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AISLAMIENTO DE BACTERIAS NITRIFICANTES DEL HUMEDAL DE LA PLANTA

DE TRATAMIENTO DE AGUAS RESIDUALES DE LA UNIVERSIDAD DE BOYACÁ

Article · June 2015

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José Castellanos-Rozo
University of Boyaca
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 AISLAMIENTO DE BACTERIAS NITRIFICANTES DEL HUMEDAL
DE LA PLANTA DE TRATAMIENTO DE AGUAS RESIDUALES DE
LA UNIVERSIDAD DE BOYACÁ

ISOLATION OF BACTERIAS NITRIFYING OF THE WETLAND

PLANT WASTE WATER TREATMENT OF THE
UNIVERSITY OF BOYACÁ

Yadi Joharia Ramos Parra*

Asesor: José Miguel Castellanos*
SEMILLERO EARTH

Resumen
La elevada concentración de nutrientes en efluentes no tratados, puede tener efectos negativos en
las aguas receptoras de lagos, ríos y embalses donde son vertidos, estimulando el crecimiento de
algas y plantas, e interferir con los usos beneficiosos de los recursos hídricos, especialmente cuan-
do se emplean en el abastecimiento de agua, cultivo de peces y/o usos recreativos. En el estudio se
zonificó el humedal de la planta de tratamiento de aguas residuales de la Universidad de Boyacá,
para esto se tuvo en cuenta las dimensiones y la profundidad útil promedio de este, a partir de lo
cual se realizaron diluciones Stokes hasta 10~3y se revelaron con reactivo de Griess y polvo de Zinc.
Los tubos positivos debían reflejar coloración rosa, de estos tubos, se hizo siembra en superficie
en medios como amonio y chocolate. Luego de seis repiques consecutivos se obtuvieron 17 mor-
fotipos aislados para posterior caracterización.

Palabras Clave
Aislamiento, Cepas bacterianas, Microorganismos, Muestreo de humedal.

* Estudiante del programa de Bacteriología y laboratorio Clínico. Universidad de Boyacá, Tunja, Colombia, yjramos@
uniboyaca.
** Microbiólogo MSc. Ciencias Microbiología. Universidad de Boyacá, Tunja, Colombia, joscastellanos@uniboyaca.edu.co

is Proyección u^«Kt/^ Edición especial: Semilleros de Investigación • junio de 2015

 Abstrae!
The high nutrient concentrations in untreated effluent can have adverse effects on receiving wa-
ters of lakes, rivers and reservoirs where they are poured, stimulating the growth of algae and
plants, and interfere with the beneficial uses of water resources, especially when using in water
supply, fish farming and / or recreational uses. In the study was zoned wetland plant treating
wastewater from the Uniboyacá, for these were taken into account the size and depth of the ave-
rage useful, from this Stokes dilutions to 10-3 and developed with reagent Griess and zinc powder.
The positive tubes should reflect pink coloration of these tubes was grown in media surface as
ammonium and chocolate. After six consecutive chimes yielded 17 morphotypes isolated for fur-
ther characterization.

Key words
Isolation, bacterial strains, Microorganisms, sampling wetland.

INTRODUCCIÓN
La elevada concentración de nutrientes en efluentes no tratados puede tener efectos negativos en
las aguas receptoras de lagos, ríos y embalses donde son vertidos, estimulando el crecimiento de
algas y plantas, e interferir con los usos beneficiosos de los recursos hídricos, especialmente cuan-
do se emplean en el abastecimiento de agua, cultivo de peces y/o usos recreativos1.

Es así, como los nutrientes primarios nitrógeno y fósforo son constituyentes de los fertilizantes,
detergentes y de las descargas de aguas residuales domésticas e industriales que causan enri-
quecimiento por nutrientes y minerales, originando una eutrofización en los ríos o en las aguas
retenidas en las desembocaduras2.

El nitrógeno se encuentra en el ambiente de forma natural, dos procesos edáficos importantes

para eímantenimiento de la circulación del nitrógeno en el suelo y entre el suelo y la atmósfera,
pero poco estudiados son la nitrificación y desnitrificación, los cuales llevan a la conversión del

1 FLORES, K. Remoción de nutrientes en un reactor discontinuo secuencial. Interciencia, 31(11), 787-793.2006, En línea:
[http://search.proquest.com/docview/2101385287accountidM3592]. Citado el: [10 de Marzo].
2 RIVAS, Z. SÁNCHEZ, J. TRONCONE, F. MÁRQUEZ, R. DE MEDINA, H. 2009. Nitrógeno y Fósforo totales de los Ríos tribu-
tarios al sistema lago de Maracaibo, Venezuela. Interciencia, 34(5), 308-314. En línea: [http://search.proquest.com/do
cview/210130727?accountid=43592]. Citado el: [10 de Marzo].

Aislamiento de bacterias nitrificantes del humedal de la planta de tratamiento de aguas PrflVPPPÍfllll/ ' AÜ ' 19
residuales de la Universidad de Boyacá. U JOuulUII U
 amonio en nitrato y la reducción del nitrato a nitrógeno gaseoso, respectivamente. Estos son lle-
vados a cabo exclusivamente por bacterias. Las bacterias nitrificantes involucran dos grupos, las
oxidadoras de amonio (que lo convierten en nitrito] y las oxidadoras de nitrito (que lo convierten
en nitrato), el cual es fácilmente absorbido por las plantas y microorganismos3.

La nitrificación es un proceso aerobio realizado por microorganismos Gram-negativos litoauto-

tróficos que pertenecen a la familia Nitrobacteríaceae, no son esporulados y pueden ser esféricos,
bacilares o espirales. Los cultivos nitrificantes generalmente tienden a formar estructuras deno-
minadas flóculos, cuya estabilidad parece depender de la formación de sustancias exopoliméricas.
El proceso respiratorio nitrificante se lleva a cabo en dos etapas:

1. oxidación de amonio a nitrito.

2. oxidación de nitrito a nitrato.

En cada una de ellas participan microorganismos de géneros diferentes, es decir, no se han iden-
tificado microorganismos que puedan convertir directamente el amonio a nitrato. Sin embargo,
cabe mencionar que hay bacterias como la Paracoccus denitrificans que son capaces de realizar
nitrificación y desnitrificación en condiciones aeróbicas, con una pH ajustado a 8, temperatura de
37° y una concentración de oxígeno disuelto de 50%4.

Diversos factores controlan el proceso de nitrificación en cultivos, tal como la cantidad de 02 pre-
sente en el medio. El crecimiento de bacterias nitrificantes es nulo a valores <0,2mg/L 02 y, por el
contrario, no se observan efectos a concentraciones elevadas de 02 disuelto, pudiendo llevarse a
cabo el proceso de nitrificación a 60 mg/L 02. Otros factores a considerar son el pH del medio, que
debe encontrarse entre 7,5 y 8,5; la temperatura óptima oscila entre 25 y 35°C, la limitación por
falta de sustratos, los cambios en la alcalinidad del medio que ocurren en la etapa de nitratación,
ya que por cada mol de NH 3 que se oxida a N02" se consumen 2 moles de bicarbonato; la interac-
ción con otro tipo de bacterias, como bacterias heterótrofas; y la cantidad de NH 3 libre5. [.

3VÁRELA, AMANDA. RAMÍREZ, DERLI. PRIETO, DIANA. BORDA, NATALIA. LARGO, YULY. BUSTOS, GISELL. DUARTE,
PEDRO. Aspectos ecológicos de bacterias nitrificantes y desnitrificantes en la Orinoquía colombiana. SUELOS
ECUATORIALES 39 (1): 95-99 Sociedad Colombiana de la Ciencia del Suelo, 2009.
4 T. LUKOW, H. DIEKMANn. Aerobic denitrification by a newly isolated heterotrophic bacterium strain TL1. Biotechnology

Letters. Vol 1., No 11. Noviembre 1997. p 1157-1159.

5 AGUILAR, JARPA. BELMONTE A. DECAP, M. ABARZÚA, J. VIDAL, G. (2007). Determinación de la capacidad nitrificante
de un sedimento marino proveniente de un centro de cultivo de salmones. Interciencia, 32(10), 679-685. En línea:
[http://search.proquest.com/docview/210199437?accountid=43592]. Citado el: [13 de Marzo].

20 Proyección i/^r^;/ Edición especial: Semilleros de Investigación • Junio de 2015

Por esta razón el montaje de cualquier tipo de experimento en el cual se quisiera evidenciar
crecimiento de bacterias nitrificantes requiere indiscutiblemente del cuidado de cada una de las
condiciones que puedan favorecer o limitar el proceso.

Teniendo en cuenta la bibliografía anterior se procedió con el muestro del humedal, procesamien-
to de muestras y posterior siembra, con lo cual se lograron aislar las bacterias que se utilizarán en
el ensayo de oxidación.

METODOLOGÍA

Toma de muestra
Las muestras fueron tomadas del humedal de flujo subsuperficial de la planta piloto de tratamien-
to de agua residual de la Universidad de Boyacá, el suelo estaba compuesto por medio de soporte y
material adherido a este por su funcionamiento. Se dividió el humedal en seis partes, tres teniendo
en cuenta su largo y otras dos en función de su ancho, además se consideró que 0,3 metros era la
profundidad útil promedio a la cual se podía evidenciar un contacto entre sustrato y vegetación.

Procesamiento de muestras
El suelo anteriormente muestreado fue recolectado en bolsas ziploc y procesado inmediatamente.
Se adicionó lOg de suelo obtenido del humedal en 90mL de NaCl 0,85% estéril y de esta dilución
se realizaron diluciones seriadas hastalO"3. Posteriormente, se sembró ImL por triplicado en tu-
bos de ensayo con caldo de amonio estéril, cuya composición es: 0,15g de (NHJ2S04, Ig de CaC03,
Ig de KH2P04, 0,3 g de MgS04 *7H 2 0,0,3 g de NaCl, 0,03g de FeS04, y 950 mL de agua destilada6.

Los tubos se incubaron durante 28 días a 30°C, para luego ser revelados con el reactivo de Griess
y polvo de Zinc, para evidenciar oxidación del amonio a nitrito o nitrato.

6 N. RODRÍGUEZ- MORENO, C. TORO-LOZANO. M. MARTÍNEZ-SALGADO. M. MERCADO-REYES. Estandarización de

condiciones para la prueba cuantitativa del NMP con bacterias nitrificantes y denitrificantes usando como matriz
compost. Grupo de Microbiología Ambiental e Industrial. Departamento de Microbiología. Facultad de Ciencias,
Pontificia Universidad Javeriana. Universitas Scientiarum, Vol. 12 N° 2, 69-81. Julio-diciembre 2007. [en linea], [citado
el 11 abril 2011]. Disponible: http://www.javeriana.edu.co/universitas_scientiarum/universitas_docs/Vol_12%20
No%202/5-ESTANDARIZACION.pdf.

Aislamiento de bacterias nitrificantes del humedal de la planta de tratamiento de aguas PrOVOCCIÓ!! UfvvWMvÍM^í- 21
residuales de la Universidad de Boyacá.
 Aislamiento Bacterias Nitrificantes
Se procedió a realizar el aislamiento de bacterias nitrifícantes. Para ello, se realizó siembra en
superficie tomando ImL de los tubos con reacción positiva para nitrito y nitrato en medio sóli-
do amonio7. Posteriormente, las cajas se incubaron durante 28 días a 30QC. Pasado el tiempo de
incubación, se realizó siembra por aislamiento de las cajas que reportaron crecimiento en medio
sólido amonio, en agar nutritivo, en agar chocolate y en agar sangre. Se comprobó la pureza del
cultivo para posterior caracterización.

RESULTADOS
' i-
Los resultados determinaron que las zonas donde se encontró mayor número de bacterias mirifi-
cantes según la técnica del NMP/mL, fue la zona 2, ya que se obtuvo una mayor cantidad de tubos
de color rosa, al agregar el reactivo de Griess y el polvo de Zinc. Al cuantificar lo anterior se obtuvo
un NMP de 210 y 150 bacterias nitrificantes/mL. Los resultados se describen en la tabla 1.

Tabla 1. NMP/mL de bacterias nitrifícantes teniendo en cuenta zonificación de humedal

.NMP BACTERIAS t , 0 v <

]:^r:^j^^. , NlÍRIFICÁNTES/MlT
1-1 21
1-2 75
2-1 210
2-2 150
3-1 23
3-2 9.2

Teniendo en cuenta los resultados de la primera confirmación se realizó la siembra en superficie

en medio sólido amonio8, de lo cual se obtuvieron 21 cajas con crecimiento, las cuales fueron
repicadas en agar chocolate, que permitió masificar las colonias. A partir de esto, se realizaron 6
repiques más, hasta obtener las cepas completamente puras para su posterior caracterización.

7 Ibíd., 69-81.

8 Ibíd., 69-81.

22 Proyección u^/m^^t Edición especial: Semilleros de Investigación • Junio de 2015

 Se confirmó el crecimiento en medio amonio obteniendo 17 morfotipos después de 30 días de
incubación a 28°C.

CONCLUSIONES
La mayor limitante para tomar las muestras del humedal fue que las raíces de los Cyperus papirus,
estaban arraigadas al medio por lo cual era difícil hacer espacio entre estas para poder sacar el
material. Además es conveniente mencionar que durante la extracción del suelo se pudo observar
que el humedal tiene lugares por los cuales no pasa la misma cantidad de agua, evidenciada en las
diferentes características que presentaron las muestras, como por ejemplo en algunas era notorio
que había más humedad que en otras y por consiguiente mayor consistencia.

Es el caso de la zona 2, la cual evidenció mayor cantidad de bacterias nitrificantes, se pudo ob-
servar que la muestra poseía buena consistencia, es decir era compacta, tenía gran humedad y su
textura era suave, con lo cual se podría inferir que por su superficie pasaba gran cantidad de agua
residual para permitir la proliferación de bacterias capaces de oxidar el amonio a nitrito y nitrato.

Por otro lado, si bien algunos tubos no dieron positivo a la aplicación del reactivo de Griess, se
efectúo siembra de estos y se evidenció posterior crecimiento, por lo cual se podría inferir en que
las bacterias pueden requerir mucho más tiempo para su óptimo desarrollo, acompañado por
supuesto de las condiciones físicas que requieren para la nitrificación.

Finalmente, se puede deducir que el crecimiento de este tipo de bacterias es prolongado, algunas
cepas tardaron hasta 3 meses en desarrollarse óptimamente, por lo cual si se deseaba realizar
un repique o algún estudio se debía verificar especialmente que las cajas ya presentaran colo-
nias acompañado de la disponibilidad de tiempo para que crecieran notablemente. Además cabe
mencionar que fue necesario utilizar medios enriquecidos como chocolate, sangre y nutritivo, que
permitieron masificar los cultivos ya que en medios como el sólido amonio la cantidad de biomasa
que crecía en un mes de incubación era mínima y en algunas ocasiones se requería hasta de 3 me-
ses para que se evidenciara un óptimo crecimiento.

Así, de los resultados obtenidos se puede concluir que la relación entre las raíces del Cyperus papirus,
el medio adherido a este y la cantidad de agua que pasa a través de estos influirán significativa-
mente en la cantidad de bacterias nitrificantes que existan. Por otro lado se puede inferir en que
si bien la literatura puede sugerir unas condiciones óptimas de crecimiento no siempre se cumple
el tiempo de incubación, ya que en el caso de esta investigación muchos de los repiques tarda-
ron en evidenciar crecimiento hasta tres meses después de la siembra. Además, cabe mencionar
que los aislamientos presentan condiciones como que pueden resistir varios días de incubación,

Aislamiento de bacterias nitrificantes del humedal de la planta de tratamiento de aguas PrOVOCCÍÓIl \J<t¿VM4¿fa¿* 2 3
residuales de la Universidad de Boyacá.

t
 en medios de cultivo enriquecidos se masifican y las colonias que se desarrollaron son bacterias
seleccionadas ya que crecieron en un medio que requería necesariamente oxidación del amonio
como fuente de nitrógeno.

BIBLIOGRAFÍA
AGUILAR, Jarpa. BELMONTE A. Decap, ABARZÚA, M. VIDAL, J. (2007). De-
terminación de la capacidad nitrificante de un sedimento marino prove-
niente de un centro de cultivo de salmones. Interciencia, 32(10), 679-685.
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id=43592]. Citado el: [13 de Marzo]. b

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matriz compost. Grupo de Microbiología Ambiental e Industrial. Depar-
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Javeriana. Universitas Scientiarum, Vol. 12 N° 2, 69-81. Julio-diciembre
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rias nitrificantes y desnitrificantes en la Orinoquía colombiana. SUELOS
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Suelo, 2009.

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