcoR I.

en hielo frappé.
2. Descongelar agua libre de DNAsas, 10X Buffer EcoRI.
3. Preparar tres reacciones de digestión para verificar patrón de digestión del plásmido, dos
con un plásmido purificado durante la clase y otra con el plásmido purificado por el profesor.
16.5 µL de Agua milliQ estéril.
2 µL de 10X Buffer EcoRI
1 µL de ADN plasmídico. Ajustar el volumen del plásmido para alcanzar 1 µg. Por lo
tanto también se debe ajustar el volumen del agua.
0.5 µL Enzima EcoRI
Actividad 5: Electroforesis en gel de agarosa al 0.8 % de los plásmidos digeridos

1. Armar la base en donde se polimerizará el gel de agarosa. Colocar el peine que funciona de
molde para la formación de los pozos en donde se cargarán las muestras a separar.
2. Preparar el gel de agarosa siguiendo el siguiente procedimiento:
a) Pesar 0.4 g de agarosa y colocarlos en 50 mL de buffer TAE 1X.
b) Calentar en baño maría o directamente a mechero, idealmente en microondas
para disolver hasta disolver la agarosa. Si no hay microondas utilizar un
mechero fisher.
c) Agregar 2 µL de bromuro de etidio (10 mg/mL) al gel sin solidificar y mezclar. (El
bromuro de etidio es sumamente cancerígeno, por lo que es importante
manipularlo con cuidado y utilizar guantes en todo este proceso).
d) Agregar la solución de agarosa al molde de gel cuando la solución tenga una
temperatura de 40ºC. Dejar que solidifique a temperatura ambiente y retirar los
peines con cuidado de no romper los pozos.
3. Una vez solidificado el gel, colocarlo dentro de la cámara de electroforesis y agregar buffer
TAE 1X hasta cubrirlo.
4. Genera un mapa de carga. Incluir el marcador de peso molecular de ADN, Plásmido sin
digerir y cada una de las muestras digeridas.
5. A cada muestra adicionar 2 µL de buffer de carga 6X. El Stock del marcador de peso
molecular Lambda DNA/Hind III Marker: 1 L de marcador, 1 L Buffer de carga 6X, 4 L de
agua destilada. Mezclar suavemente, calentar a 65°C por 5 min. Enfriar en hielo por 3 min.
Cargar 6 L de la mezcla por pozo.
6. Cargar con cuidado las muestras en cada pozo, colocando 6 µL del marcador de peso
Molecular, 3 µL de plásmido sin digerir y 20 µL del plásmido digerido en pozos diferentes.
7. Correr el gel a 90 V durante aproximadamente 40 minutos o durante el tiempo suficiente
para mantener el frente del colorante muy cercano al borde del gel.
8. Una vez terminada la corrida, enjuagar el gel con agua y exponer sobre un transiluminador
de UV. Capturar la respectiva imagen para realizar el análisis del mismo comparando el
tamaño de los fragmentos obtenidos con el marcador de peso Molecular.
RESULTADOS:
Actividad 1: Purificación del plásmido. Reportar las fotografías del proceso e indicar
detalladamente que está ocurriendo en cada etapa.
Actividad 2: Cuantificación del ADN plasmídico. Reportar los valores obtenidos y calcular
los índices de pureza en la tabla 3. Indicar que importancia y que información nos proporciona
cada índice de pureza. Registra en la tabla 3 la concentración de plásmido en µg/ µL.
Tabla 3. Registro de D. O., índice de pureza y concentración del ADN plasmídico.

Muestra Dilución D.O. 260 D.O. 280 D.O. 230 R R Concentración
nm nm nm 260/280 260/230 (µg/ µL)
Actividad 3 y 4: Linearización del Vector PVAX1-EGFP con la enzima de restricción Xho

I para la verificación del tamaño y Identificación del patrón de restricción usando la
enzima EcoR I.
Reportar las fotografías del proceso y explicar cada una de las etapas que se llevaron a cabo.
Actividad 5: Electroforesis en gel de agarosa al 0.8% de los plásmidos digeridos.

Reportar la foto del gel de agarosa que contiene los plásmidos digeridos y no digeridos,
detallando el peso Molecular de los fragmentos obtenidos comparándolos con el marcador de
pesos Molecular. Indicar detalladamente que representa cada carril del gel.
MANEJO ESPECÍFICO DE RESIDUOS GENERADOS

Desechar los Residuos Peligrosos Biológico Infecciosos (RPBI) generados de la siguiente
manera: Si se trabajó con cultivo líquido, los residuos así como las puntas que estuvieron en
contacto con él, deben ser inactivadas con una solución de hipoclorito de sodio al 10%.
Incubar por 15 min a temperatura ambiente. Desechar los líquidos en un contenedor y
etiquetarlo como RPBI. Las puntas y los microtubos desecharlos en bolsa roja y etiquetarla
como RPBI.
El gel de agarosa, los guantes, así como las puntas y todo el material que haya estado en
contacto con el bromuro de etidio deben ser desechados en una bolsa de basura destinada
para residuos tóxicos sólidos. La bolsa debe ser etiquetada con la leyenda “Bromuro de etidio”
y solo manipularse con guantes dada su peligrosidad.
Discutir cada uno de los pasos realizados en el protocolo, analizando que es lo que va
pasando con la molécula de ADN plasmídico y el papel que tienen cada una de las
soluciones. Menciona abiertamente la importancia de las digestiones realizadas y su uso para
descartar clonas negativas.
Reportar la concentración y grado de pureza del plásmido purificado. ¿Es la concentración
suficiente y de la calidad adecuada para poder llevar a cabo transformaciones de las células
DH5α posteriores?
¿Qué pasaría con la absorbancia del ADN si no hubieran utilizado RNAsa? Discutir con base
a las máximas absorbancias del ADN y ARN.
¿Cuál es la idea de utilizar las enzimas Xho I y EcoRI?
¿Cuántos fragmentos se deben recuperar y cuál es el tamaño de cada uno de ellos?
¿Por qué es importante hacer un análisis de restricción después de la purificación de un
plásmido?
CÁLCULOS
CONCLUSIONES:
Genera una conclusión haciendo una triangulación de los objetivos de la práctica y los
resultados obtenidos.
CUESTIONARIO:
1. Describir los tipos de plásmidos utilizados en la ingeniería genética así como sus
propiedades.
2. Investigar el mapa genético de un plásmidos de clonación y de un plásmido usado para
expresión tanto en bacterias como en células animales. Colocar los respectivos diagramas e
identificar cada una de sus partes.
3. ¿Cuál es la nomenclatura que se sigue para nombrar una enzima de restricción?
4. Considerando que el plásmido tuviera sitios de restricción en los pares de bases: 587, 925,
2250, y 3427, indicar el número de fragmentos que se obtendrían así como su tamaño y hacer
un diagrama del gel de agarosa que se obtendría después de correr las muestras digeridas.
BIBLIOGRAFÍA:
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de
Alimentos. Extracción y Purificación de ADN. Disponible en: http://gmo-
crl.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/manuals/Manual%20ES/Sesi%C3%B3n4.pdf
Berg, J. M., Stryer, L., Tymoczko, J. L. (2007). Bioquímica. (6a Ed.) Barcelona, España:
Reverte.
Brown, T. A. (2008). Genomas. (3a Ed.) Buenos Aires, Argentina: Médica Panamericana.
Murray, P. R., Rosenthal, K. S., Pfaller, M. A. (2009). Microbiología Médica. (6ª Ed.).
Barcelona, España: Elsevier Student Consutl.
Prieto, A. M. J., López, B. J., y Pueyo, de la Cuesta, C. Purificación de ácidos nucleicos.

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus Universitario de Rabanales.
Disponible en: http://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-
mol/pdfs/37%20PURIFICACI%C3%93N%20ACS%20NUCLEICOS.pdf
Protocolos “Recipes and protocols”. Disponibles en:
http://science.marshall.edu/murraye/Recipes.htm#10X_TAE_
Puerta, B. C. J., Ureña, P. C. P. (2005). Prácticas de biología molecular. Colombia: Pontificia
Universidad Javeriana.
Sambrook, J. y Russell, D. W. (2001). Molecular cloning: Laboratory Manual. Vol 1. (3a Ed.).
New York, USA: Editorial CSHL
PRACTICA 4. TRANSFORMACIÓN DE CÉLULAS COMPETENTES, SELECCIÓN

DE CLONAS POSITIVAS Y EVALUACIÓN DE LA INTEGRIDAD DEL PLÁSMIDO.
 Transformar utilizando el método de choque térmico las células competentes de E. coli
DH5α con el plásmido pVAX1/EGFP.
 Seleccionar las clonas positivas.
 Evaluar la integridad del plásmido pVAX1/EGFP.
Conoce las técnicas y procedimientos de transferencia de ADN, específicamente el proceso
de transformación genética bacteriana, utilizando un plásmido que contiene un gen que
permite la producción de proteínas de interés y un gen de resistencia a un antibiótico, que
permite seleccionar a la bacteria transformada de otras. Así mismo, razona que para que
ocurra la transformación, la bacteria debe estar en un estado de competencia que permita la
incorporación de ADN exógeno para generar copias del mismo ADN o expresar y obtener una
proteína de interés. Finalmente, evalua la integridad del plásmido utilizando enzimas de
restricción específicas.
INTRODUCCIÓN:
Las bacterias pueden transmitir la información genética verticalmente (de madres a hijas) o de
una manera horizontal (entre bacterias que coexisten al mismo tiempo). La transferencia
vertical se realiza mediante el proceso de división celular y el reparto equitativo del
cromosoma bacteriano replicado. La transferencia horizontal se realiza entre células vecinas y
es el mecanismo a través del cual las bacterias diseminan los genes de resistencia a
antibióticos. Los vehículos mediante los cuales se transfiere el DNA horizontalmente son los
plásmidos o los fagos (Tortora, et al. 2007). Un plásmido es un elemento extracromosómico
con capacidad de autoreplicación y los fagos son virus de bacterias (Alberts y Bray, 2006;
Murray et al., 2009).
Los mecanismos de transferencia horizontal son:
 Transformación: Por este mecanismo una célula es capaz de tomar un fragmento de ADN
del medio extracelular y expresar los genes en él contenidos.
 Conjugación: Las bacterias capaces de formar el ‘’pili’’ (pelo F) puede transferir una copia
de parte de su cromosoma a otra bacteria receptora. Es un procedimiento de transmisión
sexual de información genética.
 Transducción: Cuando un virus que infecta una bacteria de forma que el ADN viral está
integrado en el de la bacteria (ciclo lisogénico) se escinde del cromosoma bacteriano (pasa a
ciclo lítico) puede llevarse consigo parte del genoma bacteriano e integrarlo en el cromosoma
de una nueva bacteria a la que infecte (Curtis y Schnek, 2008; Tortora et al., 2007).
Para que se produzca la transformación de una bacteria ésta debe encontrarse en un estado
fisiológico especial denominado competencia. Las células competentes son aquellas
susceptibles de ser transformadas y, por lo tanto, tomar un ADN externo e introducirlo en su
citoplasma. El ADN asimilado de esta forma puede expresar sus genes en la bacteria
transformada. Si este ADN externo tiene un origen de replicación funcional en la bacteria
competente puede perpetuarse al pasar a las hijas (plásmidos) (Stanier, et al., 1992).
Por fácil y eficiente, se utiliza el principio del shock térmico para producir poros en la
membrana citoplasmática, a través de los cuales se introduce el plásmido recombinante: el
ADN del plásmido recombinante es mezclado con células en estado de competencia, lo cual
se logró mediante tratamiento con CaCl 2, reciben entonces un incremento brusco de
temperatura, lo cual permite al ADN entrar a las células con cierta eficiencia. Las células son
crecidas en medio no selectivo para permitir la síntesis de las proteínas que codifica el
plásmido y las cuales le dan la resistencia al antibiótico. Posteriormente son sembradas en
placas con medio de cultivo conteniendo el antibiótico que permite la identificación de las
colonias que contienen el plásmido (Pierce, 2010).
Para la realización de esta práctica se empleará la cepa de E. coli DH5 (alfa), y el plásmido
utilizado para transformar estas bacterias será pVAX1/EGFP el cual contiene el gen de la
proteína verde fluorescente mejorada (por sus siglas en inglés EGFP). Las clonas
recombinantes de E. coli que contengan el gen que codifican para la EGFP puede ser
identificadas mediante análisis de restricción, PCR, secuenciación o expresando la proteína
en bacterias o células animales, las cuales emitirán color verde bajo el microscopio de
epifluorecencia.
Algunos plásmidos contiene el gen de la β-galactosidasa. Clonas recombinantes de E. coli
que contengan el gen que codifican para la β -galactosidasa puede ser identificadas por el
desarrollo de colonias de color azul consideradas como colonias positivas para la expresión
del plásmido. Dicha selección se basa en la actividad de la enzima β -galactosidasa (lacZ) de
E. coli y en la regulación del operón lactosa. La enzima Betagalatosidasa está formada por
dos dominios uno N-terminal pequeño (péptido alfa) y otro C-terminal (fragmento omega).
Estos dos dominios por separados no presentan actividad enzimática pero al unirse, incluso
de manera no covalente, se restablece la actividad enzimática de esta enzima, y este
fenómeno se denomina alpha complementación. Se ha tomado ventaja de este fenómeno
para construir un sistema de plásmidos que permiten la búsqueda rápida de clones
recombinantes. Estos vectores portan ADN que codifica para la subunidad alpha de la Beta-
galactosidasa bajo el promotor y el operador del operón lactosa. Cuando células de E. coli que
portan la enzima mutada en la subunidad alpha (lacZ-) son transformadas con estos
plásmidos se restablece la actividad Beta-galactosidasa. La actividad de la enzima Beta-
galactosidasa puede detectarse in vivo usando el sustrato cromogénico 5-bromo-4-chloro-3-
indolyl-b-D-galactosido (X-gal) que toma una coloración azul intenso cuando es procesado por
la enzima. Al insertarse un gen de interés, mediante biología molecular, en los plásmidos que
portan la subunidad alfa, esta secuencia se interrumpe y este fragmento no se expresa más,
por tanto las colonias que portan los plásmidos recombinantes (que portan el gen de interés)
son de coloración blanca cuando se crecen en medio sólido que contiene Xgal e IPTG.
Mientras que aquellos clones no recombinantes serán azules en este mismo medio. El
isopropylthiogalactosido (IPTG) es una molécula sintética análoga a la alolactosa que se une
eficientemente al represor del operón lactosa, convirtiéndola en un inductor del sistema
(Izquierdo, 2014).
Es importante recordar que el plásmido de expresión pVAX1/EGFP fue construido a partir del
vector PVAX1. El vector pVAX1/EGFP (3.8 kb) posee los mismos elementos que el vector
pVAX1, además del gen de la proteína verde fluorescente mejorada (EGFP, Enhanced Green
Florescent Protein). Cuando el vector pVAX1/EGFP se somete a un ensayo de restricción con
las enzimas XhoI, EcoR I y Kpn I, se recuperan tamaños que se pueden utilizar como tamaños
de reconocimiento específicos para el vector. Las enzimas Xho I y Kpn I, cada una de ellas
presenta su propio sitio de reconocimiento dando lugar a un plásmido linearizado. La digestión
con la enzima EcoR I, da dos fragmentos uno correspondiente al vector (3000 pb) y otro
correspondiente al gen EGFP (761 pb).

Verificar tener por lo menos 2 cajas de medio LB sólido con kanamicina por equipo. Este
procedimiento puede ser revisado en la práctica 1.

Microtubos de 1.5 mL
10 30 mL Medio LB líquido
estériles
Micropipeta 20-200 µL y de Cajas con LB
1 5
100-1000 µL Kanamicina 50 g/mL
1 Vaso de precipitado 250 mL 1 mL
DH5 alfa competente
10 Tubos centrífuga de 15 mL 5 L Plásmido pVAX1/EGFP
Perlas de vidrio estériles en
30 tubos de centrífuga de 15 1 kg *Hielo molido
mL
1 Asa bacteriológica 100 mL Agua inyectable
20 Microtubos de 1.5 mL 20 mL Solución I

10 Microtubos de 0.6 mL 10 mL NaOH 10 N
1 Termómetro 10 mL SDS 10% p/v
1 Mechero Fisher 20 mL Solución II
Celda cuarzo para
1 20 mL Solución III
espectrofotómetro
1 Baño maría 20 mL Etanol
1 Piceta 1 mL Kanamicina 50 g/mL
1 Parrilla de calentamiento 500 mL Buffer TAE 1X
Bromuro de etidio 10
1 Espectrofotómetro 20 L
mg/mL
Cámara de electroforesis Marcador de Peso
1 10 L
horizontal Molecular (1Kb)
1 Microcentrífuga 100 L 5X Buffer de carga
1 Centrífuga refrigerada 2g Agarosa
Enzimas de Restricción
1 Incubadora 3 L
EcoRI, KpnI y XhoI
1 Ultracongelador 2.4 g Tris Base
Fuente de poder para
1 1 mL Ácido acético
cámara de electroforesis
1 Transluminador UV 10 g EDTA
*En caso de no contar con hielo el alumno deberá proporcionarlo, debido a la importancia para
el desarrollo de esta actividad.
TOXICOLOGÍA:
Es importante tener cuidado con el manejo de las cepas utilizadas. No tocar directamente
para evitar contaminación de la clona y del manipulante. Ningún reactivo utilizado es tóxico.
METODOLOGÍA:
Actividad 1: Transformación de células competentes.
1. Cada equipo utilizará un glicerol de los bancos preparados en la práctica 2. Colocar los
tubos que contienen las células competentes o no competentes en hielo por 10 min.
Recuerden que estas células se almacenaron en el ultracongelador a -80ºC.
2. Agregar 1 µL del plásmido pVAX1/EGFP, mezclar suavemente haciendo uso del dedo
índice. Incubar 10 min en hielo.
3. Después de la incubación de la mezcla plásmido-células en hielo, someter los tubos en un
termobloque o en baño maría a 42ºC por 60 segundos exactamente. En este paso se abren
los poros de la membrana celular para que entre el ADN plasmídico.
4. Colocar inmediatamente los tubos en hielo por 2 min. En este paso los poros de las
membranas celulares se cierran, evitando la salida del ADN plasmídico.
5. Adicionar a cada tubo 200 µL de medio LB líquido. Incubar a 37ºC por 1 hora con agitación
a 250 rpm.
6. Para sembrar las células se requiere 2 cajas con medio LB/Kanamicina 50 µg/mL. Etiquetar
una caja especificando el equipo, grupo y la leyenda “50 µL”. Etiquetar la otra caja
especificando el equipo, grupo y la leyenda” resto del volumen”.
7. Inmediatamente después que terminó la hora de incubación, sembrar las células como se
indica a continuación: adicionar 50 µL del volumen total (Paso 5) a una caja con medio LB y el
resto del volumen (Paso 5) adicionarlo a otra caja con medio LB.
8. Distribuir el volumen de las células con 8 perlas de vidrio estériles haciendo círculos hacia
la derecha y círculos hacia la izquierda. Las perlas pueden ser remplazadas por un asa
bacteriológica para estriar el volumen sembrado.
9. Decantar las perlas de vidrio en vaso de precipitado. Sellar las cajas.
10. Incubar las cajas a 37ºC por 12 horas. Las cajas que tengan clonas pueden contener el
plásmido con el que ha sido transformado. Almacenar a 4ºC hasta su uso.
Actividad 2: Selección de clones positivos.
Para llevar a cabo la verificación de la presencia del plásmido, se requiere hacer un análisis
de por lo menos 10 a 20 clonas que crecieron durante toda la noche, después de haber
sobrevivido al proceso de transformación. Para docencia y por el reducido tiempo, purificar de
2 a 4 clonas.
1. En una caja nueva que contenga medio LB sólido con kanamicina 50 µg/mL, estriar cada
una de las colonias que crecieron la noche anterior. En una sola caja se pueden ser
resembradas todas las clonas. Numerarlas, asegurando que las colonias escogidas se
encuentren aisladas.
2. Cerrar la caja con papel parafilm e incubar a 37ºC por 12 h.
3. Seleccionar las clonas que se vean más crecidas y más brillantes. Pica una clona con una
punta amarilla estéril de micropipeta y colocarla en un tubo de centrífuga con 5 mL de medio
LB líquido con kanamicina 50 µg/mL. Incubar a 37°C, 200 rpm por 12 h. Purificar el plásmido
tal como se realizó en la práctica 3 actividad 2.
Actividad 3: Evaluación de la integridad del plásmido obtenido a partir de las clonas

positivas.
1. Para evaluar la integridad del plásmido es decir, que no sufrió ninguna modificación en el
proceso de transformación, se debe verificar el peso y que cumple con el patrón de restricción
establecido. Por este motivo se llevarán a cabo dos reacciones de digestión utilizados la
enzima Xho I (verificación del tamaño) y EcoRI (patrón de digestión).
Las reacciones se llevarán a cabo de manera simultánea.
3a.Digestión con la enzima Xho I.
en hielo frappé.
2. Descongelar agua libre de DNAsas, 10X Buffer Red.
3. Preparar tres reacciones de digestión para verificar el tamaño del plásmido, dos con un
plásmido purificado durante la clase y otra con el plásmido purificado por el profesor.
16.5 µL de Agua milliQ estéril libre de DNAsas o agua inyectable
2 µL de 10X Buffer Red

1 µL de ADN plasmídico.
0.5 µL Enzima Xho I
3b.Digestión con la enzima EcoRI.
en hielo frappé.
2. Descongelar agua libre de DNAsas, 10X Buffer EcoRI.
3. Preparar tres reacciones de digestión para verificar patrón de digestión del plásmido, dos
con un plásmido purificado durante la clase y otra con el plásmido purificado por el profesor.
16.5 µL de Agua milliQ estéril.
2 µL de 10X Buffer EcoRI
0.5 µL Enzima EcoRI
6. Analizar los tamaños de los fragmentos recuperados. Si estos coinciden, podemos proceder
a obtener el vector y el inserto utilizando el mismo plásmido.
Actividad 4: Liberación del vector y el inserto a partir del plásmido pVAX1-EGFP

Para liberar EGFP de pVAX1 de acuerdo con el mapa Molecular se deben utilizar las
siguientes enzimas de restricción: para el extremo 5´-Kpn I y para el extremo 3´-Xho I. Sin
embargo no se puede llevar a cabo una doble digestión ya que las enzimas no son eficientes
en un Buffer común como podría ser el Tango. Por lo que el experimento debe ser llevado en
tres etapas: digestión con la enzima Kpn I, precipitación con butanol del ADN para eliminar el
buffer Kpn I así como la enzima, digestión con la enzima Xho I.
*Digestión con la enzima Kpn I

en hielo frappé.
2. Descongelar agua libre de DNAsas, 10X Buffer Kpn I.
3. Preparar dos reacciones de restricción en dos microtubos estériles de 0.6 mL en hielo.
11 µL de Agua milliQ estéril.
2 µL de 10X Buffer Kpn I.
2 µL de enzima Kpn I
Consideraciones: Si se va a realizar más de una reacción con la misma enzima se debe
preparar un cocktail, considerando adicionar 0.5 µL de cada reactivo a la mezcla debido al
error durante el pipeteo.
5. Incubar a 37°C por 2-3 h. Posteriormente llevar a 65oC por 15 minutos para la inactivación
de la enzima de restricción y evitar una digestión en exceso. Almacenar a -20ºC hasta su uso.
*Precipitación con butanol del ADN para eliminar el buffer Kpn I así como la enzima
1. Agregar 1 mL de Butanol absoluto a la reacción de digestión con Kpn I.
2. Mezclar por inversión 6 veces.
3. Centrifugar a 12000 rpm por 2 minutos.
4. Eliminar la fase superior con la micropipeta. Si se observa un botón en el fondo del tubo,
eliminar todo el sobrenadante. Si no se distingue un botón, eliminar el sobrenadante
asegurándose que dejan en el fondo del tubo unos 50 uL del mismo.
5. Agregar 1 mL de Butanol absoluto, mezclar por inversión 6 veces.
7. Si la pastilla aún no se detecta, repetir los pasos 4, 5 y 6. De no ser así, lavar la pastilla 2
veces con etanol absoluto. Centrifugar entre cada lavado a 12000 rpm por 2 min.
8. Secar la pastilla y resuspender con agua en un volumen de 16 uL, volumen requerido para
llevar a cabo la reacción con Xho I.
*Digestión con la enzima Xho I.

1. Conservar el ADN que se resuspendió en 16 uL en hielo frappé (precipitado con butanol).
2. Adicionar la siguiente mezcla para una sola reacción (1X):
2 µL de 10X Buffer Xho I.
2 µL de enzima Xho I.
3. Incubar a 37°C por 12 h. Posteriormente llevar a 65oC por 15 minutos para la inactivación
de la enzima de restricción y evitar una digestión en exceso. Almacenar a -20ºC hasta su uso.
RESULTADOS:
Presentar las fotos en donde demuestren las clonas positivas recuperadas. Indicar el número
de clonas que se obtuvieron.
Establecer cuál es o cuales son las clonas positivas que se obtuvieron y por qué están
llegando a esa justificación.
Analizar el tamaño de los fragmentos recuperados, especificando si corresponden a lo
esperado.
CÁLCULOS:

Desechar los Residuos Peligrosos Biológico Infecciosos generados de la siguiente manera: Si
se trabajó con cultivo líquido, los residuos así como las puntas que estuvieron en contacto con
él, deben ser inactivadas con una solución de hipoclorito de sodio al 10%. Incubar por 15 min
a temperatura ambiente. Desechar los líquidos en los contenedores para Residuos Peligrosos
Biológico Infecciosos. Las puntas y los microtubos se escurren y se desechan en bolsas rojas.
Si se trabajó con cultivo sólido y ya no se requieren más las cajas Petri que las contienen,
depositarlas en una bolsa roja y almacenar en refrigeración hasta su disposición final en el
almacén.
que fueron transformadas y sembradas utilizando dos diferentes volúmenes. Establecer la
discusión con base en:
1. Menciona brevemente cuáles son los métodos que se utilizan para transformar bacterias y
cuáles son las ventajas de cada uno de ellos.
2. Mencionar la importancia de utilizar cepas bacterianas competentes y cepas bacterianas
que no posean el estado de competencia.
Discute ampliamente la correspondencia que existe entre el tamaño de los fragmentos
recuperados y los esperados, no sólo para la integridad del plásmido sino también al vector y
al inserto.
CONCLUSIONES:
Hacer hincapié en el número de clonas positivas obtenidas por condición. Mencionar la
probabilidad de encontrar una clona sea positiva en un banco celular con CaCl 2, con respecto
al resto. Mencionar la razón por la que se utiliza kanamicina como medio de selección y no
otro antibiótico o compuesto.
CUESTIONARIO:
1. ¿Qué tipo de células receptoras son las E. coli DH5α y las células E.coli BL21?
2. Con respecto a esta práctica ¿Cuál es el marcador de selección de las cepas
transformantes y dónde se encuentra codificado?
3. Menciona cuáles son los métodos que se utilizan para transformar bacterias. En que se
basa el fundamento teórico y cuál es el más utilizado.
4. ¿Por qué es importante hacer un ensayo de restricción a los plásmidos recuperados a partir
de las clonas obtenidas?
BIBLIOGRAFÍA:
Alberts, B, Bray, D. (2006). Introducción a la biología celular. (2a Ed.). España: Médica
Panamericana.
Curtis, H., y Schnek, A. (2008). Invitación a la Biología. (7a Ed.) Editorial Médica
panamericana.
Izquierdo, R. M. (2014). Curso de Genética Molecular e Ingeniería Genética. Madrid España:
Pirámide, Grupo Anaya S.A.
Murray, P. R., Rosenthal, K. S., Pfaller, M. A. (2009). Microbiología Médica. (6a Ed.).
Barcelona, España: Elsevier Student Consutl.
Pierce, B. A. (2010). Genética: Un enfoque conceptual. (3a Ed). Madrid España:
Panamericana.
Stanier, R. Y., Ingraham, J. L., Wheelis, M. L., y Painter, P. L. (1992). Microbiología. (2a Ed.).
Barcelona España: Reverte.
Argentina: Médica Panamericana.
PRACTICA 5. LIGACIÓN DE FRAGMENT OS DE ADN.
 Extracción en gel de los fragmentos EGFP y el vector de expresión.
 Utilizar la Ligasa del fago T4 para unir los extremos cohesivos del vector de expresión y
EGFP.
Aprende los procedimientos básicos involucrados en la inserción del DNA de interés (EGFP)
en un plásmido apropiado (pVAX1) mediante un proceso denominado ligación, que involucra
el uso de la enzima T4 DNA ligasa. Así mismo, evalua mediante análisis de restricción la
correcta construcción molecular del plásmido recombinante resultante, lo cual permitirá tener
un mejor entendimiento del proceso de clonación. Finalmente, entiende que dicha
construcción puede introducirse en un hospedero (E. coli) competente y seleccionar aquellas
células portadoras del DNA recombinante para su amplificación.
INTRODUCCIÓN:
Dentro de las metodologías de ADN recombinante, una vez que se han realizado los
respectivos análisis de restricción para tener los fragmentos de ADN complementarios es
necesario llevar a cabo la reacción de ligación para formar el enlace fosfodiester entre ellos y
terminar la construcción del vector recombinante. Esta reacción es promovida por enzimas
denominadas ligasas que llevan a cabo la formación de enlaces covalentes de tipo
fosfodiester entre el extremo 5´fosfato y 3´hidroxilo de las moléculas de ADN o ARN. Estas
enzimas pueden formar este tipo de enlace entre extremos cohesivos o rasurados y fueron
aisladas en diferentes bacterias infectadas con fagos, siendo identificadas como ligasas T4 o
T7, siendo algunas dependientes de ATP y magnesio o NAD+ (Castillo, et al., 2005; Lodish, et
al., 2005; Boyer, 1982).
La ligación en principio se producirá entre extremos romos o bien entre extremos de ADNs
complementarios que pueden aparearse, aumentando la eficiencia con respecto a los
extremos romos. La ligación de extremos romos es intrínsecamente ineficiente y requiere de

una mayor concentración de ADN y de ligasa que la de extremos complementarios (Castillo,
et al., 2005; Puerta y Ureña, 2005).
La T4 DNA ligasa es inestable en hielo por largos períodos. Por lo tanto, se recomienda no
sacarla de – 20 °C hasta el momento en que vaya a ser utilizada y devolverla inmediatamente
después de su uso. Una unidad de enzima es la cantidad necesaria para hidrolizar ATP
produciendo 1 mmol de pirofosfato (PPi) durante 20 minutos a 37 °C.

Revisa en la bibliografía como actúa la enzima T4 ligasa.
MATERIAL Y REACTIVOS:
Microtubos de 0.6 mL T4 ligasa, marca

20 1
estériles Fermentas
Microtubos de 1.5 mL
20 5 mL Agua milliQ estéril
estériles
Caja con puntas para
1 1 mL 10X Buffer de T4 Ligasa
micropipetas de 0.5-10 µL
Caja con puntas para Plásmidos digeridos en
1 30 µL
micropipetas de 20-200 µL la práctica anterior
Caja de micropipetas de 0.5- Kit de extracción en gel,
1 1
10 µL marca Fermentas
Caja de micropipetas de 20- Bromuro de etidio 10
1 100 uL
200 µL mg/mL
1 Microcentrífuga 100 mL Etanol al 70%
1 Incubadora a 37°C 5g Agarosa
Cámara de electroforesis
1 600 mL TAE 1X
horizontal
Marcador de peso
molecular l/EcoR136,
1 Fuente de poder 20 µL
Cat. SM0161,
Fermentas.
TOXICOLOGÌA:
BROMURO DE ETIDIO
El bromuro de etidio es un agente intercalante usado comúnmente como marcador de ácidos
nucleicos. Cuando se expone esta sustancia a luz ultravioleta, emite una luz roja-anaranjada,
que se intensifica unas 20 veces después de haberse unido a una cadena de ADN. El
bromuro de etidio tiene una fórmula C 21H20BrN3. Como la mayoría de los compuestos
fluorescentes, es una sustancia aromática. La mayor parte de la molécula es una estructura
tricíclica con grupos amino-benceno en cada lado de una molécula pirimídica (seis átomos,
conteniendo nitrógeno y un anillo aromático). Esta estructura dibenzopiridínica es conocida
con el nombre de fenantridina.
Riesgos a la salud:
El bromuro de etidio es una sustancia fuertemente mutagénica y es irritante a los ojos, piel,
mucosas y el tracto respiratorio. Los efectos sanitarios de la exposición a este compuesto no
han sido todavía investigados profundamente. Posee efectos como agente cancerígeno y
teratogénico por su cualidad de mutagenicidad. Si se ingiere, se inhala o se absorbe por la
piel, esta sustancia puede tener efectos nocivos.
Primeros Auxilios:
Si se derrama sobre los ojos o la piel, lavar con abundante agua durante 15 minutos usando
una ducha de seguridad o un lavaojos. Si se inhala o se ingiere se debe buscar ayuda médica
urgentemente. Para derrames, use un absorbente para secar el bromuro de etidio. Limpiar
también cualquier traza de esta sustancia en estado sólido con mucha precaución e
intentando no crear polvo. Elimínese la sustancia en un contenedor hermético y entréguese,
debidamente etiquetado, al personal calificado en el manejo de residuos químicos.
METODOLOGÍA:
Actividad 1. Purificación del fragmento EGFP y del vector de expresión a partir del gel
de agarosa.
La finalidad de esta etapa de purificación es recuperar los fragmentos de EGFP y del plásmido
PVAX1. Por lo que el plásmido digerido con las enzimas KpnI y XhoI se debe correr en un gel
de agarosa al 1%. Para poder obtener material genético útil, se utilizará un kit comercial
GeneJet Gel Extraction Kit, Thermo Scientific. El procedimiento descrito corresponde al
proporcionado por el kit Thermo Scientific, de lo contrario seguir el procedimiento establecido
de acuerdo al kit utilizado. El procedimiento se describe a continuación:
1. Cortar la banda del gel de agarosa que contiene el fragmento de interés utilizando una
navaja de bisturí preferentemente. Colocar el fragmento en un microtubo de 1.5 mL
previamente pesado. Pesar nuevamente el microtubo con el fragmento del gel. Registrar los
pesos en la bitácora.
2. Adicionar al microtubo que contiene el fragmento de agarosa, un volumen 1:1 del Binding
Buffer (volumen:peso, es decir adiciona 100 µL de Binding Buffer por cada 100 mg del
fragmento de gel de agarosa). Nota: Si el gel contiene un porcentaje de agarosa mayor al 2%,
adicionar una proporción de 2:1 de Binding Buffer.
3. Incubar la mezcla a 50-60°C por 10 min o hasta que el fragmento de agarosa se haya
disuelto completamente. Mezclar el tubo por inversión de vez en cuando, para facilitar el
proceso de fusión. Asegurar que el gel esté completamente disuelto. Dar vortex a la mezcla.
Checar el color de la solución. El color amarillo indica un pH óptimo para la unión del ADN. Si
el color de la solución es naranja o violeta, adicionar 10 µL de 3 M de acetato de sodio, pH 5.2
y mezclar. El color de la mezcla debe ser amarillo.
4. Este paso se lleva a cabo sólo cuando se trabaja con fragmentos menores a 500 pb y
mayores de 10 kb.
a) Para fragmentos menores a 500 pb, adicionar 1:2 volumen de 100% isopropanol a la
solución de gel previamente solubilizado (100 µL de isopropanol debe ser adicionado a 100
mg de agarosa solubilizado en 100 µL de Binding Buffer). Mezclar en el vortex.
b) Para fragmentos mayores a 10 kb, adicionar 1: 2 volumen de agua destilada a la solución
de gel previamente solubilizado (100 µL de agua destilada debe ser adicionado a 100 mg de
agarosa solubilizado en 100 µL de Binding Buffer). Mezclar en el vortex.
5. Si los fragmentos tienen tamaños diferentes al punto 4, entonces transferir 800 µL de la
solución de gel solubilizada (la que se generó en el paso 3 ó 4) a una columna de purificación.
Colocar la columna sobre un microtubo y centrifugar por 1 min a 12,000 rpm. Eliminar el
líquido que se recupera en el microtubo. Colocar nuevamente la columna sobre el microtubo.
Si el volumen de la solución de gel solubilizada es mayor a 800 µL se debe repetir el paso 5
las veces que sean necesarias.
6. Si el fragmento se va a mandar a secuenciar, adicionar 100 µL de Binding Buffer a la
columna. Centrifugar por 1 min a 12,000 rpm. Descartar el sobrenadante y colocar la columna
sobre el microtubo de recolección.
7. Adicionar 700 µL de Wash Buffer a la columna de purificación. Centrifugar por 1 min a
12,000 rpm. Descartar el sobrenadante y colocar la columna sobre el microtubo de
recolección.
8. Centrifugar la columna de purificación vacía por 1 min adicional para eliminar el Wash
buffer residual. Este paso es esencial para remover el etanol residual que podría contener el
ADN del Wash Buffer.
9. Transferir la columna de purificación a un microtubo de 1.5 mL limpio. Adicionar 50 µL del
Elution Buffer en el centro de la columna. Centrifugar por 1 min a 12,000 rpm. Para bajas
concentraciones de ADN, se puede reducir el volumen de elución entre 20-50 µL. Si los
fragmentos de ADN son mayores a 10 kb, precalentar el Elution Buffer a 65°C antes de
adicionarlo a la columna.
10. Desechar la columna de purificación y almacenar el ADN purificado a -20°C.
Actividad 2. Ligación.
1. Colocar en 3 microtubos de 0.6 mL estériles los reactivos en el siguiente orden:
Agua destilada estéril (Libre DNAsas) 3 µL
Buffer T4 ligasa 10X 1 µL
ADN vector 3 µL
ADN GFP 2 µL
T4 ligasa 1 µL
Vol final 10 µL
2. Mezclar con la pipeta, centrifugar 20 s a 12000 rpm. Incubar por 12 h a las temperaturas de
Temperatura ambiente, 37ºC y a 4ºC.
3. Transcurrido el tiempo de incubación, inactivar la enzima a 65ºC por 10 minutos. Almacenar
a -20ºC para su uso posterior.
4. Para analizar el plásmido religado, preparar un gel de agarosa al 0.8%. Comparar la
ligación contra el plásmido no digerido y el plásmido digerido.
5. Cargar con cuidado las muestras en cada pozo, colocando 6 µL del marcador de peso
Molecular, 5 µL de las muestras en cada pozo. Proponer el orden de carga.
7. Correr el gel a 90 V durante aproximadamente 45 minutos o lo suficiente para separar los
fragmentos de ADN.
8. Exponer el gel sobre un transiluminador de UV, y capturar una foto del gel, el análisis se
lleva a cabo comparando los fragmentos obtenidos con el marcador de peso Molecular.
9. La ligación que no se cargó en el gel debe ser almacenada a -20°C para realizar eventos de
transformación con ella.
RESULTADOS:
Actividad 1. Purificación del fragmento EGFP y del vector de expresión a partir del gel
de agarosa. Incluir fotos de los procedimientos realizados. Indica la concentración del inserto
y del vector recuperado.
CÁLCULOS
 Calcula la concentración del fragmento de EGFP en µg/ µL
 Calcula la concentración del vector de expresión en µg/ µL
Actividad 2. Ligación.
1. Propón el tamaño en pb del fragmento obtenido producto de la ligación.
2. Reporta la foto del gel de agarosa que muestra las reacciones de ligación. Incluye un mapa
de carga en donde indiques el número de carril y la muestra cargada.
3. Verifica si se llevó a cabo la reacción de ligación. Verifica el tamaño del fragmento obtenido.

como RPBI.
El gel de agarosa, los guantes, así como las puntas y todo el material que haya estado en
contacto con el bromuro de etidio deben ser desechados en una bolsa de basura destinada
para residuos tóxicos sólidos. La bolsa debe ser etiquetada con la leyenda “Bromuro de etidio”
y solo manipularse con guantes dada su peligrosidad.
1. Investiga la reacción bioquímica que se lleva a cabo por medio de la unión de la ligasa T4
así como los componentes necesarios para dicha reacción.
2. Analiza los resultados obtenidos como productos de la purificación de los fragmentos de
ADN. Menciona si la cantidad de ADN recuperado es suficiente para llevar a cabo la reacción
de ligación.
3. Analiza, discute y propón cuales serían los posibles tamaños de los fragmentos esperados
(EGFP y vector de expresión) si la ligación no se hubiese llevado a cabo de la manera
adecuada.
CONCLUSIONES:
CUESTIONARIO:
1. ¿Qué tipos de ligasas existen y que requerimientos específicos tienen?
2. ¿Qué sucedería si el vector y la EGFP estuvieran cortados por una enzima que diera lugar
a extremos romos? Propón la manera de resolver el problema si lo hubiera.
3. ¿Cómo verificas que la ligación contiene el gen de interés y en el sentido deseado?
BIBLIOGRAFÍA:
Boyer, P.D. (1982). The enzymes: Nucleic acids. Volumen 15, Parte 2. (3a Ed.). Los Angeles,
California: Academic Press.
Castillo, R. F., Dolores, R. R. M., Blasco, P. R., Huertas, R. M. J., Moreno-Vivián, C., Martínez,
L-R. M. (2005). Biotecnología ambiental. Madrid, España: Tebar S.L.
Contreras, P. J. Ligación de DNA con la enzima T4 DNA ligasa. Tomado de:
http://www.geocities.ws/jorgecon/ligacion.pdf
Herveg, J-P., y Barcia-MAcay, M. (2006). Las ligasas. Tomado de:
http://genemol.org/biomolespa/Enzimas/las-ligasas.html
Lodish, H., Berk, A., Matsudaira, P., Kaiser, C. A., Krieger, M., Scott, M. P., Zipursky, S.L.,
Darnell, J. (2005). Biología Celular y Molecular. (5a Ed.). Buenos Aires, Argentina: Medica
Panamericana.
Pérez, D.G. Clonación del DNA amplificado mediante PCR. Tomado de:
http://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-
mol/pdfs/45%20CLONACI%C3%93N%20DNA%20AMPLIFICADO%20POR%20PCR.pdf
Puerta, B. C. J., y Ureña, P. C. P. (2005). Prácticas de biología molecular. Colombia: Pontificia
Universidad Javeriana.
PRÁCTICA 6. CULTIVO PARA PRODUCCIÓN
 Obtener la cinética de crecimiento bacteriano identificando las diferentes fases en
condiciones aerobias y anaerobias para calcular los parámetros relacionados con el
cultivo.
Conoce e identifica cada una de las etapas de crecimiento de un microorganismo mediante
cinéticas en lote. Así mismo, calcula los parámetros cinéticos bajo condiciones aerobias y
anaerobias, que proporcionan información referente al tiempo de duplicación y las velocidades
específicas de crecimiento, consumo de nutrimentos y obtención de productos de interés.
Estos parámetros serán de utilidad para comparar las productividades de las células utilizadas
bajo diferentes condiciones.
INTRODUCCIÓN:
Una vez realizadas todas las operaciones del Upstream, es necesario pasar a la
bioconversión para poder producir el biofármaco de interés. En esta etapa se debe de
establecer la cinética de crecimiento del sistema biológico con el que se trabajará para la
producción del correspondiente biofármaco. Existen diversos sistemas de expresión tales
como: bacterias, levaduras, hongos, cultivos vegetales y cultivos de células animales. Cada
uno de ellos ofrece ventajas y presenta desventajas para la expresión de proteínas de manera
heteróloga (Duque, 2010; Fernández, 1994; García, et al., 2004). Uno de los sistemas que a
nivel industrial presenta grandes ventajas es el bacteriano ya que crece rápidamente, sus
medios de cultivo son baratos y se obtienen productividades relativamente altas (Tortora, et
al., 2007). Sin embargo, la expresión de proteínas complejas y glicosiladas no es posible
debido a que las bacterias no cuentan con la maquinaria necesaria para realizar un correcto
plegamiento ni glicosilar (Galbis, et al., 2004). Así, considerando como ejemplo a las bacterias
para la expresión de una proteína heterólogas es que se presenta la siguiente práctica.
Al hacer crecer bacterias en un cultivo por lote, dicho cultivo muestra una curva de crecimiento
en el cual se observan diversas etapas. La fase de latencia es un período de ajuste fisiológico,
cuando la célula sinteriza enzimas nuevas, cofactores e intermediarios metabólicos
esenciales, y los depósitos intracelulares de nutrientes están estabilizados. Durante la fase de
crecimiento exponencial o logarítmico, el crecimiento y la división celular ocurre a su velocidad
máxima. Esta velocidad está influenciada por la temperatura, el pH, la concentración de
oxígeno disuelto y el tipo de medio de cultivo empleado. En esta etapa es posible calcular la
velocidad específica de crecimiento, ya que las células se encuentran en su máxima velocidad
a las condiciones dadas. Al final de esta fase, el crecimiento cesa a causa de la carencia de
nutrientes esenciales del medio o de la acumulación de sustancias que son inhibidoras o
tóxicas dando inicio a la fase estacionaria. En esta fase el número de células viables ha
alcanzado una meseta existiendo un balance entre la velocidad específica de crecimiento y la
de muerte. Finalmente, durante la fase de muerte celular, la velocidad específica de muerte es
mayor a la de crecimiento por lo que la viabilidad del cultivo disminuye de manera
exponencial. La identificación de cada una de estas etapas en un medio de cultivo dado y en
condiciones establecidas sirve como marcaje del desarrollo de un cultivo celular específico,
proporcionando información valiosa referente al tiempo de duplicación y las velocidades
específicas de crecimiento, consumo de nutrimentos y producción. Estos parámetros sirven
para comparar las productividades de la línea celular utilizada, así como para medir la
estabilidad de la misma (Hernández, et al., 2003).

Investiga la siguiente información:
1. Etapas de una cinética de crecimiento y los eventos que suceden en cada una de ellas.
2. Compara las cinéticas de crecimiento entre diferentes sistemas biológicos: bacterias,
levaduras, células vegetales y células animales.
3. Investiga los conceptos de velocidad específica de crecimiento, velocidad específica de
consumo de sustrato y velocidad específica de generación de producto.
1 Micropipeta de 20-200 µL 2 Cajas con medio LB

Cajas con medio LB
1 Micropipeta de 10-1000 µL 2
kanamicina 50 µg/ mL µL
Caja de puntas para
1 micropipeta de 20-200 µL 400 mL Medio LB líquido
estériles
Caja de puntas para
1 micropipeta de 10-1000 µL 1
DH5 alfa.
estériles
30 Microtubos de 1.5 mL estériles 1
DH5 alfa-pvax1-GFP.
1 Agitador orbital 100 mL NaCl 0.9%
Matraz Erlenmeyer de 125 mL
2 100 mL Tris-HCl 10 mM, pH 7.6
con tapón de algodón
Solución patrón de
1 Mechero fisher 5 mL albúmina bovina 0.5
mg/mL
1 Celda de 1 mL 300 mL Reactivo de Bradford
1 Pizeta 1000 mL Agua destilada
Vaso de precipitado de 250 Colorante Azul Brillante
1 300 mg
mL de Coomasie G-250
Tubos de centrífuga de 50 mL
2 100 mL Etanol 95%
estériles
1 Espectrofotómetro 200 mL Ácido fosfórico al 85%
1 Centrífuga refrigerada 10 mL Soluciones para purificar
plásmido
1 Microcentrífuga
1 Incubadora
Reactivo de Bradford. Disolver 100 mg del Colorante Azul Brillante de Coomasie G-250 en 50
mL de etanol al 95%. Adicionar a esta solución 100 mL de ácido fosfórico al 85% (w/v). Diluir
la solución resultante a 1L.
TOXICOLOGÍA:
REACTIVO DE BRADFORD
Aspecto Forma: líquido, claro. Olor, umbral olfativo, pH, punto de fusión: sin datos
disponibles. Densidad relativa 1.066 g/cm3 a 20 °C (68 °F)
Riesgos a la salud:
Toxicidad aguda, inhalación, cutáneo: sin datos disponibles
Primeros Auxilios:
Consultar a un médico. Retire a la persona de la zona peligrosa. Si es inhalado, si aspiró,
mueva la persona al aire fresco. Si ha parado de respirar, hacer la respiración artificial.
Consultar a un médico.
En caso de contacto con la piel Quítese inmediatamente la ropa y zapatos contaminados.
Eliminar lavando con jabón y mucha agua. Llevar al afectado en seguida a un hospital.
Consultar a un médico.
En caso de contacto con los ojos Lávese a fondo con agua abundante durante 15 minutos por
lo menos y consulte al médico. Continuar lavando los ojos durante el transporte al hospital.
Si es tragado No provocar el vómito Nunca debe administrarse nada por la boca a una
persona inconsciente. Enjuague la boca con agua. Consultar a un médico.
METODOLOGÍA:
Actividad 1. Amplificación en placa y preparación del inóculo.
1. Reactivar en una caja Petri con medio LB la cepa E. coli DH5 alfa competente y
transformada con el plásmido pVAX-EGFP, en medio LB sin y con kanamicina 50 µg/mL,
respectivamente. Incubar a 37°C por 12 h. Realizar este procedimiento 2 días antes de la
práctica.
2. La noche anterior a la práctica, colocar una colonia de la bacteria competente en 15 mL de
Medio LB en un tubo de centrífuga de 50 mL estéril.
3. Hacer lo mismo para la cepa transformada y adicionar al medio LB, kanamicina a 50 µg/mL.
Actividad 2. Cinética de crecimiento y determinación de parámetros.

Actividad 2a. Cinética de crecimiento de células DH5alfa control y transformadas en
condiciones aeróbicas.
1. En dos matraces Erlenmeyer de 125 mL que contengan 63 mL de medio LB líquido
adicionar en condiciones estériles 7 mL de inóculo crecido durante toda la mañana. El
experimento se hace por duplicado. Nota: El inóculo debe ser el 10% del volumen final del
cultivo. El medio para el cultivo transformado debe contener kanamicina a 50 µg/mL.
2. Tomar 2 mL de muestra lo cual representará la DO del tiempo cero.
3. Incubar los cultivos a 37°C, a una velocidad de 250 rpm. Tomar 2 mL del medio de cultivo
cada hora. Conservar los cultivos en agitación a 250 rpm y a 37ºC.
4. Para leer en el espectrofotómetro, colocar en una celda 1 mL de medio de cultivo utilizado
como blanco.
5. Indicar el autocero en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 600 nm.
6. Colocar 1 mL de medio de la cinética en otra celda. Leer en el espectrofotómetro a una
longitud de onda de 600 nm. Registrar los datos en la tabla 5 y6. Es importante considerar que
1 unidad de densidad óptica (D. O.) corresponde a 0.4 g de células/L.
7. Recuperar el volumen del medio que se colocó en la celda para procesarlo como se indica
en la actividad 3, el mililitro restante colocarlo en otro microtubo para procesarlo para la
cuantificación de proteína total.
Actividad 2b. Cinética de crecimiento de células DH5alfa control y transformadas en

condiciones anaeróbicas.
1. Esta actividad se hace exactamente igual que la actividad 1 pero los matraces que se
utilizan son con tapa ó en su defecto con tapón de algodón forrado con papel aluminio.
2. En dos matraces Erlenmeyer de 250 mL que contengan 63 mL de medio LB líquido
adicionar en condiciones estériles 7 mL de inóculo crecido durante toda la mañana. El
experimento se hace por duplicado. Nota: El inóculo debe ser el 10% del volumen final del
cultivo. El medio para el cultivo transformado debe contener kanamicina a 50 µg/mL.
3. Tomar 2 mL de muestra lo cual representará la DO del tiempo cero.
4. Incubar los cultivos a 37°C, a una velocidad de 250 rpm. Tomar 2 mL del medio de cultivo
cada hora. Conservar los cultivos en agitación a 250 rpm y a 37ºC.
5. Para leer en el espectrofotómetro, colocar en una celda 1 mL de medio de cultivo utilizado
como blanco.
6. Indicar el autocero en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 600 nm.
7. Colocar 1 mL de medio de la cinética en otra celda. Leer en el espectrofotómetro a una
longitud de onda de 600 nm. Registrar los datos en la tabla 7 y 8. Es importante considerar
que 1 unidad de densidad óptica (D. O.) corresponde a 0.4 g de células/L.
8. Recuperar el volumen del medio que se colocó en la celda para procesarlo como se indica
en la actividad 3, el mililitro restante colocarlo en otro microtubo para procesarlo para la
cuantificación de proteína total.
Actividad 3. Procesamiento de la muestra para cuantificación de la proteína total.

1. Recuperar el microtubo que contiene el cultivo celular con 1 mL de cultivo bacteriano.
Centrifugar a 12000 rpm por 3 min. Descartar el sobrenadante en un recipiente con cloro al
10%.
2. Al botón de células recuperado en el tubo, adicionar 1 mL de NaCl 0.9% y resuspender con
mucho cuidado. Centrifugar a 12000 rpm por 3 min a 4°C. Descartar el sobrenadante en un
recipiente con cloro al 10%.
3. Al botón de células recuperado en el tubo, adicionar 1 mL de Buffer Tris 10 mM pH 7.6.
Resuspender con mucho cuidado.

3. Conservar en hielo o a -20°C para realizar la cuantificación de proteína total. Utilizar 50 L
para llevar a cabo el método de cuantificación de proteína total.
Actividad 4. Cuantificación de proteína total.

1. Preparar 1 mL de una solución de Albúmina bovina a una concentración de 0.5 mg/mL en
agua inyectable.
2. Colocar en 5 microtubos de 1.5 mL los volúmenes de agua destilada y solución estándar
como se indica en la tabla 4.
Tabla 4. Curva estándar para la cuantificación de proteína total por el método de Bradford.
Tubo Estándar de albúmina bovina 0.5 mg/mL Agua destilada Reactivo de
(L) (L) Bradford
(L)
Blanco 0 20 980
1 5 15 980
2 10 10 980
3 15 5 980
4 20 0 980
3. Preparar 200 L de una dilución 1:10 de las muestras de proteína a cuantificar, utilizar el
buffer Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM pH 7.6 para realizar las diluciones de la proteína.
4. Agregar 980 L del reactivo de Bradford a los 20 L de las soluciones de la curva estándar
y a 20 uL de muestra de proteína a cuantificar.
5. Mezclar en vortex y leer la Absorbancia a 595 nm después de 2 minutos de agregar el
colorante. Si los valores de D. O. de las muestras son mayores que los valores de la curva
estándar aumentar la dilución, de lo contrario hacer una dilución menor o directamente de la
muestra sin diluir. El color es estable 1 hora.
6. Registrar los resultados obtenidos.
RESULTADOS:
Actividad 1. Amplificación en placa y preparación del inóculo.
1. Mostrar las fotos que corresponden a la activación de la cepa.
2. Registra el valor de la D. O. de los inóculos que se utilizaron para realizar las cinéticas vs el
tiempo de incubación.
Actividad 2. Cinética de crecimiento y determinación de parámetros.

1. Registra los valores de D. O. en las tablas que se presentan.
2. Calcula la concentración celular en g/L.
3. Realiza una gráfica en donde muestres la concentración celular en g/L en el eje y, y el
tiempo en h, en el eje x.
4. Identifica las fases de crecimiento de cada una de las cinéticas. Calcula la velocidad
específica de crecimiento (h-1) y el tiempo de duplicación (td) en h.
Tabla 5. Cinética de crecimiento de células DH5alfa control en condiciones aeróbicas.

Tiempo M1 D.O. M2 D.O. Células M1 Células M2
(h) (g/L) (g/L)
0
1
2
4
Tabla 6. Cinética de crecimiento de células pVAX1-EGFP en condiciones aeróbicas.

(h) (g/L) (g/L)
0
1
2
4
Tabla 7. Cinética de crecimiento de células DH5alfa control en condiciones anaeróbicas.

(h) (g/L) (g/L)
0
1
2
4
Tabla 8. Cinética de crecimiento de células pVAX1-EGFP en condiciones anaeróbicas.

(h) (g/L) (g/L)
0
1
2
4
Tabla 9. Velocidades específicas de crecimiento y tiempos de duplicación.

Velocidad td
Cinética específica de (h)
crecimiento
(h-1)
Células DH5alfa
condiciones aeróbicas
Células pVAX1-EGFP
condiciones aeróbicas
Células DH5alfa
condiciones anaeróbicas
Células pVAX1-EGFP
condiciones anaeróbicas
Actividad 3. Procesamiento de la muestra para la recuperación de la proteína total.

1. Muestra las fotos en donde se verifique la recuperación de proteína total.
Actividad 4. Cuantificación de proteína total.

1. Llena la tabla 10 para la curva estándar con los valores de las D. O. obtenidas.
2. Genera una gráfica en donde ubiques las muestras que representen a la curva estándar.
Ubica la concentración de albúmina bovina (mg/mL) en el eje x y los valores de D. O. en el eje
y.
3. Traza sobre la gráfica una línea de tendencia y obtén la ecuación lineal que se ajuste a los
puntos obtenidos.
4. Registra las D. O. de las muestras correspondientes de cada cinética en la tabla 11.
5. Calcula los valores de proteína total para cada tiempo y condición de cultivo, regístralo en la
tabla 12. Muestra los cálculos realizados.
6. Realiza una gráfica para cada condición de cultivo en donde coloques, la concentración de
proteína en mg/mL (eje y) vs el tiempo (h) eje x.
Tabla 10. Curva estándar del método de Bradford

Tubo D. O. Estándar de albúmina bovina
(mg/mL)
Blanco
1
2
3
4
Tabla 11. D. O. de proteína total de las cinéticas de crecimiento.

Tiempo Prot Prot Prot Prot Glc Prot Prot Prot
(h) M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8
D. O. D. O. D. O. D. O. D. O. D. O. D. O. D. O.
0
1
2
4
Tabla 12. Cuantificación de proteína total de las muestras de las cinéticas por método de
Bradford.
Tiempo Prot M1 Prot M2 Prot M3 Prot M4 Prot M5 Prot M6 Prot M7 Prot M8
(h) (mg/mL) (mg/mL) (mg/mL) (mg/mL) (mg/mL) (mg/mL) (mg/mL) (mg/mL)
0
1
2
4
CÁLCULOS:

como RPBI.
Todas las puntas que hayan estado en contacto con el reactivo de Bradford colocar en una
bolsa de residuos químicos sólidos. El Reactivo de Bradford y sus residuos generados
disponerlo en un contenedor perfectamente etiquetado como residuos líquidos tóxicos.
1. Discute la importancia de reactivar las cepas días antes de iniciar una cinética de
crecimiento. Comenta los cuidados que se deben tener durante la preparación del inóculo y
las recomendaciones generales para evitar errores.
2. Analiza las gráficas obtenidas. Discute las fases de crecimiento observadas y la duración
de cada una de ellas. Compara los resultados entre las células control y las transformadas.
Compara los resultados entre las cinéticas realizadas en condiciones aeróbicas y
anaeróbicas. Revisa la bibliografía y compara los valores que tu obtuviste con los reportados.
3. Analiza los valores obtenidos de velocidad específica de crecimiento y tiempo de
duplicación. Compara los resultados entre las células control y las transformadas. Compara
los resultados entre las cinéticas realizadas en condiciones aeróbicas y anaeróbicas. Revisa
la bibliografía y compara los valores que tu obtuviste con los reportados.
4. Analiza las cantidades de plásmido recuperado. Discute si existe alguna tendencia de su
producción respecto al tiempo y a la condición de oxigenación en cada una de las cinéticas.
Discute el gel obtenido, es importante mencionar si existe alguna degradación del material
genético, ya que podría suceder como consecuencia del envejecimiento del cultivo.
5. Analiza y discute la curva estándar obtenida. Los resultados son confiables. Analiza las
gráfica de proteína total generada. Compara la producción de la misma con respecto a la
condición de cultivo y al tiempo. Coinciden los resultados con lo esperado y lo reportado en la
bibliografía.
CONCLUSIONES:
Haz hincapié en cuál es el sistema que presenta una mayor velocidad específica de
crecimiento, características del plásmido durante el crecimiento de la bacteria en condiciones
aeróbicas o anóxicas, el comportamiento de la proteína con respecto a las condiciones de
oxigenación y al envejecimiento del cultivo.
CUESTIONARIO:
1. Explica la razón por la que se utiliza Albúmina Bovina como proteína patrón?
2. ¿Qué sucede con la cantidad de proteína total conforme se envejece el cultivo?
3. Existe una sobreexpresión de proteína en el transcurso del tiempo. Con el vector que
trabajaste, la proteína GFP ¿se va a expresar en este sistema? ¿Qué tipo de sistema de
expresión deberías de utilizar para poder expresarla?
BIBLIOGRAFÍA:
Duque, J. P.(2010). Biotecnología. Panorámica de un sector. España: Netbiblo SL.
Fernández, M. (1994). Avances en ingeniería genética. Madrid, España: Consejo Superior de
Investigaciones Científicas.
Hernández, A., Alfaro, I., Arrieta, R. (2003). Microbiología Industrial. Costa Rica: Universidad
Estatal a Distancia EUNED.
Galbis, P. J. A. (2004). Panorama actual de la Química Farmacéutica. (2a Ed.). España:

Secretariado de Publicaciones de la Universidad de Sevilla.
García, G. M., Quintero, R. R., López-Munguía, A. (2004). Biotecnología alimentaria. México,
D.F.: Limusa.
Buenos Aires, Argentina: Editorial Médica Panamericana.
Universidad del País Vasco. Práctica 1. Métodos de ruptuta celular. Tomado de:
http://www.ehu.eus/biofisica/pdf/practica_1.pdf
PRACTICA 7. FABRICACIÓN DE SOLUCION INYECTABLE
 Fabricar una solución inyectable cumpliendo con especificaciones de la NOM-072-
SSA1-2012 y la NOM-073-SSA1-2005.
 Que el estudiante evalué en el inyectable pH, volumen, partículas, esterilidad y sellado
hermético.
 Desarrollar su capacidad de aplicar conocimientos teóricos en un problema práctico.
 Fabricar una formulación inyectable cumpliendo con especificaciones preestablecidas.
 Decidir en base a los RESULTADOS experimentales si el producto es aprobado o
rechazado
 Integrar sus conocimientos de microbiología y tecnología farmacéutica al fabricar un
medicamento inyectable
 Aplicar sus conocimientos previos para evaluar
INTRODUCCIÓN:
Los medicamentos inyectables pueden ser soluciones, suspensiones o emulsiones con uno o
más fármacos pero que deben ser estériles y cumplir con estándares de fabricación muy
estrictos para poder ser administrados al paciente. Pueden administrarse por vía intravenosa,
intramuscular, intradérmica, subcutánea, epidural, articular, intrarraquídea, etc.
Son la forma farmacéutica de elección si se requiere un efecto inmediato.
En general su pH debe ser cercano a la neutralidad, aunque dependiendo de la estabilidad del
fármaco puede variar dicho valor.
Una solución inyectable debe contener un ligero exceso de volumen en la ampolleta para
poder extraer correctamente el líquido con la jeringa. El exceso que debe contener depende
de su valor de viscosidad y de los porcentajes aceptados por la Farmacopea.
Para poder cumplir con la ausencia de partículas visibles y esterilidad las soluciones
inyectables pueden hacerse pasar por un filtro de membrana de 0.22 micras, con lo cual se
retienen todas aquellas partículas de tamaño mayor al mencionado y también se retienen
prácticamente todas las bacterias por lo que el producto se puede considerar estéril.
Las ampolletas para una solución inyectable deben ser llenadas y selladas mediante calor. Y
es importe garantizar que el producto esta herméticamente sellado y que no hay riesgo de que
se pueda contaminar durante su manejo. Por ello es necesario hacer una prueba que permita
detectar cualquier ampolleta que pudiese no cumplir con hermeticidad.
Y finalmente se debe recurrir a una medición microbiológica que asegure que el producto es
estéril, por ello se toma una muestra de la solución inyectable una vez que pasa por el filtro de
0.22 micras y se incuba para cuantificar el número de bacterias presentes en el producto.

Se recomienda revisar:
La Norma Oficial Mexicana 059, particularmente el anexo de áreas de fabricación.
La FEUM para verificar el exceso de volumen para un inyectable.
La USP para verificar los tipos de agua que se emplean en la fabricación de medicamentos.
Videos de YOUTUBE sobre sellado de ampolletas.
30 Ampolletas de vidrio de 5 ml 0.18 g NaCl

4 Pipeta volumétrica de 5 ml 1g Glucosa
Selladora de ampolletas
1
Mechero Bunsen
1 Mechero Fisher 500 mL Azul de metileno 1% p/V
15 Cajas Petri con medio LB Colorantes*
1 Pipeta volumétrica de mL
3 Vaso de 500 ml
1 Espátula
1 Probeta de 25 mL
1 Pinzas de disección
TOXICOLOGÌA:
AZUL DE METILENO
El azúl de metileno conocido como 3,7-Bis(Dimetilamino)Fenotiacina-5-Inio Cloruro,C.I. Basic
Blue 9, Tetrametiltionina Cloruro, es un colorante orgánico utilizado para diagnóstico y análisis
químico. Es un compuesto químico heterocíclico aromático, el cual presenta una fórmula
química C16H18CIN3S x H2O y tiene un peso molecular de 319.85 g/mol. Es un sólido inodoro
que posee un pH 3.
Riesgos a la salud:
El azul de metileno es un reactivo combustible cuyos vapores son peligrosos debido al óxido
de azufre, óxido de nitrógeno y gas cloruro de hidrógeno que puede emanar. Por ello se
deben reprimir los vapores con agua pulverizada, no permitir el paso al sistema de desagües.
Evitar la contaminación del suelo, aguas y desagües. Almacenar siempre en un rango de 5°C
a 30°C.
PRIMEROS AUXILIOS:
En caso de pérdida del conocimiento nunca dar a beber ni provocar el vómito, en caso de
inhalación trasladar a la persona al aire libre, en caso de contacto con la piel lavar con
abundante agua y retirar la ropa contaminada. En caso de contacto con los ojos lave con
abundante agua manteniendo los párpados abiertos y si se ingirió por error beber agua
abundante, provocar el vómito y pedir asistencia médica de inmediato.
METODOLOGÍA:
Actividad 1: Lavado de ampolletas
1. Preparar una solución jabonosa al 2% con agua corriente. Sumergir cuidadosamente las
ampolletas. Adicionar jabón en el interior de la misma con ayuda de una jeringa a presión.
2. Enjuagar las ampolletas con agua corriente. Finalmente enjuagar con agua destilada.
Escurrir las ampolletas sobre papel secante.
3. Tapar las ampolletas como papel aluminio. Colocar las ampolletas en el interior del vaso de
precipitado, tapado con papel aluminio.
4. Esterilizar al calor húmedo por 30 min.
Actividad 2: Preparación de la solución fisiológica inyectables y solución de glucosa

5% inyectable.
1. Preparar 20 mL de solución de Cloruro de Sodio al 0.9% en agua milliQ y 20 mL de glucosa
al 5% en agua milliQ.
2. Adicionar unas gotas del colorante amarillo de la marca McCormirk para que la solución
adquiera un color amarillo tenue.
4. Medir el pH de las soluciones preparadas y de ser necesario, hacer el ajuste a pH
fisiológico (7.35-7.4).
5. Reservar 1 mL de cada solución para la actividad de control de calidad.
6. Esterilizar en calor húmedo por 30 min. Dejar que las soluciones alcancen la temperatura
ambiente.
Actividad 3: Llenado y sellado de ampolletas.

1. Llenar 2 ampolletas al 100% de su capacidad y 2 al 80% de su capacidad en condiciones
estériles (utilizar un mechero Fisher que proporcione la esterilidad de la zona de trabajo).
2. Encender el mechero bunsen y colocar la ampolleta en un ángulo de 45° en la zona de la
flama donde el azul cielo termina (figura 3). Es importante que la flama quede posicionada a ¾
parte de la altura de la boquilla de la ampolleta. Rotar la ampolleta continuamente si perder el

ángulo de inclinación.
Figura 3. Sellado de ampolleta con mechero Bunsen.
3. Con una pinza de disección tomar la boquilla de la ampolleta para ver si el vidrio ya está
maleable, y eso se nota cuando el cuello de la ampolleta empieza a doblarse en la zona del
calentamiento. Sin quitarla del fuego, sostener la boquilla con las pinzas de disección y seguir
rotando la ampolleta de manera que valla sellando. Cuando ya esté sellada, tirar con fuerza y
rapidez con las pinzas de la boquilla para separar el extremo residual. Con la ampolleta en el
fuego, tomar la pinza de disección y tratar de moldear la punta de la ampolleta para asegurar
su sellado.
4. Dejar la ampolleta sobre la mesa para asegurar su correcto sellado mientras alcanza la
temperatura ambiente. Nunca poner la ampolleta de cabeza recién salida del fuego, ya que el
cambio de temperatura puede hacer que la ampolleta se estrelle.
5. Sellar el resto de las ampolletas.
Actividad 4: Control de calidad
Descripción de la solución inyectable. Observar a contraluz y determinar si la solución es

translucida.
Volumen promedio del vaciado. Abrir la ampolleta y con una jeringa con aguja recuperar el
Volumen de la solución inyectable. Medirlo con una pipeta volumétrica para determinar el
volumen de llenado.
Hermeticidad. De acuerdo a la FEUM, se deben sumergir las ampolletas en un matraz
Kitazato que contenga una solución al 1% (p/V) de azul de metileno u otro colorante que sea
diferente al color de la muestra. Aplicar vacío hasta un diferencial de presión de 26.667 Kpa
(200 mm de mercurio) por no menos de 5 min y observar. El contenido no debe presentar
ningún cambio de color.
Inspección óptica. Observar a contraluz y la solución no debe presentar partículas
suspendidas.
Altura promedio de las ampolletas. Medir con un vernier o regla la altura del nivel del líquido
en las ampolletas utilizadas.
Ampolletas defectuosas (apariencia). La ampolleta debe estar bien sellada y con la
apariencia lo más parecida a la que se muestra en la figura 3.
Microbiología de las áreas y de las soluciones de trabajo
Área de producción. Colocar una caja Petri con medio LB abierta por 2 min en la zona de
producción. Sellar con parafilm e incubar por 12 h a 37°C.
Área estéril. Colocar una caja Petri con LB abierta por 2 min en el área estéril. Sellar con
parafilm e incubar por 12 h a 37°C.
Inyectable antes de esterilizar. Adicionar 1 mL de la solución inyectable NO estéril a una caja
Petri con medio LB en condiciones estériles. Sellar con parafilm. Distribuye la solución
inyectable haciendo círculos sobre la mesa de trabajo. Incubar por 12 h a 37°C.
Inyectable estéril. Adicionar 1 mL de la solución inyectable estéril a una caja Petri con medio
LB en condiciones estériles. Sellar con parafilm. Distribuye la solución inyectable haciendo
círculos sobre la mesa de trabajo. Incubar por 12 h a 37°C.
RESULTADOS:
Con los resultados obtenidos en el desarrollo del trabajo experimental, llena las tablas 13, 14 y
15.
Tabla 13. Control de calidad de la solución inyectable de NaCl 0.9%
Prueba Especificación Resultado Verificación
Descripción Solución transparente
Volumen promedio de _____ mL
vaciado
Hermeticidad Herméticas
Inspección óptica Sin partículas visibles
(partículas)
Altura promedio de las _____ cm (+/- 5%)
ampolletas
Ampolletas Sin defectos
defectuosas (fotos)
Tabla 14. Control de calidad de la solución inyectable de Glucosa 5%

Descripción Solución transparente
Volumen promedio de _______ mL
vaciado
Hermeticidad Herméticas
Inspección óptica Sin partículas visibles
(partículas)
Altura promedio de las _______ cm (+/- 5%)
ampolletas
Ampolletas Sin defectos

defectuosas (fotos)
Tabla 15. Calificación microbiológica de las áreas y de las soluciones de trabajo

Evaluación Especificación Resultado Verifico
Área de producción Área clase 1000
Área estéril Área clase 100
Inyectable antes de filtrar Con algunos mos.
Inyectable filtrado Sin mos.
RENDIMIENTO:
Ampolletas teóricas _____________

Ampolletas obtenidas _____________
Porcentaje de rendimiento
DICTAMEN DE CONTROL DE CALIDAD

DICTAMEN OBSERVACIONES
APROBADO
RECHAZADO
FIRMA____________________________
Menciona la importancia de la hermeticidad de las ampolletas, por qué se debe monitorear las
áreas de trabajo con cajas Petri, por qué se debe calificar microbiológicamente las soluciones
de trabajo y considerar las fuentes de contaminantes de una solución inyectable.
Los residuos de vidrio generados se etiquetan como material de vidrio y se desechan

siguiendo el procedimiento de desechos. Los residuos de solución de lidocaína se reúnen en
un frasco y se etiquetan indicando los componentes de la formulación. Los residuos de azul
de metileno se reúnen en un frasco y se etiquetan indicando composición.Las cajas Petri
generadas se recolectan como Residuos Peligrosos Biológico Infecciosos y se disponen de
acuerdo al procedimiento de la Facultad.
CONCLUSIONES:
resultados obtenidos. Haz hincapié en la hermeticidad de las ampolletas tomando en cuenta
que estás generando una solución inyectable de consumo humano.
CUESTIONARIO:
1. ¿Qué características debe cumplir un producto para considerarse parenteral?
2. ¿Qué tipo de materiales se usan para envasar los productos parenterales?
3. ¿Qué ventajas y desventajas presenta el vidrio como material de envasado?
4. ¿En el caso de productos oftálmicos que materiales de envase se recomiendan y porque?
BIBLIOGRAFÍA:
Raymond C Rowe, PaµL J Sheskey and Marian E Fuinn. (2009). Handbook of.
Pharmaceutical Excipients. USA: Pharmpress.
United States Pharmacopeia 30 NF25 (2007).
James Swarbrick (2004). Encyclopedia of Pharmaceutical Technology. USA. CRC Press
NOM SSA 059
American Society of Health-System Pharmacists. (2014). Handbook od Injectable Drµgs.
USA. American Society of Health-System Pharmacists; Eighteenth Edition edition
Michael E. AµLton. (2001). Pharmaceutics: The Science of Dosage Form Design. 2nd edition
USA. Churchill Livingstone
PRÁCTICA 8. SOLUCIONES OFTALMICAS
OBJETIVOS PARTICULARES:
 Que el estudiante sea capaz de fabricar una solución oftálmica cumpliendo con sus
especificaciones
 Que el estudiante calcule las cantidades necesarias para isotonizar una solución
 Que el estudiante calcule las cantidades necesarias para controlar la capacidad
amortiguadora de un buffer
 Que el alumno verifique isotonicidad, capacidad amortiguadora, viscosidad de una
solución oftálmica.
COMPETENCIAS ACADÉMICAS:
 Describir el uso de soluciones buffer en soluciones oftálmicas, así como aprender la
 importancia de la capacidad amortiguadora del mismo.
 Formular y analizar una disolución con un pH y una capacidad amortiguadora
 determinadas.
 Estudiar la influencia de sales sobre la tonicidad de una disolución.
 Diferenciar entre hipertonicidad, hipotonicidad y presión osmótica.
 Formular y analizar una solución isotónica al fluido lacrimal del ojo.
 Estudiar la aceptabilidad fisiológica de la formulación preparada.
 Elaborar el PNO correspondiente de la formulación obtenida.
 Decidir en base a los RESULTADOS experimentales si el producto es aprobado o
rechazado.
INTRODUCCIÓN:
Los colirios constituyen la forma farmacéutica de aplicación oftálmica u ocular más
comúnmente empleada. Los colirios o gotas oftálmicas son soluciones o suspensiones
estériles acuosas u oleosas, que contienen una o varias sustancias medicamentosas
destinadas a la administración ocular. Un colirio se comporta, en relación con el ojo, de la

misma forma que un cuerpo extraño; es decir, su aplicación puede provocar (con mayor o
menor intensidad según el caso):
1. Reflejo de cerrado de los párpados.
2. Lagrimeo.
3. Reacciones dolorosas.
4. Enrojecimiento de la conjuntiva.
La correcta formulación de un colirio debe conseguir minimizar estas reacciones. En concreto,
éstas no deben desencadenar el lagrimeo que arrastre de forma instantánea el principio
activo. Las últimas trazas del colirio no permanecen en el ojo más de 15-25 minutos. De ahí la
necesidad, en ciertas afecciones, de repetir con frecuencia las instilaciones o bien de sustituir
el colirio líquido por una pomada oftálmica.
Las preparaciones farmacéuticas se aplican tópicamente en el ojo para tratar la superficie o
condiciones intraoculares, incluyendo bacterias, hongos e infecciones virales del ojo o de los
párpados (antiinfecciosos); conjuntivitis infecciosa o alérgica, inflamación; presión intraocular
elevada, glaucoma, como anestésicos locales y ojo reseco debido a una producción
inadecuada de fluidos que bañan el ojo. En el tratamiento de ciertas condiciones oftálmicas,
como el glaucoma, se pueden emplear medicamentos tanto tópicos como sistémicos.
El volumen de fluido lagrimal es de 7-8 microlitros, pudiendo almacenarse hasta 30 microlitros,
por lo que la capacidad de retener un medicamento en el ojo es limitada. Debido a la dinámica
del ojo el tiempo de retención es corto y usualmente la cantidad de fármaco absorbido es una
fracción de la cantidad administrada. Por ejemplo, una solución oftálmica de pilocarpina es
drenada de la zona corneal en 1 ó 2 minutos llevando a una absorción ocular menor al 1%.
Por esto, su administración debe repetirse con cierta frecuencia.
Los fluidos biológicos como la sangre y las lágrimas tienen un presión osmótica igual a una
solución de NaCl al 0.9%. Aplicar una solución con diferente presión osmótica puede causar
diferentes problemas. Si es hipertónica, provoca la salida de agua de los tejidos hacia la
solución en un esfuerzo por equilibrar a los sistemas. En la sangre, un fluido hipertónico causa
cremación de los eritrocitos. En el caso de una solución hipotónica, puede inducir hemólisis de
los glóbulos rojos o migración de agua hacia el tejido ocular. Afortunadamente, el ojo es capaz
de tolerar ciertos límites (0.6-2.0%) sin presentar molestias notorias como sensación de dolor
o aparición de lagrimeo en un ojo sano. El ajuste de la tonicidad se realiza del mismo modo
que para los preparados inyectables; por lo general, con cloruro de sodio. En caso de
incompatibilidades, se utilizan otras sales. De ahí la importancia de conocer los métodos para
isotonizar soluciones como son: a) por equivalentes isotónicos, donde todos los compuestos
químicos tienen una cierta equivalencia a gramos de cloruro de sodio: es su “equivalente
isotónico” que se encuentra tabulado y que también puede determinarse experimentalmente.
Según este método “La suma de los equivalentes isotónicos de todos los componentes de 100
mL de forma farmacéutica deberán ser necesariamente equivalentes a 0.9 gramos de NaCl”; y
b) por descensos crioscópicos, el cual es una constante físico-química para cada sustancia y
que tiene que ver con la facilidad de la disolución de la sustancia para pasar de estado líquido
a sólido, pasando por el punto de congelación (solidificación). Se simboliza por ∆ c se
encuentra tabulado o puede determinarse en el laboratorio con el osmómetro. La solución
isotónica con el organismo (0.9% P/V de NaCl) tiene un descenso crioscópico de ∆ c de 0.52.
Según este método “La suma de los descensos crioscópicos al %P/V en que se halla cada
componente en la fórmula farmacéutica deberá ser de 0.52”.
El pH de las lágrimas se considera de 7.4 aunque varía (oscila aproximadamente entre 7.4 y
7.7). Cuando el medicamento no es estable en este intervalo de pH, pueden formularse
colirios cuyo pH final se aparte del intervalo ya que las lágrimas tienen cierto poder tampón.
Por ejemplo, los usuarios de lentes de contacto tienen un valor menor de pH y las lágrimas
tienen cierta capacidad amortiguadora. Los ojos soportan mayor desviación hacia pHs
alcalinos que hacia pHs ácidos.
Con el fin de ajustar simultáneamente el pH y la presión osmótica pueden emplearse mezclas
de diferentes soluciones reguladoras. Para los colirios se utilizan sobre todo los tampones
fosfato y la mezcla ácido bórico-borato de sodio.
La viscosidad de una solución oftálmica se considera óptima en el intervalo de 15 a 25 cPs y
existen diferentes agentes modificadores de la viscosidad que pueden ser incluidos en la
formulación de un colirio.
Las características de los colirios son prácticamente idénticas a las requeridas para
soluciones inyectables. Deben ser límpidos (como todas las soluciones), indoloros (factor que
suele estar en función de su pH), neutros, isotónicos con el fluido lagrimal y, sobre todo,
estériles. Para el caso de colirios-suspensión, la farmacopea incluye además un control del
tamaño de partícula.
El problema específicamente que se plantea con los colirios es el de la conservación de su
esterilidad durante su intervalo de empleo. Un colirio se administra en forma de gotas y en el
transcurso de cada una de las diferentes aplicaciones pueden contaminarse, lo que puede
conducir a crecimiento microbiano, modificación de pH del colirio y de la estructura de los
principios activos e infección ulterior del ojo. A fin de evitar que microorganismos se
introduzcan accidentalmente y se multipliquen durante la administración del colirio, deben
incluirse agentes antisépticos y antifúngicos en su formulación, que sean inocuos para la
córnea y la conjuntiva, compatibles con los principios activos y eficaces a dosis bajas como
los derivados organomercuriales tales como nitrato y borato de fenilmercurio y ésteres del
ácido parahidroxibenzoico, aunque estos últimos sean muy poco solubles en agua.
Los ensayos para la evaluación de colirios, además de la valoración de los principios activos y
de la identificación de los diferentes constituyentes, incluyen los siguientes controles:
1. Esterilidad.
2. Medida del pH y del poder tampón.
3. Descenso crioscópico.
4. Limpieza.
5. Eventualmente, determinación de la viscosidad.

Investigar los diferentes tipos de oftálmicos y sus propiedades de pH, viscosidad, isotonicidad.
Revisar la FEUM o la USP para verificar ejemplos de oftálmicos y qué pruebas deben cumplir.
2 Vasos de precipitado de 300 mL 20 g NaCl
5 Vasos de precipitado de 100 mL NaH2PO4, Na2HPO4
5 Espátula 2g Lidocaína HCl
4 Cajas Petri HCl 0.01 N
1 Probeta de 250 mL NaOH 0.01 N
1 Pinzas de disección Metil y propilparabeno
Carbopol 934, HPMC

1 Potenciómetro
K4M, 100LV
4 Portaobjetos y cubreobjetos *Agua para inyectable
1 Gotero Alcohol al 70%
1 Microscopio Cloruro de benzalconio
3 Matraces aforados de 50 mL Azul de metileno
Caja de Petri con agar

1 Viscosímetro 1
MH
Juego de agujas para

1
viscosímetro
1 Picnómetro de vidrio
1 Mechero Fisher
1 Termómetro

1 Parrilla de calentamiento
TOXICOLOGÌA:
ACIDO CLORHIDRICO (HCl)
El ácido clorhídrico es una disolución acuosa de cloruro de hidrógeno. Es un líquido de color
amarillo (por presencia de trazas de fierro, cloro o materia orgánica) o incoloro con un olor
penetrante. Es soluble en agua, desprendiéndose calor. Su fórmula química es HCl y tiene un
peso molecular de 36.46 g/mol. Con agentes oxidantes como peróxido de hidrógeno, ácido
selénico y pentóxido de vanadio, genera cloro, el cual es muy peligroso.
Riesgos a la salud:
En el caso de exposiciones agudas por inhalación, los mayores efectos se limitan al tracto
respiratorio superior. Los vapores causan dificultad para respirar, tos e inflamación y
ulceración de nariz, tráquea y laringe. Exposiciones severas causan espasmo de la laringe y
edema en los pulmones y cuerdas vocales. Una exposición prolongada y repetida puede
causar decoloración y corrosión dental. En algunos casos se han presentado problemas de
gastritis y bronquitis crónica.
Es un irritante severo de los ojos y su contacto con ellos puede causar quemaduras, reducir la
visión o, incluso, la pérdida total de ésta.
En forma de vapor o disoluciones concentradas causa quemaduras en piel serias, dermatitis y
fotosensibilización. Las quemaduras pueden dejar cicatrices, que incluso pueden desfigurar
las regiones que han sido dañadas. Su ingestión produce corrosión de las membranas
mucosas de la boca, esófago y estómago. Los síntomas que se presentan son: disfagia,
náuseas, vómito, sed intensa y diarrea. Puede presentarse, incluso, colapso respiratorio y
muerte por necrosis del esófago y estómago.
Para su manejo es necesario utilizar lentes de seguridad y, si es necesario, guantes de
neopreno, viton o hule butílico, nunca de PVA o polietileno en lugares bien ventilados. No

deben usarse lentes de contacto cuando se utilice este producto. Al trasvasar pequeñas
cantidades con pipeta, siempre utilizar propipetas, NUNCA ASPIRAR CON LA BOCA. Si se
manejan cantidades grandes de este producto, es necesario utilizar un equipo de respiración
autónoma sin partes de aluminio.
Primeros Auxilios:
Inhalación: Mover al afectado al aire fresco. Si no respira, dar respiración artificial y
mantenerlo caliente y en reposo, no dar a ingerir nada. Si está consciente, suministrar
oxígeno, si es posible, y mantenerlo sentado. Ojos: Lavar inmediatamente con agua corriente,
asegurándose de abrir bien los párpados. Piel: Lavar inmediatamente la zona dañada con
abundante agua. Si ha penetrado en la ropa, quitarla inmediatamente y lavar la piel con agua
abundante. Ingestión: No provocar vómito. En caso de que la víctima esté inconsciente, dar
respiración artificial y mantenerla en reposo y caliente. Si está consciente dar a beber un poco
de agua continuamente, por ejemplo una cucharada cada 10 minutos. EN TODOS LOS
CASOS DE EXPOSICION, EL PACIENTE DEBE SER TRANSPORTADO AL HOSPITAL TAN
PRONTO COMO SEA POSIBLE.
AZUL DE METILENO
Para revisar la información toxicológica del bromuro de etido vaya al apartado descrito en
las páginas 38 y 39.
CLORURO DE BENZALCONIO
Las sales de amonio poseen un extraordinario poder bactericida frente a las bacterias gram-
positivas exterminándose incluso las gram-negativas con soluciones considerablemente
diluidas en materia activa, actúa de igual manera sobre virus, algas y hongos. El cloruro de
benzalconio (cloruro de dimetilbencilamonio) es un compuesto de amonio cuaternario cuya
fórmula química es C17H30ClN.
Se presenta como un polvo blanco o amarillento. De tacto jabonoso y olor levemente
aromático. Muy higroscópico; no contiene más del 10% en agua. Soluble en agua y etanol;
poco soluble en benceno; casi insoluble en éter. Su solución acuosa suele ser ligeramente

alcalina y bajo agitación produce espuma. Cuando se calienta forma una masa fundida
transparente
Riesgos a la salud:
Almacenar los productos en un lugar fresco y seco en condiciones higiénicas, empaque
original y cerrado a temperaturas no superiores a 40C.
No aplicar soluciones en la piel sin diluir a concentraciones superiores al 1%. Si la piel está
inflamada o irritada, deben utilizarse soluciones más diluidas de lo recomendado. Se utiliza
agua estéril o destilada para diluir (debe evitarse el agua del grifo, porque puede contener
iones metálicos y materia orgánica que inactivan al antiséptico). El contacto prolongado con la
piel puede producir irritaciones o quemaduras. Se recomienda precaución e incluso no utilizar
para la desinfección de material quirúrgico o de superficies (por falta de eficacia y porque
producen corrosión). El cloruro de benzalconio actúa rápidamente y de forma prolongada.
También puede ser adsorbido por lentes de contacto lo que puede provocar toxicidad ocular.
Primeros Auxilios:
Tras inhalación tomar aire fresco, en caso de contacto con la piel aclarar con abundante agua,
utilizar un algodón impregnado con polietilenglicol 400 para extraer el producto y cambiar o
retirar la ropa contaminada. Tras ingestión beber abundante agua, no vomitar pues existe
riesgo de perforación, no intentar realizar medidas de neutralización y llamar a atención
medico de inmediato. En caso de contacto con los ojos enjuagar con abundante agua,
conservando los parpados abiertos como mínimo durante 10 minutos y avisar inmediatamente
al oftalmólogo.
HIDRÓXIDO DE SODIO
El hidróxido de sodio soluble en agua, alcoholes y glicerol, insoluble en acetona (aunque
reacciona con ella) y éter, es corrosivo de metales y tejidos. Su fórmula química es NaOH y su
peso molecular es de 40.01 g/mol. La reacción con sosa y tricloroetileno es peligrosa, ya que
este último se descompone y genera dicloroacetileno, el cual es inflamable.
Riesgos a la salud:

Para el manejo del NaOH es necesario el uso de lentes de seguridad, bata y guantes de
neopreno, nitrilo o vinilo. Siempre debe manejarse en una campana y no deben utilizarse
lentes de contacto al trabajar con este compuesto. En el caso de trasvasar pequeñas
cantidades de disoluciones de sosa con pipeta, utilizar una propipeta, NUNCA ASPIRAR CON
LA BOCA.
El hidróxido de sodio es irritante y corrosivo de los tejidos. La inhalación de polvo o neblina
causa irritación y daño del tracto respiratorio. En caso de exposición a concentraciones altas,
se presenta ulceración nasal, quemaduras en la nariz y tracto. El NaOH es extremadamente
corrosivo a los ojos por lo que las salpicaduras son muy peligrosas, pueden provocar desde
una gran irritación en la córnea, ulceración, nubosidades y, finalmente, su desintegración. En
casos más severos puede haber ceguera permanente, por lo que los primeros auxilios
inmediatos son vitales. Tanto el NaOH sólido, como en disoluciones concentradas es
altamente corrosivo a la piel. Se han reportado casos de disolución total de cabello, calvicie
reversible y quemaduras del cuero cabelludo en trabajadores expuestos a disoluciones
concentradas de sosa por varias horas. Este producto está considerado como posible
causante de cáncer de esófago, aún después de 12 a 42 años de su ingestión. La
carcinogénesis puede deberse a la destrucción del tejido y formación de costras, más que por
el producto mismo.
Primeros Auxilios:
En caso de inhalación retirar del área de exposición hacia una bien ventilada. Si el
accidentado se encuentra inconsciente, no dar a beber nada, dar respiración artificial y
rehabilitación cardiopulmonar. Si se encuentra consciente, levantarlo o sentarlo lentamente,
suministrar oxígeno, si es necesario. En caso de contacto en ojos lavar con abundante agua
corriente, asegurándose de levantar los párpados, hasta eliminación total del producto. En
caso de contacto con la piel quitar la ropa contaminada inmediatamente. Lavar el área
afectada con abundante agua corriente. Si se ingirió por error no provocar vómito. Si el
accidentado se encuentra inconsciente, tratar como en el caso de inhalación. Si está
consciente, dar a beber una cucharada de agua inmediatamente y después, cada 10 minutos.

EN TODOS LOS CASOS DE EXPOSICION, EL PACIENTE DEBE SER TRANSPORTADO AL

HOSPITAL TAN PRONTO COMO SEA POSIBLE.
METODOLOGÍA:
Características del Lote y solución amortiguadora isotónica:
1. Tamaño estándar del lote (Batch size): 200 mL de solución oftálmica.
2. Descripción: solución transparente, líquido incoloro con olor característico.
3. Fórmula cuali-cuanti se describe en la tabla 16.
4. Solución amortiguadora isotónica, constituida por NaH 2PO4, Na2HPO4, NaCl
Tabla 16. Fórmula Cuali-cuanti.
PESADO
COMPONENTE O MP CANTIDAD/ LOTE Eq. Iso. VERIFICADO
(g)
LIDOCAINA HCL (PA) 2% 0.220
NaH2PO4 al 0.7% p/v c.s. 0.460
Na2HPO4 al 1.5% p/v c.s. 0.420
NaCl c.s.p. isotonizar 1
HPMC (agente viscosante) 0.5%
Metilparabeno (conservador) 0.18%
Propilparabeno (conservador) 0.02%
Agua para inyectable c.s.p. 200 mL
Eq. Iso.=Equivalente isotónico; c.s.=Cantidad sufiente; c.s.p.=Cantidad suficiente para
Actividad 1: Preparación del área de fabricación del lote de solución oftálmica (colirio).

1. Lavar perfectamente su mesa de trabajo del laboratorio usando solución de detergente y un

lienzo de algodón.
2. Retirar el exceso de detergente con ayuda del lienzo y proceda a rociar cloruro de
benzalconio en el área lavada.
3. Con ayuda de una sanita de papel absorbente, limpiar el exceso de benzal en un sentido.
Finalmente, rociar alcohol al 70% y dejar evaporar.
4. Colocar un pliego de papel estraza sobre la mesa limpia y sanitizada pegándolo con cinta
masking tape.
Actividad 2: Identificación y pesado de las materias primas a utilizar.

1. Identificar las materias primas o componentes de la fórmula a emplear en la fabricación del
colirio.
2. Registrar en la bitácora personal, datos como nombre químico o IUPAC, fabricante,
proveedor, número de lote, fecha de fabricación y de caducidad, características físicas, etc.,
de cada una de las materias primas a usar.
3. Realiza los cálculos requeridos para preparar la formulación:
𝑚1 ∗ 𝐸𝑞. 𝐼𝑠𝑜1 + 𝑚2 ∗ 𝐸𝑞. 𝐼𝑠𝑜2 + 𝑚𝑛 ∗ 𝐸𝑞. 𝐼𝑠𝑜. 𝑛 = 0.9 𝑁𝑎𝐶𝑙

Dónde:
m, es la masa de cada uno de los componentes en g.
Eq. Iso, es el Equivalente isotónico de cada uno de los componentes.
Para calcular la cantidad de agua requerida, se debe tomar en cuenta la cantidad de

clorhidrato de lidocaína a utilizar, así como el volumen de la solución a preparar.
(2𝑔 𝑐𝑙𝑜ℎ𝑖𝑑𝑟𝑎𝑡𝑜 𝑑𝑒 𝑙𝑖𝑑𝑜𝑐𝑎í𝑛𝑎)(100 𝑚𝐿 𝑑𝑒 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛)

%=
𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑎𝑔𝑢𝑎 𝑟𝑒𝑞𝑢𝑒𝑟𝑖𝑑𝑎

Calculando los equivalentes isotónicos del clorhidrato de lidocaína, ya que la solución

amortiguadora ya es isotónica:
(2𝑔 𝑐𝑙𝑜ℎ𝑖𝑑𝑟𝑎𝑡𝑜 𝑑𝑒 𝑙𝑖𝑑𝑜𝑐𝑎í𝑛𝑎)(100 𝑚𝐿 𝑑𝑒 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛)

𝑥 𝐸𝑞. 𝐼𝑠𝑜. 𝑐𝑙𝑜𝑟ℎ𝑖𝑑𝑟𝑎𝑡𝑜 𝑑𝑒 𝑙𝑖𝑑𝑜𝑐𝑎í𝑛𝑎 = 0.9
𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑎𝑔𝑢𝑎 𝑟𝑒𝑞𝑢𝑒𝑟𝑖𝑑𝑎
El volumen de agua requerida debe dividirse en tres partes que será la cantidad requerida
para la actividad 4. El agua debe ser inyectable.
4. Verificar la limpieza del área de pesado y de la balanza analítica.
5. Registrar en la bitácora de uso de la balanza.
6. Pesar con precisión las cantidades (g) requeridas de cada una de las materias primas.
7. Limpiar la balanza y área de trabajo; regresar las materias primas al almacén.
Actividad 3: Preparación de la solución amortiguadora de pH isotónica.

1. Calcular de acuerdo a la tabla cuali-cuanti del lote a preparar, el volumen de solución
isotónica a preparar.
2. Preparar la solución de acuerdo a las condiciones establecidas en la tabla 20, para 100 mL
de solución amortiguadora de pH isotónica.
Tomando en cuenta el volumen de agua que se calculó previamente, se debe considerar que
se prepararan 200 mL de solución oftálmica, por lo tanto el volumen de la solución
amortiguadora a preparar se calcula de la siguiente manera:
𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑎𝑚𝑜𝑟𝑡𝑖𝑔𝑢𝑎𝑑𝑜𝑟𝑎

= 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑜𝑓𝑡á𝑙𝑚𝑖𝑐𝑎 − 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑎𝑔𝑢𝑎 𝑖𝑛𝑦𝑒𝑐𝑡𝑎𝑏𝑙𝑒
Donde, el volumen es en mL.
3. Mezclar los volúmenes necesarios de las soluciones de fosfatos previamente preparadas
(amortiguador de pH) y la cantidad de cloruro de sodio necesaria para isotonizar la solución.
4. Registrar los pesos obtenidos en los cálculos para las sales en la tabla de la fórmula cuali-
cuanti de su solución oftálmica.

Tabla 17. Composición de la solución amortiguadora.
Solución amortiguadora de pH isotónica

Composición por 100 mL
c.s. (pH 7.4)
NaH2PO4 al 0.7% p/v 60 mL
Na2HPO4 al 1.5% p/v 40 mL
NaCl 0.348 g
Actividad 4: Preparación de la formulación oftálmica.

a) Volumen de agua inyectable.
1. Para calcular la cantidad de agua inyectable a usar en la solución oftálmica, se requiere
establecer una ecuación que relacione los gramos de clorhidrato de lidocaína en la
formulación con sus equivalentes isotónicos (Eq. Iso.) que deben ser igual al 0.9% de NaCl.
b) Dispersión del agente viscosante hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC).

1. Colocar en vaso de precipitado de capacidad adecuada la tercera parte del agua inyectable
a usar en la fabricación del oftálmico.
2. Incorporar poco a poco la cantidad de HPMC a usar, mientras se agita continuamente con
ayuda de una espátula.
3. Calentar la dispersión en una parrilla de calentamiento (80-90ºC) sin dejar de agitar la
mezcla. Enfriar y coloque la dispersión en un baño de hielo.
NOTA: Si la HPMC no se solubiliza en un tercio de agua, utilizar un tercio más hasta su
completa solubilidad.
c) Preparación de la solución de clorhidrato de lidocaína (PA), premezcla uno.

1. En un vaso de capacidad adecuada, medir el volumen requerido para tener una tercera
parte de agua inyectable a usar.

2. Incorporar el activo (Clorhidrato de lidocaína) agitando gradual y constantemente hasta su

completa disolución.
NOTA: El volumen de agua requerido depende del volumen utilizado para solubilizar HPMC.
d) Preparación de la solución de conservadores parabenos, premezcla dos.

1. En un vaso de capacidad adecuada, medir el volumen requerido para tener una tercera
parte de agua inyectable a usar.
2. Agregar el metilparabeno agitando gradual y constantemente hasta su incorporación.
3. Proceder a agregar a la mezcla, el propilparabeno hasta su completa incorporación.
4. Calentar ligeramente la mezcla sin dejar de agitar para mejorar la solubilidad de los
conservadores.
NOTA: El volumen de agua requerido depende del volumen utilizado para solubilizar HPMC.
e) Unión de las premezclas con la dispersión de HPMC.

1. Al vaso que contiene la dispersión de HPMC, agregar la premezcla uno incorporándola con
agitación constante.
2. Una vez incorporada, proceder a agregar la premezcla dos agitando constantemente.
3. Finalmente, añadir la cantidad necesaria de solución amortiguadora isotónica que permita
tener una solución oftálmica con pH y presión osmótica adecuada para su administración
ocular.
4. Esterilizar la solución oftálmica por un método convencional de laboratorio.
5. En condiciones estériles, acondicione la solución de colirio en un material de empaque
primario idóneo para la administración por instilación de las gotas de colirio.
Actividad 5: Ensayos para la evaluación del colirio.

Determinación de apariencia e inspección óptica. Examinar y registrar las características
físicas del colirio respecto a la limpieza y transparencia de la forma farmacéutica. A contra luz,
inspeccione la ausencia o presencia de partículas sólidas dispersas.

Determinación del volumen total obtenido de producto. Con una probeta de capacidad
adecuada, medir el volumen total obtenido del lote de granel de colirio fabricado. Registre el
volumen obtenido de colirio.
Determinación de viscosidad
1. Nivelar el equipo con los tornillos niveladores del soporte hasta que la burbuja de aire se
encuentre centrada.
2. Seleccione la aguja adecuada con el botón spindle select y una vez parpadeando la letra
“S”, ajuste con las flechas (arriba o abajo) del panel de control y presione nuevamente el
botón spindle select para que el equipo guarde la configuración seleccionada.
3. Sujetar el cabezal donde se atornillará la aguja.
4. Centrar la aguja a utilizar y girar en sentido de las manecillas del reloj a la aguja hasta que
se junte con el soporte.
5. Descender el viscosímetro hasta que el nivel del líquido quede en la marca de la aguja.
6. Seleccionar la velocidad (rpm) a la que operará el equipo con las flechas (arriba o bajo) y
apriete el botón speed select para que el equipo guarde la configuración seleccionada.
7. Encender el equipo con el botón rojo derecho on/off.
8. Atemperar la muestra de colirio a 25ºc y determinar la viscosidad (cps) a un minuto.
Registre el resultado obtenido y compárelo con la especificación del producto.
Determinación de pH.
1. Verificar que el potenciómetro este previamente calibrado.
2. Medir el pH de la muestra de colirio a 25ºC.
3. Registrar el resultado obtenido.
4. De ser necesario, ajustar el pH de la solución oftálmica hasta alcanzar el pH fisiológico del
líquido lagrimal.
5. Registre el resultado obtenido.
Determinación de densidad

1. Pesar con precisión el picnómetro de vidrio vacío.

2. Llenar el picnómetro con agua destilada (25ºC) hasta que el líquido ascienda en el capilar y
quede enrasado.
3. Pesar con precisión el picnómetro lleno con agua destilada.
4. Retirar el agua y secar el picnómetro. Llene el picnómetro con el colirio sin formar burbujas
de aire.
5. Pesar el picnómetro con el colirio a 25ºC. Calcule la densidad del producto mediante la
siguiente ecuación:
𝑀𝑝 + 𝑚 − 𝑀𝑝
𝜌𝑚 = 𝜌𝑤
𝑀𝑝 + 𝑤 − 𝑀𝑝
Dónde:
Mp = Masa del picnómetro vacío
Mp+m = Masa del picnómetro con muestra
Mp+w = Masa del picnómetro con agua destilada
m = densidad de la muestra
w = densidad del agua (utilizamos la siguiente: 1g/mL)
Evaluación de la esterilidad del producto

1. En condiciones estériles, tome con una punta estéril y medir con la micropipeta 500 L de
solución oftálmica estéril.
2. Vertir el volumen medido en el centro de una caja de Petri con agar LB.
3. Distribuir uniformemente el volumen depositado en la caja de Petri haciendo movimientos
circulares sobre la mesa de trabajo.
4. Incubar a 37ºC por 12 horas.
5. Transcurrido el tiempo de incubación, observe la presencia o ausencia de crecimiento
microbiano. Registrar los resultados obtenidos.
Análisis de la isotonicidad del producto

1. Preparar 50 mL de una disolución que contenga las siguientes cantidades de NaCl: 0.2%,
0.9% y 4%.
2. Separar una de las capas internas de la cebolla y desprender la membrana que está
adherida por su cara inferior cóncava.
3. Cortar 4 trozos de epidermis de cebolla (2 cm2) y coloque un trozo en cada caja Petri.
4. Agregar 5 mL de solución hipotónica (NaCl 0.2%) en la primera caja, 5 mL de solución
hipertónica (NaCl 4%) en la segunda caja Petri, 5 mL de solución isotónica (NaCl 0.9%) en la
tercera caja de Petri y 5 mL de su formulación (colirio) en la cuarta caja de Petri.
5. Dejar que se equilibren las soluciones con la membrana de la epidermis de la cebolla por
10 minutos.
6. Transcurrido el tiempo de equilibrio, tomar el trozo de cebolla que estuvo en contacto con la
solución isotónica con una pinza de disección. Colocarlo en un portaobjeto agregando una
gota de azul de metileno.
7. Observar la forma y el tamaño de las células bajo un microscopio en los objetivos 10X y
20X. Tomar fotografías de los campos observados.
8. Repetir el procedimiento con los otros trozos de cebolla puestos en contacto con las otras
condiciones de tonicidad. Registre los resultados obtenidos.
RESULTADOS:
Con los resultados obtenidos en el desarrollo del trabajo experimental, llena las tablas 18 y19.
Tabla 18. Control de calidad de la solución oftálmica
Solución
Apariencia
transparente
Volumen del producto 200 mL
pH 7.0-7.4

Viscosidad 20-40 cPs
Inspección óptica Sin partículas

(partículas) visibles
Tonicidad Isotónico
Densidad 1.1500+/-2%
Esterilidad Estéril
Tabla 19. Calificación de las soluciones de diferente tonicidad*.
Solución 0.2% Solución 4.0% Solución isotónica Producto
*Colocar fotografía
DICTAMEN DE CONTROL DE CALIDAD
APROBADO
RECHAZADO
FIRMA:____________________________
FECHA:
CÁLCULOS


Los residuos de solución de lidocaína se reúnen en un frasco y se etiquetan indicando los
componentes de la formulación. Y se sigue el procedimiento que indique la Facultad. Los
residuos de azul de metileno se reúnen en un frasco y se etiquetan indicando composición.
Los residuos de cebolla se desechan siguiendo el procedimiento de la Facultad para material
biológico, siempre y cuando haya estado en contacto con los materiales de la
experimentación. De lo contrario debe ser desechada a la basura municipal.
En la discusión realice comentarios referentes a:
* Dificultades se presentaron durante la fabricación.
* Relevancia del método para isotonizar la solución oftálmica y medir la capacidad
amortiguadora.
*Por qué no se calculó el equivalente de NaCl del viscosante y por qué una solución oftálmica
debe llevar conservador.
CONCLUSIONES:
resultados obtenidos. Haz hincapié en la importancia de preparar adecuadamente la solución
oftálmica y sobre todo tomando como base la isotonicidad de la misma.
CUESTIONARIO:
1) ¿En qué se basa y qué indica la capacidad amortiguadora?
2) ¿Cómo afecta la concentración de sales a la presión osmótica?
3) Investigue dos ejemplos numéricos de cómo se utiliza el método de equivalentes de NaCl.
A) Si se conoce el equivalente de NaCl del fármaco

B) Si se desconoce el equivalente de NaCl.

4) Si vas a utilizar un viscosante, explica por qué y cómo afecta a la tonicidad.
5) Si vas a utilizar un conservador, explica por qué y cómo afecta a la tonicidad
6) ¿Cómo afecta la presencia de sales a la solubilidad del principio activo?
7) ¿Cómo se puede medir la isotonicidad empleando un espectrofotómetro?
BIBLIOGRAFÍA:
1. Raymond C Rowe, PaµL J Sheskey and Marian E Fuinn. (2009). Handbook of
2. United States Pharmacopeia 30 NF25 (2007).
3. James Swarbrick (2004). Encyclopedia of Pharmaceutical Technology. USA. CRC Press
4. NOM SSA 059.
5. American Society of Health-System Pharmacists. (2014). Handbook of Injectable Drugs.
USA. American Society of Health-System Pharmacists; Eighteenth Edition edition.
6. Loyd V. Allen, Nicholas G. Popovich, Howard Ansel. (2011). Ansel´s Pharmaceutical
Dosage Forms and Drug Delivery Systems. USA Lippincott Williams.
7. Michael E. Aulton (2001). Pharmaceutics: The Science of Dosage Form Design. 2nd edition
USA. Churchill Livingstone.
8. A. Le Hir (1995). Farmacia galénica. Manuales de Farmacia. Ed. Masson, S.A. Barcelona,
España.
9. J. Ruíz Soriano (1997). Problemas de Laboratorio Químico y Farmacéutico. Ed. Harcourt
Brace de España S.A. Madrid, España.


PRÁCTICA 9. JARABES
 Conocer el proceso general de manufactura de un jarabe y distinguir los cuidados que
se deben de tener durante el mismo.
 Conocer los ingredientes de su formulación y las funciones que cumplen.
 Apreciar la importancia de este tipo de forma farmacéutica.
COMPETENCIAS ACADEMICAS:
 Conocer el proceso de fabricación de un jarabe
 Conocer los diferentes componentes de un jarabe y su función dentro del mismo
 Integrar sus conocimientos de química a la fabricación de un jarabe
 Evaluar la calidad del jarabe fabricado
 Determinar si cumple las especificaciones requeridas
INTRODUCCIÓN:
Como ya fue mencionado anteriormente, los jarabes son soluciones concentradas de azúcar
en agua o algún otro liquido acuoso. Cuando se utiliza exclusivamente agua destilada y
desmineralizada para preparar la solución de sacarosa, la preparación se conoce como jarabe
"simple". Si se adiciona a la solución de sacarosa otro tipo de polioles tales como glicerina,
sorbitol, etc., se denomine jarabe "compuesto". Cuando la solución con sacarosa contiene
algún fármaco se conoce cono jarabe "medicinal" (21).
En general los jarabes ofrecen oportunidades muy variadas como vehículo ya que son
fácilmente aceptados tanto por niños como por adultos, poseen propiedades para enmascarar
sabores de fármacos con características muy variadas. La formulación clásica tipo jarabe
puede representarse como sigue (10):
√ Principio activo c.s.

√ Sabor c.s.

√ Color c.s.
√ Preservativo
√ Sacarosa 85 g
√ Antioxidante
√ Agua csp 100 ml
c.s: cantidad suficiente csp: cantidad suficiente para
La sacarosa es el azúcar más utilizada en jarabes, sin embargo, en circunstancias especiales

puede ser reemplazada total o en parte por otros azúcares tales como la dextrosa o polioles
como glicerina, propilenglicol o sorbitol. En algunos casos todas las substancias glicogénicas,
incluyendo los agentes mencionados arriba, son reemplazados por sustancias no glicogénicas
como la metilcelulosa o hidroxietilcelulosa y su uso resulta excelente vehículo para
medicaciones de pacientes díabéticos.
Se recomienda no hacer los jarabes en cantidades más grandes de las que se puedan utilizar
dentro de pocos meses, excepto en los casos donde puede ser preservado fácilmente. Una
temperatura baja es el mejor método de preservación dé jarabes. La USP (27) sugiere que los
jarabes deben de ser guardados a una temperatura no mayor de los 25ºC. Los preservativos
como glicerina, metil perabeno, ácido benzoico etc., pueden adicionarse particularmente
cuando la concentración de sacarosa es baja.

Figura 4. Emulsificador Marca IKA
Buscar en YOUTUBE videos sobre jarabes (syrup) y sobre percolación (percolation).
2 Vaso de pp de 250 mL 2.5 g Acetaminofén

2 Vaso de pp de 50 mL 50 g *Azúcar
1 Agitador de vidrio 15 g Sorbitol
1 Espátula 5g Propilenglicol
1 Probeta 0.02 g Propilparabeno
1 Termómetro 0.10 g Metilparabeno

1 Viscosímetro c/agujas cs *Colorante

1 Probeta de 250 ml cs *Esencia de frambuesa
1 Papel filtro 1 Jarabe de acetaminofén
1 Parrilla
1 potenciómetro
TOXICOLOGÌA:
Ninguno de los materiales utilizados es tóxico y dañino para el organismo o salud.
METODOLOGÍA:
1. Tamaño estándar del lote: 250 mL de jarabe.
2. Descripción: Solución translucida, de color y olor característicos.
3. Fórmula del producto a fabricar se describe en la tabla 20.
Tabla 20. Componentes del jarabe.
COMPONENTE CANTIDAD EN % CANTIDAD/ PESADO VERIFICADO

LOTE
Acetaminofén 1% 2.50 g
Sacarosa 50% 125.0 g
Sorbitol 15% 37.50 g
Propilenglicol 5% 12.50 g
Metilparabeno 0.1% 0.25 g
Propilparabeno 0.02% 0.05 g

Color* rojo c.s.
Esencia* de frambuesa c.s.
Agua destilada c.s.p. 250 mL 72.20 g

*Colorante y esencia a elección
Actividad 1. Fabricación del jarabe.

Fase A:
1. Pesar con precisión en un vaso de precipitado de capacidad adecuada la cantidad total de
sacarosa.
2. Pesar y agregar la cantidad de agua destilada a usar y verterla sobre la sacarosa. Agitar
primero con una varilla de vidrio, y una vez disuelta parte del azúcar, coloque la mezcla sobre
la parrilla de calentamiento y calentar ligeramente (40-50ºC). Continuar mezclando hasta
lograr completa disolución y homogeneidad en el producto. Detener el calentamiento.
3. Adicionar a la solución 37.5 g de sorbitol, mezclar cuidadosamente hasta que se logre una
solución homogénea.
Fase B:
1. En un vaso de precipitado de capacidad adecuada, agregar 12.5 g de propilenglicol.
Disolver el acetaminofén y los parabenos con ayuda de una varilla de agitación. Realizar la
disolución de las materias primas a temperatura ambiente.
Unión de fases
1. Una vez que ambas fases fueron preparadas, adicione la fase B a la fase A y mezcle hasta
incorporar por completo.
2. Calcular el rendimiento del jarabe.
3. Agregar la solución colorida a elección.
4. Agregar la esencia artificial seleccionada.
5. Aforar al volumen con agua destilada y agitar. Filtrar con papel filtro y al vacío si es

necesario.
Actividad 2. Análisis del producto a granel.

Determinación de viscosidad.
1. Se nivela el equipo con los tornillos niveladores (R) del soporte hasta que la burbuja de aire
se encuentre centrada como se muestra en la figura 5 (1).
2. Seleccione la aguja número 3 con el botón spindle select y una vez parpadeando la letra
“S”, ajuste con las flechas (arriba o abajo) del panel de control y presione nuevamente el
botón spindle select para que el equipo guarde la configuración seleccionada (2).
3. Sujetar el cabezal donde se atornillará la aguja (3).
Figura 5. Viscosímetro Brookfield programable modelo DV-II+.
6. Seleccionar la velocidad a 12 rpm con las flechas (arriba o bajo) y apriete el botón speed
select para que el equipo guarde la configuración seleccionada.

7. Para proceder a medir la viscosidad, presionar el botón rojo derecho on/off.

8. Atemperar la muestra de jarabe a 25ºC y determinar la viscosidad (cPs) a un minuto.
Registre el resultado obtenido.
Determinación de pH
2. Medir el pH de la muestra a 25ºC.
3. Registrar el resultado obtenido.
quede enrasado.
4. Retirar el agua y secar el picnómetro. Llene el picnómetro con el jarabe sin formar burbujas
de aire.
5. Pesar el picnómetro con el jarabe a 25ºC. Calcule la densidad del producto mediante la
𝜌𝑚 = 𝜌𝑤
Dónde:
Determinación de acetaminofén, ensayo espectrofotométrico.

Determinar la cantidad de acetaminofen por mL de jarabe. Siguiendo la monografía de la

farmacopea o espectrofotométricamente comparar una solución de referencia versus el
jarabe, leyendo a 242 nm.
1. Preparación de la muestra. Agitar la muestra (jarabe) y transferir 5 mL con una pipeta

volumétrica a un matraz aforado de 100 mL, disolver con 10 mL de etanol absoluto y aforar
con agua destilada. Transferir 2 mL de esta solución a un matraz volumétrico de 200 mL y
aforar con agua destilada. Leer la absorbancia de la muestra en el espectrofotómetro a 242
nm.
2. Preparación del estándar. Pesar 60 mg de acetaminofén en un matraz volumétrico de 100

mL, disolver con 10 mL de etanol absoluto y aforar con agua destilada; transferir 2 mL de esta
solución a un matraz volumétrico de 100 mL y aforar con agua destilada. Usar agua destilada
como blanco. Leer la absorbancia del estándar a 242 nm. Realizar los cálculos
correspondientes para determinar la cantidad de acetaminofén presente en el jarabe.
Actividad 3. Análisis del producto comercial.

Adquiere un jarabe comercial, realiza todas las pruebas que se realizaron en la actividad 2.
Haz una comparación de los resultados obtenidos para esta formulación con la formulación
líquida preparada en el laboratorio.
RESULTADOS:
Con los resultados obtenidos en el desarrollo del trabajo experimental, llena las tablas 21 y 22.

Tabla 21. Control de calidad de jarabe de Acetaminofén.
Análisis Especificación Resultado Verificación
Apariencia Solución
transparente
*Color Rojo
*Olor Frambuesa
Volumen del producto 250 ml
pH 7.0 +/- 0.5
Gravedad específica 1.2069+/- 0.072
Ensayo 100% +/- 10%

*Dep end erá del colorante y esencia seleccionadas.
Apariencia, color y olor son características organolépticas del jarabe.
- Calcule la densidad del jarabe.

-Calcule el rendimiento obtenido de jarabe antes de realizar el aforo a 250 mL.
Tabla 22. Control de calidad de jarabe de Acetaminofén comercial
Análisis Especificación Resultado Verificación
Apariencia Solución
transparente
*Color Rojo
*Olor Frambuesa

Volumen del producto 250 ml
pH 7.0 +/- 0.5
Ensayo 100% +/- 10%

*Dep end erá del colorante y esencia seleccionada.
Apariencia, color y olor son características organolépticas del jarabe.
Dictamen de control de calidad del lote obtenido.
APROBADO
RECHAZADO
FIRMA___________________________
CÁLCULOS

Los residuos de solución de jarabe se reúnen en un frasco, se etiquetan indicando los
componentes de la formulación etiquetándose como residuos líquidos químicos. Finalmente
se dará la disposición final de los residuos de acuerdo a los mecanismos establecidos por las
instalaciones de la Facultad de Farmacia.

Es importante tener en cuenta el empleo de altas concentraciones de azúcar, los agentes que
se emplean para evitar la cristalización del azúcar, El cambio en la densidad del jarabe con
respecto al agua, y por qué la viscosidad del jarabe debe ser alta. Haz hincapié en el análisis
realizado al jarabe comercial analizado. Discute la comparación de los análisis realizados
entre la formulación líquida que se generó con respecto a la comercial.
CONCLUSIONES:
Analiza los resultados obtenidos, revisa los objetivos de la práctica y genera una triangulación
entre ellos para generar las conclusiones requeridas.
BIBLIOGRAFÍA:
- Raymond C Rowe, PaµL J Sheskey and Marian E Fuinn. (2009). Handbook of
- United States Pharmacopeia 30 NF25 (2007).
- James Swarbrick (2004). Encyclopedia of Pharmaceutical Technology. USA. CRC Press.
- NOM SSA 059 2013.
- American Society of Health-System Pharmacists. (2014). Handbook of Injectable Drugs.
USA. American Society of Health-System Pharmacists; Eighteenth Edition edition.
- Loyd V. Allen, Nicholas G. Popovich, Howard Ansel. (2011). Ansel´s Pharmaceutical Dosage
Forms and Drµg Delivery Systems. USA Lippincott Williams.
- Michael E. Aulon. (2001). Pharmaceutics: The Science of Dosage Form Design. 2nd edition


PRÁCTICA 10. EMULSIONES Y SUSPENSIONES
 Conocer la importancia de las emulsiones como forma de administración de fármacos.
 Analizar los fenómenos involucrados en la fabricación de emulsiones, la función que
cumple el tensoactivo y las aplicaciones prácticas de las emulsiones.
 Conocerá los problemas que presenta una formulación de suspensión, así como las
diferentes fases que presenta esta formulación.
 Conocer la importancia que tiene el orden de adición de los reactivos en la preparación
de una suspensión.
 Estabilizar una mezcla de dos fases inmiscibles.
 Comprender la importancia de los tensoactivos y su uso en las emulsiones.
 Conocer en qué casos se emplean emulsiones como forma farmacéutica y sus
ventajas.
 Analizar el comportamiento de los agentes suspensores.
 Analizar el efecto de la presencia de agentes humectantes.
 Conocer el equipo de fabricación de suspensiones.
 Evaluar la estabilidad de una emulsión y una suspensión mediante pruebas de acuerdo
a la Farmacopea.
INTRODUCCIÓN:
Una emulsión la podemos definir como un sistema disperso que contiene por lo menos dos
fases líquidas inmiscibles. Podemos decir que al igual que las suspensiones, las emulsiones
son inestables termodinámicamente como resultado del exceso de energía libre asociada con
la superficie de los glóbulos que se forman en la emulsión. Para minimizar este efecto, es
necesario agregar un tercer componente que es el emulsificante.

Tipos de emulsiones: En una emulsión una fase líquida es de características polares mientras
que la otra es relativamente no polar. Cuando la fase oleosa se encuentra dispersa en forma
de glóbulos a través de una fase continua acuosa, el sistema se refiere a una emulsión de tipo
aceite /agua (Ac/Ac o O/W); cuando la fase oleosa se encuentra como fase continúa, se dice
que la emulsión es de tipo agua /aceite (Ag/Ac o W/O). Las emulsiones de tipo oral son
generalmente de tipo O/W.
La utilidad de las emulsiones dentro del área farmacéutica es muy amplia, generalmente las
emulsiones son utilizadas para la administración de fármacos que son liposolubles, pueden
ser utilizadas para uso externo, esto último reviste gran importancia dentro de la
cosmetología. Para la producción de emulsiones a gran escala, las fases oleosa y acuosa son
calentadas de manera independiente en tanques enchaquetados. Cuando se trabaja con
ceras, ambas fases (oleosa y acuosa) son calentadas a una temperatura ligeramente superior
al punto de fusión más alto de entre los ingredientes utilizados. Una de las fases es bombeada
hacia el tanque que contiene a la otra, hasta adición completa y posteriormente se enfría el
producto. En esta facultad se cuenta con emulsificador marca IKA Modelo RW 20 digital, que
se muestra en la figura 4.
Existen varias técnicas para examinar la coalescencia y separación de fases. La observación
visual, antes y después de agitarse, la foto micrografía puede ser útil también para observar
este fenómeno. Las pruebas de centrífuga pueden utilizarse para el mismo propósito. Unas
pocas gotas de un colorante pueden colocarse sobre la superficie de la emulsión de tal
manera que si la emulsión es Ac/Ag, el colorante difundirá rápidamente a través del sistema
(si el colorante es hidrosoluble); si es Ag/Ac el colorante no difundirá. Al igual que en las
suspensiones, es útil realizar el estudio reológico del producto.
Por otro lado, las suspensiones son sistemas heterogéneos que consisten de 2 fases. Una
fase externa o continua, que generalmente es un líquido o semisólido y la fase interna o
dispersa que consiste de partículas prácticamente insolubles pero capaces de dispersarse en
la fase continua.
Es importante que las características de la fase dispersa sean escogidas con cuidado, de tal
manera que produzcan una suspensión que tenga una óptima estabilidad química y física,

además de propiedades farmacológicas. Finalmente se desea que el producto contenga

ingredientes que pueden ser fácilmente incorporados a la formulación utilizando métodos y
equipo estándar.
Para propósitos farmacéuticos, la estabilidad física de suspensiones se puede definir como la
condición donde las partículas no se agregan y donde permanecen uniformemente
distribuidas a través de la dispersión. O bien, si se sedimentan se deberán resuspender
fácilmente con una agitación moderada. Existen dos posibilidades de trabajo para la
obtención de este tipo de sistemas, por ejemplo:
Por vía química: La división se lleva a cabo mediante precipitación del solido en forma de finas
partículas en el seno de un líquido. Aun que pueden emplearse las reacciones de
precipitación química, para tener partículas de una tenuidad y una forma cristalina
determinadas, es necesario operar en condiciones rigurosamente definidas de concentración,
agitación y temperatura.
Cuando se consideran las propiedades interfaciales de partículas dispersas deben tenerse en
cuenta dos factores, ya sea que se trate de una fase dispersa solida o liquida. El primero se
relaciona con un aumento de energía libre de la superficie cuando se reduce el tamaño de las
partículas y aumenta su superficie específica. El segundo es una carga eléctrica sobre la
superficie de las partículas dispersas.
Energía libre superficial: Cuando materiales sólidos y líquidos disminuye de tamaño tiende a
aglomerarse o adherirse entre si. Este fenómeno, que puede ocurrir en medio líquido o aire,
es un intento de las partículas de reducir el exceso de energía libre superficial del sistema.

*Revisa las pruebas que establece la farmacopea mexicana para emulsiones y suspensiones.
*Revisar en YOUTUBE videos sobre emulsificación y homogenizadores


2 Probeta de 100 ml 40 g *Aceite mineral
2 Vasos de pp de 150 ml 10 g *Cera de abeja
2 Vaso de pp de 250 ml 6g *Petrolato
4 vidrios de reloj 2g Lanolina
1 Espátula 7g *Glicerina
1 Piseta con agua 1.1 g Tween 80
1 Agitador mecánico 2g Span 60
1 Propela Cs *Colorante
Cs *Perfume
Cps 100 Agua destilada
3.2 g Acetaminofén
40 g Sacarosa
1.3 g Avicer RC591
0.25 g Benzoato de soido
0.2 g Ácido cítrico
1 Emulsión comercial
1 Suspensión comercial
TOXICOLOGÌA:
Ninguno de los materiales utilizados es tóxico y dañino para el organismo.
METODOLOGÍA:
Actividad 1. Elaboración de la Emulsión.

Pesar cada uno de los componentes de la formulación para formar la fase oleosa y la fase
acuosa, tal como se describe a continuación:
Fase Oleosa:
1. Colocar 10 g de cera de abeja, 6 g de petrólato, 40 g de aceite mineral, 2 g de lanolina, en
un vaso de precipitado de 150 mL.
2. Calentar la mezcla a 70°C hasta que se disuelvan los componentes. Homogenizar los
componentes con un agitador continuamente a baja velocidad.
NOTA. Si se va a calentar directamente la mezcla, es importante mantener la temperatura
controlada, es decir que no rebase los 70°C.
3. Una vez alcanzada la temperatura agregar 2 g de Span 60 y mantener dicha temperatura,
con agitación continua.
Fase acuosa:
1. Mezclar en un vaso de precipitado: 37 mL de agua destilada, 1 g de tween 80 y 2 g de
glicerina.
2. Calentar la mezcla en un baño maría de tal manera que se disuelvan los componentes y la
mezcla alcance 70ºC.
3. Agregar rápidamente y con agitación continúa la fase acuosa a la fase oleosa.
4. Mantener la agitación hasta que la emulsión baje su temperatura a 30ºC y proceder a
agregar color y esencia. NOTA: si no se cuenta con un colorante para crema se puede utilizar
un poco de sudan III que es afín a los lípidos.
5. Mantener la agitación hasta que la emulsión baje su temperatura a 30ºC, para poder
realizar los estudios de evaluación y finalmente envasarla.
Actividad 2. Elaboración de la suspensión

1. Pesar o medir cada uno de los componentes de la formulación: 3.2 g de Acetaminominofen,

40 g de sacarosa, 5 g de glicerina, 1.3 g Avicer RC591, 0.25 g de benzoato de Sodio, 0.1 g de
Tween 80 y 0.2 g de ácido cítrico.
2. Es IMPORTANTE dispersar el Avicel RC591 en 45 g de agua empleando una parrilla con
agitación haciendo uso de un agitador magnético a 200 rpm durante 2 h. Dejar reposar por 1
h.
3. Adicionar la sacarosa, glicerina, colorante y Tween 80 en la mezcla anterior.
4. Adicionar el acetaminofén y mezclar hasta obtener una dispersión homogénea.
5. Adicionar el ácido cítrico y la esencia.
6. Agregar el volumen necesario de agua, de tal manera que se ajuste al volumen final de 100
mL y agitar por 5 minutos a velocidad moderada.
Actividad 3. Pruebas de pre-estabilidad. Evaluación de la suspensión y la emulsión.

Densidad:
1. Evaluar densidad usando el picnómetro como se describe a continuación:
-Pesar el picnómetro vacío.
-Pesar el picnómetro con agua.
-Pesar el picnómetro con una muestra de la emulsión.
𝜌𝑚 = 𝜌𝑤
Dónde:
2. Lavar el picnómetro con jabón y agua corriente y enjuagar con agua destilada.

3. Repetir lo mismo para la suspensión.
Viscosidad:
1. Revisar el apartado de metodología de la práctica 9 en donde se explica a detalle el uso del
viscosímetro y la medición de la viscosidad.
2. Para la medición de la viscosidad de esta formulación líquida se usará el agua 3 a 12 y 20
rpm.
pH:
1. Medir el pH de la emulsión/suspensión directamente con el potenciómetro.
2. Si la muestra es muy viscosa o no se logra estabilizar el pH, preparar una dilución de la
emulsión al 10% en agua (10 g de emulsión en 100 mL de agua destilada). Homogenizar
perfectamente y medir el pH utilizando potenciómetro.
NOTA. La medición del pH se realizará a una temperatura de 25 °C.
Grado de separación:
1. Colocar una muestra de la emulsión en un tubo de centrifuga graduado.
2. Centrifugar a 3000 rpm durante 15 min.
3. Medir la separación de la emulsión con ayuda de un vernier, tomando la altura total de la
emulsión, así mismo, medir la altura de separación o sedimentación.
El porcentaje de separación se calcula tomando en consideración la altura total de la emulsión
como el 100%.
Microscopía de campo claro:

1. Colocar una gota de la emulsión en un portaobjetos, colocar cuidadosamente un
cubreobjetos sobre la gota o muestra.
2. Observar al microscopio con los objetivos de 10X y 40X (Tomar fotografías).

Actividad 4. Pruebas de pre-estabilidad. Evaluación de la suspensión y la emulsión

comercial.
1. Haciendo uso de una suspensión y emulsión comercial, realiza cada una de las pruebas de
pre-estabilidad que realizaste. Compara los resultados obtenidos con los de las formulaciones
líquidas realizadas en el laboratorio.
2. Genera una tabla comparativa en donde incluyas los parámetros de control de calidad.
RESULTADOS:
Con los resultados obtenidos en el desarrollo del trabajo experimental, llena las tablas 23 y 24.
Tabla 23. Control de calidad de emulsión.

Prueba Especificación Resultado Resultado Verificación
FFL FFL comercial
Apariencia Crema o/w
Color Blanco
Olor Flores
Peso del producto 250 gr
pH 7.0 +/- 0.5
Viscosidad 20 rpm 2500-8000 cPs
Centrifuga 100% +/- 10%
Microscopía (fotos) Gotas uniformes

Tabla 24. Control de calidad de suspensión.

FFL FFL comercial
Apariencia Suspensión
homogenea
Color Blanco
Olor piña
Peso del producto 250 gr
pH 5.0 +/- 0.5
(Densidad)
Centrifuga (volumen de >50% +/- 10%
sedimento)
Microscopía (fotos) Gotas uniformes
CÁLCULOS

Todos los contenedores que tuvieron contacto con la fase oleosa deben lavarse con agua a
50°C. Para facilitar su limpieza. Se reúnen todos los residuos de la emulsión,y se etiquetan

indicando los componentes de la misma, y se disponen en un contenedor etiquetado como

residuos líquidos. Su disposición final se llevará a cabo de acuerdo a los procedimientos
establecidos por la Facultad.
Es importante considerar:
La importancia de hacer la emulsión a temperaturas elevadas, la importancia de la
incorporación de agentes tensoactivos a la emulsión, la importancia del orden de adición de
los componentes de la emulsión.
Considerar la relación que existe entre la viscosidad de la emulsión y las revoluciones de las
agujas del viscosímetro.
Discutir la importancia de dispersar adecuadamente el avicel RC591. Mencionar el tipo de
suspensión fabricada: floculada, defloculada, permanente. El objetivo de adicionar el tween
80. Menciona otros agentes suspensores que se pueden utilizar.
Comparar los resultados obtenidos con las emulsiones y suspensiones comerciales.
CONCLUSIONES:
CUESTIONARIO:
1. ¿Qué debe de contener una emulsión estable? Menciona los mecanismos de
desestabilización de una emulsión.
2. Dibuja cómo se comportan las emulsiones o/w y w/o.
3. Describe o explica que es el potencial zeta.
4. ¿Qué es la ley de Stokes, para que se utiliza y cuál es la ecuación de esta ley?
BIBLIOGRAFÍA:

Raymond C Rowe, PauL J Sheskey and Marian E Fuinn. (2009). Handbook of.
James Swarbrick (2004). Encyclopedia of Pharmaceutical Technology. USA. CRC Press
NOM SSA 059 2013
American Society of Health-System Pharmacists. (2014). Handbook of Injectable Drugs. USA.
American Society of Health-System Pharmacists; Eighteenth Edition.
Loyd V. Allen, Nicholas G. Popovich, Howard Ansel. (2011). Ansel´s Pharmaceutical Dosage
Forms and Drug Delivery Systems. USA Lippincott Williams
Michael E. AuLton. (2001). Pharmaceutics: The Science of Dosage Form Design. 2nd Edition
USA. Churchill Livingstone


PRÁCTICA 11. GELES FARMACEUTICOS Y COSMETICOS
 El alumno aprenderá a realizar un gel farmacéutico y evaluarlo cumpliendo
especificaciones farmacopeicas.
 El alumno aprenderá a realizar un gel farmaceútico.
 Conocerá los problemas que presenta una formulación de geles.
 Además conocer la importancia que tiene el orden de adición en la preparación.
COMPETENCIAS ACADÉMICAS:
 Aprender a fabricar un gel
 Analizar el comportamiento de los viscosantes (polímeros)
 Analizar el efecto de la presencia de agentes humectantes
 Conocer el equipo de fabricación de geles
 Analizar de acuerdo a la Farmacopea una gel
 Decidir si el producto es aprobado
INTRODUCCIÓN:
Existe una gran variedad de preparados tópicos que son utilizados de diferentes formas para
tratar problemas en la piel, los cuales se aplican directamente sobre un área afectada; la
importancia y acción de estos radica en la forma farmacéutica que se presenten beneficiando
el grado de absorción que tenga cada presentación.
La absorción a través de la piel depende de factores fisiológicos, estructura de la piel, flujo
sanguíneo, área anatómica; así como de la formulación y presentación del mismo.
Un gel, es una preparación semisólida que contiene él o los principios activos y aditivos,
sólidos en un líquido que puede ser agua, alcohol o aceite de tal manera que se forma una red
de partículas atrapadas en la fase líquida.

Un gel se puede clasificar por su uso y acción generalizando, ambos pueden ser particulados
(hidrogeles) o poliméricos (alcogeles), dependiendo del solvente y estructura que posean.
Actualmente se utilizan los geles de acuerdo a sus propiedades o características deseadas ya
sean geles en donde solo se busque hacer un efecto terapéutico (geles farmacéuticos) o
aquellos que tengan la característica de producir un efecto terapéutico y al mismo tiempo sea
un cosmético (geles cosmecéutico) y geles que solo produzcan una buena apariencia física
(gel cosmético). En la tabla 25, se muestran los geles y jaleas que se recomiendan en la
United States Pharmacopeia 24 (USP 24).
Tabla 25. Monografías de geles y jaleas en la USP 24
Gel de Hidroxido de Aluminio Gel Flucinonido
Gel Acido Aminobenzoico Gel Hydrocortisona
Gel Benzocaina Butamben and Clorhidrato Sistema OcµLar Hidroxipropil CelµLosa

Tetracaina
Gel Benzocaina Jalea Clorhidrato Lidocaina
Gel Benzoil Peroxido Gel Metronidazol
Gel Betametazona Benzoato Gel Clorhidrato Naftifina
Gel Silica Nondrµg Jalea Nasal Clorhidrato Fenilefrina
Gel Fosfato Clindamicina Gel Silica Porosa Nondrµg
Gel Desoximetazona Jalea Clorhidrato Pramoxina
Gel Desametazona Gel Acid Salicilico
Gel Dimetil SµLfoxido Nondrµg Gel Fluoruro Acido Fosforico
Gel Clorhidrato Diclonina Gel Fluoruro Estanoso
Gel Topico Eritromicina y Peroxido Benzoil Gel Tolnaftato
Gel Topico Eritromicina Gel Tretinoina

Revisar la importancia de cada uno de los constituyentes de un gel.

Revisar las diferencias en cuanto a la composición de un gel farmacéutico, gel cosmecéutico y

gel cosmético.
2 Probeta de 100 mL 6.0 g Benzocaína

2 Vaso de pp de 50 mL 0.5 g Mentol
1 Vaso de pp de 250 mL 1.0 g Carbopol 934
4 Vidrio de reloj 35.5 g Etanol
1 Espátula 2.0 g Propilenglicol
1 Piseta con agua 0.3 g Metilparabeno
1 Parilla de agitación 0.03 g Propilparabeno
1 Pipeta serológica de 5 mL 1.0 g Tween 80
1 Mortero con pistilo 2.5 g Glicerina
Vaso de precipitado de
1 c.s. Trietanolamina
600 mL
Vaso de precipitado de
1 c.s. *Colorante
100 mL
2 Agitadores de vidrio c.s. *Perfume
1 Agitador de globo* C.b.p. 100 Agua destilada
4 Envases* 0.5 g Acetaminofén
4 Etiquetas adheribles* 4.0 g Carboximetilcelulosa
Cajas Petri con medio
2
LB sólido

TOXICOLOGÌA:
TRIETANOLAMINA,
La trietanolamina cuyo nombre químico es Tri(2-Hidroxietil) amina tiene una fórmula es
N(CH2-CH2-OH)3 cuyo peso molecular es 149.19 g/mol. Se presenta como un líquido viscoso
de color amarillo pálido o incoloro y con un ligero olor a amoniaco.
Riesgos a la salud:
El vapor y la niebla producidos por el material calentado, pueden causar una irritación en las
vías respiratorias, que se presenta con Malestar nasal y secreción, dolor torácico y tos. La
ingestión de este reactivo puede provocar una sensación de dolor y quemazón de la boca, la
Garganta, el pecho y el abdomen, náuseas, vómitos y diarrea. Puede provocar vértigos,
somnolencia, desfallecimiento, debilidad, Colapso y coma. En caso de contacto con la piel un
contacto breve puede causar una ligera irritación con picazón y enrojecimiento local. Un
contacto prolongado puede causar una irritación más grave que se presenta con malestar o
dolor, enrojecimiento local, tumefacción y Posiblemente destrucción de los tejidos. Si el
contacto es ocular es puede provocar una irritación que se presenta con picazón, parpadeo
excesivo y lacrimación. Puede causar enrojecimiento y tumefacción de la conjuntiva. Es
posible que se produzca una lesión en la córnea.
Primeros Auxilios:
Inhalación: Sacar a tomar aire fresco. Ingestión: Si el paciente está totalmente consciente,
darle dos vasos de agua. Inducir el vómito. Proporcionar atención médica. Contacto con la
piel: Sacar la ropa contaminada. Lavar la piel con agua y jabón. Si la irritación persiste o si el
contacto ha sido prolongado o extendido, Proporcionar atención médica. Contacto ocular:
Lavar los ojos inmediatamente con agua y seguir lavándolos por lo Menos durante 15 minutos.
No quitar las lentes de contacto. Consultar enseguida al oftalmólogo.

METODOLOGÍA:
1. Tamaño del Lote: 100 mL
2. Descripción: Semisólido con olor característico.
3. Fórmula cuali-cuanti en la tabla 26.
Tabla 26. Fórmula Cuali-Cuanti de geles.

Componente Cantidad/Lote Pesado (g) Verificado
Fórmula 1
Benzocaína 6.0 %
Mentol 0.5 %
Carbopol 934 1.0 %
Etanol 35.5 %
Propilenglicol 2.0 %
Metilparabeno 0.3 %
Propilparabeno 0.03 %
Tween 80 1.0 %
Glicerina 2.5 %
Trietanolamina c.s.
Colorante c.s.
Perfume c.s.
Agua destilada c.s.p. 100 mL
Fórmula 2
Alcohol etílico 70% 240 mL
Agua destilada 160 mL
Carbopol 1.2 g
Glicerina 0.3 mL
Trietanolamina c.s.
Aceite de almendras 0.04 mL

Fragancia c.s.
Fórmula 3
Trietanolamina 5 mL
Carbopol 15 g
Alcohol 50 mL
desnaturalizado
Agua hervida fría 250 mL
Esencia c.s.
Colorante vegetal c.s.
Fórmula 4
Acetaminofén 0.5 %
Carboximetilcelulosa 4.0 %
de Sodio
Alcohol Etílico 10.0 %
Agua destilada c.s.p. 100 mL
Actividad 1: Elaboración de la Fórmula 1

Pesar o medir cada uno de los componentes de la fórmula.
Preparación de la mezcla A:
En un vaso de precipitados de 250 mL verter el agua destilada y calentar a 40-50°C. Adicionar

poco a poco el carbopol 934, y con ayuda de un agitador magnético, mezclar fuertemente y
hasta dispersión completa. El calentamiento ayudará a mejorar la solubilidad del carbapol.
Preparación de la Mezcla B:
En un vaso de precipitados de 50 mL verter la glicerina, el propilenglicol, calentar ligeramente
y adicionar uno a uno el metilparabeno y el propilparabeno agitando suave y constantemente

con varilla de vidrio hasta que se disuelvan completamente. Dejar enfriar la solución hasta que
alcance la temperatura ambiente.
Preparación de la Mezcla C:
En otro vaso de precipitados de 50 mL adicionar el tween 80 y el alcohol etílico, mezclar
perfectamente con el agitador de vidrio y posteriormente disolver uno a uno la benzocaína y el
mentol utilizando el agitador de vidrio.
Formulación del gel:

1. Verter en la mezcla A la mezcla B, manteniendo una agitación suave y constante con el
agitador de vidrio hasta incorporar perfectamente. Posteriormente adicionar la mezcla C y
mezclar con el agitador de vidrio hasta homogeneizar.
2. Medir el pH del gel y utilizar la cantidad suficiente de trietanolamina para ajustarlo entre un
pH de 6.0-7.0.
3. Adicionar el colorante, mezclar suavemente con el agitador de vidrio sin incorporar aire al
producto. Adicionar el resto del agua destilada.
4. Evaluar el gel
Actividad 2: Elaboración de la Fórmula 2.

1. Pesar o medir cada uno de los componentes de la fórmula.
2. Disminuir el tamaño de partícula del carbopol triturándolo en un mortero con pistilo para su
adecuada incorporación a la fórmula y evitar la posible formación de grumos.
3. En un vaso de precipitado de 600 mL colocar 160 mL de agua destilada. Calentar el agua a
40-50°C. Adicionar poco a poco 1.2 g de carbopol triturado hasta que este disuelta la cantidad
adicionada previamente. Mantener una agitación constante.
4. Adicionar 240 mL de alcohol etílico al 70%. Adicionar la glicerina. Adicionar la
trietanolamina en cantidad suficiente para ajustar el pH de 6.0-7.0.
5. Adicione finalmente el aceite de almendras y la fragancia.
6. Evaluar el gel.


1. Vertir en un vaso de precipitado de 600 mL, el agua destilada hervida y el carbapol.
2. Agitar continuamente con un agitador de bola continuamente hasta que se disuelva.
3. Adicionar la trietanolamina. Homogenizar suavemente hasta obtener una mezcla
homogénea.
4. Sin dejar de batir, añadir el alcohol desnaturalizado poco a poco, el colorante y la esencia,
hasta obtener el aroma y el tono deseado.
5. Evaluar el gel.
6. Con una espátula o cuchara, verter la formulación en un envase y taparlo.
7. Generar una etiqueta en donde se indique: nombre del producto, fecha de elaboración y
fecha de caducidad.

1. Pesar o medir cada uno de los componentes de la fórmula.
2. Disminuir el tamaño de partícula en un mortero con pistilo la cantidad necesaria de la
carboximetilcelulosa para lograr una adecuada incorporación de la materia prima a la fórmula
y evitar la posible formación de grumos.
3. En un vaso de precipitado de 600 mL colocar la porción de agua destilada y el volumen
requerido de alcohol etílico.
4. Adicionar poco a poco la carboximetilcelulosa a la solución anterior. Mantener en agitación
constante de preferencia en una parrilla de agitación. Una vez soluble, reposar el tiempo
suficiente para su completa hidratación.
5. Adicionar la cantidad suficiente de trietanolamina para ajustar el pH de 6.0-7.0.
6. Adicionar el acetaminofén e incorporarlo con agitación moderada. Esta formulación está
diseñada para geles antiinflamatorios como piroxicam.
7. Evaluar el gel.

Actividad 4: Evaluación de las fórmulas.

Determinación de apariencia e inspección óptica. Examinar y registrar las características
físicas del gel respecto a la apariencia de la forma farmacéutica. A contra luz, inspeccione la
ausencia o presencia de partículas sólidas dispersas.
quede enrasado.
4. Retirar el agua y secar el picnómetro. Llene el picnómetro con el gel sin formar burbujas de
aire.
5. Pesar el picnómetro con el gel a 25ºC. Calcule la densidad del producto mediante la
𝜌𝑚 = 𝜌𝑤
Dónde:
Determinación de pH
2. Medir el pH de la muestra de gel a 25ºC.
3. Registre el resultado obtenido.

Determinación de viscosidad
1. Nivelar el equipo con los tornillos niveladores del soporte hasta que la burbuja de aire se
encuentre centrada.
2. Seleccionar la aguja adecuada (No.7) con el botón spindle select y una vez parpadeando la
letra “S”, ajustar con las flechas (arriba o abajo) del panel de control. Presionar nuevamente el
control spindle select para guardar la configuración seleccionada.
3. Sujetar el cabezal donde se atornillará la aguja No.7.
6. Seleccionar la velocidad (20 rpm) a la que operará el equipo con las flechas (arriba o bajo)
y apriete el botón speed select para que el equipo guarde la configuración seleccionada.
7. Encender el equipo con el botón rojo derecho on/off.
8. Atemperar la muestra de gel a 25ºC y determinar la viscosidad (cps) a un minuto. Registre
el resultado obtenido y compárelo con la especificación del producto.
Evaluación del grado de separación:

1. Colocar una muestra del gel en un tubo de centrifuga graduado.
3. Medir la separación del gel (volumen de sedimentación F) con ayuda de un vernier,
tomando la altura total del gel con respecto a la altura de sedimentación.
F= Vu/Vo Relación entre el volumen de equilibrio del sedimento (V u) y el volumen total de la
suspensión (Vo). Valor entre 0 y 1.
Evaluación de la fórmula 3.
Colocar en condiciones estériles, los dedos de un estudiante sobre una caja Petri que
contiene medio LB u otro medio enriquecido. Aplicar el gel de la fórmula 2, suficiente para
lavar las manos e inocular una nueva caja. Sellar con papel parafilm e incubar a 37°C por 12
h. Tomar fotografías y discutir los resultados obtenidos.

Microscopía de campo claro:

1. Colocar una gota de cada gel en un portaobjetos. Colocar el cubreobjetos sobre la muestra.
2. Observar las muestras al microscopio con los objetivos de 10X y 40X. Tomar fotografías de
los campos observados.
Actividad 5: Evaluación de las fórmulas comerciales.

1. Adquiere formulaciones comerciales de apariencia parecida a las formulaciones elaboradas
durante la experimentación. Realiza las mismas evaluaciones de la actividad 4. Registra los
RESULTADOS:
Con los resultados obtenidos en el desarrollo del trabajo experimental, llena las tablas 27, 28,
29 y 30.
Tabla 27. Formulación 1.
FFL FFL comercial
homogénea
Color Blanco
Olor menta
Peso del producto 250 g
pH 6.5 +/- 0.5
Centrífuga (volumen <1% +/- 10%
de sedimento)
Tabla 28. Formulación 2.


FFL FFL comercial
homogénea
Color Blanco
Olor menta
pH 6.5 +/- 0.5
de sedimento)
Tabla 29. Formulación 3

FFL FFL
comercial
homogénea
Color Blanco
Olor menta
pH 6.5 +/- 0.5
de sedimento)

Tabla 30. Formulación 4

FFL FFL
comercial
homogénea
Color Blanco
Olor menta
pH 6.5 +/- 0.5
de sedimento)
DICTAMEN DEL CONTROL DE CALIDAD DEL PRODUCTO
APROBADO:
RECHAZADO:
FIRMA:____________________________
FECHA:
CÁLCULOS


Reunir todos los residuos generados durante la evaluación de los formulaciones líquidas y
disponerlos en un garrafón asignado el cual debe ser etiquetado como residuos químicos
líquidos. Finalmente deben ser desechados de acuerdo a los procedimientos establecidos por
la Facultad.
Analiza los resultados obtenidos. Compara la apariencia y la viscosidad de las tres
formulaciones. Haz hincapié en las diferencias observadas en función de la formulación.
Compara los resultados obtenidos con las formulaciones comerciales adquiridas.
CONCLUSIONES:
CUESTIONARIO
1. ¿Cuál es la importancia de dispersar adecuadamente el carbopol 934?
2. ¿Qué tipo de geles se prepararon?
3. ¿Cómo controlamos la viscosidad del producto, con el carbopol o con la trietanolamina?
4. ¿Qué objetivo tiene el adicionar el tween 80 y la glicerina?
5. ¿Qué otros agentes gelificantes se pueden utilizar?
BIBLIOGRAFÍA:
Raymond C Rowe, Paul J Sheskey and Marian E Fuinn. (2009). Handbook of. Pharmaceutical
Excipients. USA: Pharmpress.
James Swarbrick (2004). Encyclopedia of Pharmaceutical Technology. USA. CRC Press.
NOM SSA 059 2013.

American Society of Health-System Pharmacists. (2014). Handbook od Injectable Drµgs. USA.

American Society of Health-System Pharmacists; Eighteenth Edition.
Loyd V. Allen, Nicholas G. Popovich, Howard Ansel. (2011). Ansel´s Pharmaceutical Dosage
Forms and Drµg Delivery Systems. USA Lippincott Williams.
Michael E. Aulton. (2001). Pharmaceutics: The Science of Dosage Form Design. 2nd edition
Profeco: Gel fijador para el cabello. Tomado de:
www.profeco.gob.mx/tecnologias/usoperso/gelfc.asp



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Práctica 12 B. Sistemas no convencionales (Reservorios) 177

PRESENTACIÓN GENERAL DEL MANUAL DEL LABORATORIO DE FORMAS

generados durante la bioconversión mediante técnicas separación tales como la

REGLAMENTO PARA LOS LABORATORIOS DE LA F ACULTAD DE FARMACIA.

Residuos químicos sólidos, aquí se encuentran generalmente guantes, puntas que

CARACTERISTICAS DEL REGISTRO DE RESULTADOS Y REPORTE DE

diagramas de flujo, observaciones, discusión de resultados, conclusiones, cuestionario

PRACTICA 1. ESTERILIZACIÓN DE MATERIAL DE VIDRIO Y PREPARACIÓN DE

ACTIVIDADES PRELIMIN ARES:

CANTIDAD MATERIAL CANTIDAD REACTIVOS

2 Matraces de 250 mL 20 mL Etanol 70%

10 Cajas de Petri estériles CaCl2

* Este material deberá ser proporcionado por el estudiante.

5. Colocar algodón en el extremo de succión de las pipetas y envolverlas en papel de estraza

Actividad 2: Preparación del medio líquido y sólido.

Actividad 3: Preparación de CaCl2, NaCl y glicerol estéril.

MANEJO ESPECÍFICO DE RESIDUOS GENERADOS:

PRACTICA 2. GENERACIÓN DE UN BANCO DE CÉLULAS BACTERIANAS

Por otra parte, la criopreservación permite el mantenimiento de diferentes tejidos a

ACTIVIDADES PRELIMIN ARES:

CANTIDAD MATERIAL CANTIDAD REACTIVOS

1 Matraz de 125 mL esteril Etanol 70%

Actividad 1: Reactivación de cepas: DH5 y pVAX1 en medio sólido y líquido.

a) Reactivación en medio sólido (realizarlo en la primera práctica)

b) Reactivación en medio líquido (realizarlo un día antes de la segunda práctica)

Actividad 2: Generación de un banco de células bacterianas competentes.

MANEJO ESPECÍFICO DE RESIDUOS GENERADOS:

PRACTICA 3. VERFICACIÓN DE LA INTEGRIDAD DE UN VECTOR PLASMÍDICO

ACTIVIDADES PRELIMIN ARES:

CANTIDAD MATERIAL CANTIDAD REACTIVOS

Micropipetas de 0.5-10 µL,

Centrífuga para tubos de 15 Bromuro de etidio 10

Figura 1. Plásmido pVAX1 y plásmido pVAX1/EGFP

Figura 2. Digestión del plásmido pVAX1/EGFP.

En la figura 2, se muestran el ensayo de restricción de 1 g de plásmido pVAX1/EGFP con las

Actividad 1: Purificación del Plásmido pVAX1/EGFP utilizando el método de lisis

a temperatura ambiente por 2 min. Centrifugar a 11,000 rpm durante 10 minutos.

Actividad 2: Cuantificación de ADN plasmídico.

Actividad 3: Linearización del Vector PVax1-EGFP con la enzima de restricción Xho I

1. Descongelar el ADN del plásmido previamente purificado y almacenado a -20oC, conservar

Actividad 4: Identificación del patrón de restricción usando la enzima EcoR I.

Actividad 5: Electroforesis en gel de agarosa al 0.8 % de los plásmidos digeridos

Tabla 3. Registro de D. O., índice de pureza y concentración del ADN plasmídico.

Actividad 3 y 4: Linearización del Vector PVAX1-EGFP con la enzima de restricción Xho

Actividad 5: Electroforesis en gel de agarosa al 0.8% de los plásmidos digeridos.

MANEJO ESPECÍFICO DE RESIDUOS GENERADOS

Prieto, A. M. J., López, B. J., y Pueyo, de la Cuesta, C. Purificación de ácidos nucleicos.

PRACTICA 4. TRANSFORMACIÓN DE CÉLULAS COMPETENTES, SELECCIÓN

ACTIVIDADES PRELIMIN ARES:

CANTIDAD MATERIAL CANTIDAD REACTIVOS

20 Microtubos de 1.5 mL 20 mL Solución I

Actividad 2: Selección de clones positivos.

Actividad 3: Evaluación de la integridad del plásmido obtenido a partir de las clonas

2 µL de 10X Buffer Red

Actividad 4: Liberación del vector y el inserto a partir del plásmido pVAX1-EGFP

*Digestión con la enzima Kpn I

*Digestión con la enzima Xho I.

MANEJO ESPECÍFICO DE RESIDUOS GENERADOS:

PRACTICA 5. LIGACIÓN DE FRAGMENT OS DE ADN.

extremos romos. La ligación de extremos romos es intrínsecamente ineficiente y requiere de