FUNDAMENTOS DE LOS

ESPECTROFOTOMETROS UV-VIS
 ORIGEN DE LOS ESPECTROS UV-VIS

La energía potencial total de una molécula:

La diferencias de energía entre los diferentes

estados siguen el orden:
ORIGEN DE LOS ESPECTROS UV-VIS

La presencia de una banda de absorbancia a

una determinada longitud de onda es una
buena indicación de la presencia de un
cromóforo. Sin embargo, la posición del
máximo no es fija sino que depende, en parte,
del entorno molecular del cromóforo y del
disolvente en el que pueda disolverse la
muestra.

Otros parámetros, como pH y temperatura,

también pueden causar cambios tanto en la
intensidad como en la longitud de onda de
los máximos de absorbancia.
 Cuantificación indirecta
Derivatización química
Debido a que muchos compuestos exhiben débil o
ninguna absorbancia en las regiones UV o visible, se han
desarrollado varios métodos con derivatización química.
Tales métodos, normalmente implican el añadir un
reactivo orgánico, que forma un complejo con fuerte
absortividad. La etapa final de medida es prácticamente
igual que la de los métodos directos. Con esta técnica, la
elección apropiada del reactivo puede mejorar
significativamente tanto la sensibilidad como la
selectividad.

Valoraciones Espectrofotométricas
En análisis volumétricos, el cambio de color que señala el
final de una valoración normalmente se detecta
visualmente. Este proceso es inherentemente subjetivo y
puede ser una fuente de error. El uso de un
espectrofotómetro para detectar el final, introduce la
objetividad y la automatización en el análisis.
 Cuantificación indirecta

Ensayos cinéticos enzimáticos

El análisis UV-visible directo de un componente en matrices biológicas, por ejemplo sangre o
alimentos, es difícil. Las interferencias de otros componentes a menudo imposibilitan la medida
directa de una propiedad específica, como la absorbancia. La separación del compuesto de interés
puede ser costosa y pesada y por tanto, impracticable en el análisis de rutina.

Pueden utilizarse ensayos enzimáticos en el análisis indirecto de un compuesto o un grupo de

compuestos en una matriz compleja. Si se selecciona la enzima cuidadosamente, cualquier cambio en
la muestra posterior a la adición de la enzima, será el resultado sólo de la reacción del compuesto o
compuestos específicos. Esta selectividad es la base de los ensayos enzimáticos.
 INSTRUMENTACIÓN – Diseño instrumental

Componentes
Un espectrofotómetro es un instrumento para medir la
transmitancia o absorbancia de una muestra, en función de la
longitud de onda de la radiación electromagnética. Los
componentes clave de un espectrofotómetro, son:

• Una fuente que genera una banda ancha de radiación

electromagnética
• Un dispositivo de dispersión que selecciona una longitud
de onda particular (o más correctamente, una banda de
ondas) de la radiación de la fuente
• Un área de muestra uno o más detectores para medir la
intensidad de la radiación.
• Otros componentes ópticos, como lentes o espejos,
transmiten la luz a través del instrumento.
 INSTRUMENTACIÓN – Diseño instrumental

Fuentes
La fuente ideal de luz sería aquella que generara una intensidad constante a todas las longitudes de onda, con
bajo ruido y gran estabilidad. Sin embargo, estas fuentes no existen. Dos son las fuentes utilizadas,
comúnmente, en los espectrofotómetros UV-visible.

Espectro intensidad de la Espectro intensidad de la lámpara Espectro intensidad de

lámparaIrradiación espectral halógena de wolframio la lámpara de xenon
de arco de deuterio
INSTRUMENTACIÓN – Diseño instrumental

Dispositivos de dispersión
Estos dispositivos causan que diferentes longitudes de
onda de luz sean dispersadas con ángulos distintos.
Cuando se combinan con una rendija adecuada de salida,
pueden utilizarse para seleccionar una longitud de onda
(o, más exactamente, una estrecha banda de onda) de luz
de una fuente continua. Comúnmente, se utilizan dos
dispositivos de dispersión, prismas y redes holográficas
de difracción, en los espectrofotómetros UV-visible.
 INSTRUMENTACIÓN – Diseño instrumental
Detectores
Un detector convierte una señal de luz en una señal
eléctrica. Idealmente, debe ofrecer una respuesta lineal en
un amplio rango, con bajo ruido y alta sensibilidad.
Normalmente, los espectrofotómetros contienen un tubo
fotomultiplicador o un tubo fotodiodo, como detector.
Detector tubo fotomultiplicador

Este tipo de detector ofrece alta sensibilidad a bajos niveles de luz. Sin embargo, en aplicaciones analíticas
espectroscópicas, una alta sensibilidad está asociada con bajas concentraciones, lo que resulta en bajas
absorbancias, lo que al final da lugar a altos niveles de intensidad. Para detectar con exactitud pequeñas
diferencias entre las medidas de blanco y de muestra, el detector debe tener bajo ruido a altos niveles de
intensidad.
 INSTRUMENTACIÓN – Diseño instrumental

El detector de fotodiodos
Tienen un rango dinámico más ancho y son más
robustos que los fotomultiplicadores. En un fotodiodo, la
luz que incide sobre el material semiconductor permite
que los electrones fluyan a su través, reduciendo la carga
en un condensador conectado a él.

Diagrama esquemático de una matriz de fotodiodos

 INSTRUMENTACIÓN – Diseño instrumental
Óptica
Para transmitir y enfocar la luz por el instrumento, se utilizan lentes o espejos cóncavos. Las lentes son
baratas pero sufren de aberración cromática, es decir, luz de diferentes longitudes de onda no se enfoca en
exactamente el mismo punto del espacio. Sin embargo, con un diseño cuidadoso, la aberración cromática de
las lentes individuales de un sistema óptico, puede utilizarse para cancelarse mutuamente, y puede
construirse un sistema. El espectrofotómetro convencional óptico eficaz con estos componentes simples y
baratos.

Esquema de un espectrofotómetro
convencional de haz simple
 INSTRUMENTACIÓN – Diseño instrumental
El espectrofotómetro de diodos

El policromador (rendija de entrada más

dispositivo de dispersión) y la matriz de diodos
están contenidos en una unidad conocida como
espectrógrafo. Como las posiciones relativas de
la muestra y el elemento dispersivo están
invertidas respecto a un instrumento
convencional, esta configuración, a menudo, se
denomina óptica inversa.
 INSTRUMENTACIÓN – Diseño instrumental
El espectrofotómetro de diodos
 INSTRUMENTACIÓN – Diseño instrumental
Diseño de doble haz

Sistema óptico de un espectrofotómetro de doble haz

Sistema óptico del espectrofotómetro de diodos HP 8450A

 INSTRUMENTACIÓN – Diseño instrumental

Diseño con división de haz

El espectrofotómetro con división de haz (Figura )

simula el espectrofotómetro de doble haz pero utiliza un
divisor en lugar de un chópper para dirigir la luz por los
pasos de blanco y muestra, simultáneamente, hasta dos
detectores idénticos pero separados. Esta configuración
permite medir el blanco y la muestra al mismo tiempo.
Aunque el diseño de división de haz es mecánicamente
más simple que el instrumento real de doble haz y
requiere menos elementos ópticos, el uso de dos
detectores independientes introduce
otra posible fuente de deriva.
 INSTRUMENTACIÓN – Parámetros instrumentales clave
Resolución espectral

La resolución espectral es una medida de la

capacidad de un instrumento para diferenciar
entre dos longitudes de onda adyacentes. Dos
λ se consideran resueltas, normalmente, si el
mínimo entre los dos picos de la señal de
salida del detector es menor que el 80 % del
máximo. Esto se conoce como conoce como el
criterio Rayleigh
 INSTRUMENTACIÓN – Parámetros instrumentales clave
Exactitud y precisión de longitud de onda
Efecto de una pobre repetitividad de la
La exactitud de longitud de onda es importante para longitud de onda
comparar medidas realizadas en diferentes
instrumentos. Sin embargo, en la mayoría de los
análisis UV-visible las medidas se realizan en el
mismo instrumento relativamente a un patrón y, la
precisón de longitud de onda (es decir, la
repetitividad) es más importante.

Efecto de la deriva sobre los valores de

absorbancia medida
 INSTRUMENTACIÓN – Tratamiento y medidas de la muestra

Cubetas
La espectroscopía UV-visible se utiliza Características de transmisión óptica de los materiales
principalmente, para medir líquidos o de cubetas
disoluciones. Esto es más simple y permite
un análisis cuantitativo más exacto que
realizar medidas de reflectancia en sólidos.
En esta técnica, una cubeta debe contener el
líquido o disolución en el área de muestra.
Existen de acrílico (300 nm), vidrio (320 nm),
cuarzo (210 nm) y sílice fundida sintética de
alta pureza (190 nm).
 INSTRUMENTACIÓN – Tratamiento y medidas de la muestra
Tipos de cubeta
a) Estas cubetas pueden tener pasos ópticos de 1 a 100 mm, pero el
más popular es 10 mm.
b) anchura exterior de 12.5 mm.

Cubetas micro (a) y de flujo (b)

Cubetas estándar (a) y con apertura

(b) a) Sólo se requieren aproximadamente 60
µl de muestra para medir. Con
ultramicrocubetas especiales, pueden
medirse volúme- nes por debajo de 5 µl.
b) Para aplicaciones automatizadas, se
utilizan cubetas de flujo
 INSTRUMENTACIÓN – Tratamiento y medidas de la muestra
Elección del disolvente
(dictar texto pagina 61)