UVM

2020
Drosophila chem mutations disrupt
epithelial polarity in Drosophila embryos

Claudia Fernanda Delgado Elías

Biología Molecular y Genética
4-12-2020
Docente: José Manuel Zamudio
La embriogénesis de Drosophila ha demostrado ser un sistema extremadamente
poderoso para el descubrimiento y la caracterización de los genes del desarrollo.
Tras la exploración de este sistema por primera vez, se logró aislar la mayoría de
los genes relevantes para el desarrollo embrionario, así como también, categorizar
fenotipos mutantes y clases de genes; estos estudios conducen a muchos
conocimientos y principios mecanicistas de los procesos de desarrollo. Algunos de
los principales hallazgos que ilustraron las mutaciones aisladas son la importancia
de los epitelios, la polarización y el movimiento epiteliales y, los cambios en la forma
de las células.

La polarización epitelial establece dos dominios: apical y basolateral. Éstos se

reconocen y evalúan generalmente por la presencia de proteínas marcadoras. Los
embriones con una polaridad apicobásica fuertemente alterada no se desarrollan y
dan lugar a fenotipos mutantes letales en los que sólo se sintetizan pequeños trozos
de cutícula. El análisis genético ha descubierto que los genes necesarios para la
polaridad epitelial codifican las proteínas citoesqueléticas y sus reguladores, como
la proteína par-3 Bazooka o los dominios EGF y laminina que contienen la proteína
Crumbs. Las mutaciones en los genes con fenotipos menos extremos pueden dar
lugar a un deterioro del movimiento celular y a cambios en la forma de la célula,
obstaculizando o impidiendo el cierre dorsal embrionario y la involución de la
cabeza. Una de las líneas letales aisladas de las pantallas de Nüsslein-Volhard /
Wieschaus y que no se caracteriza más es: l(3R)5G83. El cual se aisló sólo un alelo
con defecto de cierre dorsal. En el experimento lograron aislar cinco nuevos alelos
mutantes con fenotipos embrionarios.

Para el presente artículo, los autores obtuvieron el alelo mutante l(3R)5G83 y con
este alelo y EMS, mutagenizaron a los machos control y,w. Todos los alelos
químicos mutantes se recombinaron en los cromosomas FRT82, también limpiaron
los cromosomas mutagenizados de las supuestas mutaciones del segundo lado,
ya que el cromosoma que contiene FRT82 que usaron para la recombinación hacía
que las moscas fueran viables y fértiles como homocigotos. Todas las reservas
de terceros cromosomas utilizadas se equilibraron sobre un tercer equilibrador de
cromosomas «verde» antes de ser utilizados en experimentos. Para puntuar la
letalidad, se realizaron puestas de huevos y se contaron los embriones mutantes
muertos y supervivientes. Para los estudios de interacción genética, cruzaron las
poblaciones de heterocigotos dobles equilibrados «verdes» con heterocigotos
simples equilibrados «verdes» de manera similar de forma independiente, y el
heterocigoto doble consigo mismo por separado.

Se halló que los fenotipos cuticulares mutantes estaban presentes en alrededor de

un cuarto de los embriones mutantes. Los cinco nuevos alelos tuvieron fenotipos
embrionarios similares (Fig. 3A). La mayoría de los embriones cigoticos mutantes
que mueren con fenotipos cuticulares tienen defectos de apertura dorsal y de
involución de la cabeza. Dado que para todos los alelos los fenotipos cuticulares
parecen una pequeña embarcación,
nombraron al locus chem. También
estudiaros las larvas mutantes
sobrevivientes de chem1, chem3 y
chem5. Cultivaron estas larvas
mutantes supervivientes de forma
Figura 3: Un examen genético produce nuevos alelos químicos. aislada, sin hermanos que contuvieran
equilibrador (Fig. 3B)

Las larvas mutantes de yurta tienen fenotipos embrionarios similares a los de la

química ( (l(3R)5G83). Inicialmente estudiaron las interacciones entre chem1 con
yurt3, ya que es un alelo débil del locus, y
repitieron los experimentos con el alelo fuerte
de chem3. Encontraron que la
heterocigosidad de chem1 suprime
significativamente los fenotipos mutantes de
yurt3 (Fig. 4B). Seleccionaron los
homocigotos heterocigotos de yurt3 para las
larvas de chem1 y los cultivaron por separado.
Los homocigotos dobles mostraron un rescate
Figura 4: Chem interactúa antagónicamente con yurt.
significativo del fenotipo mutante de yurt3, pero son una mejora de los fenotipos
mutantes químicos correspondientes.

Para estudiar con más detalle los fenotipos epiteliales de la química y la

yurta/química, tiñeron varios de estos embriones mutantes para la proteína
transmembrana Crumbs. Crumbs es una proteína transmembrana rica en EGF que
se encuentra en la zona marginal de los epitelios, necesaria para la polarización
epitelial que interactúa con Yurt.

La heterocigosidad de Crumbs8F105 también

Figura 5: La heterocigosidad para chem1 interactúa
antagónicamente con Crumbs8F105, suprimiendo
parcialmente los fenotipos y la letalidad de
Crumbs8F105.
Chem que tiene un papel más general en la polaridad epitelial.
suprime parcialmente el fenotipo mutante
homocigótico de chem1 (Fig. 5B), y las larvas
supervivientes, cultivadas separadas de otros
genotipos, alcanzan el estadio adulto a la
misma velocidad que los heterocigotos dobles
hermanos (Fig. 5C). A continuación
estudiaron la expresión de Crumbs en los
mutantes Chem. Los mutantes homocigotos
chem1, chem3 y chem5 se localizaron mal y
redujeron la expresión de Crumbs (Figs. 5D y
5E). En conjunto, esto es consistente con la
acción de los químicos en contra de Crumbs,
promoviendo la membrana basolateral
epitelial. Esto también es consistente con

Prosiguieron con un análisis cuticular, donde recuperaron las puestas de huevos de

las diferentes poblaciones y cruces, y seleccionaron embriones fluorescentes sin
GFP. Y recuperaron los clones de la línea germinal.
Continuaron con métodos de inmunohistoquímica y microscopía, donde los
embriones se fijaron de dos formas diferentes: para la tinción con anticuerpos anti-
Crumbs y anti-Armadillo , fijaron los embriones descorionados mediante un
tratamiento térmico de dos segundos a 93,4 ° C. Para las tinciones anti-Coracle y
anti-Fasciclin 3 , fijaron embriones descorionados. Utilizaron embriones en etapas
13-14 para las tinciones de anticuerpos de Crumbs, Coracle y Armadillo; para la
tinción de Fasciclina 3,
utilizaron embriones en etapas
15-16, excepto para la Fig. S1,
donde se utilizaron embriones
en etapas 13-14. Finalmente,
en las Figs. 1C y 2 se utilizaron
los embriones de las etapas 16.
Tanto cora2 como chem1 como
heterocigotos mejoraron Figura 1: Chem y cora mejoran los fenotipos mutantes de cada uno.

significativamente las condiciones homocigotas mutantes de los otros alelos como

embriones.

En consonancia con la reducción de la

expresión de Cora en el compartimento de
unión septada, en la etapa 16, la expresión de
Cora en otro epitelio columnar, las glándulas
salivales, también se redujeron
significativamente en Chem3 (Figs. 2A y 2B).
Asimismo, la extensión de la tinción observada
en las secciones ópticas a través de la mitad de
Figura 2: Tinción de cora en la etapa 16 de las
glándulas salivales. las glándulas salivales embrionarias, en
comparación con la distancia entre la extensión
apical del patrón de Cora y el extremo de los núcleos de las glándulas salivales,
también se reduce significativamente en el chem5 (Fig. 2C).
Después que tiñeron los epitelios de los
mutantes químicos con otro marcador de
epitelios polarizados, el armadillo; en la Figura
6, se halló que el patrón de tinción y la
localización de Arm en chem1, chem3 y chem5
se observó normal, a pesar de la alteración de
los epitelios en los mutantes químicos en el
segmento A. Sin embargo, el nivel de tinción
de Arm se redujo significativamente en los
embriones de los mutantes químicos, lo que
demostró que la expresión de esta proteína
Figura 6: La localización del armadillo, pero no los
también se vió afectada. niveles de proteína, es normal en los mutantes químicos.

Para las mediciones de intensidad de fluorescencia en el epitelio lateral de

embriones en etapas 13-14 teñidos con anticuerpos contra Armadillo, Coracle y
Crumbs ,y embriones en etapa 16 teñidos con anticuerpos contra Coracle; se
generaron pilas de secciones ópticas de 10 micrómetros de espesor. Para los
valores de intensidad de fluorescencia de amnioserosa de los embriones en
las etapas 13-14, se utilizaron stacks de 4 micrómetros de espesor. Luego, se
usaron áreas de 25 micrómetros cuadrados para calcular un valor de intensidad de
fluorescencia. Se seleccionó un área micrométrica que solo tenía células
amnioserosa para las mediciones de intensidad de fluorescencia como se describe
para el epitelio lateral. Para controlar las diferencias en la tinción, la tinción se repitió
varias veces y se tomaron datos de los embriones debidamente clasificados de los
diferentes experimentos.

A través de un método indirecto en los epitelios laterales, tiñeron las células

epiteliales laterales con Fas 3 (una proteína que marca las membranas laterales), y
midieron la "longitud de las células" como la longitud de la tinción de Fas 3 en
proyecciones Z tomadas de pilas en las etapas 13-14 de la embriogénesis. Por
último, realizaron un análisis estadístico de las diferencias entre las distribuciones
(clones de línea germinal con y sin rescate paterno, y experimentos de interacción
genética) por medio del procedimiento de chi-cuadrado implementado por SAS (las
distribuciones no son normales), con una significación establecida en P < 0,05.

Como resultado, los autores lograron aislar nuevos alelos en el locus químico y
demostraron que estas mutaciones alteran la polaridad epitelial, un fenotipo que
puede explicar sus efectos perjudiciales. En los mutantes químicos, la proteína Cora
de las uniones septadas y la proteína apical Crumbs
estuviero mal localizadas más basalmente, y terminaron
con una expresión reducida, consistente con un equilibrio
alterado en los dominios de la membrana apical/basolateral
en los epitelios. El patrón de expresión de Arm fue normal,
pero los niveles de expresión de Arm fueron más bajos. A
pesar de que los fenotipos mutantes son similares, tanto
las mutaciones chems y cora, como las migajas y las
mutaciones chems, se comportaron de forma antagónica.
Figura7: Promoción de la
identidad de la membrana Por otro lado, las mutaciones chems y cora potenciaron los
basolateral por Chem y Cora.
fenotipos mutantes de cada uno, como se explica en la
Figura 7.

Bibliografía

Zamudio-Arroyo JM, Riesgo-Escovar JR. 2016. Drosophila chem mutations disrupt

epithelial polarity in Drosophila embryos. PeerJ 4:e2731
https://doi.org/10.7717/peerj.2731