Manual Tecnico de Produccion de Embriones in Vitro de Alpacas

MANUAL TÉCNICO: PRODUCCIÓN DE EMBRIONES IN VITRO DE ALPACAS
UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN
“PROYECTO DE INVESTIGACIÓN
USO DE LA BIOTECNOLOGÍA PARA EL MEJORAMIENTO GENETICO Y DESARROLLO DE
CAPACIDADES EN EL MANEJO DE ALPACAS (VICUGNA PACOS) EN LA ZONA ALTO
ANDINA DE TACNA”
Presenta:
MANUAL TECNICO:
PRODUCCION DE EMBRIONES IN VITRO

DE ALPACAS
Daniel Gandarillas Espezúa
Angelina Puma Iquise
Lisbeth Nataly Manrique Espinoza
Tacna – Perú
I
UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN
Responsable del proyecto de investigación:

MANUAL TÉCNICO: PRODUCCION DE EMBRIONES IN VITRO DE ALPACAS
Autores:

Angelina Puma Iquise
Lisbeth Nataly Manrique Espinoza
Editado por:
Universidad Nacional Jorge Basadre Grohmann Av. Miraflores S/N Tacna, Perú.
Proyecto de investigación: USO DE LA BIOTECNOLOGÍA PARA EL MEJORAMIENTO
GENETICO Y DESARROLLO DE CAPACIDADES EN EL MANEJO DE ALPACAS (VICUGNA
PACOS) EN LA ZONA ALTO ANDINA DE TACNA.
Equipo técnico: Está conformado por los siguientes profesionales del proyecto
de investigación.
Daniel Gandarillas Espezúa, Rosario Milagros Ríos Bobadilla, Edith Annie Torres
Hualla, Angelina Puma Iquise, Abel Eleazar Quispe Quispe
1a. edición – Noviembre 2021

Hecho el Depósito Legal en la Biblioteca Nacional del Perú N° 2022-00004
II
AGRADECIMIENTO
Los autores expresan su agradecimiento a la Universidad Nacional Jorge Basadre
Grohmann por el financiamiento a través de fondos de canon, sobre canon y regalías
mineras.
Este manual se hace realidad en el marco del proyecto “Uso de la biotecnología para el
mejoramiento genético y desarrollo de capacidades en el manejo de alpacas (vicugna
pacos) en la zona alto andina de Tacna”.
Igualmente se agradece a los productores alpaqueros por sus aportes para lograr para
realización de este proyecto. Al equipo técnico del proyecto de investigación por sus
aportes científicos en pro de la ciencia.
III
PREFACIO
El presente manual ha sido preparado por equipo técnico del laboratorio de Reproducción
Animal de la Universidad Nacional Jorge Basadre Grohmann de Tacna.
El objetivo de este manual es difundir los trabajos que se viene realizando dentro del
proyecto titulado. “USO DE LA BIOTECNOLOGÍA PARA EL MEJORAMIENTO GENÉTICO Y
DESARROLLO DE CAPACIDADES EN EL MANEJO DE ALPACAS (Vicugna pacos) EN LA ZONA
ALTO ANDINA DE TACNA, financiado a través de fondos de canon, sobre canon y regalías
mineras con resolución rectoral N°3780-2014/UNJBG. Donde se desarrollaron diferentes
protocolos para la producción de embriones in vitro en alpacas. La producción de
embriones de alpaca comprende las etapas de maduración de los ovocitos, capacitación
de los espermatozoides, fecundación y cultivo de los embriones hasta el estadio de mórula
o blastocito. Donde finalmente estos embriones pueden ser crio- preservado o transferido.
Este manual dará a conocer los procedimientos de manera sencilla y fácil para su
entendimiento y aplicación de la biotecnología reproductiva a profesionales, estudiantes
técnicos y público en general que servirá como guía para quienes quieran aprender y tener
mayores conocimientos sobre la producción de embriones in vitro en alpacas.
IV
PRESENTACION
Durante el periodo 2015-2020, especialmente en los tres últimos años, el proyecto ha
desarrollado investigación en el área de la biotecnología reproductiva en alpacas mediante
técnicas de inseminación artificial y protocolo de producción de embriones in vitro que
fortalecen la base científica en esta área, al tiempo que benefician a la sociedad en su
conjunto por medio de trabajos de investigación generados y capacitaciones a los
productores.
La Universidad Nacional Jorge Basadre Grohmann comprometida en el desarrollo
agropecuario y en el fortalecimiento de capacidades a través de la ejecución del proyecto
busca aplicar y difundir las técnicas de reproducción asistida empleadas en programas de
mejoramiento genético, con el objetivo de mejorar la calidad de fibra de los animales e
incrementar los ingresos económicos de los productores.
V
Contenido
PREFACIO ......................................................................................................................... IV
INTRODUCCION .................................................................................................................. 1
Capítulo I ............................................................................................................................4
Generalidades .............................................................................................................4
1.1. Métodos de recolección de ovocitos ............................................................... 4
1.2. Técnicas de recuperación de los COCs .............................................................8
1.3. Selección y clasificación de ovocitos ...............................................................9
1.4. Maduración in vitro ......................................................................................... 10
1.5. Recuperación de los espermatozoides............................................................ 11
1.6. Selección y capacitación de espermatozoides. .............................................. 14
1.7. Fecundación in vitro (FIV) ............................................................................... 15
1.8. Cultivo in vitro (CIV)......................................................................................... 16
Capítulo II ......................................................................................................................... 18
Procedimientos para la producción de embriones in vitro en el Laboratorio de
Reproducción Animal de la Universidad Nacional Jorge Basadre Grohmann de Tacna ..... 18
2.1. Materiales y equipos para la producción de embriones in vitro. ........................... 19
2.2. Preparación de Medios Para Embriones in vitro.................................................23
2.3. Procedimientos para Producción de Embriones in vitro de Alpaca.................... 30
2.4. Recepción de las muestras. ............................................................................... 31
2.5. Recuperación y selección de los COCs ..............................................................32
VI
2.6. Metodología para la Maduración in vitro ............................................................. 36
2.7. Fertilización in vitro ............................................................................................ 37
2.7. Colección y Capacitación Espermática ............................................................... 38
2.8. Inseminación in vitro ......................................................................................... 42
2.9. Cultivo in vitro de embriones ..............................................................................43
Referencias bibliográficas ................................................................................................ 46
VII
INTRODUCCION
La crianza de alpacas y llamas son el único sustento de miles de familias del mundo andino
(Ruíz, 2013); donde la calidad de fibra ha sido el principal impulso de la investigación y
programas de desarrollo genético (Miragaya et al., 2006); sin embargo sus características
reproductivas, son la causa de su pobre rendimiento reproductivo en comparación con
otras especies domésticas (Brown, 2000); esta deficiencia reproductiva de los camélidos
es bajo debido al inicio tardío de la pubertad, la corta temporada de reproducción, pérdida
embrionaria y un largo período de gestación de 11.5 meses (Tibary & Vaughan, 2006).
La aplicación de biotecnologías reproductivas, como la inseminación artificial, la
transferencia de embriones y fertilización in vitro podría aumentar rápidamente el número
de animales genéticamente superiores (Miragaya et al., 2006).
Los primeros trabajos de investigación en la producción de embriones por fertilización in
vitro (FIV) en camélidos sudamericanos se han realizado utilizando ovocitos recuperados
de animales beneficiados (Del Campo et al., 1994; Gamarra et al., 2008; Mendoza et al.,
2008). Dichos trabajos han sido de valiosa ayuda para investigar, estandarizar protocolos
de maduración in vitro (MIV) y FIV. Pero, aún no existe un protocolo definido que permita
obtener tasas altas de embriones; sin embargo, se han reportado gestaciones tempranas
en llamas (Mendoza et al., 2013; Trasorras et al., 2014) y alpacas (Mendoza et al., 2013) y el
nacimiento de la primera llama en el mundo con la aplicación de esta biotecnología (Landeo
et al., 2016). Por eso, esto implica mayores estudios que permitan estandarizar protocolos
de MIV, FIV y cultivo in vitro para obtener mayores tasas de gestación y natalidad en
camélidos.
La producción de embriones in vitro comprende diferentes procesos: la colección de
ovocitos, maduración nuclear y citoplasmática, la capacitación espermática, la
1
fecundación in vitro y el cultivo embrionario; ocurriendo en cada una de estas etapas
diferentes modificaciones bioquímicas y estructurales en los gametos y los embriones
(Ruiz López, 2013).
El objetivo de esta manual es dar a conocer los procedimientos que involucran la
producción in vitro de embriones en alpacas para su uso en laboratorios de biotecnología
2
reproductiva.
3
Capítulo I
Generalidades
La Producción in vitro de Embriones (PIVE), es una técnica para la multiplicación
de material genético, la cual abarca procesos de maduración de ovocitos, capacitación
espermática, fertilización y cultivo in vitro.
1.1. Métodos de recolección de ovocitos

Para la obtención de ovocitos inmaduros de los complejos ovocitos cúmulus (COCs)
existen varios métodos para su obtención, se pueden recuperar de animales in vivo como
también animales post-morten las cuales son:
1.1.1. Animales vivos: Laparoscopía/ Laparotomía
El desarrollo de estas técnicas es una herramienta clínica muy importante en el
examen del tracto reproductivo en llamas y alpacas (Rodríguez et al., 2014, Wilker et al.,
1994). La técnica de laparoscopía es menos invasiva que la técnica de laparotomía, el
equipo laparoscópico consta de un laparoscopio de 5 mm / 0, con tres puertos de trocar /
cánula, una pinza de agarre atraumática y una fuente de luz cableada. La pinza de agarre se
utiliza para tirar del mesosalpinx en diferentes direcciones para exponer las diferentes
superficies de los ovarios, permitiendo así la aspiración de todos los folículos de >2 mm.
4
Figura 1:
Laparoscopia en alpaca
La técnica de laparotomía es invasiva y consiste en un conjunto de maniobras
quirúrgicas que se realizan a los efectos de crear una vía de acceso a los órganos
contenidos en la cavidad abdominal: primero se realiza una incisión de la piel con un bisturí
sobre la línea sagital, seguidamente divulsión del tejido subcutáneo y por ultimo incisión de
línea alba y peritoneo, luego el ovario es localizado para realizar punciones de los folículos
maduros, con una aguja de 18 G acopladas a jeringa de 10 ml. Una vez obtenido el líquido
folicular es vaciado a una placa Petri para realizar su búsqueda de los ovocitos (Pino, 2004).
1.1.2. Aspiración folicular guiada por ultrasonido (OPU)
La técnica de OPU permite la obtención de ovocitos de calidad de forma estable a
partir de animales previamente seleccionados y controlados. Este procedimiento es no
invasivo y repetible, no afecta el estado reproductivo ni compromete la fertilidad futura de
las donantes. Puede ser utilizada en aquellos animales que presentan problemas
reproductivos (oviductos obstruidos, metritis persistente, etc), viejos, refractarios a los
tratamientos superovulatorios, así como animales saludables de alto valor genético que se
encuentren vacías (Murphy y Pescador 1996).
5
Descripción de la Técnica: El dispositivo se manipula desde el exterior de la hembra con una
mano mientras que la otra mano es introducida en el recto para fijar el ovario contra el
transductor visualizándose el ovario y los folículos en la imagen ecográfica, una vez fijado
el ovario, la aguja es visualizada en el sector y con movimientos suaves y cuidadosos es
perforada la pared vaginal y los folículos son puncionados, donde el líquido folicular es
aspirado con una bomba de vacío y recolectados en un tubo colector conteniendo un buffer
fosfato salino (PBS) para realización de la búsqueda de los COCs (Corredor & Páez, 2012)
1.1.3. Obtención de los COCs de ovarios obtenidos post mortem
Esta técnica es la menos costosa de obtener ovocitos de forma numerosa y viable.
También es útil para el aprovechamiento de hembras que fueron sacrificadas por motivos
sanitarios y accidentes. La técnica conlleva factores externos que influyen en la
manipulación de los COCs antes de realizar el cultivo, de modo que pueden afectar en la
expresión de la competencia del desarrollo.
Dentro de los factores externos que están relacionados con la manipulación de los ovarios,
se encuentran la temperatura de almacenamiento de los ovarios y el tiempo de recolección
de los ovocitos después del sacrificio. La obtención de los ovarios, debe realizarse
inmediatamente después de la muerte del animal, siendo habitual hacerlo dentro de los 30
minutos siguientes al sacrificio (Ruiz & Correa, 2007; Mendoza et al., 2008; Gamarra et al.,
2008; Ruiz et al.,2009; Sacha & Rojas, 2009). Donde el transporte se hace en solución
fisiologica o PBS con antibióticos (Ratto et al., 2005; Huanca et al., 2009). El tiempo que
transcurre, desde la colecta de los ovarios hasta el cultivo de los ovocitos, debe oscilar
entre 2 y 5 h (First & Parrish, 1988), aunque después de ocho horas desde la colecta de los
ovarios todavía se puede conseguir la maduración in vitro, siempre y cuando los ovarios se
mantengan por encima de 24°C.
6
Figura 2:
Obtención de los COCs de Ovarios Obtenidos Post Mortem
A B
C D
A: Obtención de muestras de animales sacrificados en el matadero). B: Extracción de los ovarios.

C: Ovarios de los animales sacrificados. D: Transporte de las muestras en un termo a temperada.
Figura 3:
Obtención de COCs Por Aspiracion Folicular Guiada por Ultrasonografia (OPU)
A B C
A y B: Entrada del transductor unido con la aguja por la vagina de la alpaca. C:

obtención de la muestra en un tubo falcón de 45 ml.
7
1.2. Técnicas de recuperación de los COCs

Para la recuperación de los COCs, las técnicas más utilizadas son:
1.2.1. Aspiración folicular
Este método consiste en la punción de la pared de los folículos antrales de tamaño 2 a 6
mm claramente visibles y la aspiración del líquido folicular se lleva a cabo utilizando una
agua unida a una jeringa o a una bomba de vacío (Ward y col, 2000). Este método es más
simple y rápido que la disección (Gordon, 2003). Aunque, la calidad de los ovocitos
obtenidos es menor que la de los recuperados por disección folicular, debido a que la
aspiración ocasiona la separación de las células del cúmulo que se encuentran firmemente
unidas a las de la granulosa. La presencia de estas células tiene una importancia decisiva
para la maduración y la fecundación in vitro (Ahmed y col 2001)
1.2.2. Técnica de slicing
Esta técnica consiste en sujetar los ovarios con una pinza simple y realizar cortes
longitudinales sucesivos en la superficie ovárica con bisturí, recuperando los COCs del
medio donde se encuentran sumergidos (Lorenzo et al., 2015). Se deja reposar por 10
minutos y una vez terminado este proceso los COCs serán buscados, seleccionados y
Figura 4:
Recuperación de COCs por aspiración folicular
A B
A: medidas de los folículos antes de la aspiración. B: Aspiración de los

folículos de 2 a 6 mm
8
clasificados. (Rivera et al., 2010). Con esta técnica de slicing se recuperan gran cantidad de
COCs por ovario, pero la población ovocitaria resulta muy heterogénea y es por eso que
debe hacerse una estricta selección de los COCs.
Figura 5:
Cortes superficiales en forma longitudinal sobre el ovario en una placa Petri
1.3. Selección y clasificación de ovocitos

Una etapa crítica en el procedimiento de FIV es la selección de ovocitos de buena
calidad para poder garantizar un óptimo desarrollo.
El aspecto más importante que se evalúa en la calidad de ovocitos, es la presencia
del complejo ovocito cumulus, con un mínimo de 5 capas que cubran la totalidad de la
superficie del ovocito, el citoplasma sea de color gris oscuro uniforme y no contenga
manchas (Palma, 2001).
Tabla 1:
Clasificación de Complejos Ovocito Cúmulus (COCs) de Alpacas
Categorías Características por Categoría
I COCs con cúmulos de capas múltiples (>5 capas), compacto
citoplasma homogéneo.
II COCs parcialmente rodeados por células del cúmulo (entre 2-4
capas), y con citoplasma homogéneo.
III COCs con cúmulo ≤ 1capa de granulosa o en partes desnudos y
citoplasma variado.
IV Incluye a los ovocitos desnudos y con citoplasma granular.
Fuente: Ratto et al., (2005)
9
Figura 6:
Clasificación de ovocitos
I II
III IV
1.4. Maduración in vitro

La maduración de los ovocitos es un proceso que permite reducir la carga
cromosómica de la especie a la mitad, convirtiéndose en una célula haploide (Gordon, 1994)
Durante el proceso de maduración, tanto in vivo como in vitro de ovocitos, ocurren una serie
de cambios que permiten la reanudación de la meiosis. Estos eventos deben ocurrir antes
de la fertilización y se caracterizan por la expansión de las células del cúmulus, la
eliminación del primer corpúsculo polar y la formación de la metafase II (Hyttel et al., 1986).
Para la maduración in vitro de ovocitos, se utilizan medios de cultivo clasificados en medios
simples y complejos (Gordon, 1994). Un medio simple contiene una solución salina
fisiológica bufferada usualmente con bicarbonato y adicionada de piruvato, lactato y
glucosa. Un medio de maduración complejo contiene además de los constituyentes de un
medio simple, aminoácidos, vitaminas, purinas y otras sustancias asociadas al suero. En
camélidos se ha usado con éxito el Tissue Culture Medium 199 (TCM 199) como
10
estabilizadores de pH, suplementado con piruvato lactato, vitaminas, aminoácidos,
proteína, y suero fetal bovino (Palma, 2001).
Figura 7:
Maduración in vitro de ovocitos
A B
A: agrupación de COCs. B: maduración de COCs en microgotas
1.5. Recuperación de los espermatozoides.

Para la recuperación de los gametos masculinos se pueden obtener de animales
sacrificados y de animales vivos las cuales existen diferentes técnicas.
1.5.1. Recuperación de espermatozoides del epidídimo.
Cuando es sacrificado al animal se extrae los testículos y se retira la cola del
epidídimo, se extrae los espermatozoides usando solución fisiológica buferada (PBS). Esta
técnica está orientada principalmente al rescate del germoplasma de individuos muertos
súbitamente, cuyas especies se encuentren en peligro de extinción y cuyas colectas de
semen sean difíciles de realizar (Anel et al., 2002); no obstante, la recuperación de
espermatozoides epididimarios también se constituye en una herramienta factible de
usarla con machos sin valor genético y/o económico como modelos para experimentar
diversos efectos en las respuestas biológicas y fisiológicas de los espermatozoides. En
camélidos sudamericanos se vienen recuperando espermatozoides epididimarios de llama
y alpaca debido a la dificultad para obtener muestras de espermatozoides bajo los
diferentes procedimientos (Ratto et al.1999; Santiani, 2012).
11
Figura 8:
Recuperación de Espermatozoide del Epidídimo
A B C D
A: extracción de testículos de alpacas sacrificados en el camal. B: Testículo sobre un papel toalla,

retirando todas las capas, para la identificación del epidídimo. C: Asilando la cola del epidídimo para
limpiar los restos de tejidos. D: La cola del epidídimo colocado sobre una placa atemperada con
medio SP –TALP.
Colección de espermatozoides con vagina artificial (VA).
Consiste en un dispositivo que se acopla a un maniquí en forma de una hembra
sentada en posición de copula o en caso se utiliza junto a una hembra receptiva; la vagina
artificial es una modificación de la vagina artificial usada para vacunos y ovinos, la cual
consiste en un tubo rígido de 7 cm de diámetro por 25cm de largo con una funda interna de
látex, un cono de látex al que envolvía un alambre en espiral simulando el cérvix de la alpaca
y al final un frasco de colección de semen.
Figura 9:
Colección de semen con vagina artificial
A B C
A: La VA armado y cubierta con una frazadilla eléctrica para mantener una temperatura
constante. B: Colección de semen con la ayuda del maniquí, acoplado a una vagina artificial
1.5.2. Obtención
controlando de espermatozoides
ciertos parámetros. C: Colección por Electro
de semen eyaculación
con VA.
12
Fernandez Baca y Calderon (1996), reportaron el uso del electro eyaculación para la
colección de semen de alpacas, utilizando un equipo de fabricación nacional, con una
intensidad máxima de 40 voltios, se obtuvieron muestras de semen con la ventaja de
realizar la colección sin la necesidad de tener hembras en celo, acortar el tiempo de
colección y realizarla a lo largo de todo el año.
1.5.3. Desviación de los Conductos Deferentes
Con el fin de colectar espermatozoides libres de la secreción de las glándulas
anexas en alpacas, se desarrollaron las técnicas de la desviación de los conductos
deferentes y la extirpación de la próstata; la primera técnica intenta colectar
espermatozoides directamente de su reservorio, la cola del epidídimo, sin que estos
tengan contacto con las secreciones de las glándulas anexas, desviando quirúrgicamente
los conductos deferentes hacia la región de la cara interna del muslo, formando una fístula
permanente en la piel desde donde se puedan colectar continuamente sin la necesidad de
tener hembra receptiva ni someter a los espermatozoides a la acción de enzimas
proteolíticas que intenten licuefactar el coágulo del eyaculado para un mejor manejo
espermático (Paricahua y Col., 2001; Quintano, 2002).
Figura 10:
Obtención de semen por Electro eyaculación
A B C
A: equipo de electro eyaculador. B: descargas eléctricas de 2 segundos de duración,

14 voltios, 4 amperios, 25 ciclos/seg y 2 seg de descanso entre cada pulsación. C:
obtención de semen por electroeyaculaculación.
13
1.6. Selección y capacitación de espermatozoides.

Al menos dos metodologías han sido descritas para el lavado de las células
espermáticas y su selección en camélidos sudamericanos. Estas son: Swin-up y gradiente
de percoll
1.6.1. Método SWIM-UP
Esta técnica se realiza cuando la muestra es normozoospérmia, la cual fue desarrollada
por Parrish et al., (1986), en esta se seleccionan los espermatozoides en virtud de su
movilidad intrínseca; consiste en colocar el semen en el fondo de un tubo cónico con medio
FER-TALP y puesto a incubación por media hora con una inclinación de 45º. Donde los
espermatozoides con mejor movilidad subirán hacia la superficie, recuperándolos para
realizar la fertilización.
Figura 11:
Selección y capacitación de espermatozoides por Swin-up
A B
A: Centrifugación de la muestra por un tiempo determinado. B: formación del pellet en el

fondo del tubo eppendorf con medio FERT-TALP después de la centrifugación.
1.6.2. Método PERCOLL
En este método los espermatozoides se seleccionan en virtud de su velocidad potencial y
su relativa alta densidad. El semen diluido en medio de capacitación, es colocado en la
parte superior del percoll®, el gradiente intermedio posee una concentración diferencial de
45% y el gradiente inferior una concentración de 90%; luego este se procede a su
14
centrifugación, obteniendo espermatozoides viables concentrados en el fondo del tubo,
quedando en las fases del gradiente los espermatozoides muertos o de baja movilidad, el
plasma seminal y demás estructuras (Dode et al., 2002)
1.7. Fecundación in vitro (FIV)

La técnica de FIV consiste en la unión del espermatozoide con el ovocito, una vez
terminado el período de maduración in vitro; los gametos interaccionan, se unen y tras la
activación ovocitaria dan origen a un zigoto. Esta técnica se ha definido como la
penetración de espermatozoides con capacidad de fecundar a ovocitos maduros fuera del
aparato reproductor de la hembra (Lopera, 2009). La fecundación in vitro se busca imitar
los eventos que su suceden fisiológicamente en la región ámpula del oviducto mediante
técnicas y protocolos de laboratorio (Greve et al., 1987).
Figura 12:
Ovocitos maduros con espermatozoides capacitados en medio de fertilización
15
1.8. Cultivo in vitro (CIV)

El cultivo embrionario in vitro intenta simular las condiciones en las que se desarrolla un
embrión in vivo en estadio preimplantacional. Los eventos más importantes del CIV son: la
primera división celular que se produce entre las 24 y 48 horas post fertilización, la
activación del genoma embrionario, la compactación de la mórula y la formación del
blastocito. En la actualidad existen tres sistemas para el cultivo de los cigotos y su
posterior desarrollo in vitro hasta el estadio de blastocisto: el sistema de co-cultivo, el
cultivo en medios definidos y el cultivo en medios condicionados (Marquant-Leguienne y
Humbolt, 1998).
Figura 13:
Desarrollo de embriones en medio de cultivo in vitro
Figura 14:
Co-cultivo de células
A B
A: Cultivo de células de la granulosa. B: Embriones desarrollados en co-cultivo de

células.
16
17
Capítulo II
Procedimientos para la producción de embriones in vitro en el Laboratorio

de Reproducción Animal de la Universidad Nacional Jorge Basadre
Grohmann de Tacna
Para la producción de embriones en el laboratorio se realiza los cuatro pasos siguientes:
Figura 15:
Esquema sobre la metodología para la producción de embriones in vitro
32 Horas 18- Horas 2- 8 Días
Obtención de Maduración In Fertilización In Cultivo de

los COCs vitro vitro Embriones
1 2 3 4
Evaluación de embriones
Transferencia de
embriones o
criopreservación
18
2.1. Materiales y equipos para la producción de embriones in vitro.

Para la producción de embriones in vitro se requieren los siguientes equipos y materiales:
Figura 16:
Equipos del laboratorio de reproducción animal
Incubadora de CO2 Horno de Secado
Microscopio invertido de Microscopio Estereoscopio

fluorescencia con cámara Trinocular
fotográfica
19
Baño María digital Platina térmica
Microscopio Trinocular compuesto

Cámara de flujo laminar
Balanza analítica Micro centrifuga de sobre mesa
20
Medidor de pH sobre mesa Autoclave vertical
Equipo Bidestilador Refrigeradora
21
Figura 17:
Materiales del laboratorio de reproducción animal
Tobos de 15 y 45 ml Placas Petri de 30 y 90 mm
Micropipetas de 10, 100, 200 y Tubos de 0.2, 0.5 y 1.5 ml
1000 ul
Pinza simple y tijera Filtros de 0.22um
22
Vasos precipitados diferentes Frascos de vidrio diferentes
volúmenes volúmenes
2.2. Preparación de Medios Para Embriones in vitro

2.2.1. Solución salina fisiológica: medio para el transporte de ovarios
Para preparar 250 ml de solución:
▪ Pesar en una balanza 2.25g de NaCl2 y colocar en una botella graduada de 500 ml
▪ Llenar con agua ultra pura hasta el nivel de 250 ml y homogenizar hasta que se
disuelva y finalmente agregar 50 mg de antibiótico (Estreptomicina)
▪ Colocar la fecha de preparación y almacenar a 4 ºC hasta su uso
Tabla 2: Composición de la solución fisiológica
Reactivo Marca Cantidad
NaCl2 Sigma 2,25 gr
Estreptomicina Sigma 50 mg
H2O Ultra pura 250ml
23
2.2.2. Medio de maduración in vitro
Para preparar 10 ml:
▪ En un tubo de 15 ml rotular fecha (día, mes) y el nombre quien lo preparó.
▪ En este tubo se añade 9 ml del medio TCM-199 (EARLS SALTS), y seguidamente se
va agregando los siguientes reactivos:
Tabla 3:
Composición del medio de maduración in vitro
Reactivo Concentración Marca Cantidad
Suero fetal Bovino (SFB) 10% sigma 1.0 ml
FSH 0.5ug/ml sigma 10 µl
Piruvato de Na 0.2mM sigma 10 ul
17-β estradiol 50ug/ml sigma 10 µl
gentamicina 1ug/ml sigma 10 µl
▪ Medir el pH la cual debe estar en el rango de 7.2 y 7.4
▪ Terminado lo agregado, el medio de maduración es pasado por un filtro de
membrana de 0.2 um
▪ Colocar el medio dentro de la incubadora de CO2, como mínimo dos horas antes de
su uso para su gasificación del medio.
24
Figura 18:
Preparación del medio de maduración
A B C
A: Filtrado de Medio de maduración con filtro de 0.2um sobre otro tuvo falcón de 15 ml. B:
medio de maduración suplementado. C: el medio preparado colocado en la incubadora para
su gasificación
2.2.3. Preparación de Medio de Fertilización Stock (FERT-TALP)
Para preparar 25 ml de medio:
▪ En un tubo falcón de 50 ml en el rotulo colocar la fecha y el nombre del responsable
quien lo preparo.
▪ Colocar solo 5 ml de agua ultra pura luego pesar y adicionar los siguientes reactivos:
Tabla 4: Composición del Medio FERT – TALP Stock

NaCl 114 Mm Sigma 0.1650 g
KCl 3,2 Mm Sigma 0.0060 g
NaHCO3 25 Mm Sigma 0.0530 g
NaH2PO4 0,4 Mm Sigma 0.0012 g
Cl2+2H2O 2 Mm Sigma 0.0074 g
MgCl2+6H2O 0,5 Mm Sigma 0.0025 g
Lactato de Na 10 mM Sigma 47 ul
Rojo de fenol - Sigma 25 ul
H2O - Agua ultra 25 ml
pura
25
▪ Una vez adicionado todos los reactivos se completa los 20 ml para completar los 25
ml, homogenizar con la ayuda del vórtex.
▪ Medir el pH, que debe estar a 7.8 obteniendo el color rosado.
▪ Tomar 10 ml y el resto almacenar en la nevera a 4ºC máxi.mo un mes.
▪ Se adiciona los siguientes reactivos:
Tabla 5: Composición para el Medio de Fertilización Final.
Reactivo Concentración Cantidad
Fert - Talp 10.0 ml
Piruvato de Na 10 mM 10 ul
BSA Faty Free 6 mg/ml 60 mg
Estreptomicina 50 ug/ ml 10 µl
▪ Una vez adicionado todo, se agita manualmente suave y se filtra en un nuevo tubo
falcón previamente rotulado
▪ Colocar a la incubadora de CO2, mínimo dos horas antes de usarlo, para su
gasificación del medio de fertilización. Este medio se debe preparar un día antes de
la fertilización.
Figura 19:
Preparación de medio FERT-TALP.
A B
A: filtrado del medio FERT-TALP. B: medio de FERT-TALP preparado
26
2.2.4. Preparación del Medio de Cultivo de Embriones
Para prepara este medio de Fluido sintético del oviducto (SOF) se divide en tres partes SOF
Stock A, SOF Stock B y SOF Stock C
Para preparar 25 ml de medio SOF Stock “A”:
▪ Marcar en un tubo cónico de 50 ml y colocar el nombre del medio, fecha de
elaboración y la persona quien lo preparó.
▪ Colocar 10 ml de agua ultra pura y adicionar los siguientes reactivos:
Tabla 6:
Composición de SOF Stock “A”.
NaCl 107,7 mM Sigma 1.5740 g
KCl 7,16 mM Sigma 0.1340 g
NaH2PO4 1,19 mM Sigma 0.0310 g
Cl2+2H2O 1,71 mM Sigma 0.0630 g
MgCl2+6H2O 0,49 mM Sigma 0.0385 g
Rojo fenol Sigma 25 ul
H2O Agua ultra pura 25 ml
▪ Completar con agua ultra pura hasta los 25 ml y homogenizar con la ayuda del vortex
▪ Almacenar en refrigeración 4ºC por un tiempo máximo de un mes
Para preparar 25 ml de medio SOF Stock “B”:
27
Tabla 7:
Composición de SOF Stock “B”.
Reactivos Concentración Marca Cantidad
NaHCO4 37 mM Sigma 0.3300 g
Rojo de fenol Sigma 25 ul
H2O Agua ultra 25 ml

pura
▪ Completar con agua ultra pura hasta los 25 ml y homogenizar con la ayuda
del vortex.
▪ Almacenar en refrigeración a 4ºC por un tiempo máximo de un mes.
Para preparar 25 ml de medio SOF Stock “C”:
Tabla 8:
Composición de SOF Stock “C”.
H2O - Agua ultra pura 25 ml
Stock A - - 2.5 ml
Stock B - - 4 ml
L- glutamine 0,33 mM Sigma 0.0037 g
Glicina 5 mM Sigma 0.0094 g
Taurina 5 mM Sigma 0.0156 g
Lactato de sodio 60% 3,3 mM Sigma 11.5 ul
BME 50 X Sigma 0.5000 ml
MEM 100 X Sigma 0.2500 ml
Insulina 10 ug/ml Sigma 25 ul
Estreptomicina 50 ug/ml Sigma 25 ul
28
▪ Completar con agua ultra pura hasta los 25 ml y homogenizar con la ayuda
del vortex
▪ Medir el pH la cual debe estar de 7.4
▪ Almacenar en refrigeración a 4 ºC, máximo por un mes.
Figura 20:
Medio de cultivo SOF
SOF Stock A SOF Stock B SOF Stock C
Preparar 10 ml de medio SOF final
▪ En un tubo de 15 ml colocar la fecha de elaboración y nombre del medio.
▪ Colocar 9 ml del SOF Stock C.
▪ Adicionar los siguientes suplementos.
Tabla 9:
Suplemento del SOF final
SFB - Sigma 1 ml
BSA Faty Free 3 mg/ ml Sigma 30 mg
29
▪ Filtrar en el tubo cónico de 15 ml con un filtro de membrana de 0,2 um.
▪ Colocar el medio en la incubadora de CO2, mínimo dos horas antes de ser utilizado.
2.3. Procedimientos para Producción de Embriones in vitro de Alpaca.

2.3.1. Obtención de muestras
Materiales para recolección y transporte de ovarios de alpaca post mortem.
- Termo
- Termómetro
- Tijera
- Solución fisiológica
- Guantes
- Barbijo
- Gorro descartable
Figura 21:
Materiales para el transporte de las muestras
A B
A: Termo, frasco con solución fisiológica y termómetro. B Gorro, Guantes

y barbijo
Los ovarios son recolectados de hembras sacrificadas en el matadero realizando los
siguientes pasos:
▪ Un día antes preparar la solución fisiológica.
30
▪ Llenar al termo 150 ml de solución fisiológica la cual tiene que estar a una
temperatura de 35 ºC.
▪ Se identifica el aparato reproductor de la hembra al momento de la evisceración,
con unas tijeras curvas se diseccionan los ovarios, una vez retirados los ovarios
estos son colocados inmediatamente al termo con solución Fisiológica, cerrar el
termo y controlar la temperatura constantemente a 35 ºC, hasta la llegada al
laboratorio (ver figura 21)
Figura 22:
Procedimiento para la obtención de muestras
A B C
A: alpacas beneficiadas. B: disección de ovarios. C: control de temperatura de las muestras
2.4. Recepción de las muestras.
Horas antes de la recepción de muestras, se prepara todo los materiales y la solución
fisiológica, la cual tiene que estar a una temperatura de 37 °C. La recepción de los ovarios
se realiza en el área de lavado del laboratorio.
▪ Cuando los ovarios llegan al laboratorio, retirar cuidadosamente la solución
fisiológica del termo.
31
▪ Colocar en un vaso precipitado los ovarios y retirar con tijera curva restos de los
tejidos.
▪ Lavarlos con solución fisiológica dos o tres veces hasta eliminar la cantidad de
sangre y obtener un color cristalino de la solución.
▪ Colocar al vaso precipitado los ovarios en baño María a temperatura de 37 ºC y
mantenerlos allí durante todo el proceso de aspiración.
Figura 23:
Procedimiento de limpieza y lavado de los ovarios
A B C D
A: ovarios de alpacas. B: corte de ligamento del ovario. C: los ovarios puestos en un vaso
precipitado con solución fisiológica atemperada a 37 ºC. D: lavado de los ovarios con solución
fisiológica hasta que este cristalina
2.5. Recuperación y selección de los COCs

Para la recuperación de los COCs se realiza por el método de aspiración de los folículos, lo
cual consiste en:
▪ Sujetar un ovario con una pinza y puesto sobre el papel toalla estéril y secarlo muy
bien.
▪ Se identifica todos los folículos visibles de 2 a 6 mm (No aspirar folículos de más de
7 mm de diámetro) con aguja de 21G acoplada a una jeringa de 5 ml la cual contiene
0.5 ml de medio de maduración.
32
▪ Se introduce la aguja por la corteza del ovario y se aspira suavemente el líquido
folicular
▪ Todo lo aspirado son colocados en placas Petri de 90 x 20 mm, depositando
lentamente a una distancia cerca de la placa, para no desnudar los ovocitos de las
células de la granulosa.
▪ Realizar el mismo procedimiento hasta aspirar la totalidad de los ovarios.
▪ Se recomienda aspirar como máximo 6 ovarios para evitar la saturación de los
ovocitos y para su mejor búsqueda.
Figura 24:
Obtención de los COCs
A B C
A: jeringa con medio de maduración. B: aspiración del folículo. C: deposito del contenido en
la placa Petri
2.5.1. Búsqueda y selección de los COCs para maduración
▪ Preparar en una placa Petri de 90 x 20 mm, tres gotas de medio de maduración de 200
ul.
▪ La búsqueda se realiza en un estero microscopio incorporada con una platina térmica
a 37 ºC.
▪ La forma de búsqueda de los COCs se realiza en dirección horizontal y vertical, para
garantizar la recuperación de los COCs (ver Fig. 24)
33
Figura 25:
Guía de búsqueda de los COCs en la placa Petri
Inicio Fin Inicio
Fin
▪ Los COCs son capturados con la micropipeta de 10 ul y colocados en la placa Petri
de las tres gotas.
▪ Todos los COCs recuperados, se pasan por las gotas de forma sucesiva, y en cada
pase se seleccionan los COCs, teniendo en cuenta los parámetros de calidad. Serán
clasificados tomando en cuenta la compactación de las células del cumulo y su
forma homogénea del citoplasma, según los criterios descritos por Ratto y col.,
2005.
Figura 26: Figura 27:

Agrupación de COCs Lavado de COCs en gotas de
medio de maduración
34
Tabla 10:
Clasificación del Complejo Ovocito-Cúmulo (COCs) de Alpaca.
Categorías Características por Categoría
1 COCs con cúmulos de capas múltiples (˃5 capas), compacto, claro y
transparente, citoplasma con granulación fina y homogéneo.
2 COCs parcialmente rodeados por células del cúmulo (entre 2-4 capas) más
oscuros y menos transparentes; citoplasma de granulación más gruesa y más
oscura que en la categoría 1.
3 COCs con cúmulo ≤ 1 capa de granulosa o en partes desnudo.
4 Incluye a los ovocitos con cúmulo expandido, parcialmente desnudos o
totalmente desnudos; citoplasma granular.
Ratto y col (2005).
Figura 28:
Clasificación de CCOs para maduración in vitro
I II
III IV
35
2.6. Metodología para la Maduración in vitro

▪ Los ovocitos seleccionados son lavados al menos en tres gotas de 100 ul de medio
de maduración.
▪ Los ovocitos una vez lavados son colocados en las placas de Wells 500 ul de medio
para incubar por 32 horas a 38.5 ºC, 5% CO2 y 90 % de humedad (ver Fig. 28).
Figura 29:
Proceso de maduración in vitro
A B
A: 500 ul de medio colocados en placas de 6 well. B: Los COCs puesto en la

incubadora para su maduración in vitro
2.6.1. Evaluación de la Maduración in vitro de Ovocitos de Alpacas.
Culminando las 32 horas de maduración, se retira cuidadosamente la placa de la
incubadora, para ser trasladado al microscopio invertido, donde se tiene que observar el
estado de los ovocitos maduros, si estos aún mantienen adheridos las células de los
cúmulos en la superficie del ovocito, los cuales serán desprendidos mecánicamente por
denudación, mediante aspiraciones y espiraciones suaves por medio de una micro pipeta
de 10 ul en gotas de 200 ul del medio de maduración. Finalmente observar los ovocitos si
presenta primer cuerpo polar, lo cual indica que es un ovocito maduro.
36
Figura 30:
Evaluación de ovocitos después de la maduración in vitro
Ovocitos con primer cuerpo
2.7. Fertilización in vitro

La fertilización in vitro es un proceso donde intervienen los gametos hembra (óvulos) y
macho (espermatozoide). Se recomienda que antes de cumplirse el tiempo de maduración
ovocitaria es necesario colocar el medio de fertilización en la incubadora.
▪ Colocar en las placas con Wells el medio de fertilización 500 ul y colocar en la
incubadora de CO2. Se pre incuban por un tiempo de dos horas para su gasificación.
▪ Colocar en un tubo eppendorf 1 ml de medio de fertilzacion en la incubadora de CO2
para su gasificación, la cual va ser usada para la capacitación de los
espermstozoides
37
Figura 31: Figura 32:

Tubos eppendorf con medio de Medio de fertilización en placas con well
fertilización dentro de la incubadora
2.7. Colección y Capacitación Espermática

1.8.1. Colección de Semen.
Para obtener el semen, se va emplear por vagina artificial acoplado a un maniquí.
Materiales y equipos para la colección de semen.
-Maniquí -Vagina artificial.
-Ligas -Cinta de sujeción
-Papel toalla -Alcohol
-Hervidora -Inflador
-frazadillas eléctricas -Dilutor comercial
38
Figura 33:
Materiales para el armado de la vagina artificial
2.7.1. Armando de la vagina artificial (VA).
▪ Para el armado de la vagina artificial se coloca por dentro del tubo la funda latex, en
unos de los extremos se coloca el tubo falcón de 15 ml, se fija con la liga. Por el otro
extremo se le agrega agua a una temperatura inicial de 47 ºC, y finalmente se
asegura con liga.
▪ Una vez sujetados los dos extremos, se coloca al inflador para adicionar el aire
hasta tener la presión adecuada.
▪ Se envuelve la vagina artificial con las frazadillas eléctricas para mantener la
temperatura.
▪ Una vez armado la vagina artificial tiene que estar con una temperatura final 40 ºC
▪ Al colocar la vagina artificial al maniquí, se desinfecta con alcohol toda la zona
donde se va colocar la vagina artificial, luego se asegura al maniquí.
39
▪ Finalmente se suelta al macho para que se suba al maniquí, se verifica que el macho
este en la posición correcta de la monta. En donde se va controlando el tiempo de
la cópula, hasta que el macho se retire del maniquí.
Figura 34:
Armado de la vagina artificial incorporado al maniquí
A B C
A y B: la VA envuelto en la frazadilla eléctrica. C: la VA incorporado al maniquí
Figura 35:
Copula del macho en el maniquí
40
▪ Una vez concluida la copula del macho, se retira la vagina artificial del maniquí se
lleva al laboratorio, se coloca el tubo que contiene el semen al baño seco a una
temperatura 37ºC.
▪ El semen obtenido es diluido con un dilutor comercial (Steridyl) en un volumen de
1/1.
▪ Después de la obtención del semen se evalúa parámetros espermáticos como
motilidad y concentración.
Figura 36:
Dilución y evaluación del semen colectado
A B C
A: Obtención de semen. B: Dilución de semen con dilutor. C: Evaluación de

espermatozoides en el equipo CASA
41
2.7.2. Capacitación espermática por el Método de Swin Up
Para la capacitación y separación espermática se realiza mediante el método de Swin Up
según Parrish y col., (1984) con algunas modificaciones.
▪ En un tubo de 1.5 ml se coloca 500 ul de semen diluido y 500 ul de FERT-TALP del
tubo que se colocó antes en la incubadora. Se centrifuga a 2500 rpm/ 5min, en la
base se formará un pellet y se retira el sobre nadante.
▪ Sobre el pellet adicionar el resto de 500 ul de FERT-TALP y colocar en ángulo de 45º
en la incubadora por 20 min, con la finalidad de que los espermatozoides con buena
motilidad suban a la superficie del tubo.
Figura 37:
Capacitación espermática por método Swin Up
A B C D
A: Semen diluido con diutor. B: Centrifugación del semen. C: Formación de pellet y

diluido con medio FERT-TALP. D: el tubo con espermatozoides puestos a la incubadora
de co2
2.8. Inseminación in vitro

▪ Los ovocitos maduros serán lavados en gotas de medio FERT-TALP y colocados en
las placas well que fueron colocados en la incubadora.
▪ Colocar 5 ul de la suspensión de espermatozoides capacitados a los ovocitos, y
dejar co-incubando los gametos por 18 horas en la incubadora de CO2
42
2.8.1. Evaluación de los ovocitos Fertilizados
Culminado el tiempo de 18 horas de fertilización; la placa es retirada cuidadosamente de la
incubadora de CO2 y colocadas en el microscopio invertido, para realizar su evaluación. Solo
se consideran ovocitos fertilizados aquellos que presentan la expulsión del segundo
cuerpo polar.
Figura 38:
Ovocito con dos cuerpos polares
2.9. Cultivo in vitro de embriones

▪ Colocar 500 ul de medio SOF en placas well y luego colocarlos en la incubadora de
CO2.
▪ En una placa de 90 X 20 mm se coloca tres gotas de 200 ul SOF suplementado.
▪ Los posibles cigotos son lavados en las 3 gotas hasta quedar libre de todos los
espermatozoides adheridos.
▪ Finalmente son colocados a las placas well que contiene el medio de cultivo y
llevados a la incubadora, puestos bajo condiciones de una temperatura 38.5 °C, 5 %
de CO2 y humedad alta.
▪ A las 48 horas se realiza la primera evaluación de los embriones si hay presencia de
división celular y también se realiza el cambio de 50% del medio de cultivo, cada 48
horas se repite lo mismo, evaluación y cambio del medio hasta el día 7.
43
Figura 39:
Embriones a 96 h pos cultivo. A: embrión de 6 células. B:
embrión de 4 células. C: sin división
2.9.1. Evaluación de los Embriones Producidos por Fertilización in vitro
Los parámetros a evaluar son los siguientes:
División: Porcentaje de ovocitos que a las 48 horas pos fecundación están divididos en 2 o
4 células y que además presentan apariencia normal y uniforme en cuanto al tamaño, forma
y coloración oscura de cada una de las células.
Mórula temprana: El cigoto presenta aproximadamente entre 16 y 32 células, su forma es
similar a la de una mora en la cual es posible distinguir individualmente a los blastómeros.
Su masa celular ocupa casi todo el espacio perivitelino.
Mórula compacta: Aproximadamente entre 32 y 64 blastómeras. Estos están unidos y
constituyen una masa compacta que ocupa solo el 60 a 70% del espacio perivitelino.
Blastocistos: Porcentajes de los ovocitos que alcanzan el estadio de blastocistos a las 144-
168 horas, aproximadamente 6 a 7 días considerando solo aquellos, que presentan una
forma de coloración adecuada y además con una masa celular interna visible.
44
Eclosionados: Porcentaje de blastocistos eclosionados el día 7, 8 y 9 de cultivo con
respecto al total de blastocistos evaluados.
Figura 40:
Embriones de alpacas en diferentes divisiones celulares
A B C
D E F
G H I
A: Embrión de dos células. B: Embrión de 4 células. C: Embrión de 6 células. D: Embrión

de 8 a 16 células. E: Mórula. F: Blastocisto temprano. G: Blastocisto H: Blastocisto
expandido. I: Blastocisto eclosionado.
45
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MANUAL TÉCNICO: PRODUCCIÓN DE EMBRIONES IN VITRO DE ALPACAS

MANUAL TÉCNICO: PRODUCCIÓN DE EMBRIONES IN VITRO DE ALPACAS

UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN

PRODUCCION DE EMBRIONES IN VITRO

UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN

Responsable del proyecto de investigación:

MANUAL TÉCNICO: PRODUCCION DE EMBRIONES IN VITRO DE ALPACAS

Daniel Gandarillas Espezúa

1a. edición – Noviembre 2021

Los autores expresan su agradecimiento a la Universidad Nacional Jorge Basadre

Grohmann por el financiamiento a través de fondos de canon, sobre canon y regalías

mejoramiento genético y desarrollo de capacidades en el manejo de alpacas (vicugna

pacos) en la zona alto andina de Tacna”.

aportes científicos en pro de la ciencia.

Animal de la Universidad Nacional Jorge Basadre Grohmann de Tacna.

proyecto titulado. “USO DE LA BIOTECNOLOGÍA PARA EL MEJORAMIENTO GENÉTICO Y

DESARROLLO DE CAPACIDADES EN EL MANEJO DE ALPACAS (Vicugna pacos) EN LA ZONA

mineras con resolución rectoral N°3780-2014/UNJBG. Donde se desarrollaron diferentes

protocolos para la producción de embriones in vitro en alpacas. La producción de

embriones de alpaca comprende las etapas de maduración de los ovocitos, capacitación

de los espermatozoides, fecundación y cultivo de los embriones hasta el estadio de mórula

entendimiento y aplicación de la biotecnología reproductiva a profesionales, estudiantes

mayores conocimientos sobre la producción de embriones in vitro en alpacas.

Durante el periodo 2015-2020, especialmente en los tres últimos años, el proyecto ha

desarrollado investigación en el área de la biotecnología reproductiva en alpacas mediante

técnicas de inseminación artificial y protocolo de producción de embriones in vitro que

fortalecen la base científica en esta área, al tiempo que benefician a la sociedad en su

conjunto por medio de trabajos de investigación generados y capacitaciones a los

La Universidad Nacional Jorge Basadre Grohmann comprometida en el desarrollo

agropecuario y en el fortalecimiento de capacidades a través de la ejecución del proyecto

busca aplicar y difundir las técnicas de reproducción asistida empleadas en programas de

mejoramiento genético, con el objetivo de mejorar la calidad de fibra de los animales e

incrementar los ingresos económicos de los productores.

1.1. Métodos de recolección de ovocitos ............................................................... 4

1.2. Técnicas de recuperación de los COCs .............................................................8

1.3. Selección y clasificación de ovocitos ...............................................................9

1.4. Maduración in vitro ......................................................................................... 10

1.5. Recuperación de los espermatozoides............................................................ 11

1.6. Selección y capacitación de espermatozoides. .............................................. 14

1.7. Fecundación in vitro (FIV) ............................................................................... 15

1.8. Cultivo in vitro (CIV)......................................................................................... 16

Procedimientos para la producción de embriones in vitro en el Laboratorio de

Reproducción Animal de la Universidad Nacional Jorge Basadre Grohmann de Tacna ..... 18

2.1. Materiales y equipos para la producción de embriones in vitro. ........................... 19

2.2. Preparación de Medios Para Embriones in vitro.................................................23

2.3. Procedimientos para Producción de Embriones in vitro de Alpaca.................... 30

2.4. Recepción de las muestras. ............................................................................... 31

2.5. Recuperación y selección de los COCs ..............................................................32

2.6. Metodología para la Maduración in vitro ............................................................. 36

2.7. Fertilización in vitro ............................................................................................ 37

2.7. Colección y Capacitación Espermática ............................................................... 38

2.8. Inseminación in vitro ......................................................................................... 42

2.9. Cultivo in vitro de embriones ..............................................................................43

Referencias bibliográficas ................................................................................................ 46

(Ruíz, 2013); donde la calidad de fibra ha sido el principal impulso de la investigación y

reproductivas, son la causa de su pobre rendimiento reproductivo en comparación con

es bajo debido al inicio tardío de la pubertad, la corta temporada de reproducción, pérdida

La aplicación de biotecnologías reproductivas, como la inseminación artificial, la

transferencia de embriones y fertilización in vitro podría aumentar rápidamente el número

de animales genéticamente superiores (Miragaya et al., 2006).

Los primeros trabajos de investigación en la producción de embriones por fertilización in

vitro (FIV) en camélidos sudamericanos se han realizado utilizando ovocitos recuperados

nacimiento de la primera llama en el mundo con la aplicación de esta biotecnología (Landeo

La producción de embriones in vitro comprende diferentes procesos: la colección de