Benemérita Universidad Autónoma de Puebla

Facultad de Medicina
Departamento de Agentes Biológicos

MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO

DE MICROBIOLOGÍA Y VIROLOGÍA

Autores:
M.C. Ma. Guadalupe Guzmán Coli
D.C. Cristina Domínguez Castillo
Dra. Silvia Enríquez Cruz
M.C. Ivan Garcia Lopez
Dra. Norarizbeth Lara Flores
M.C. Julieta Martínez García
D.C. Ma. De los Ángeles Martínez Martínez
Dra. Elisa Sánchez Cabrera
D.C. Noé Velázquez Márquez
D.C. William Toledo Rueda

1
 DIRECTORIO
Dr. José Alfonso Esparza Ortiz
Rector

Dr. José Jaime Vázquez López

Secretario General

Dr. José Luis Gándara Ramírez

Director

Dra. María Teres Abad Camacho

Secretaria Académica

Dr. Jorge George Sánchez

Secretario Administrativo

Dra. Alejandra Escobar Noriega

Coordinador de la Licenciatura en Medicina

M.C. Ma. Guadalupe Guzmán Coli

Coordinadora del Dpto. de Agentes Biológicos

2
 ÍNDICE

Pág.
Escudo del Departamento de Agentes Biológicos………….……..…….…….. 4
Reglamento interno de laboratorio de agentes biológicos facultad de
medicina, BUAP……..………………………………………..……………………. 5
Práctica 1. Clasificación y especificaciones de Manejo de los Residuos
peligrosos biológico-infecciosos……..…….……..……….……..…….……..… 8
Práctica 2. Uso de antisépticos y desinfectantes en la práctica
médica……….……..…….………………………………………………………… 13
Práctica 3. Tinción de Gram……….……..…….……………………………..….. 22
Práctica 4. Exudado faríngeo…………………………………………………..… 27
Práctica 5. Diagnóstico de Tuberculosis por Baciloscopía…………………… 46
Práctica 6. Diagnóstico de Enfermedad Diarreica Aguda (EDA)………..…… 58
Práctica 7. Diagnóstico de Infección de Vías Urinarias (IVU)……………….. 74
Práctica 8. Prueba de Sensibilidad a los Antimicrobianos y Lectura
Interpretada del Antibiograma………………………………………………….. 90
Práctica 9. Diagnóstico de Infecciones de Transmisión sexual (ITS)
producidas por Virus y Bacterias………………………………………………… 97
Práctica 10. Diagnóstico de infecciones sistémicas…………………………… 110
Práctica 11. Métodos Moleculares para el Diagnóstico de Enfermedades
Infecciosas……………………………………………………………………….…. 120
Práctica 12. Hemaglutinación de eritrocitos………………………………….. 132

3
 ESCUDO DEL DEPARTAMENTO DE AGENTES BIOLÓGICOS

En 1982 se llevó a cabo al V Congreso Nacional de Parasitología organizado por la

Universidad Autónoma de Puebla a instancias del Departamento de Agentes Biológicos; los
ponentes japoneses platicando con el Dr. Antonio Cruz López argumentaron que si era
capaz de reconocer los parásitos que se presentan en el logotipo del escudo; lo nombrarían
miembro de la Sociedad Japonesa de Parasitología y se le obsequiaría un pisa corbatas
con ese símbolo que sólo portaban los miembros de aquella sociedad.
El escudo estaba conformado por un huevo de Ascaris lumbricoides dentro de los dientes
de la cavidad oral de un uncinárido, en cuyo centro se representa la probóscide de un
mosquito Anopheles macho, todo enmarcado en la figura de un huevo de Clonorquis
sinensis.
Nació entones la idea de crear un escudo basado en el de nuestra universidad en el que se
sustituyen las diversas formas de éste por esquema de parásitos. Así, la cara de Minerva
es un trofozoito de Giardia lamblia, el gelmo del casco un trofozoito de Balantidium coli,
complementado por un taquizoito de primer orden de Plasmodium vivax, que se encuentra
adornado por un amastigote del género Leishmania. En la parte central se encuentra el ave
Fénix representada por una larva rabditoide de Strongyloides stercoralis; las flamas de
fuego son varios Enterobius vermicularis adultos y éstas se prolongan con dos imágenes
de Trichuris trichiura; estos elementos se encuentran dentro del marco triangular de un
escudo tradicional.
Adornado a modo de cintas el escudo, se halla a la derecha una hembra de Ascaris
lumbricoides y a la izquierda un macho del mismo género y especie.
El escudo se presentó ante el Rector Alfonso Vélez Pliego, quien lo vio con agrado y
expresó "úsenlo"; por lo que desde esa fecha ha sido parte de la documentación que esta
dependencia emite y ha representado al Departamento de Agentes Biológicos.

4
 REGLAMENTO INTERNO DE LABORATORIO DE
AGENTES BIOLÓGICOS FACULTAD DE MEDICINA, BUAP

Artículo 1. El presente reglamento es aplicable en los laboratorios del

Departamento de Agentes Biológicos de la Facultad de Medicina, donde se realizan
actividades con microorganismos.
Artículo 2. Los laboratorios deberán estar acondicionados, como mínimo, con lo
siguiente: Control maestro para energía eléctrica, señalamientos de protección civil,
botiquín de primeros auxilios, extintor vigente, sistema de ventilación adecuado,
agua corriente y drenaje.
Artículo 3. Todas las actividades que se lleven a cabo en los laboratorios deberán
estar supervisadas por un responsable.
Artículo 4. Al realizar actividades experimentales, nunca deberá estar una persona
sola en los laboratorios, por lo que el mínimo de personas deberá ser,
invariablemente dos.
Artículo 5. En los laboratorios queda prohibido fumar y consumir alimentos o
bebidas.
Artículo 6. Para trabajar en los laboratorios es obligatorio el uso de bata de algodón.
Artículo 7. No tiene entrada al laboratorio para realizar su práctica el estudiante que
NO porte su bata blanca adecuadamente. En caso de ser indicado por el
responsable de laboratorio, se usaran guantes u otro equipo de protección personal.
El personal que no haga uso de este equipo, no podrá permanecer en el laboratorio,
siendo responsabilidad suya el contar con el equipo mencionado.
Artículo 8. Todas las sustancias, material biológico, equipos, materiales, entre
otros, deberán ser usados con máximo cuidado atendiendo a las indicaciones de
los manuales de uso o de los manuales de seguridad, según sea el caso.
Artículo 9. Las salidas de emergencia deberán estar siempre libres de obstáculos,
accesibles y en posibilidad de ser utilizadas ante cualquier eventualidad. El
responsable del laboratorio deberá verificar esto, al menos una vez cada semana.
Artículo 10. Las regaderas y lava ojos deberán contar con el drenaje
correspondiente, funcionar correctamente, estar lo más alejadas que sea posible de

5
instalaciones o controles eléctricos y libres de todo obstáculo que impida su correcto
uso.
Artículo 11. Los controles maestros de energía eléctrica para cada laboratorio,
deberán estar señalizados adecuadamente, de manera tal, que sean identificados
fácilmente.
Artículo 12. En cada laboratorio deberá existir al alcance de todas las personas que
en él trabajen, un botiquín de primeros auxilios.
Artículo 13. Los sistemas de suministro de agua y drenaje deberán recibir
mantenimiento preventivo y correctivo, al menos una vez por cuatrimestre.
Artículo 14. Los lugares en que se almacenan reactivos, disolventes, equipos,
materiales, medios de cultivo y todo aquello relacionado o necesario para que el
trabajo en los laboratorios se lleve a cabo, estarán sujetos a este reglamento en su
totalidad.
Artículo 15. Queda prohibido desechar sustancias al drenaje sin autorización del
responsable del laboratorio.
Artículo 16. Queda prohibido usar zapatos abiertos tipo huarache.
Artículo 17. Queda prohibido pipetear con la boca. Deberán usarse bulbos de
caucho.
Artículo 18. Al finalizar las actividades de laboratorio, el responsable del área
deberá verificar que queden cerradas las llaves de paso de agua.
Artículo 19. Cualquier alteración en las condiciones de seguridad o el cumplimiento
del presente reglamento, deberá ser reportado al responsable correspondiente para
ser sancionado.
Artículo 20. Nunca deberán tomarse frascos por la tapa o el asa lateral, siempre
deberán tomarse con ambas manos, una en la base y otra por la parte media.
Artículo 21. El cumplimiento del presente reglamento estará supervisado por los
responsables de los laboratorios y el Coordinador del Departamento de Agentes
Biológicos de la Facultad de Medicina BUAP.
Artículo 22. Las infracciones al presente reglamento originarán las sanciones
correspondientes.

6
Artículo 23. Las áreas académicas podrán emitir las normas complementarias que
estimen necesarias, en tanto no contravengan lo estipulado en el presente
reglamento.
Artículo 24. Antes de iniciar cualquier trabajo, deberán lavarse las manos con agua
y jabón y secar con una toalla limpia.
Artículo 25. Los libros y cuadernos de trabajo nunca deberán colocarse en la mesa
de trabajo.
Artículo 26. Queda prohibido hacer ruidos molestos y movimiento excesivo dentro
del laboratorio.
Artículo 27. La superficie de la mesa debe ser correctamente desinfectada antes y
después de trabajar.
Artículo 28. El material usado como tubos, frascos, pipetas u otros, se colocarán
inmediatamente en recipientes específicos.
Artículo 29. Las envolturas o tapones de algodón nunca deberán tirarse al suelo.
Artículo 30. Es obligatorio adquirir y trabajar con el manual para realizar las
prácticas y aprobar el laboratorio.

7
 PRÁCTICA 1
CLASIFICACIÓN Y ESPECIFICACIONES DE MANEJO DE LOS RESIDUOS
PELIGROSOS BIOLÓGICO-INFECCIOSOS

PROPÓSITO:
AL FINALIZAR ESTA PRÁCTICA EL ALUMNO SERÁ CAPAZ DE:

 Clasificar y disponer correctamente los Residuos Peligrosos Biológico-

Infecciosos.

INTRODUCCIÓN:
Ya en los escritos de Hipócrates encontramos que en la Grecia Antigua se
consideraba que la salud representa la unidad del ser humano con su entorno, y
que por lo tanto para que aquel alcance y conserve su salud debe respetar y
conservar limpio el medio ambiente.
Sin embargo, la historia nos demuestra que cumplir esta aspiración
aparentemente sencilla no ha sido fácil y que se han implementado múltiples y
variadas soluciones. Fue hasta 1991, que la Dirección General de Salud Ambiental
de la Secretaría de Salud inicia los trabajos tendientes a elaborar una norma de
Residuos Peligrosos Biológico-Infecciosos (RPBI), que finalmente es emitida por la
Secretaría de Medio Ambiente y Recursos Naturales (SEMARNAT).
En 1995 se publicó en el Diario Oficial de la Federación la primera norma
para regular el manejo y tratamiento de los RPBI, la NOM-087-ECOL-1995. El
objetivo primordial de ésta fue proteger al personal de salud de los riesgos
relacionados con el manejo de estos residuos, así como proteger el medio ambiente
y a la población que pudiera estar en contacto con estos residuos dentro y fuera de
las instituciones de atención médica. Sin embargo, en esta norma se consideraban
una gran cantidad de residuos que en realidad no representaban ningún peligro y
fueron identificados como tal.
Para mejorar esta situación, el 17 de febrero del 2003 se publicó en el Diario
Oficial de la Federación, la NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002, Protección

8
ambiental – Salud ambiental – Residuos peligrosos biológico-infecciosos –
Clasificación y especificaciones de manejo, en la que se incorpora un
replanteamiento de los criterios para la identificación de RPBI, sin dejar a un lado el
objetivo inicial de la protección a la salud y al ambiente.
Para que un residuo sea considerado RPBI debe contener agentes biológicos
infecciosos que de acuerdo a la norma se definen como “cualquier microorganismo
capaz de producir enfermedades”, siempre y cuando ocurra lo siguiente:

La etapa de clasificación es la parte fundamental en el manejo de RPBI, para

evitar riesgos a la salud y daños al medio ambiente, lo cual conlleva a una mejor
administración de los recursos, reduciendo así los gastos de operación.

Por lo que es necesaria la cooperación del equipo médico, paramédico, personal de

laboratorio, de enfermería y de limpieza.

9
 • Material de curación y recipientes
empapados con sangre fresca.
• Recipientes con cultivos y cepas
de agentes biológico-infecciosos.
• Tubos de ensayo de plástico con
sangre fresca.
• Jeringas con sangre y sin aguja.
• Material punzocartante o de
vidrio que haya estado en
contacto con muestras biológicas.
• Agujas, bisturí, portaobjetos,
cubreobjetos.

Recipiente
Bolsa Roja
Rigido Rojo

• Material no contaminado.
• Empaques de materiales de uso
en el laboratorio.
• Telas adhesivas no contaminadas.
• Gorros

Bolsa
Negra

No se consideran RPBI la orina y el excremento, sin embargo, cuando estos

provengan de pacientes con enfermedades infectocontagiosas graves deben ser
desinfectadas con hipoclorito de sodio o formol antes de ser desechadas.

10
 • La sangre y sus componentes,
sólo en su forma líquida, así
como sus derivados no
comerciales, incluyendo las
células progenitoras,
hematopoyéticas y las
fracciones celulares o acelulares
de la sangre resultante
(hemoderivados).
• Muestras para analisis de
laboratorio (líquido sinovial,
pericárdico, pleural,
cefaloraquídeo, peritoneal y
pulmonar).
• Excluyendo orina y excremento.

Recipiente
Recipiente
Hermetico
hermetico Rojo
amarrillo

• Los tejidos, órganos y partes

que se extirpan o remueven
durante las necropsias, la cirugía
o algún otro tipo de
intervención quirúrgica y que no
se encuentren en formol.
• Animales muertos inoculados
con agentes entero-patógenos.

Bolsa amarilla

CONCLUSIÓN: El manejo correcto de los RPBI garantiza minimizar los riesgos

biológicos para los trabajadores del área de la salud, de un método sencillo como lo
es la identificación, clasificación y separación adecuada de los mismos, logrando un
mejor cuidado ambiental.

11
 Actividad orientada para consolidar el conocimiento adquirido:
Coloca en el envase que corresponda cada uno de los materiales que se te
indicarán.

Contenedor
Bolsa roja
Rigido rojo

Bolsa negra

REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA
Guía de cumplimiento de la norma oficial mexicana NOM-087-SEMARNAT-SSA1-
2002. Protección Ambiental - Salud Ambiental - Residuos Peligrosos Biológico-Infecciosos
- Clasificación y Especificaciones de Manejo. Secretaría de Medio Ambiente y Recursos
Naturales; 2007.

12
 PRÁCTICA 2
USO DE ANTISÉPTICOS Y DESINFECTANTES EN LA PRÁCTICA MÉDICA

PROPÓSITO:
AL FINALIZAR ESTA PRÁCTICA EL ALUMNO SERÁ CAPAZ DE:

 Diferenciar los conceptos de desinfección y esterilización

 Reflexionar sobre la importancia que tienen la desinfección-antisepsia y los
métodos de esterilización físicos y químicos en la salud y la práctica médica.
 Comprender los fundamentos básicos de los principales antisépticos utilizados
para la eliminación de microbiota.

INTRODUCCIÓN

La desinfección tiene como objeto reducir el número de microorganismos a un nivel

tan bajo que sea poco probable una infección. Por otro lado, en la esterilizacón se
eliminan todos los microorganismos incluyendo virus o formas de resistencia como
las esporas. Los métodos físicos y químicos que se usan para destruir
microorganismos, en los objetos inanimados, por lo general son inespecíficos, es
decir, matan una variedad amplia de células vivas. Sin embargo, los agentes
quimioterapéuticos deben ser capaces de destruir selectivamente sólo a
microorganismos y no a las células del hospedero.

El proceso de esterilización debe ser diseñado, validado y llevado a cabo de

modo tal que se asegure que es capaz de eliminar la carga microbiana de un objeto.
En indicaciones como es la preparación de vendajes, del instrumental utilizado en
cirugía o bien el área de quirófano de un hospital requiere la destrucción de
microorganismos incluyendo esporas y esto se logra a través de procesos
específicos que se muestran a continuación en la siguiente tabla:

13
 MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN

Flameado Útil para asas bacteriológicas

Calor seco Se destruyen objetos
El objeto es expuesto Incineración
contaminados con secreciones
directamente a la flama (hornos
o líquidos corporales tales como
incineradores a
ropa, tejidos o animales
180°C por 1 hora)
muertos, RPBI.

Estufa de vapor que se utiliza

para esterilización de gasas,
Autoclave vendas, materiales sólidos,
Más del 90% de todos los medios de cultivo, guantes,
productos médicos y de objetos no termolábiles.
laboratorio se esterilizan Envueltos en papel testigo o
Calor húmedo

con vapor a presión, como tornasol que cambia de color.

la autoclave a 121° c por
15 o 20 minutos.
Suficiente para destruir
bacterias, virus y esporas
de hongos
Agentes físicos
Calentamiento lento hasta una
temperatura de 65 °C por 30
Pasteurización
minutos y luego exponerlo a
enfriamiento rápido.

Tindalización Forma modificada de autoclave

La T° aumenta a 80°C por un
Ultrapasteurización
minuto con menor resultado.
No permite el paso de
Membranas filtrantes

moléculas más grandes

que los poros de la
Se usan en bancos de trabajo, quirófanos,
membrana.
laboratorios. Filtra bacteria, virus, otros se utilizan
Se utilizan recipientes de
sueros sanguíneos, cultivos y soluciones para uso
porcelana, de vidrio,
intravenoso.
membranas de gradacol,
éster de celulosa de
porosidad muy fina.
α, β, γ
Radiaciones

Ionizantes
Se utilizan microondas,
útiles para radio-
esterilización No ionizantes Rayos X

En forma de vapor
Formol intrahospitalaria Objetos
desechables
Gases

Matan la forma resistente

Cámaras de acero inoxidable
de los microorganismos
mezclado con aire y CO2.
Óxido de etileno
Jeringas, mascarillas, sondas,
tubos de intubación

14
Agentes físicos. El calor se puede aplicar como agente esterilizante de dos formas:
el calor húmedo el cual destruye a los microorganismos por desnaturalización de
las proteínas y el calor seco que destruye a los microorganismos por oxidación de
sus componentes celulares. El calor es considerado como el método de
esterilización por excelencia siempre y cuando el material a esterilizar soporte altas
temperaturas sin sufrir ningún tipo de daño.

La radiación, o emisión y propagación de la energía a través de un medio,

puede ser utilizada como agente para la eliminación de microorganismos. Así
tenemos que las radiaciones ionizantes se pueden utilizar para la esterilización de
materiales termolábiles, como por ejemplo materiales plásticos, y las radiaciones no
ionizantes, como la luz ultravioleta, puede ser empleada en el control de áreas
cerradas.

Agentes mecánicos. La filtración permite la remoción de todos los

microorganismos presentes en un líquido o un gas reteniéndolos sobre la superficie
de un material.

Agentes químicos. Algunas sustancias químicas pueden ser usadas como agentes
esterilizantes porque tienen la capacidad de promover una o más reacciones
químicas capaces de dañar los componentes celulares de los microorganismos
(proteínas, membranas entre otros).

Control del proceso de esterilización. Todos los procesos de esterilización deben

controlarse para poder asegurar que han sido efectivos. Para ello se pueden utilizar
indicadores físicos, químicos y/o biológicos, los cuales deben ser colocados en cada
carga de esterilización. La mayoría de estos indicadores son cintas adhesivas que
se adhieren al material a esterilizar. Estas cintas están impregnadas con una
sustancia química que cambia de color cuando el material ha sido sometido al
proceso de esterilización. Indicadores físicos. Entre los principales indicadores
físicos se encuentran los medidores de presión y los termómetros los cuales
permiten constatar las condiciones físicas dentro de la cámara de esterilización.

15
También existen los termógrafos los cuales, además de registrar la temperatura
alcanzada en el proceso, permiten conocer durante cuánto tiempo ésta se conservó.

Aplicación médica.
Debe entender el médico que la esterilización es necesaria en su trabajo cotidiano
debido que existen muchos procesos que requieren la utilización de materiales
estériles. Entre éstos podemos destacar:
1. La esterilización de equipos quirúrgicos y otros materiales de uso médico con el
propósito de reducir el riesgo de infecciones en pacientes.
2. En una cirugía es imprescindible trabajar con material y soluciones estériles La
esterilización del quirófano por medio de radiaciones UV.

En cuanto al concepto de desinfección se le conoce como al proceso físico o

químico que mata o inactiva agentes patógenos como bacterias, virus y protozoos
impidiendo el crecimiento de microorganismos patógenos en fase vegetativa que se
encuentren en objetos inertes. Es el proceso de destrucción de los agentes
infecciosos. No es una esterilización. Un desinfectante es un compuesto que mata
las formas vegetativas de los microorganismos, pero no sus formas de resistencia
o esporas. Los desinfectantes reducen los microorganismos nocivos a un nivel que
no dañan la salud ni la calidad de los bienes perecederos. Los desinfectantes se
aplican sobre objetos inanimados, como instrumentos y superficies, para tratar y
prevenir las infecciones. En la siguiente tabla se presentan la clasificación de los
desinfectantes.

16
 MÉTODOS DE DESINFECCIÓN
Ácido paracético Oxida
Peróxido de hidrógeno constituyentes
celulares, implantes
Agentes oxidantes
de plástico, prótesis
Ozono
quirúrgicas, lentes
de contacto
Etílico
Desinfectar piel
Alcoholes Isopropílico
sana
Metílico
Agentes químicos

Actúa sobre las

Fenol proteínas
Fenol bacterianas
Jabón quirúrgico,
Hexaclorofeno
bacterias Gram+
Inactiva reacciones
Hipoclorito de Sodio
enzimáticas
Halógenos Altera la síntesis
Yodopolivinilpirrolidona
proteica y las
o yodopovidona
membranas
(isodine)
celulares
Coagulación de
Metales pesados Merthiolate
proteínas
Peróxido de hidrógeno
Peróxidos Desinfectar piel
Agua oxigenada

APLICACIÓN MÉDICA
La desinfección debe ser utilizada cotidianamente en el quehacer médico para:
1. Cirugía menor.

2. Curar heridas.

3. Desinfectar material utilizado en las curaciones.

4. Uno de los problemas actuales se ha comprobado que las fuentes de benzal, de

alcohol, de solución de iodo no son cambiados con frecuencia y hacen que se
convierta en fuentes de infección.

5. Debemos recordarle al médico que una de las acciones más efectivas en la

actualidad sigue siendo en lavarse las manos antes y después de explorar a un
paciente y evitar que el médico se convierta en un vehículo de infección.

17
6. Tener siempre presente que las medidas profilácticas más recomendadas en la
última epidemia de influenza fue lavarse las manos con agua y jabón y utilizar un
desinfectante.

MATERIAL:
 Asas bacteriológicas
 Hisopos estériles
 Mechero de Bunsen
 Gradillas
 Desinfectantes / antisépticos (benzal, cloro, alcohol etílico, etc)
 Medios de cultivo por equipo de laboratorio:
o 4 Tubos con 3 ml de Caldo de soya tripticasa (TSC)
o 1 Placa de agar Sal y Manitol

DESARROLLO DE LA PRÁCTICA

1. Con un hisopo estéril se frota el objeto sucio y se introduce en el caldo soya

tripticasa (TSC), dejar el hisopo. Incubar a 37°C por 24 h. Observar, si hay turbidez
hay crecimiento bacteriano e interpretar el resultado.

Observación: ______________________________________________________

Interpretación: _____________________________________________________

18
2. El objeto se desinfecta (con alcohol o benzal), posteriormente con hisopo estéril
se frota y se coloca en un tubo de TSC, se incuba a 37°C de 18 a 24 h. Observar si
hay turbidez

Observación: ______________________________________________________

Interpretación: ______________________________________________________

3. Con un hisopo estéril frotar manos sucias y colocarlo en el tubo con TSC, incubar
a 37°C de 18 a 24 h. Posteriormente observar si hay crecimiento bacteriano.
Interpretar resultados.

Observación: _______________________________________________________

Interpretación: ______________________________________________________

4. Con un hisopo estéril frotar manos limpias previo lavado con jabón y de aplicación
de un gel desinfectante y colocar el hisopo en el TSC e incubar a 37°C de 18 a 24
h. Posteriormente observar si hay crecimiento bacteriano

19
Observación: ______________________________________________________

Interpretación: ______________________________________________________

5. Con un hisopo estéril frotar la zona por detrás de la oreja y sembrar por estirado
en la mitad de una caja con agar Sal y manitol. Aplicar algún antiséptico (p. ejem.
alcohol etílico al 70%) y con otro hisopo frotar la misma zona para sembrar en la
otra mitad de la caja de Petri. Incubar a 37°C / 18-24 h

MORFOLOGÍA COLONIAL
A continuación realiza la observación del crecimiento de las colonias bacterianas,
selecciona una y describe su morfología como a continuación se describe:
La morfología colonial la clasificamos de acuerdo a:
a) Color: blanca, amarilla, roja, negra, naranja
b) Densidad: opaca, traslúcida, transparente
c) Superficie: brillante, tornasol, mate, opaca
d) Consistencia: viscosa, membranosa, lábil, firme
e) Forma:

Irregular Circular Fusiforme Filamentosa Puntiforme

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f) Elevación:
Convexa Elevada Plana Invaginada Umbilicada

g) Margen:
Entero Lobulado Aserrado Filamentoso Rizoide

De acuerdo a tus resultados completa la siguiente tabla

MORFOLOGÍA
Colonia Color Densidad Consistencia Forma Elevación Margen
bacteriana

Escribe tu conclusión de la práctica:

__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________

21
 PRÁCTICA 3
TINCIÓN DE GRAM

PROPÓSITO:
AL FINALIZAR ESTA PRÁCTICA EL ALUMNO SERÁ CAPAZ DE:
 Comprender la importancia que tiene la Tinción de Gram para establecer el
diagnóstico de las infecciones bacterianas.

INTRODUCCIÓN:
El fundamento de la tinción de Gram se basa en la diferencia constitutiva de
la estructura de su pared celular en las bacterias Grampositivas y Gramnegativas.
La pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa de
peptidoglucano (peptidoglicano, mureína o mucopéptido), además de dos clases de
ácidos teicoicos: 1) el ácido lipoteicoico, anclado en la cara interna de la pared
celular y unido a la membrana plasmática y 2) el ácido teicoico en la superficie, que
está anclado solamente en el peptidoglucano (Ver figura 3.1).
Por el contrario, la capa de peptidoglucano de las Gram negativas es delgada
y se encuentra unida a una segunda membrana plasmática exterior (de composición
distinta a la interna) por medio de lipoproteínas. La membrana exterior está formada
por proteína, fosfolípido y lipopolisacárido.
Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tiñen diferencialmente debido a
estas propiedades constitutivas de su pared. La clave es el peptidoglicano, ya
que es el material que confiere rigidez a la pared celular bacteriana y las
Grampositivas lo poseen en mucha mayor proporción en comparación con las
Gramnegativas.
El cristal violeta (colorante catiónico) penetra en todas las células bacterianas
a su pared bacteriana (tanto Gram positivas como Gramnegativas). El lugol es un
compuesto formado por yodo (I2 en equilibrio con KI), el cual está presente para
solubilizar el yodo y actuar como mordiente, haciendo que el cristal violeta se fije
con mayor intensidad a la pared de la célula bacteriana. El yodo entra en las
células y forma un complejo insoluble en solución acuosa con el cristal violeta.

22
 La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la
decoloración, ya que en la misma es soluble el complejo yodo/cristal violeta. Los
organismos Grampositivos no se decoloran, mientras que los Gramnegativos sí
lo hacen. Para poner de manifiesto las células Gramnegativas se utiliza una
coloración de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la
safranina o la fucsina. Después de la coloración de contraste las células
Gramnegativas son rojas, mientras que las Grampositivas permanecen azules.

Fig. 3.1 Se representa esquemáticamente la composición de la pared celular

bacteriana.

La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloración, se debe a que la

membrana externa de las Gramnegativas es soluble en solventes orgánicos,
como por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. La capa de peptidoglucano que
posee es demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristal
violeta/yodo que se formó previamente y por lo tanto este complejo se escapa,
perdiéndose la coloración azul-violácea. Pero por el contrario, las Grampositivas,
al poseer una pared celular más resistente y con mayor proporción de
peptidoglicanos, no son susceptibles a la acción del solvente orgánico, sino
que este actúa deshidratando los poros cerrándolos, lo que impide que pueda
escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la coloración azul-
violácea.

23
¿Cómo es el procedimiento?
1. Preparación del frote (frotis). Sobre un portaobjetos de vidrio limpio y seco,
se coloca una gota del material que se va a teñir (colonia bacteriana, producto
biológico) o se hace rodar el hisopo con que se obtuvo la muestra. Este material
es suspendido e n una gota de agua o solución salina previamente colocada
sobre el portaobjetos. El material colocado en el portaobjetos se deja secar al aire.
Posteriormente deberá fijarse la muestra al portaobjetos pasando varias veces
por la zona azul de la llama de un mechero de Bunsen, el vidrio no debe quemar
la palma de la mano.
2. Dejar secar al aire.
3. Fijar al calor (pasar la laminilla por la flama del mechero).
4. Enfriar
5. Colocar en un puente de tinción.
6. Realizar la tinción de Gram como indica el esquema siguiente (por cada paso hay
un lavado con agua)

7. Secar la preparación.
8. Observar el frotis en el microscopio en objetivo de inmersión (100x).
9. Observar la afinidad tintorial.
10. Observar la morfología bacteriana microscópica y describirla.

24
 APLICACIÓN MÉDICA E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

El diagnóstico mediante la tinción de Gram es precoz y orientador, por tanto hay

que confirmar con cultivos y pruebas de diferenciación bacteriana.

Para la interpretación adecuada de resultados de la Tinción de Gram, se

deberá de considerar integralmente lo siguiente: 1) La procedencia de la muestra
biológica, 2) Su microbiota residente y 3) los aspectos microscópicos hallados, tales
como: la forma (cocos, bacilos), Agrupación (diplo, estafilo, estrepto, sarcinas,
tétradas) y Afinidad tintorial (Grampositivos o Gramnegativos).

Ejemplos:
 Si el reporte de una secreción de expectoración patógena son cocos Gram
positivos agrupados en racimos, es probable que te enfrentes a un
Staphylococcus aureus.
 Si observas es una secreción de expectoración diplococos Gram positivos
en cadenas cortas, es probable que te enfrentes a un Streptococcus
pneumoniae.
 Si observas cocobacilos Gram negativos, es posible que te enfrentes a un
Haemophillus influenzae.
 Si observas cocos en cadenas largas es probable que sea Streptococcus
pyogenes.
 Si observas bacilos Gram negativos es probable que sea una enterobacteria
(Escherichia coli, Klebsiella sp).
 El que te enfrentes a un Gram positivo y aun Gram negativo tiene una
utilidad importante, si es Gram positivo deberás utilizar antibiótico
betalactámico como penicilina sódica cristalina, ampicilina, amoxicilina,
dicloxacilina.
 Si es un bacilo Gram negativo deberás iniciar una terapéutica con
aminoglucósidos.

25
 Ejercicios para consolidar el conocimiento adquirido
Dibuja tus observaciones

CUESTIONARIO
Ejercicios para evaluar el conocimiento adquirido
Discute junto con el profesor las siguientes preguntas:
1. ¿De qué color se observarían las células Gram negativas si no se aplicara el
colorante safranina después del lavado con alcohol acetona?
2. ¿Qué estructura celular es la responsable de la tinción diferenciada entre Gram-
positivas y Gram negativas?
3. En un diagnóstico presuntivo la utilidad la tinción de Gram es con la finalidad de:
4. La tinción de Gram tiene importancia epidemiológica para:
5. ¿Cuáles son las fuentes de errores más comunes en la Tinción de Gram?

26
 PRÁCTICA 4
EXUDADO FARÍNGEO

PROPÓSITOS

AL FINALIZAR ESTA PRÁCTICA EL ALUMNO SERÁ CAPAZ DE:

 Comprender la utilidad e importancia diagnóstica del exudado faríngeo a

través de la revisión de un caso clínico en conjunto con el profesor de
laboratorio.
 Reconocer e identificar los microorganismos de la flora normal y los principales
patógenos del tracto respiratorio superior.
 Identificar los Criterios de Centor así como las indicaciones para realización de
exudado faríngeo.
 Esquematizar los pasos para la obtención, conservación y procesamiento
microbiológico de la muestra de exudado faríngeo.
 Realizar cultivo de exudado faríngeo, describir la morfología colonial y conocer
algunas pruebas.
 Interpretar de resultados de manera crítica y concisa.

INTRODUCCIÓN

El término Infección aguda de las vías respiratorias superiores (IAVRS) se

refiere a la enfermedad infecciosa, que afecta al aparato respiratorio desde la nariz
hasta antes de la epiglotis, durante un periodo menor a 15 días, frecuentemente
ocasionado por virus y ocasionalmente por bacterias.

La IAVRS es la primera causa de enfermedad, en México; igualmente es el

primer motivo por el cual se busca atención médica. La enfermedad se presenta en
todos los grupos etarios; sin embargo, la mayoría de los casos observados en la
población general ocurren en pacientes pediátricos (60%), principalmente en
menores a 4 años de edad.

27
 Los niños presentan entre 2 a 4 episodios de infección respiratoria,
anualmente; sin embargo, no es raro que presenten 5 a 8 episodios de refriado
común al año. En el 80 a 90% la etiología es viral, estos episodios de infección son
generalmente benignos y se auto limitan en corto tiempo. En una proporción menor,
entre 15 hasta 30% de los casos en niños y entre 5 hasta 20% en adultos, la
etiología es bacteriana: Streptococcus pyogenes (Estreptococo β hemolítico del
grupo A o EBHA), Streptococcus pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae, Neisseria
meningitidis y Neisseria gonorrhoeae. Con base en lo expresado previamente, es
posible afirmar que la mayoría de los pacientes con IAVRS solo requieren de
tratamiento sintomático y no el uso indiscriminado de antibióticos, los cuales solo
deben limitarse a infecciones bacterianas.

La faringoamigdalitis aguda (FAA) es una de las infecciones respiratorias

más frecuentes en nuestro medio, puede ser causada por varios virus y bacterias,
entre los virus, los adenovirus son de los más prevalentes, además encontramos
rinovirus, enterovirus, virus influenza A y B, virus parainfluenza, virus respiratorio
sincitial, coronavirus, metapneumovirus humano, virus de Epstein-Barr, virus del
herpes simple, citomegalovirus y el virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1
(VIH-1). (Ver tabla 4.1)

Las causas bacterianas más frecuentes son EBHGA, que causa hasta el 30%
de los casos en población infantil, pero es menos frecuente en los adultos del 5-
15%. Es habitual la existencia de portadores asintomáticos, principalmente entre los
niños. Otras bacterias implicadas en la FAA en nuestro medio son Streptococcus
dysgalactiae subsp, equisimilis (estreptococos β-hemolíticos de los grupos C y G),
Haemophilus influenzae tipificable y no tipificable. . Más raramente, la FAA puede
estar causada por Fusobacterium necrophorum, Borrelia vincentii, Arcanobacterium
haemolyticum, Neisseria gonorrhoeae (en adolescentes y adultos que practican
sexo oral-genital), Mycoplasma pneumoniae (causa además bronquitis aguda o
infección respiratoria superior) y Chlamydophila pneumoniae. (Ver tabla 4.1). Los
estreptococos causantes de FAA mantienen hasta la fecha sensibilidad a las
penicilinas y a otros antibióticos β-lactámicos, a pesar del uso masivo de éstos.

28
CARACTERÍSTICAS VIRAL BACTERIANA

EDAD <4 años y >45 años 5-15 años

ESTACIONAL Variable Invierno-primavera

INICIO Gradual Brusco

Fiebre elevada
SÍNTOMAS Fiebre leve Odinofagia leve
Odinofagia importante

Tos, conjuntivitis, rinitis, mialgias, Cefalea, náuseas, vómitos,

OTROS SÍNTOMAS
diarrea exantema

Eritematosa Inflamación importante

FARINGE
Exudado (65%) Exudado (70%)

ADENOPATÍAS Múltiples y pequeñas o ausentes Dolorosas. Aumento de tamaño

Tabla 4.1 Diferencias clínicas entre faringoamigdalitis viral y bacteriana:

Como se ha comentado anteriormente la mayor parte de las FAA son de origen

viral y ocurren en el contexto de un cuadro catarral. Suelen presentarse en forma
de brotes epidémicos y se acompañan de síntomas virales como la congestión
nasal, febrícula, tos, disfonía, cefalea, o mialgias, recordando que hasta un 65% de
las FAA virales cursan con exudado faringeo. La FAA bacteriana cursa con un
cuadro brusco de fiebre alta con escalofríos, odinofagia y disfagia importantes, pero
sin síntomas virales generales, hasta un 30% cursan sin exudado. La mayor
contagiosidad es al inicio de la sintomatología y mientras el paciente se encuentra
en el periodo febril. En la tabla 1 se reflejan las principales diferencias clínicas entre
la etiología viral y bacteriana. En la tabla 4.2 se describen los principales síntomas
y signos que sugieren una etiología específica en la FAA.

29
Tabla 4.2. Características clínicas específicas en base al agente etiológico de la
faringoamigdalitis aguda:

AGENTE ETIOLÓGICO CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS

VIRUS

Rinovirus Resfriado común. Predominio en otoño y primavera.

Coronavirus Resfriado común. Predominio en invierno.

Influenza A y B Resfriado común.

Parainfluenza Resfriado, crup laríngeo.

Adenovirus Fiebre faringoconjuntival. Predominio en verano.

Virus Coxsackie A Suele afectar a niños. Brotes epidémicos en verano.

Fiebre alta. Odinofagia intensa. Hiperemia en pilares amigdalinos. Vesículas

pequeñas, superficiales, con halo rojo. Enfermedad boca-mano-pie.

Virus del herpes simple 1 y 2 Gingivoestomatitis, vesículas y úlceras que afectan a faringe y cavidad oral.
Puede cursar con exudado faríngeo.

Virus de Epstein-Barr (VEB) Mononucleosis infecciosa. Más frecuente en adolescentes.

Fiebre. Malestar general. Astenia. Mialgias.

Importante inflamación faringoamigdalar que puede ser obstructiva y

requerir
tratamiento antiinflamatorio intenso.

Exudado amigdalar en 50% de los casos.

Inflamación ganglios cervicales. Esplenomegalia. Alteración hepática.

La toma de antibióticos puede desencadenar un exantema máculo-papular

en tórax y extremidades.

Citomegalovirus Síndrome mononucleósico. Respecto a VEB menos intensa la

faringoamigdalitis y mayor aumento de transaminasas.

VIH Primoinfección: Fiebre. Mialgias. Artralgias.

Exantema cutáneo. Linfadenopatías y ulceraciones mucosas sin exudado.

BACTERIAS

Estreptococo Grupo A Faringoamigdalitis.

Escarlatina (por cepas productoras de toxinas eritrogénicas). Exantema

30
 máculo-papuloso más acentuado en pliegues. Lengua aframbuesada.
Descamación durante convalecencia.

Posibilidad de fiebre reumática.

Estreptococos grupos C y G Faringoamigdalitis.

Arcanobacterium Faringoamigdalitis. Exantema escarlatiniforme.

haemolyticum

Neisseria gonorrhoeae Faringoamigdalitis.

Corynebacterium diphteriae Exudados faríngeos. Estridor. Alteraciones cardíacas.

Anaerobios Angina de Plaut-Vincent. Gingivoestomatitis.

Fusobacterium necrophorum Tromboflebitis séptica de la yugular interna: dolor intenso, disfagia,

tumefacción y rigidez cervical.

Francisella tularensis Faringoamigdalitis. Con antecedentes de consumo de carne silvestre poco

cocinada.

Yersinia enterocolítica Faringoamigdalitis. Enterocolitis. Puede cursar con exudados.

Mycoplasma pneumoniae Bronquitis. Neumonía.

HONGOS

Candida spp. Pacientes inmunodeprimidos, con múltiples tratamientos antibióticos,

corticoides inhalados o quimioradioterapia. Exudado blancuzco en faringe y
cavidad oral.

Afectación superficial, sin fiebre ni adenitis.

Es muy importante recordar las complicaciones que puede provocar EBHA, las
cuales se clasifican en 2 grupos, supurativas y no supurativas por ello es de suma
importancia su diagnóstico

 Complicaciones supurativas. Ocurren por afectación de las estructuras

contiguas a la infección, o por extensión de la infección a las zonas de
drenaje. De entre ellas destacan el flemón y el absceso periamigdalino, el
absceso retrofaríngeo, la otitis media aguda, la sinusitis, la mastoiditis y la
adenitis cervical supurativa. Más excepcionales son la tromboflebitis dela
vena yugular interna (síndrome de Lemierre), la fascitis necrotizante, la

31
 meningitis o los abscesos metastásicos por diseminación hemática. Estas
complicaciones pueden aparecer en un 1-2% de las FAA bacterianas sin
tratamiento o mal tratadas con un antibiótico inadecuado o mal
cumplimentado. Diversos estudios publicados en los últimos tres años ponen
de manifiesto que otros gérmenes distintos del EBHGA pueden causar estas
complicaciones, como por ejemplo, el causado por S. anginosus y
posiblemente por Fusobacterium sp.
 Complicaciones no supurativas. Destaca la fiebre reumática aguda y la
glomerulonefritis post-estreptocócica, que ocurre tras un periodo de latencia
de unas semanas.
En nuestro país el diagnóstico acostumbra a ser clínico, sin embargo, ninguno de
estos signos y síntomas ya descritos son específicos de la FAA por EBHGA, ya que
los criterios clínicos tienen poca validez para discernir la causa estreptocócica del
resto de causas.

CRITERIOS DE CENTOR
Fiebre o historia de fiebre >38°C
Exudado o hipertrofia amigdalar
Adenopatías laterocervicales dolorosas
Ausencia de tos
Número de Probabilidad de
Criterios infección por
de Centor EBHGA
Cuatro 39-57%
Tres 25-35%
Dos 10-17%
Uno <10%
Cero <2,5%

EBHGA: Estreptococo β-hemolítico del grupo A.

Tabla 4.3 Criterios de Centor y probabilidad de infección por Estreptococo β-

hemolítico del grupo A

32
 Diversos estudios han evaluado escalas de predicción clínicas que aumentan
las probabilidades de infección causada por EBHGA, la más conocida es la de
Centor, que usa cuatro criterios: fiebre, exudado o hipertrofia faringo amigdalar,
adenopatías latero cervicales dolorosas y ausencia de tos, en la que se suma un
punto por cada uno de los criterios presentes, oscilando la puntuación global de 0 a
4.

La mayoría de expertos opinan que no pueden usarse estas escalas de

puntuación clínica sin una evaluación adicional para el diagnóstico de la FAA por
EBHGA porque los médicos suelen sobreestimar la probabilidad de infección por
esta causa. Esto está apoyado por dos estudios que mostraron que los pacientes
con cuatro criterios presentan entre el 39 y el 57% de probabilidades de presentar
un cultivo faríngeo positivo para EBHGA (Ver tabla 4.3).

El cultivo faríngeo es la prueba de referencia para conocer la etiología de la

infección. Su principal desventaja es el tiempo que se tarda en obtener resultados.
Al mismo tiempo, es muy probable que la etiología por anaerobios se haya infra
estimado hasta ahora ya que su identificación requiere de unas condiciones de
cultivo anaerobias estrictas que muchos laboratorios de microbiología no disponen,
a pesar de sus inconvenientes sigue siendo el estándar de oro, ya que es un estudio
económico con un 90-95% de sensibilidad.

INDICACIONES PARA EXUDADO FARÍNGEO

El cultivo del exudado faríngeo está indicado fundamentalmente para el

diagnóstico de las faringoamigdalitis causadas por el estreptococo β-hemolítico del
grupo A y su diferenciación de los casos de etiología vírica, que no requieren
tratamiento antibiótico, así como para identificar los casos ocasionales producidos
por microorganismos menos frecuentes (otros estreptococos β-hemolíticos-no
grupo A, Arcanobacterium haemolyticum, Mycoplasma pneumoniae) y el
diagnóstico de difteria y tos ferina. Además, está indicado en el diagnóstico de
abscesos retrofaríngeos, donde hay que tener en cuenta la presencia de

33
microorganismos anaerobios, en infecciones por Neisseria gonorrhoeae y en el
estudio de portadores de Neisseria meningitidis y microorganismos
multirresistentes.

MATERIALES:

- Abatelenguas
- Hiposo estéril
- Placas de Petri de agar Sangre y agar Sal y Manitol
- Mechero de Bunsen
- Peróxido de Hidrógeno
- Tubo Vacuntainer de Citrato (azul)
- Torniquete
- Aguja Vacuntainer con su sistema para obtención de sangre o jeringa 5 ml
- Portaobjetos
- Asa bacteriológica
- Solución salina
- Encendedor
- Cinta Masking tape
- Discos impregnados con bacitracina y optoquina

DESARROLLO DE LA PRÁCTICA:

Condiciones previas del paciente

a. Presentarse en ayunas.
b. No haberse lavado los dientes ni enjuagarse la boca.
c. No haber estado tomando agua por la mañana
d. No debe estar tomando antibióticos 5 días antes de la toma de muestra
e. Para niños menores de un año ayuno mínimo de 3 horas.

34
Toma de muestra

1. Previo a la toma de muestra, presentarse con el paciente y explicarle

ampliamente el procedimiento a realizar.
2. Sentarlo cómodamente, colocar su cabeza hacia atrás e iluminar la cavidad
oral y con un abatelenguas abatir la lengua lo que facilitará el acceso a la
parte posterior de la orofaringe.
3. Utilizando un hisopo estéril, realizar un raspado firme en ambas amígdalas,
haciendo girar el hisopo en las áreas lesionadas que se observan
hiperémicas, purulentas o necróticas y también en las membranas formadas
sobre las lesiones o de las manchas de Koplic.
4. Retirar el hisopo cuidando de no tocar las paredes laterales de orofaringe,
úvula, lengua, encías y dientes.
5. Extender la muestra con suaves movimientos sobre la superficie de los
portaobjetos para realizar los frotis que serán teñidos al Gram.
6. Obtener un segundo hisopado para la siembra en Agar Sangre y Agar Sal y
Manitol, siguiendo la técnica de estriado sobre superficie, realizando
siembras de profundidad con el asa para la detección de hemolisinas
estreptocócicas en Agar Sangre.
7. Incubar las placas de Petri de 24-72 h a 35-37°C (Ver Figura 4.1).
8. Transcurrido el tiempo de incubación, revisar los resultados de crecimiento
microbiano.
9. Realizar las pruebas bioquímicas convenientes para determinación de
crecimiento de flora normal y patógena.
10. Reportar e interpretar resultados.

Nota: En algunos casos, los médicos son los encargados de toma y envío de
muestras a los laboratorios, una vez realizado el exudado se debe introducir el
hisopo en un tubo con tapón de rosca que contenga el medio de transporte
adecuado al microorganismo que se sospeche, ejemplo Medio Stuart.

35
 Toma de muestra Sembrado en Agar

Incubación

Figura 4.1 Procedimiento para toma de Exudado Faringeo.

De 24 a 48 horas:

1. Evaluar cada placa de cultivo según las características morfológicas de las

colonias, la presencia o no de hemólisis (Tabla 4.4 y Esquema 4.1) y valorar
el desarrollo bacteriano en escaso, moderado o abundante.
2. Realizar el análisis microscópico de las colonias de interés microbiológico,
según el tipo de muestra. Para ello preparar frotis con las colonias a
investigar y teñir con la coloración de Gram. Observar y registrar los
resultados.

TIPO DE HEMOLISIS EN GELOSA SANGRE

α–hemólisis β–hemólisis γ–hemólisis

(hemolisis incompleta) (hemólisis completa) (sin hemólisis)

Se presenta una zona de
glóbulos rojos
parcialmente lisados que
rodean a la colonia,
acompañada por un color
verde tenue, con
tendencia a dar un color
café con decoloración de
la placa, alrededor de la
superficie de las colonias.
Proporciona una zona totalmente No hay cambios de color
decolorada alrededor de la colonia que
alrededor de las colonias
indica hemólisis de los glóbulos rojos. Vista
en las placas con la técnica de profundidad, bacterianas.
las colonias tienen la forma de aguja. Si la
técnica se hace por estría en superficie la
hemólisis puede aparecer como alfa o sin
hemólisis dada la in activación de una de las
hemolisinas, la estreptolisina O, la cual es
sensible al oxígeno. Con la estreptolisina S,
hemolisina estable al oxigeno puede estar
presente en pequeñas cantidades, por lo
que las colonias pueden dar hemólisis
pobres.

Tabla 4.4 Tipos de hemólisis en Agar Gelosa Sangre

36
 Esquema 4.1. Protocolo de rutina en exudado faríngeo.

Para diferenciar S. pyogenes de otros beta-hemolíticos, se pueden utilizar

diferentes pruebas, siendo la de uso común la prueba de la bacitracina (Esquema
2). Esta prueba se basa en la susceptibilidad de S. pyogenes frente a una
concentración relativamente baja de bacitracina. Para ello se inocula la cepa pura
en Agar Sangre, mediante hisopo estéril extendiendo en cuatro direcciones; se
coloca el taxo A (bacitracina 0,04 U). Al cabo de 18-24 h de incubación a 36°C, se
detectará la presencia de un halo de inhibición del crecimiento de cualquier tamaño,
que indica la susceptibilidad del microorganismo. Esta técnica tiene un 5% de falsos
negativos y entre 10 y 20% de falsos positivos ya que otros Streptococcus (grupos
C y G) también pueden dar sensibles.

Otra prueba disponible en muchos laboratorios es la hidrólisis del PYR, ésta

se fundamenta en la actividad de la enzima pirrolidonil aminopeptidasa producida
por S. pyogenes, sobre un sustrato el L-pirrolidonil-beta-naftilamida (PYR), con
formación de beta-naftilamida libre, que se combina con el reativo cinamaldehído
formando un producto final de color rojo.

37
 Esquema 4.2 Identificación de Streptococcus pyogenes

La identificación definitiva se lleva a cabo mediante la detección del antígeno

específico de grupo, también llamado carbohidrato de Lancefield; ésta se realiza a
través de métodos de aglutinación con partículas de látex o coaglutinación,
directamente sobre la colonia aislada. Solo los estreptococos beta-hemolíticos, A ,
B , C , F , G y los alfa o no hemolíticos del grupo D pueden clasificarse con esta
prueba. Para su realización se procede a una extracción previa de los antígenos de
pared, que dependiendo del método, se empleará: ácido, calor o enzimas.

Luego se hace reaccionar la cepa pura de 24 h de desarrollo con cada uno de

los antisueros para cada serogrupo. La reacción positiva se evidenciará

38
dependiendo de la interpretación de cada protocolo: ya sea por aglutinación,
coaglutinación, entre otros.

Detección directa de Streptococcus del grupo del A en hisopado de garganta

Estas pruebas permiten detectar directamente el carbohidrato de la pared de

S. pyogenes, a partir de un hisopado faríngeo, con la ventaja de obtener resultados
inmediatos. La mayoría de las pruebas rápidas tienen excelente especificidad
(>95%) comparado con el cultivo, sin embargo, la sensibilidad alcanza entre 80 y
90%. Por lo que se recomienda que una prueba negativa sea confirmada con el
cultivo.

Entre los métodos de detección rápida de antígenos se emplean las pruebas

de aglutinación con látex y los métodos de enzimoinmunoanálisis (ELISA), estos
últimos con una mayor sensibilidad y especificidad. Actualmente se ha desarrollado
la prueba de inmunoensayo óptico y sondas de ADN quimioluminiscentes. Los datos
sugieren que son más sensibles aunque más costosos, por lo cual no están
disponibles para uso rutinario.

Las desventajas de estos métodos de detección directa se basan en:

- Solo detectan Streptococcus grupo A, no detecta otros serogrupos.

- Bajo valor predictivo positivo, esto es, que no diferencia eficientemente los
portadores de un individuo infectado con un reducido número de S. pyogenes.

- El elevado costo, sobre todo de los últimos métodos.

En el caso de Agar Sal y Manitol observe si hubo la fermentación del manitol, si hay
viraje a color amarillo (Staphylococcus aureus), además realizar prueba de catalasa
y coagulasa como se menciona posteriormente (Tabla 4.5). Registrar todas las
características observadas.

39
 CATALASA COAGULASA

Enzima que descompone el peróxido de Es una enzima proteica con actividad

hidrógeno (H2O2) en oxígeno y agua. semejante a la protrombina, capaz de
Químicamente la catalasa es una transformar el fibrinógeno en fibrina,
hemoproteína de estructura similar a la de la provocando la formación de un coagulo visible
hemoglobina, excepto que los 4 átomos de en un sistema analítico adecuado. Se cree que
hierro de la molécula se encuentran la coagulasa funciona in vivo produciendo una
oxidados. Excluyendo los estreptococos, la barrera en el sitio de la infección estafilocócica.
mayoría de las bacterias aerobias Esto puede servir para localizar los organismos
descomponen el H2O2 con peroxidasas in vivo, en abscesos. En el laboratorio, la
semejantes a la catalasa. Está prueba es prueba de coagulasa se utiliza más
comúnmente utilizada para diferenciar comúnmente para diferenciar al S. aureus
Estreptococos (catalasa negativos) de (coagulasa +) de otros estafilococos y
Estafilococos (catalasa positivos). micrococos.

Tabla 4.5 Características de las enzimas catalasa y coagulasa

Prueba de catalasa

1. Añadir 1 o 2 gotas de peróxido de hidrógeno (H2O2) en un portaobjetos.

2. Esterilizar el asa bacteriológica y al enfriar transferir una colonia bien aislada
del cultivo en la superficie del portaobjetos.
3. Para un resultado positivo observar si hay producción de burbujas de gas o
efervescencia (Figura 4.2).

Figura 4.2. Prueba de catalasa positiva (B) y negativa (A).

40
Prueba de coagulasa

1. Colocar una gota de solución salina estéril sobre un portaobjetos

2. Transferir una colonia del medio de cultivo al portaobjetos
3. Colocar una gota de plasma en el portaobjetos
4. Inclinar el portaobjetos hacia uno y otro lado, observar si hay formación de
un precipitado granular o grumos blancos (Figura 4.3).

A B

Figura 4.3. Prueba de coagulasa positiva (A) y negativa (B).

41
RESULTADOS Y OBSERVACIONES

Completa la ficha de solicitud de toma de muestra.

BENEMERITA UNIVERSIDAD AUTONOMA DE PUEBLA

FACULTAD DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE AGENTES BIOLOGICOS

Nombre del paciente: ____________________________________________________ Edad:_______

Sexo: ____ Fecha de toma de muestra: _____________ Tipo de muestra:______________________
Examen solicitado:___________________________________________________________________
Impresión Diagnóstica: _______________________________________________________________
B
Recibe antibióticos Especifique droga y ultima dosis:____________________________________
Resumen clínico:
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________

42
 Ejercicio para evaluar el conocimiento obtenido

PRUEBA REALIZADA AGENTES SUGESTIVOS

Cultivo en Agar Gelosa

Sangre

Tipo de hemólisis

Cultivo en Agar Sal y Manitol Viraje amarillo

Sin viraje

Catalasa Positiva

Negativa

Coagulasa Positiva

Negativa

Interpreta los resultados obtenidos y anota tus conclusiones

_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________

43
 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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comunitaria para la discriminación rápida de faringitis bacteriana y vírica en pacientes
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Editorial Venezolana C. A.

45
 PRÁCTICA 5
DIAGNÓSTICO DE TUBERCULOSIS POR BACILOSCOPÍA

PROPÓSITOS:

AL FINALIZAR ESTA PRÁCTICA EL ALUMNO SERÁ CAPAZ DE:

 Comprender la importancia diagnóstica de las baciloscopías a través de la

revisión de un caso clínico en conjunto con el profesor de laboratorio.
 Analizar otros recursos de laboratorio útiles para el diagnóstico de TB.
 Realizar e interpretar los resultados tras la tinción de Ziehl-Neelsen.

INTRODUCCIÓN

Mycobacterium tuberculosis

En 1882, Robert Koch describió el agente etiológico de la tuberculosis (TB) y lo

denominó Bacterium tuberculosis. El nombre inicial fue sustituido por el de
Mycobacterium tuberculosis en 1896 por Lehmann y Neumann. El término
Mycobacterium significa hongo-bacteria, y esta denominación se debe al aspecto
de los cultivos, que en ciertos aspectos recuerdan a los de los hongos (Mims C,
Playfeir JH y Roitt I, 1999).

Hoy en día, dentro del género Mycobacterium se han descrito más de 120
especies de micobacterias diferentes. Se caracterizan por ser bacterias ácido-
alcohol resistente (BAAR) debido al alto contenido en lípidos que tienen en su pared
celular.

La bacteria requiere técnicas especiales de tinción y medios de cultivo

distintos a los empleados habitualmente en bacteriología, además, para poder
aislarla, y debido a su lento crecimiento, hay que realizar una descontaminación
previa de la mayoría de las muestras, con el fin de destruir la flora acompañante
que crece más rápidamente.

46
 Las micobacterias son capaces de sobrevivir durante semanas o meses
sobre objetos inanimados, siempre que estén protegidas de la luz solar, y son más
resistentes a los ácidos, álcalis y desinfectantes que el resto de las bacterias no
formadoras de esporas. Resisten la desecación y la congelación, pero la luz
ultravioleta y el calor (>65º C durante 30 minutos) las inactiva (Murray P.R, Pfaller
M.A. y Rosenthal, 2009).

El complejo tuberculosis: Incluye las especies M. tuberculosis,

Mycobacterium bovis (incluida la cepa BCG) y Mycobacterium africanum,
productoras todas ellas de tuberculosis, siendo el primero el que se aísla con mayor
frecuencia. Se incluye también Mycobacterium microti, productor de tuberculosis en
rata (Murray P.R, Pfaller M.A. y Rosenthal, 2009).

La tuberculosis es una enfermedad en la que las bacterias se multiplican y

atacan diferentes partes del cuerpo. Los síntomas de la enfermedad de tuberculosis
incluyen debilidad, pérdida de peso, fiebre, falta de apetito, escalofríos y sudores
por la noche.

5.1 Diagnóstico clínico:

La tuberculosis es una enfermedad en la que las bacterias se multiplican y atacan

diferentes partes del cuerpo. Los síntomas de la enfermedad de tuberculosis
incluyen debilidad, pérdida de peso, fiebre, falta de apetito, escalofríos y sudores
por la noche Otros síntomas de la enfermedad de tuberculosis dependen del área
del cuerpo donde estén proliferando las bacterias. Si se localiza en los pulmones
(tuberculosis pulmonar), los síntomas pueden incluir tos intensa, dolor en el pecho
y tos con sangre. Una persona con enfermedad de tuberculosis puede ser
contagiosa y transmitir la tuberculosis a otras personas (Koneman E, 1999).

En 1976, la American Lung Association, propuso una clasificación dinámica

de la tuberculosis que incluye los aspectos epidemiológicos, inmunológicos, clínicos
y de tratamiento, esta clasificación se divide en los siguientes grupos (Hospital
General de México [HGM], “s.f.”):

47
 Individuos no infectados y no expuestos a la
infección
Clase 0

Individuos en contacto con tuberculosos.

Combe positivo. PPD negativo
Clase I

Infección Tuberculosa, sin enfermedad

evidente. BAAR negativo. PPD positivo.
Clase II
Requieren vigilancia estricta y eventualmente
tratamiento quimioprofilaxis.

Tuberculosis activa, pulmonar o

extrapulmonar. El cultivo para M.tuberculosis
es positivo aunque la baciloscopia no siempre
Clase III es positiva y existe la evidencia radiográfica de
enfermedad pulmonar o extrapulmonar. Deben
estudiarse y totalmente y tratarse con los
esquemas propuestos por la NOM-006-SSA2-
1993.

Tuberculosis sin enfermedad activa pero

con secuelas. Pueden ser datos radiográficos,
PPD positivos, cultivo negativo.
Clase IV
Se debe investigar fecha de diagnóstico y
tratamiento previo. En caso necesario puede
reclasificarse de acuerdo a resultados.

Sospecha de tuberculosis. El diagnóstico

debe ser confirmado antes de 3 meses y
Clase V
reclasificado.

5.2 Diagnóstico epidemiológico: Los factores de riesgo son diversos, uno de los
más importantes es estar en contacto con pacientes tuberculosos. Además se
asocia factores que afectan la respuesta inmunológica como desnutrición,
enfermedades inmunosupresoras (VIH-SIDA), tabaquismo.

48
5.3 Diagnóstico de laboratorio y gabinete:

5.3.1. Baciloscopías (Investigación de BAAR en espetoración): Es un examen

microscópico para la detección de bacilos ácido alcohol resistentes (BAAR)
mediante la tinción de Ziehl–Neelsen. Sencillo y de bajo costo. Presenta baja
sensibilidad, ya que se requieren al menos 5 000 bacilos/ml de esputo para que la
microscopía resulte positiva; la sensibilidad es aún menor en casos de tuberculosis
extra pulmonar, cuando existe coinfección con VIH y cuando la infección es debida
a micobacterias no tuberculosas (Koneman E, 1999).

5.3.2. Prueba cutánea de la tuberculina (intradermorreacción de Mantoux): Es

una prueba que a menudo se utiliza para saber si la persona está infectada con
tuberculosis. Un antígeno denominado tuberculina es inyectado debajo de la piel en
la parte anterior del antebrazo. Si se tiene una reacción positiva a esta prueba, es
probable que tenga la infección de tuberculosis. Sin embargo más que ser una
prueba diagnóstica es una prueba orientadora porque sólo nos dice que el paciente
estuvo en contacto en algún momento de su vida con el agente, más no que tenga
una infección activa.

Valores de Referencia
Positiva (+) Eritema y edema 5-10 mm diámetro
Positiva (+) Eritema y edema 10-15 mm diámetro
Positiva (+++) Eritema y edema 15-20 mm diámetro
Positiva (++++) Necrosis central y marcado edema

5.3.3. Cultivo sólido o líquido e identificación de micobacterias. Aumenta la

posibilidad de diagnóstico en un 30 - 50% en relación a las técnicas de microscopía.
Evidentemente es un método más complejo y requiere de medidas de bioseguridad.
Pacientes que presenten dos series de tres baciloscopías negativas, sujetos con
VIH/SIDA, pacientes con TB extrapulmonar, con fracaso al tratamiento, recaída o
segundo abandono al tratamiento (Koneman E, 1999). Se utilizan principalmente los
medios Löwestein Jensen (sólido 4-6 semanas) y Middlebrook (líquido 15-30 días),

49
es importante destacar que el tiempo de reporte puede variar, pero puede reportarse
incluso hasta en 8 semanas.

5.3.4. Antibiograma TB. Los estudios de sensibilidad para la identificación de

micobacterias se pueden realizar a partir de la muestra respiratoria, o a partir de la
cepa aislada en el cultivo. El método de referencia clásico es el de las proporciones.
El tiempo de lectura de un antibiograma en medio de Löwenstein Jensen es de 4-5
semanas, en medios semisintéticos (7H10 o 7H11 de Middlebrook) de 2-4 semanas
(Prats G, 2012).

Un problema que se está extendiendo en los últimos años es la aparición de M.

tuberculosis resistentes a antibióticos. En función de la las resistencias a antibióticos
que presentan las distintas cepas, podemos distinguir:

 Multirresistentes (MDR). Que son bacterias que desarrollan resistencia

frente a rifampicina (RMP) e isoniacida (INH), que son los tratamientos de
primera línea.
 Ultrarresistentes (XDR). Bacterias resistentes a drogas de primera línea y
a cualquier miembro de la familia de las fluoroquinolonas y al menos frente a
uno de segunda línea (kanamicina (KAN) o capromicina (CPM)) (Murray P.R,
Pfaller M.A. y Rosenthal, 2009).

Han sido identificadas mutaciones en un número limitado de genes y regiones

intergénicas (IGRs) en cepas resistentes de M. tuberculosis, pero aún no están
claras todas las causas genéticas de la resistencia a antibióticos.

5.3.5 Pruebas de determinación de liberación de interferón gamma (IGRA):

Estas técnicas detectan el IFN-γ producido por las células T previamente
sensibilizadas por antígenos secretados y específicos de M. tuberculosis. Las
pruebas QuantiFERON®-TB Gold (QFT-G) y la prueba TB T-Spot®.son las dos
únicas pruebas autorizadas por la FDA. Su ventajas es que los resultados son de
24 a 48 horas y que a diferencia de la PT, las pruebas IGRA, evitan falsos positivos
por la inmunización previa con la vacuna BCG. Es importante destacar que es

50
costosa, pero con buena sensibilidad y especificidad, además que ya es posible
encontrar en laboratorios clínicos.

5.3.6 Pruebas bioquímicas (determinación de adenosina desaminasa): La

adenosina desaminasa (ADA) es una enzima esencial para el metabolismo de
diversas células, por ejemplo, de la respuesta inmune (linfocitos T). La enzima se
encuentra en altas cantidades en presencia de enfermedades como la tuberculosis.
Su determinación en diversos líquidos como el pleural, sinovial, peritoneal,
pericárdico y cefalorraquídeo ayuda al diagnóstico de la tuberculosis que afecta a
estos líquidos de cavidades estériles respectivamente. El test ADA es un ensayo
colorimétrico rápido, sencillo y de bajo costo aunque hay que tomar en cuenta su
poca sensibilidad comparada con otras pruebas diagnósticas (Boris Quiñones J,
Gonzalo Ramírez C, Peña Oscuvilca A y Estrada Choque E, 2010).

5.3.7 Pruebas moleculares (PCR). Los estudios moleculares para el diagnóstico

de tuberculosis constituyen una nueva herramienta que facilita y mejora la velocidad
del diagnóstico y tratamiento de los pacientes. Se ha obtenido una sensibilidad del
66-82% y especificidades del 99-100% de en muestras respiratorias. En contraste,
otros estudios muestran falsos positivos debido a contaminación cruzada en el
laboratorio, que el ADN amplificado corresponde a fragmentos de ADN de M.
tuberculosis degradado o latente que no presente relevancia clínica y en muestras
no respiratorias se presenta una eficiencia menor en el análisis. Aunque se ha
descrito que la técnica de PCR es sensible para el diagnóstico de micobacterias,
siempre se debe correlacionar con la clínica y hallazgos histopatológicos (Koneman
E, 1999). En el análisis de laboratorio se emplean muestras como sangre con EDTA
(2 ml), orina (50 ml de la primera en la mañana), expectoración (5 ml); lavado
bronquial (5 ml), biopsias; semen (2 ml) y líquido cefalorraquídeo (0.5 ml); se envía
las muestras sólidas en solución salina estéril, y muestras líquidas en recipiente
estéril, se envía también con refrigerante y en un plazo de 24 horas después de su
obtención.

5.3.8 Detección de anticuerpos IgM e IgG contra Mycobacterium tuberculosis.

Se trata de un inmunoensayo cromatográfico que analiza la presencia anticuerpos

51
IgM e IgG contra proteínas extracelulares de M. tuberculosis. Las pruebas
tradicionales de laboratorio para el diagnóstico (análisis del esputo y tuberculina)
toman mucho tiempo o incluso llegan a ser insensibles, por lo tanto, se presenta
esta prueba serológica como alternativa. Posee una sensibilidad del 96.4%, y una
especificidad del 98.2%. Las limitaciones que muestra el análisis serológico son las
siguientes: reconocimiento de anticuerpos contra Mycobacterium bovis y
Mycobacterium africanum, detección cualitativa de anticuerpos contra M.
tuberculosis; al mismo tiempo no debe ser empleado como única prueba de
diagnóstico de la enfermedad (Havlir, D. V., y P. F. Barnes. 1999).

5.3.9 Telerradiografía de tórax: Los hallazgos más frecuentes en telerradiografía

torácica son cavernas en lóbulos superiores, condensaciones pulmonares, derrame
pleural, imagen miliar, ensanchamiento mediastinal y cavernas en lóbulos inferiores
(frecuentes en inmunosuprimidos). (SSA e INSP).

5.4 Tratamiento.

Antimicrobianos Isoniazida, rifampicina, estreptomicina, pirazinamida y etambutol.

A veces pueden aparecer resistencias a isoniazida y rifampicina.

5.5 Vacuna BCG: una vacuna contra la tuberculosis que lleva las iniciales de los
científicos franceses que la desarrollaron, Calmette y Guérin. En México, la vacuna
de BCG se aplica al nacer en única dosis (WHO, 2002).

5.6 FUNDAMENTO DE LA TINCIÓN DE ZIEHL NEELSEN

La propiedad que presentan algunas bacterias de resistir la decoloración con ácidos

fuertes después de ser coloreadas con solución de fucsina caliente, permite
reunirlas bajo la denominación general de bacterias “ácidoresistentes” o “ácido-
alcohol resistentes”. La ácido-alcohol resistencia es la capacidad de incorporar
ciertos colorantes y retenerlos después de someterlos a la acción de ácidos y

52
alcohol y está determinada por la presencia en la pared celular de los ácidos
micólicos que son ácidos grasos de cadenas ramificadas de alto peso molecular (60
a 70 átomos de carbono). (Ver figura 5.1).

Las micobacterias se caracterizan como bacilos ácido-alcohol resistente,

corto y ligeramente curvo. El género Mycobacterium, incluido en esta clasificación,
comprende especies patógenas para el hombre, animales y especies saprófitas. El
grado de “ácido-alcohol resistencia” es variable entre las especies de este género y
está relacionado muchas veces con las condiciones culturales, no pudiendo
utilizarse esta diferencia para distinguirlos entre sí.

Fig. 5.1. Esquema estructural de la pared celular de las Micobacterias

Cabe destacar que los géneros Nocardia, Rodoccocus, Corynebacterium y

Legionella, se comportan como ácido-alcohol resistentes débiles porque también
presentan ácidos micólicos aunque de cadenas más cortas.

La coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento con la

finalidad de derretir la pared externa y aumentar la energía cinética de las moléculas
del colorante rojo fucsina lo que facilita su entrada y unión a los lípidos de la pared
celular con alta finalidad. Posteriormente al enfriar con agua provoca nuevamente
la solidificación de los ácidos micólicos y otros lípidos de modo que el colorante ya

53
no puede salir de las bacterias. Las bacterias que resisten la decoloración son de
color rojo (BAAR positivo) y las que no siguen este patrón, se observan de color
azul (BAAR negativo) debido que se utiliza azul de metileno como colorante de
contraste (Mac Faddin, 2003). Una variación de la tinción de Ziehl-Neelsen es la
tinción kinyoun. La principal diferencia radica en que no se calienta la preparación,
en vez de eso se utiliza carbolfucsina con una mayor concentración de fenol (Prats
G, 2010).

¿Qué indicaciones debe darle a su paciente para la toma adecuada de la

espectoración?

Obtener la primera expectoración al despertar considerando:

 Estar en ayunas.
 Cepillar los dientes sin utilizar pasta.
 Enjuagar repetidamente la boca sólo con agua.
 Pedir que inspire profundamente para provocar que el paciente expectore un
gargajo porque si es saliva NO SIRVE, esto debe ser en un frasco estéril.
 En caso de que no se cultive inmediatamente, la muestra podrá mantenerse por
24 horas, en el refrigerador.
 El tamaño de la muestra debe ser una cucharadita, cantidad suficiente para el
estudio.
 No estar tomando antibióticos al menos 3 días antes del estudio.

Casos especiales para la obtención de muestra ante sospecha de TB

pulmonar:

 En el caso de pacientes con dificultad para expectorar o niños se realiza estudio

de jugo gástrico, se recogen 3 muestras en días consecutivos estando el
paciente en ayuno, mediante una sonda nasogástrica.
 Otra manera es mediante el esputo inducido que se realiza administrando
salbutamol inhalada y posteriormente nebulización de suero salino hipertónico.
 Se pueden usar otras muestras como LCR, líquido sinovial (TB miliar
principalmente), material de biopsia.

54
MATERIAL

 Frotis con BAAR

 Colorantes para la tinción de Ziehl Neelsen.
 Mechero
 Microscopio
 Papel seda
 Aceite de Inmersión

DESARROLLO

1.- Realizar frotis 2.- Secar la muestra

de expectoración

4.- Calentar la preparación

hasta la emisión de
3.- Teñir con
vapores evitando la
carbolfucsina
ebullición (2 min), cada
que emita vapores,
detener el calentamiento y
después proseguir

5.- Lavar con agua 6.- Decolorar con alcohol

ácido, hasta dejar rosa
claro

7.- Teñir con azul

de metileno
8.- Lavar con agua
(colorante de
contraste) por 2
min

55
¿Cómo se reportan los resultados?

El criterio a seguir en la baciloscopía varía según la cantidad de bacilos

encontrados:

 Si no se encuentran bacilos debe examinarse por lo menos 100 campos útiles.

 Si se encuentran de 1 a 10 bacilos por campo es suficiente observar 50 campos.
 Si se encuentran más de 10 bacilos por campo es suficiente observar 20 campos.

Resultado negativo

. No se observan BAAR en 100 campos observados

Resultado positivo

+ Se observan menos de un bacilo por campo en promedio de 100 campos

++ Se observan de 1 a 10 bacilos por campo en promedio de 50 campos

observados.

+++ Se observan más de 10 bacilos por campo en promedio de 20 campos

observados.

RESULTADO: Se observan

BAAR (+) en un objetivo de_____ BAAR (-) en un objetivo de____

56
 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Gómez, A., Casas, M.C. (2014). Interpretación Clínica del Laboratorio, 8va edición.
Editorial Médica Panamericana. Bogotá, Colombia.

Havlir, D. V., and P. F. Barnes. (1999). Tuberculosis in patients with human

immunodeficiency virus infection. N. Engl. J. Med. 340, 367-37

Hospital General de México. (s.f.).Tuberculosis pulmonar. Recuperado el 16 de julio de

2017, de http.//www.hgm.salud.gob.mx/.

Jawetz, E., et al. (2011). Microbiología Médica 25ª ed. Madrid; España: Mc Graw – Hill
Interamericana de España S. L.

Koneman E. (1999). Diagnóstico Microbiológico. 5ª ed. México, D.F., México: Ed.

Panamericana.

Mac Faddin. (2003). Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia

clínica. México, D.F; México: Ed. Panamericana.

Mims, C., Playfeir, J.H., Roitt, I. (1999). Microbiología Médica.2 ª ed. Madrid; España:
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Murray, P.R., Pfaller, M.A., Rosenthal. (2009). Microbiología Médica. 6ª ed. Madrid;
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Quiñones, J.B., Ramírez, C.H.G., Peña, A., Estrada, E. (2010). Validez de la prueba de
adenosina deaminasa y del recuento diferencial de leucocitos para el diagnóstico de
tuberculosis pulmonar. Anales de la Facultad de Medicina, 71(1): 18-22.

Prats G. (2010). Microbiología Clínica. Panamericana S. A.

Prats G. (2012). Microbiología, Virología y Parasitología. Médica. Barcelona; España:

Panamericana S.A.

Romero C. R. (2000). Microbiología y Parasitología Humana. Barcelona; España: Medica

Panamericana S.A.

World Health Organization. (2002). Global tuberculosis control: surveillance, planning,

Finance. WHO/CDS/2002.295. World Health Organization, Geneva, Switzerland.
57
 PRÁCTICA 6
DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDAD DIARREICA AGUDA (EDA)

PROPÓSITOS:
AL FINALIZAR ESTA PRÁCTICA EL ALUMNO SERÁ CAPAZ DE:

 Reconocer los estudios microbiológicos que dispone el clínico para establecer

el diagnóstico de infecciones gastrointestinales complicadas, a través de la
revisión de un caso clínico en conjunto con el profesor de laboratorio.
 Dar las indicaciones adecuadas a sus pacientes para la obtención,
conservación y transporte de la muestra de materia fecal.
 Comprender los fundamentos teórico-prácticos de las pruebas bioquímicas
que se utilizan en la identificación etiológica de las bacterias patógenas
aisladas del coprocultivo.
 Interpretar los resultados de citología del moco fecal, determinación antigénica
de patógenos virales y bacterianos, así como el coprocultivo de manera crítica
y concisa.

Introducción

La Enfermedad Diarreica Aguda (EDA) se define como un cambio súbito en el

patrón de evacuación intestinal normal del individuo, caracterizado por aumento en
la frecuencia o la disminución en la consistencia de las deposiciones. Para ser
considerad como aguda, su aparición debe tener menos de tres semanas.
La causa más frecuente de EDA son microorganismos patógenos (ver tabla
6.1) que producen una inflamación de la mucosa gástrica e intestinal. Los pacientes
con EDA no requieren una evaluación inmediata por el laboratorio, puesto que sus
episodios clínicos son por lo general autolimitados y por tanto los resultados de
sus estudios diagnósticos estarán disponibles después que los síntomas hayan
desaparecido.

58
 Tabla 6.1 Causas infecciosas de Diarrea Aguda
Diarrea Viral Diarrea Bacteriana Diarrea Parasitaria Diarrea fúngica
Rotavirus grupo A Salmonella entérica Giardia lamblia Candida albicans
Adenovirus Shigella dysenteriae Entamoeba histolytica
entérico Shigella sonnei Cryptosporidium sp.
Astrovirus Campylobacter jejuni Isospora belli
Calicivirus Clostridium difficile Balantidium coli
humanos Yersinia enterocolitica Strongyloides
- Norovirus Escherichia coli stercoralis
- Sapovirus (ECEP, ECET, ECEI
ECEH,ECDA,ECEA)

¿Qué indicaciones debe darle a su paciente para la toma de muestra fecal?

 No haber tomado antibióticos
 Evitar que la muestra se contamine de orina
 La cantidad de muestra tiene que ser del tamaño de una nuez
 No ingerir laxantes, carnes rojas, grasas en exceso o legumbres de hojas

¿Qué medidas se debe tener en cuenta para obtener una muestra adecuada
para el dx de infecciones gastrointestinales?
 Las muestras de materia fecal deben ser recién emitidas y obtenidas en
recipiente estéril de boca ancha y con tapa hermética (5 ml) que permitan su fácil
transporte (máximo 2 h).
 Cuando la muestra no pueda analizarse inmediatamente después de haberse
obtenido, es importante el empleo de medios de transporte tales como el Cary
Blair que preserva la viabilidad de los microorganismos patógenos.
 Para pacientes pediátricos las muestras se deberán obtener por irrigación
con sonda, una jeringa sin aguja y SSI a 37°C. La solución salina se inyecta a
través de la sonda directamente al recto y posteriormente con la misma jeringa
y sonda se recolecta la muestra, también se puede introducir un hisopo estéril

59
 hasta rebasar el esfínter anal y rotarlo suavemente. Cuando sea posible se
recurre a una sigmoidoscopía.
 Las heces obtenidas del suelo, excusado así como del pañal no son
recomendables por que pueden contaminarse con material extraño.

6.1 CITOLOGÍA DEL MOCO FECAL (CMF)

La presencia de moco indica irritación o inflamación intestinal. En condiciones

normales las heces no suelen contener células epiteliales, ni leucocitos, ni
eritrocitos. Por tanto, la citología del moco fecal tiene por objetico evaluar la
celularidad de la muestra.

Primero se hace una evaluación macroscópica del Moco fecal:

 Su presencia sugiere que se origina del colon.

 Si está mezclado con las heces y tiene aspecto brillante, sugiere que procede
del intestino delgado.
 Si es transparente como catarro alérgico, sugiere colon irritable (estrés).
 Si es opaco con células epiteliales, sugiere un proceso inflamatorio agudo.
 Si es sanguinolento, sugiere neoplasma, amibiasis, gastroenteritis
enteroinvasiva.
 Si es sanguinolento y tiene pus, sugiere colitis ulcerosa, carcinoma,
disentería bacilar, diverticulitis aguda o tubérculos intestinales.

Posteriormente se evalúa la celularidad:

Se realiza una búsqueda e identificación de células polimorfonucleares

(PMN) o mononucleares (MN) que permiten determinar la posible causa del
padecimiento (viral o bacteriano); el reporte de más de 10 leucocitos por campo
orienta a una etiología infecciosa.

60
¿Cómo es el procedimiento?
Se coloca una pequeña cantidad de heces (moco y sangre) y se realiza
un extendido sobre un portaobjetos. Luego se agregan 2 gotas de azul de metileno,
y se cubre con un cubreobjetos. Se deja reposar de 2 a 3 min y se observa al
microscopio con aumento de 40x.

¿Cómo se reporta la CMF?

El reporte de PMN y MN se realiza contando 100 células y se informa el
porcentaje de las células encontradas.
La presencia de células epiteliales, eritrocitos y bacterias se reporta como:
 Abundantes: (+++)
 Moderadas (++)
 Escasas (+)

¿Cómo se interpretan los resultados?

 Condiciones normales: las heces no suelen contener células epiteliales,
leucocitos o eritrocitos.
 Si existe un predominio de MN sugiere etiología viral.
 Si existe un predominio de PMN sugiere etiología bacteriana (p. ejemplo en
Shigelosis) o colitis: lo recomendable es realizar un coprocultivo para
confirmar el origen de la diarrea.
 Si se encuentran pocos PMN sugiere amibiasis aguda
 Si encuentra abundantes eosinófilos sugiere alergia intestinal
 Si observa células epiteliales sugiere irritación gastrointestinal
 Si encuentra abundantes eritrocitos indicaría u n a sospecha de síndrome
disentérico.

6.1.3 pH DE LAS HECES

Las heces normales son neutras o ligeramente alcalinas (pH 6.9 a 7.2), esto
depende de múltiples factores dietéticos y endógenos, por lo que sus variaciones
son de escaso valor clínico.

61
¿Cómo es el procedimiento?
Una tira reactiva o un papel tornasol que contiene indicadores de pH se sumerge
en una mezcla de heces y solución salina (o agua destilada) hasta adoptar un color
que va a depender de los protones existentes en la muestra, después se compara
con la tira control.

¿Cómo se interpretan los resultados?

 Si el pH fecal ácido menor a 6.0 es evidencia sugestiva de malabsorción
de azúcares reductores en el intestino delgado, por lo que al llegar al intestino
grueso éstos son fermentados por acción bacteriana y generan ácido láctico,
ácido acético, ácidos grasos de cadena corta. Al mismo tiempo se forman
gases, provocando distensión abdominal y cólico.
 Si el pH es ligeramente alcalino se sospechará de intolerancia a los
disacáridos; se presenta en casos de diarreas secretoras sin ingesta de
alimentos, colitis, adenoma velloso y posiblemente el uso de antibióticos.
 Si el pH fecal e s alto puede ser un factor de riesgo de cáncer colo rectal.

6.1.4 Azúcares reductores

Los azúcares reductores son aquellos que poseen su grupo carbonilo (grupo
funcional aldehído o cetona) intacto y que a través del mismo pueden reaccionar
como agentes reductores de otras moléculas (donando electrones). Todos los
monosacáridos son azúcares reductores tales como la glucosa, celobiosa, fructosa
y galactosa, también dos de los tres tipos de disacáridos tienen la estructura química
abierta que les confiere carácter reductor y ejemplos de ellos se encuentran la
maltosa y lactosa. Por otro lado los azúcares no reductores son aquellos que tienen
estructuras químicas cerradas tales como la trehalosa, la sacarosa y los
polisacáridos.
Si en un paciente presenta deficiencia de disacaridasas por daños inespecíficos a
la mucosa (por ejemplo en casos de gastroenteritis viral) o por razones congénitas
(por ejemplo en la intolerancia a la lactosa por deficiencia de lactasas), los
disacáridos no se hidrolizan en monosacáridos y al pasar a intestino grueso son
fermentados, generando malestar intestinal, gases y por ende el pH fecal se acidifica.

62
Por tanto, la detección de los azúcares reductores en heces nos indicará que existe
un síndrome de mala absorción de azúcares.

¿Cómo es el procedimiento?
Existen distintos métodos de detección de azúcares reductores, sin embargo
uno de los más usados se fundamenta en usar el reactivo de Benedit (que contiene
sulfato cúprico, citrato sódico y carbonato anhídrido de sodio). En una solución que
contiene azúcares reductores y el reactivo de Benedit, el ion cúprico (Cu2+, forma
oxidada del cobre, proviene del sulfato cúprico y de color azul) es reducido por
efecto del grupo aldehído o cetona del azúcar hasta formar un precipitado de color
rojo-naranja correspondiente al óxido cuproso (Cu2O).

1. En un tubo de ensayo colocar una cantidad pequeña de heces y agregar un

mililitro de Solución Salina Isotónica.
2. Mezclar, adicionar una pastilla de clinitest (que contiene al reactivo de Benedit).
3. Sin agitar la mezcla esperar 15 segundos y se observa la coloración.
¿Cómo se interpretan los resultados?
El color resultante, varía con la cantidad de sustancia presente reducida, s i existen
azúcares reductores la reacción se tornará rojo-naranja, y se sospechosa
etiología viral ó; si la reacción adquiere la tonalidad azul, será negativa.

6.2 Pruebas rápidas para detección antigénica de patógenos virales o

bacterianos en heces.
Las pruebas de diagnóstico rápido se basan en tres técnicas inmunológicas:
aglutinación con látex, ELISA e inmunocromatografía. Se trata de pruebas
cualitativas que detectan antígenos virales o de enterobacterias patógenas. Se
recomiendan las pruebas de diagnóstico rápido basadas en la
inmunocromatografía que las basadas en aglutinación por látex o ELISA, porque:
precisan menor cantidad de muestra, requieren menor entrenamiento previo del
personal que la realiza, son más rápidas, y han demostrado en diversos ensayos
clínicos una sensibilidad del 87% al 100%, y especificidad del 91.7% al 100%
(dependiendo del fabricante) respecto a otras pruebas de detección molecular. Los

63
resultados por inmunocromatografía pueden estar disponibles en pocos minutos,
por lo que suponen una gran ventaja sobre las demás técnicas que pueden
necesitar de varias horas. Se han desarrollado pruebas rápidas para la detección
de: Rotavirus, Helicobacter pylori, Yersinia enterocolítica, E. coli, pruebas de
aglutinación mediante anticuerpos monoclonales para V. cholerae O1 y O139,
coaglutinación SMART.

¿Cómo es el procedimiento?
La técnica de elección dependerá del equipo y reactivos disponibles para la
práctica, por lo que el profesor indicará el procedimiento preciso a seguir. Por
ejemplo si se utiliza una prueba rápida de detección de antígenos basada en el
principio de “sandwich” en fase sólida por inmunocromatografía (por ejemplo para
rotavirus ó H. pylori), se tomará una alícuota diluida de heces y se deberá agregar
al pozo para muestra (S). La muestra fluye a través de la tira que contiene los
anticuerpos (por ejemplo anti-H.pylori) asociados con el colorante rojizo de oro
coloidal (Ver Fig. 6.1).

Fig. 6.1 Cartucho de una prueba de rápida de detección antigénica

¿Cómo se interpretan los resultados?

Si la muestra contiene los antígenos problema (por ejemplo Ag-H. pylori),
estos se unirán al anticuerpo asociado al oro coloidal para formar el complejo
Antígeno-anticuerpo-oro coloidal. El movimiento de este complejo a través de la
membrana de nitrocelulosa por acción de capilaridad hacia la región de la línea de
prueba en la cual se encuentran los anticuerpos inmovilizados. Como estos
complejos reaccionan en la zona de prueba se verán unidos los anticuerpos en la
membrana formando una línea. La segunda línea rojiza en la zona de control
siempre debe aparecer, pues es el control de calidad de la prueba.

64
 Algoritmo de Síndrome
diarreico

Heces líquidas sin Heces líquidas con

moco y sangre moco y sangre

Virus o
microorganismos Microorganismos invasivos
productores de o productores de toxinas
toxinas

MOCO
FECAL

Acelularidad, ++ ó +++ de ++ ó +++ de PMN ++ ó +++ de

++ ó +++ de neutrófilos con predominancia PMN
MN de Eosinófilos

pH Coprocultivo Examen CPS

directo

Azúcares
reductores Helmintiasis

Positivo Negativo
Positivo Negativo

Coprocultivo Amibiasis
intestinal
Determinación de Deficiencia
Ag Viral por congénita de
Inmunodiagnóstico disacaridasas Examen CPS
directo en fresco

Trofozoitos de E.
histolytica

65
 Ejercicios para evaluar el conocimiento adquirido

1. Paciente de 3 años que sufre de diarrea severa, vómitos acuosos y fiebre.

Usted solicita un estudio coprológico y se obtienen los siguientes
resultados:
Interprete los resultados e indique la
Parámetro Resultado etiología que le sugiere este estudio
(JUSTIFIQUE SU RESPUESTA)
Ph 5.3
Azúcares
Positivo
reductores
Examen microscópico
% PMN 20%
%MN 80%
Cristales
-
charcot Leyden
Células
-
epiteliales
Eritrocitos -
Prueba rápida
para detección Positiva
viral

66
 2. Paciente de 4 años que cursa con diarrea, vómitos, fiebre, tenesmo,
mialgias, distención abdominal con cólicos y náuseas. Usted solicita un
estudio coprológico y se obtienen los siguientes resultados:
Interprete los resultados e indique la
Parámetro Resultado etiología que le sugiere este estudio
(JUSTIFIQUE SU RESPUESTA)
pH 6.0
Azúcares
Positivo
reductores
Examen microscópico
% PMN 75%
%MN 25%
Observación de
bacterias en
Positivo
forma de alas
de gaviota
Células
++
epiteliales
Eritrocitos +
Prueba rápida
para detección Negativa
viral

6.3 Coprocultivo

El tracto gastrointestinal esta colonizado por una microbiota normal contituída

principalmente por bacterias pertenecientes a las familias Enterobacteriaceae (p.
ejemplo Escherichia coli), Bacteroidetes (p. ejemplo Bacteroides sp.),
Enterococcaceae (p. ejemplo Enterococcus faecalis), Streptococcaceae ( p .
e j e m p l o Streptococcus del grupo viridans), entre otros. Sin embargo algunos

67
miembros de estas familias pueden causar gastroenteritis y disentería bacilar. Por
lo que el diagnóstico etiológico se realiza mediante el cultivo de los microorganismos
presentes en la materia fecal, procedimiento denominado coprocultivo, a través del
cual se logra, inicialmente el aislamiento y posteriormente se realiza la identificación
bioquímica y serológica de las bacterias patógenas presentes. Para e l aislamiento
bacteriano se requiere el uso de medios selectivos diferenciales y de medios d e
cultivos enriquecidos.

¿Cómo es el procedimiento?
1. Realizar un primoaislamiento en caldo de enriquecimiento (ver diagrama) e
incubar a 37° C por 24 h

2. Inocular con el asa los medios de cultivo Mc Conkey, Salmonella- Shigella (SS),
Eosina-azul de m etileno (EMB).

3. Con el asa bacteriológica sembrar en estría cruzada y luego esterilizar por calor
seco el asa.
4. Incubar a 37°c por 24 h
5. Observar el crecimiento y morfología colonial.
6. Realizar resiembras para detallar el metabolismo bacteriano (pruebas
bioquímicas).

68
Actualmente se utilizan medios cromogénicos CHROMagar TM. Son medios de
cultivo de elevada especificidad, se obtienen resultados de una forma rápida y de
confianza; eliminan la mayoría de los falsos positivos que se denotan en los
medios tradicionales reduciendo pruebas posteriores de confirmación y evitando
la necesidad de investigar 10 colonias sospechosas por muestra. Estos medios
identifican a: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa,
Candida albicans, Listeria monocytogenes, Enterococcus sp, Salmonella sp,
Candidas sp.

6.4 Pruebas Bioquímicas para la identificación bacteriana

TSI (agar triple azúcar-hierro): prueba que permite observar la fermentación de

glucosa, lactosa y sacarosa así como la producción de gas y la producción de ácido
sulfhídrico.

 La fermentación acidifica el medio, haciendo que el indicador (rojo de

fenol) vire de rojo a amarillo.

69
  El tiosulfato de sodio puede reducirse a sulfuro de hidrógeno (H2S) que
reacciona con sales de hierro, proporcionando sulfuro de hierro de color
negro.

Agar citrato de Simmons: prueba empleada para diferenciar aquellas

bacterias que emplean el citrato como única fuente de carbono y energía.

 Tiene como indicador, al colorante azul de bromotimol, que se alcaliniza al

emplear las sales de amonio y hace que el medio vire de verde a un color azul
cuando es positivo.

LIA (agar hierro lisina): prueba basada en la descarboxilación y desaminación de

lisina, así como en la producción de ácido sulfhídrico, el medio sin inocular es violeta
(morado).

 Descarboxilación de la lisina positiva; pico violeta/fondo violeta. Prueba

negativa: Pico violeta/ fondo amarillo.
 Desaminación de la lisina; pico rojizo/fondo amarillo, se presenta en
Proteus, Providencia y Morganella sp.
 Producción de ácido sulfhídrico: ennegrecimiento del medio
(especialmente en el límite entre el pico y el fondo.

MIO (agar Movilidad-Indol-Ornitina): prueba que permite detectar la

movilidad del microorganismo, producción de indol y descarboxilación de ornitina.
La fermentación de la dextrosa hace que el medio vire a un color amarillo.

 La descarboxilación de la ornitina alcaliniza el medio dando un vire a color

púrpura.
 La producción de indol a partir del triptófano se manifiesta al agregar el
reactivo de Kovac o de Erlich.

UREA (Agar Christensen): prueba que permite detectar la capacidad de hidrolizar

la urea del microorganismo debido a la producción de ureasa.

70
  Un cambio de amarillo a rosado indica que la urea fue hidrolizada por
la ureasa del microorganismo. Ausencia de cambio de color indica
reacción negativa.

Rojo de Metilo y Vogues Proskauer: pruebas que se realizan para determinar la

capacidad de un microorganismo de fermentar la glucosa con producción de ácido
por la vía ácido mixta o con producción de un producto final neutro (acetoína) por la
vía butanodiólica.

 Prueba de Rojo de Metilo: Una coloración roja, indicadora de la presencia

de ácidos provenientes de la fermentación de la glucosa, constituye un
resultado positivo, una coloración amarilla constituye una reacción negativa.
 Vogues Proskauer: La aparición de un color rosado constituye una reacción
positiva indicadora de la presencia de acetoína, producto de la fermentación
de la glucosa.

Ejercicios para evaluar el conocimiento adquirido

Medio de cultivo Resultado Interpretación

Colonias rosadas

Mc Conkey Colonias sin cambio de

color
Colonias con brillo
metálico
EMB Colonias sin brillo
metálico

Describa e interprete los resultados obtenidos en su coprocultivo.

__________________________________________________________________
__________________________________________________________________

71
 Anote los resultados e Ilumine los cambios observados en las pruebas
bioquímicas.

TSI
UREA: ____
GLU: ____
LAC: ____ CITRATO:
SAC: ____ CIT: ___
GAS: ____

MIO LIA
Movilidad: ____ LIS: ____
INDOL: ____ H2S____
ORN: ____

De acuerdo a los resultados de las bioquímicas ¿Cuál es el microorganismo

identificado?

____________________________________________________________

72
 TABLA DE IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTERIAS

INDOL

VOGP
MOV

MAN
UREA

FENIL
MAL
ORN
GLU

KCN
GAS

SAC
LAC

HIS

CIT
LIS
GÉNERO Y ESPECIE
E. coli +(-) + +(-) - +(-) +(-) +(-) + - + - - + - - -
Shigella sp - - - - - -(+) - -(+) - - - - +(-) - - -
Shigella sonnei - +I +I - - + - - - + - - - - - -
Edwarsiella tarda + + -I +++ + + + + - - - - - - - -
Salmonella typhi - + - + + - + - - - - - + - - -
S. enteritidis + + - +++ + + + - - - - + + - - -
S. cholerasuis + + - +++ + + + - - - - + + - - -
A. hinshanti + + -(+) +++ + + + - - - + + + - - -
Citrobacter freunddii + + -(+) +++ - -(+) + - -(+) +(-) - + +(-) - - +
C. freundii H2S + + - - - -(+) + - -(+) +(-) - + +(-) - - +
C. diversus + + - - - + + + - + +(-) + +(-) - - -
C. malonaticus + + - - - + + + - +(-) - + - - - +
Klebsiella pneumoniae ++ + + - + - - - -(+) + + + + - + +
K. oxitoca ++ + + - + - - + -(+) + + + + - + +
K. rhinoscleromatis - + - - - - - - - + + - + - - +
K. Ozanae - + + - -(+) - - - - + - - + - - +
Enterobacter cloacae ++ + + - - + + - dw + +(-) + + - + +
E. aerogenes ++ + + - + + + - - + + + + - + +
E. agglomerans ++ + + - - - + -(+) -(+) D +(-) D + - +(-) d
E. gergoniae ++ + + - + + + - + + + + + - +(-) -
E. sakazakii - + + - + + +
Hafnia alvei + + -I - + + - - - -(+) -(+) D + - +(-) +
Serratia marcescens +(-) + -(+) - + + + - -(+) + - + + - + +
S. liquefaciens + + + - +(-) + + - - + -(+) + + - +(-) +
S. rubidae + + + - + -(+) + - - + -(+) + + - + +
Proteus vulgaris + - +(-) +++ - - + - + + - +(-) - + -(+) +
P. mirabilis + + -(+) +++ - + + - + + - + - + +(-) +
Morganella morganii -(+) + - - - + +(-) + + - - - - + - +
Providencia rettgeri - + - - - - +I + + + - + + + - +
P. alcalifaciens +(-) + - - - - +I + - + - + - + - +
P. stuart II- - + - - - - + + - + - + -(+) + - +
P. stuart II+ - + - - - - + + + + - + -(+) + + +
Yersinia enterocolitica -(+) + - - - +(-) - +(-) + + - - + - - -
Y. pseudotuberculosis +(-) + - - - - - - +(-) - - - -
Y. pestis -(+) + + - - - - - - - - - + - -
Erwinia + + - - - - - - - +
Plectobacterium -(+) -(+) + - - - +(-) -(+) +I + -(+) -(+) + - -(+) +(-)
+ Cultivo D: Diferent
positivo - es W: Débil
Cultivo negativo L: Lento
( ): Reacciones ocasionales

73
 PRÁCTICA 7.
DIAGNÓSTICO DE INFECCIÓN DE VÍAS URINARIAS (IVU)

PROPÓSITOS
AL FINALIZAR ESTA PRÁCTICA EL ALUMNO SERÁ CAPAZ DE:

 Reconocer los métodos microbiológicos más utilizados para el diagnóstico

de las IVU a través de la revisión de un caso clínico en conjunto con el
profesor de laboratorio.
 Indicar a sus pacientes con IVU los cuidados y medidas que deben tomar
para una adecuada recolección de muestra de orina.
 Interpretar los resultados del Examen General de Orina (EGO) y Urocultivo
para establecer un diagnóstico y tratamiento de IVU.

INTRODUCCIÓN
La Infección de Vía Urinaria (IVU) se define como la presencia y proliferación de
microorganismos en cualquier órgano de las vías urinarias, y que generalmente,
cursa con la presencia de un gran número de bacterias en orina (bacteriuria).
El aparato urinario se divide en una porción superior, compuesta por los
riñones, la pelvis renal y los uréteres, y una porción inferior, compuesta por la vejiga
urinaria y la uretra. La IVU altas se adquieren con mayor frecuencia por vía
ascendente o exógena que por vía endógena, y las mujeres son las más afectadas
en comparación con los varones.
Algunos clínicos clasifican a las IVU en dos categorías: no complicadas y
complicadas. Las IVU no complicadas son aquellas que se presentan como cistitis
aguda o pielonefritis aguda en personas previamente sanas y sin alteraciones
anatómicas o funcionales del aparato urinario, en cambio las IVU complicadas
implica la existencia de factores, como: anomalías urinarias congénitas, obstrucción
del flujo de la orina, sondaje uretral, embarazo, por manipulación o cirugía urológica,
además se asocia también a enfermedades sistémicas que contribuyan al deterioro
de la capacidad inmunitaria (infecciones previas del tracto urinario, ancianos,
diabetes o inmunosupresión). Otros factores de riesgo para IVU que se han descrito

74
son dependientes de la edad del paciente, en adultos se asocia el tipo de prácticas
sexuales, falta de micción después del acto sexual, uso de diafragma, nivel
socioeconómico bajo.

Mecanismos de defensa y etiología de las infecciones del tracto urinario

Como sistema orgánico, el tracto urinario tiene varios mecanismos de defensa que
permite evitar en gran medida la colonización y la infección causada por bacterias.
Algunos de los principales mecanismos de defensa se presentan a continuación:

 Mecanismos mecánicos. En estos mecanismos previenen mecánicamente

el ascenso y la colonización de las vías urinarias por bacterias de origen
intestinal e incluyen: la peristalsis uretérica, el vaciado normal de la vejiga y
la descamación de células uroteliales.
 Mecanismos químicos. Un gran número de sustancias están presentes o
son secretadas a diferentes niveles en el tracto urinario y tienen algún efecto
bacteriostático o bactericida, de manera que ayudan a prevenir
inespecíficamente la multiplicación y la colonización bacteriana. En estos
mecanismos químicos se incluyen: sustancias antibacterianas presentes en
las secreciones prostáticas, condiciones hiperosmolares en la orina y la
médula renal, acidez urinaria, así como sustancias que inhiben la adhesión
microbiana (Proteínas Tamm-Horsfall)
 Mecanismos inmunológicos. Diversos mecanismos inmunológicos,
específicos e inespecíficos, son importantes en el control de la colonización
bacteriana y las infecciones en el tracto urinario, incluyendo: presencia de
anticuerpos tipo IgA en las secreciones vaginales, prostáticas, uretrales y
vesicales, producción de anticuerpos IgG y consecuente opsonización
bacteriana y factores de complemento como mediadores de opsonización y
lisis bacteriana.

La etiología de las IVU bajas no complicadas en mujeres está dominada por

Escherichia coli, microorganismo aislado en 80 a 95% de las ocasiones, al que le
siguen Staphylococcus saprophyticus (5 a 10%) y en menor proporción Klebsiella

75
pneumoniae y Proteus mirabilis. Característicamente, las IVU complicadas tienen
un espectro más amplio de microorganismos causales; la probabilidad de infección
por hongos es alta, así como la resistencia a antimicrobianos comunes. En la IVU
complicada, E. coli sigue siendo el principal patógeno. Las infecciones por
oportunistas, como especies de Candida y Mycobacterium tuberculosis en
pacientes con inmunodepresión y por microorganismos nosocomiales (como
especies de Pseudomonas, de Serratia y de Klebsiella), deben considerarse.

Algunos resultados de diferentes estudios sobre los principales agentes

bacterianos de infecciones del tracto urinario se muestran a continuación:

Microorganismos Microorganismos
Microorganismos patógenos
comensales patógenos de IVU no
de IVU complicada
(contaminantes). complicada
 Staphylococcus  Escherichia coli  Escherichia coli
coagulasa negativos no  Staphylococcus  Pseudomonas aeruginosa
S. saprophyticus saprophyticus  Bacterias Gram-positivas
 Especies de Bacillus  Klebsiella pneumoniae  Klebsiella spp.
 Escherichia coli y  Proteus spp  Acinetobacter spp.
otros coliformes  Enterococcus faecalis  Candida spp
 Especies de  Estreptococos del grupo B
Lactobacillus spp (mujeres embarazadas)
 Estreptococcus α/β  Staphylococcus epidermidis
hemolíticos (hombres ancianos)

Los cuadros clínicos que se presentan en pacientes con IVU son:

 Uretritis: inflamación de la uretra. Se caracteriza por dolor y ardor al orinar e
incremento de la frecuencia urinaria.

 Cistitis: se manifiesta con disuria, polaquiuria, nicturia, hematuria, tenesmo

vesical, dolor suprapúbico, fiebre moderada, escalofrío, cefalea y moderado
ataque al estado general.

76
 Pielonefritis bacteriana aguda: se caracteriza por la presencia de dolor en
flancos, fiebre, temblor, disuria, piuria y a veces hematuria. Sus manifestaciones
clínicas son fiebre, dolor lumbar, polaquiuria, disuria, orina de olor fétido,
bacteriuria, tenesmo vesical, urgencia urinaria y hematuria. La orina suele tener
un pH alcalino.

¿Qué instrucciones debe darle a su paciente para una toma correcta de orina
para EGO y urocultivo?
1. Si está tomando vitamina C (ácido ascórbico) suspender la toma por lo menos 24
horas antes de recolectar su muestra de orina. Avise al personal del laboratorio si
está tomando cualquier otro medicamento.

2. Utilice guantes de látex: de no ser posible lave perfectamente sus manos con
agua y jabón.

3. Preferentemente, evite el contacto sexual el día anterior a la obtención de la

muestra.

4. La muestra idónea es la primera orina de la mañana, porque en ella hay una

mayor concentración de los microorganismos que se han multiplicado durante la
noche y quedan retenidos en la vejiga hasta la primera micción.

5. Si su paciente es mujer:
La paciente no debe de estar en su periodo menstrual. De ser así, se recolectará la
muestra siete días después de que la menstruación comenzó.
Una vez que se ha lavado las manos y se ha colocado en una posición como la
indicada en el dibujo adjunto, se procederá de la siguiente manera:
 Poner una gaza impregnada con jabón líquido en las manos.
 Con la otra mano separar los labios y proceder a limpiar la vulva con la gaza
o el pañito, de arriba hacia abajo y adentro.
 Con una mano se mantienen los labios separados y se recolectará la fracción
media del chorro, es decir, descartar el primer chorro y recolectar la porción
intermedia (5 o 10 ml).

77
  Tapar y rotular el frasco con el nombre de la paciente y llevar la muestra de
orina lo más pronto posible al laboratorio.

6. Si su paciente es hombre:
 Retraer el prepucio (si al paciente no se le ha practicado la circuncisión).
 Limpiar el glande con agua y jabón. Enjuagar con abundante agua.
 Proceder a orinar descartando la primera porción de la orina.
 Sin detener la micción recolectar la porción intermedia de orina
directamente en un frasco estéril. Evitar tocar el frasco con el glande.
 Tapar y rotular el frasco con el nombre del paciente y llevar la muestra de
orina lo más pronto posible al laboratorio. Si no es posible llevar la
muestra de orina antes de dos horas mantener la muestra en refrigeración
a 4°C.

7. Otros métodos: Sonda vesical y Aspiración suprapúbica. Llevar la muestra de

inmediato al laboratorio ya que deberá ser analizada en un periodo máximo de 2
horas después de la recolección.

Aspiración suprapúbica de la vejiga urinaria. Se dirige

una aguja en forma percutánea dentro de la vejiga
urinaria justo por arriba de la sínfisis pubiana. La
orina se puede obtener con un jeringa

78
 7.1 EXAMEN GENERAL DE ORINA (EGO)
FUNDAMENTO
El examen general de orina (EGO) es una de las pruebas urológicas más
importantes y útiles en el diagnóstico médico para las IVU. Es utilizado para valorar
el propio aparato urinario desde el riñón hasta la uretra, también proporciona
información sobre patologías metabólicas como: diabetes, cetosis o de tejidos u
órganos específicos como las hepatopatías, etc. El EGO examina tres parámetros:
físico, químico y microscópico.

Características físicas (valor normal):

o Color: Amarillo claro

o Olor: “sui generis” (característico)

o Aspecto: transparente

o Volumen: 1500 ml en 24hrs

o Densidad: 1.010 - 1.030

o pH: 5.5 (ácida)

Características químicas (Uso de tira de urianálisis):

o Densidad específica de la orina: concentración o diluida se encuentra la orina.

o pH: acidez o alcalinidad de la orina.

o Leucocitos: Infección.

o Nitritos: indicio de infección del tracto urinario solamente por enterobacterias que
son las únicas que transforman los nitratos a nitritos.

o Proteínas: la excreción de proteínas es anormal e indicaría daño renal.

Sintomático para enfermedades localizadas en los tractos hepáticos y renales.

o Glucosa: Detección en la fase latente y supervisión de diabetes mellitus

(concentración mayor a 180 mg/dl en sangre).

79
o Cetonas: es un subproducto del metabolismo de las grasas, anomalías en el
metabolismo, indicación de cetoacidosis, presente con inanición, diabetes e
individuos con actividad física elevada.

o Urobilinógeno: un producto de degradación de la bilirrubina. Daños severos y

crónicos del parénquima hepático, ictericia hemolítica, estado patológico del tracto
intestinal. Su valor normal 0.2 mg/dL.

o Bilirrubina: Se presenta cuando existe aumento de bilirrubinas directas. Daños

del parénquima

Características microscópicas del sedimento tras centrifugar la orina (40X):

o Cristales en orina: Los cristales se forman por precipitación de sales en la orina
producto de los cambios en el pH, concentración de las sales y variación en la
temperatura. Se pueden presentar como verdaderos cristales o como material
amorfo, rara vez tienen importancia clínica y solo en determinadas situaciones
pueden tener significado patológico, principalmente en los trastornos metabólicos
y en la formación de cálculos. Normalmente no hay cristales en la orina recién
recogida, estos aparecen después de un tiempo prolongado de reposo de la
muestra; para interpretar la presencia de los cristales es necesario conocer el pH
de la orina, porque algunos de estos se precipitan a valores distintos. Los cristales
más frecuentes son los uratos y fosfatos amorfos, los oxalatos de calcio, los
cristales de ácido úrico y los fosfatos de amonio y magnesio. Estos cristales se
pueden encontrar en personas sanas, pero también pueden estar presentes en
determinadas situaciones patológicas como a continuación se describe:
 Cristales de ácido úrico: se pueden encontrar en leucemias, fiebre, gota y
procesos catabólicos de nucleoproteínas.
 Cristales de uratos amorfos: presentes en estados febriles.
 Cristales de oxalato cálcico: relacionados a dietas con ajo, naranja, tomate
y en patologías como la diabetes mellitus, hepatopatías y litiasis.
 Cristales de carbonato cálcico: están asociados a dieta vegetariana y a
infecciones urinarias.

80
  Cristales de fosfato - ácido cálcico: aparecen en hiperfosfaturia,
hipercalciuria, obstrucciones urinarias y en pacientes con catéter vesical.
 Cristales de fosfatos triples (fosfato-amonio-magnesio), urato de
amonio, fosfato y carbonato calcio: presentes en pH alcalino. Cuando
existe IVU por bacterias productoras de amonio hay probabilidad de
formación de cálculos coraliformes de fosfatos triples o estruvita.
 Cristales de uratos y oxalatos cálcicos, ácido úrico, xantinas y cistina:
presentes en pH ácido.
Los cristales que siempre son considerados anormales y que tienen relevancia
clínica se describen a continuación con su patología asociada:
 Cristales de leucina: se encuentran en leucinosis y en hepatopatías graves.
 Cristales de cistina: son comunes en cistinuria.
 Cristales de tirosina: presentes en tirosinosis y hepatopatías graves.
 Cristales de colesterol: comunes en el síndrome nefrótico y quiluria.
 Cristales de bilirrubinas: presentes en hiperbilirrubinemias.
 Cristales de sulfonamidas: se encuentran en pacientes tratados con
sulfonamidas.

o Cilindros: Normalmente no deben reportarse cilindros en la orina; estos se

forman en la luz del túbulo renal y en el colector. Su centro (matriz) lo compone
una proteína renal llamada Tamm Horsfall sobre la cual se van uniendo
elementos celulares o detritus que le van dando la forma a medida que viajan a
través del túbulo. El nombre del cilindro lo determina el elemento o la célula que
predomine en la unión con la proteína matriz. Los cilindros siempre tienen origen
renal y constituyen importantes indicadores de enfermedad renal intrínseca.
Pueden estar presentes en los casos de daño glomerular, de daño tubular, de
inflamación renal y de infección renal.

81
 CRISTALES SIN SIGNIFICADO CLÍNICO EN ORINA
ORINAS ALCALINAS

Triple fosfato Carbonato de Fosfato de Calcio Biurato de Amonio

Calcio

ORINAS ÁCIDAS

Oxalato de Calcio Ácido úrico Ácido hipúrico Urato amorfo

CRISTALES CON SIGNIFICADO CLÍNICO EN ORINA (Se presentan en pH ácido)

Tirosina Colesterol Leucina Cistina

Bilirrubina Sulfonamida

82
 7.2 UROCULTIVO

FUNDAMENTO
El urocultivo es la siembra de una cierta cantidad de orina en placas de Petri
con medios de cultivo específicos y su interpretación tras 24 - 48 h de incubación a
37°C.
Su finalidad es identificar y cuantificar a los microorganismos causantes de
la infección. Al hablar de infección urinaria usualmente se emplea el término
“bacteriuria”, que significa presencia de bacterias en orina, sin embargo, las
bacterias pueden haber entrado en la orina como contaminantes fecales o
vaginales, por esto para distinguir una infección de una posible contaminación se
debe de hablar de bacteriuria significativa. En 1956 Kass, tras un estudio en mujeres
con pielonefritis, desarrolló el criterio de infección urinaria con recuento igual o
mayores a 100,000 Unidades Formadoras de Colonias (UFC) correspondientes a
1ml de orina de la bacteria identificada.

¿Cuándo realizar un urocultivo?

 Sospecha de pielonefritis.

 Sospechas de IVU en neonatos, lactantes y niños.

 Sospecha de IVU en varones.

 IVU recurrente en mujeres.

 Sospecha de IVU complicada en mujeres.

 En mujeres en el primer trimestre del embarazo (16 semanas).

 Sospecha de IVU en pacientes portadores de sonda permanente.

 Sospecha de sepsis de origen urinario.

 Como control en los casos anteriores.

 Antes de cirugía urológica.

83
Medios de cultivo:
 Mac Conkey: Enterobacterias (E. coli, Proteus sp, Klebsiella sp, otras)

 Gelosa sangre: Staphylococcus saprophyticus, Estreptococo del grupo D.

 Biggy: levaduras (Candida albicans)

Nota: Actualmente se utilizan medios selectivos de cultivo CHROMagar y cuya

identificación es por medio de una reacción cromatológica.

¿Cómo se realiza el procedimiento?

1. Agitar el frasco, sembrar en la placa de cultivo (agar sangre, agar Mc Conkey)
una asada de orina con el asa calibrada (base roja, de 0.001 mL de capacidad),
puede sembrarse por estriado en placa o descargar en el centro en línea recta y
sembrar en cola de ratón.

2. Incubar a 37°C por 24 - 72 h.

Lectura de las placas de cultivo

1. A las 24 hrs observar si hay crecimiento bacteriano y proceder a contar el número
de colonias o UFC aisladas y multiplicar por 1000 (el número de colonias obtenido
corresponde a las cifras de microorganismos presentes en un μl de orina al haber
utilizado una asa calibrada para hacer la siembra, por lo que debido a la dilución
realizada se deberá multiplicar por 1000).

2. De acuerdo con el criterio de Kass y Standford, cuando el número de colonias

bacterianas de determinada bacteria (sólo Enterobacterias) aislada es igual o mayor
a 100,000 UFC/ml de orina (105 UFC/ml).
84
3. Identificar el género y la especie del microorganismo por los métodos
convencionales (pruebas bioquímicas: TSI, LIA, MIO, Urea, citrato de Simons).

Resultado:
 Si no hay desarrollo en las primeras 24 horas se reincuba otras 24 horas
y si tampoco no hubo crecimiento se reporta: Sin crecimiento bacteriano
a las 72 horas de incubación

 Si hay crecimiento bacteriano; utilizar los Criterios de Kass para

urocultivo:
<103 UFC/ml = Contaminación
Cuentas intermedias = volver a realizar el urocultivo

>105 UFC/ml = INFECCIÓN (cuando se aísla un solo microorganismo). Si se

trata de un microorganismo Gram Positivo, recuentos superiores a 10,000
UFC/ml puede ser significativo de una infección (correlacionar con los datos
clínicos).

Actualmente, la mayoría de los autores considera que un recuento de colonias igual

o mayor de 10,000 UFC de Candida spp por ml correlaciona con una infección, aún
en ausencia de síntomas y/o piuria. En realidad no existe criterio alguno que
diferencie adecuadamente entre una colonización fúngica y una infección.
Probablemente, más importante que una cifra determinada en el recuento de
colonias, lo más importante es evaluar cualquier grado de candiduria con el estado
clínico del paciente.

MATERIALES
1. Una muestra reciente de orina
2. Tiras reactivas de urianálisis
3. Tubos de ensayo 13 cm
4. Placas de agar EMB o Mc Conkey y Agar Sangre
5. Asa calibrada de 0.001 mL

85
 DESARROLLO DE LA PRÁCTICA
SESIÓN I
1. El profesor presentará un caso clínico sobre IVU
2. Posteriormente se realizará la práctica:
o Primero se realizará el urocultivo:
1. Colectar la primera orina de la mañana mediante la técnica de chorro medio, tal
como se describió en la introducción.
2. Homogeneizar la orina agitando el frasco por rotación con el asa calibrada estéril,
tomar una asada y descargar en línea recta en el centro de la placa de EMB, gelosa
sangre, EMB o Mc Conkey y estriar masivamente.
3. Incubar las placas a 37°C durante 24 a 48 h.

o En seguida se realizará el EGO (para evitar contaminaciones):

1. Observar las aspectos físicos de la orina y anotarlos en la hoja de resultados.
2. Para sus características químicas debemos transferir la orina en un tubo de
ensayo e introducir la tira reactiva de urianálisis.
3. Esperar 40 segundos y comparar los colores de la tira reactiva con los de
referencia del frasco de tiras reactivas (primera lectura, de glucosa) para su
interpretación. Hacer la lectura de leucocitos a los 2 minutos y anotar los resultados.

Para la evaluación microscópica se realizará lo siguiente:

1. Centrifugar la orina que se encuentra en el tubo a 2 000 r.p.m. por 5 minutos.

2. Decantar el sobrenadante.

3. Resuspender en la orina residual el sedimento.

4. De este se obtiene una gota y se deposita en un portaobjetos limpio, colocar un

cubreobjetos.

86
5. Observar al microscopio, identificar células epiteliales, leucocitos, eritrocitos,
cristales, otros y anotará en su hoja de resultados nulo, escaso o abundante, o bien
observar 10 campos y obtener promedio.

SESIÓN II
Preguntas orientadas para evaluar el conocimiento adquirido
Los equipos discutirán los resultados obtenidos del EGO y de las placas de
urocultivo de la Sesión I, si la muestra resultó positiva se mencionará el diagnóstico
obtenido y también analizarán las siguientes preguntas conjuntamente con el
profesor durante la sesión:

1. ¿Cómo sería el resultado del EGO en una infección de vías urinarias por
Staphylococcus saprophyticus?

2. ¿Qué datos del EGO me sugieren la presencia de una infección de vías urinarias
por E. coli?

3. El encontrar urocultivo >100,000 UFC de E. coli/ml de orina, nitritos positivos y

en sedimento urinario te reportan 50 leucocitos por campo, ¿cuál sería su
interpretación?

4. Si te reportan urocultivo >100,000 UFC de Staphylococcus saprophyticus/ml de

orina y nitritos negativos, ¿cuál sería su interpretación?

5. Si se cuantifican 15 colonias (UFC/μL de orina) de Enterococcus en Gelosa

Sangre en un urocultivo, ¿cuál sería su interpretación?

6. Si te reportan urocultivo >10,000 UFC de Staphylococcus aureus/ml de orina,

¿cuál sería su interpretación?, ¿Cuál sería la posible procedencia del
microorganismo?

7. ¿Cuál es el diagnóstico clínico del siguiente resultado?; Urocultivo 10,000 UFC

de K. pneumoniae /mL de orina, nitritos positivos, y en sedimento urinario se
reportan 30 leucocitos /campo; la paciente presenta disuria, polaquiuria y signo de
Giordano positivo.

87
 OBSERVACIONES:
RESULTADO DE EXAMEN GENERAL DE ORINA (EGO)
FICHA DE IDENTIFICACIÓN
Nombre
Edad
Género
Diagnóstico

ASPECTO RESULTADO VALORES DE REPORTE

FÍSICO REFERENCIA
Ámbar fuerte, rojo, anaranjado,
Color Amarillo claro ámbar
verde, azul, etc.
Amoniacal, pútrido, dulzaino,
Olor Sui géneris
fecal, etc.
Limpio, ligeramente turbio, turbio
Aspecto Translúcido
o muy turbio
Sedimento Nulo o muy escaso Nulo, escaso o abundante
Blanca, abundante y
Espuma
fugaz

ASPECTO QUÍMICO
Densidad 1.010 – 1.030
pH 5
Leucocitos Negativo
Nitritos Negativo
Proteínas Negativo
Glucosa Negativo
Cuerpos
Negativo
Cetónicos
Urobilinógeno 0.2 mg/dL
Bilirrubina Negativo
Sangre Negativo
Hemoglobina Negativo

ASPECTO MICROSCÓPICO
Células epiteliales (nulo, escaso, abundante):
Bacterias (nulas, escasas, abundantes):
Leucocitos número de leucocitos por campo (# p/c):
Eritrocitos (# p/c):
Cristales (identificarlos):
Cilindros (identificarlos):
Otros (Filamentos de mucina, uratos amorfos)

88
 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Forbes, B., Sahm, D.F., Weissfeld, A.S. (2009). Bailey & Scott Diagnóstico
Microbiológico. 12 Ed. Editorial Médica Panamericana.

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LaboratoryInfo.com. [online] LaboratoryInfo.com. Available at:
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Woods, G.L. (2013). Koneman Diagnóstico microbiológico, Texto y Atlas en color, 6ta
edición. México, 81-88.

89
 PRACTICA 8
PRUEBA DE SENSIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS Y LECTURA
INTERPRETADA DEL ANTIBIOGRAMA

PROPÓSITOS
AL FINALIZAR ESTA PRÁCTICA EL ALUMNO SERÁ CAPAZ DE:
 Describir los pasos requeridos para realizar una prueba de difusión por disco.
 Mencionar las variables que deben ser controladas cuando se realiza la
prueba.
 Reconocer los problemas que podrían ocurrir si las variables de la prueba no
son controladas apropiadamente.
 Discutir los dos métodos básicos de preparación del inóculo y la aplicación
de cada uno de ellos.
 Interpretar los diámetros de la zona de inhibición como sensible, intermedio
o resistente para organismo/agente Antimicrobiano específicos, según la
normativa internacional recomendada.

INTRODUCCIÓN
La resistencia bacteriana a los antibióticos es un grave problema de salud que
actualmente ocupa a médicos y personal de laboratorios de microbiología. Dicha
resistencia obliga a cambiar conceptos establecidos en cuanto a la interpretación
de los resultados de las pruebas de susceptibilidad.

La sensibilidad a los antibióticos de los microorganismos se ha estudiado

desde la década de los 30 del siglo pasado. En 1940 se comienzan a describir los
primeros mecanismos de resistencia y en 1950 se establece la relación entre
resistencia y fracaso terapéutico. A partir de 1960 se inicia la normalización de las
pruebas de susceptibilidad, en las que se destaca el método estandarizado de
difusión con discos, propuesto por Kirby y Bauer, en 1966. La década de los 70 trae
consigo la aparición de los criterios de interpretación de los resultados de las
pruebas de sensibilidad y en 1980 se introduce el concepto de lectura interpretada
90
de estos resultados. Al final del siglo XX, se inicia la automatización de este proceso.
En el actual siglo XXI, aparejado con los descubrimientos en el campo de la
genómica y la biología molecular, comienzan los estudios de la llamada
epidemiología de la resistencia.

El Instituto de Normas Clínicas y de Laboratorio (en inglés Clinical and

Laboratories Standards Institute, o CLSI, radicado en Pennsylvania, EUA), define el
antibiograma como: Un perfil general de los resultados de la susceptibilidad
antimicrobiana de una especie microbiana frente a una batería de agentes
antimicrobianos.

En general, se entiende por antibiograma el resultado de las pruebas de

susceptibilidad in vitro llevadas a cabo para conocer el comportamiento de un
microorganismo frente a determinados antibióticos, cuyos resultados se expresan
en términos de "sensibilidad" y "resistencia". El CLSI adoptó los pasos básicos del
procedimiento descritos en el estudio de Bauer como el método de referencia para
difusión por disco. Estos pasos deben seguirse en forma minuciosa para obtener
resultados precisos.

En décadas pasadas la interpretación de estos resultados resultaba muy

fácil, ya que sólo bastaba utilizar el antibiótico al cual el antibiograma señalaba como
sensible. En la actualidad este proceso se ha complejizado excesivamente debido
al incremento de la resistencia bacteriana, a punto de partida de un sinnúmero de
mecanismos creados por los microorganismos, que hacen que no siempre se
puedan tomar en cuenta los resultados del antibiograma sin un previo análisis. De
aquí que surgiera el concepto de lectura interpretada de los resultados del
antibiograma. Esta lectura puede ser considerada una técnica de avanzada, pues
utiliza un método convencional, pero aplicando un concepto novedoso. Está
fundamentada en el conocimiento molecular de los mecanismos de resistencia y en
la interpretación terapéutica de las pruebas de susceptibilidad in vitro. Persigue la
detección de la resistencia a partir de los diferentes fenotipos de resistencia
deducidos. Utiliza antibióticos marcadores o indicadores de la presencia de los
mecanismos de resistencia. Cuando se realiza mediante el método de difusión,

91
durante la ejecución de un antibiograma convencional, los discos de los antibióticos
marcadores son colocados de manera conveniente para visualizar los efectos y
evidenciar los posibles mecanismos de resistencia.

Los sistemas automatizados actuales, que utilizan preferentemente la

determinación de la concentración inhibitoria mínima (C.I.M.) como parámetro para
establecer los resultados, son capaces de realizar una lectura interpretada y
corregida del antibiograma.

CONTROL DE LAS VARIABLES DE LA PRUEBA

Las variables enumeradas a continuación, deben ser controladas al realizar las
pruebas de difusión por disco.

• Composición del medio de cultivo.

• pH del medio.

• Profundidad del agar.

• Tamaño del inóculo.

• Procedimiento de inoculación.

• Concentración del antimicrobiano en el sensidisco.

• Almacenamiento de los sensidiscos.

• Número de sensidiscos en la placa.

• Temperatura de incubación.

• Atmósfera de incubación.

• Tiempo de incubación.

92
 DESARROLLO DE LA PRÁCTICA

Una vez que se han aislado colonias puras de un organismo y que ha sido
identificado como agente patógeno potencial GRAM Positivo o Negativo, es
necesario proceder de la siguiente manera para realizar la prueba de susceptibilidad
a los antimicrobianos (antibiograma).

1. Seleccionar las colonias puras. Las colonias puras (colonias o grupos de

colonias con las mismas características morfológicas) se recolectan con ayuda
del asa bacteriológica.
2. Preparar y estandarizar una suspensión del inóculo. (Caldo Mueller-
Hinton). Se realizó una suspensión de la bacteria en caldo Müeller - Hinton (tubo
0,5 de la escala de Mac-Farland) lo cual es equivalente a inocular 1,5 X
108 Unidades Formadoras de Colonias (UFC)/ml.
3. Inocular la placa. Con ayuda de un hisopo estéril, realizar dos estrías a través
de todo el medio (MÜLLER-HINTON), posteriormente sembrar masivamente
sobre la superficie y rotar la placa 45 grados, repetir este procedimiento de
estriar y rotar hasta cubrir totalmente la superficie del medio de cultivo,
finalmente rotar el hisopo alrededor de la circunferencia del medio de cultivo.
4. Colocar los sensidiscos del antimicrobiano. Existen en el mercado
sensidiscos individuales y bien los multidisco. Con ayuda de pizas previamente
estériles, tomar un multidisco, y depositarlo suavemente sobre el medio de
cultivo cerciorándose de que el disco ha hecho contacto con el medio de cultivo,
recuerde que este es un procedimiento de difusión por lo tanto es absolutamente
importante que el disco este en contacto con el medio, de no ser así, con ayuda
de las pinzas presione suavemente sobre el disco hasta que entre en contacto
con el medio de cultivo
5. Incubar la placa Una vez realizado el paso anterior, llevar las placas a la estufa
de incubación donde permanecerán aproximadamente 24 h a 37 °C.
6. Medir las zonas o halos de inhibición. Una vez transcurrido el tiempo de
incubación, retirar las placas de la estufa de incubación y proceder a medir los

93
 halos de inhibición. De acuerdo a las tablas de referencia de CLSI, clasificar a
los antibióticos en Sensibles, Intermedios y Resistentes.
7. Interpretación de los resultados. La interpretación del antibiograma presenta
las características siguientes:

- Establecer la probabilidad de éxito o de fracaso terapéutico que se deriva de la

utilización de los antimicrobianos frente a los microorganismos causantes de
infección y estudiados en el antibiograma.

- Utilizar los criterios que se establecen por comités de expertos y generar en función
del conocimiento microbiológico, los datos farmacológicos y la respuesta
terapéutica, o sea, la correlación entre el antibiograma y el éxito terapéutico.

- Realizar un análisis fenotípico de los resultados de las pruebas de sensibilidad

fundamentada en el conocimiento de los mecanismos de resistencia y en su
expresión.

- Tiene como principal objetivo la detección de la resistencia y la predicción del

fracaso terapéutico.

94
 CONCLUSIONES
Finalmente, los beneficios que alcanza la realización de la lectura interpretada del
antibiograma son los siguientes:

- Detección de nuevos mecanismos de resistencia.

- Conocimiento de la epidemiología de la resistencia

- Mejor adecuación de los tratamientos antimicrobianos.

- Mejor calidad y gestión de los resultados.

Se concluye que la lectura interpretada del antibiograma debe dejar de ser un

ejercicio intelectual de unos pocos, y plantearse como una necesidad clínica del
microbiólogo en el laboratorio y para el médico en la práctica clínica diaria.

95
 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Bantar C. (2007). Are laboratory-based antibiograms reliable to guide the selection of

empirical antimicrobial treatment in patients with hospital-acquired infections? J Antimicrob
Chemother. 59(1), 140-143.

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96
 PRÁCTICA 9.
DIAGNÓSTICO DE INFECCIONES DE TRANSMISIÓN SEXUAL (ITS)
PRODUCIDAS POR VIRUS Y BACTERIAS

EXUDADO VAGINAL Y URETRAL

Propósitos

AL FINALIZAR ESTA PRÁCTICA EL ALUMNO SERÁ CAPAZ DE:

 Reconocer los métodos microbiológicos útiles para el diagnóstico de las

Infecciones de transmisión sexual (ITS), a través de la revisión de un caso
clínico en conjunto con el profesor de laboratorio.
 Describir los microorganismos bacterianos y virales productores de ITS.
 Realizar adecuadamente la toma de muestra de exudado vaginal y uretral.
 Interpretar resultados de los estudios microbiológicos del exudado vaginal
y uretral para correlacionarlos con el cuadro clínico de su paciente.

INTRODUCCIÓN

El término “microbiota” hace referencia a la población de microorganismos

que habitan en la piel y mucosas de las personas sanas. Participan en una gama
de procesos biológicos tales como digestión, extracción y almacenamiento de
energía, crecimiento y desarrollo de órganos, maduración del sistema inmune y
proporciona la primera línea de defensa contra patógenos. Los cambios en esta
microbiota, o la inflamación que incitan estos comensales, generan diversas
enfermedades (Carroll, 2013). Entre los diferentes órganos que los
microorganismos colonizan se encuentra el aparato genitourinario, en la porción
anterior de la uretra y la vagina que están colonizadas por microorganismos de
manera permanente.

Microbiota del aparato genitourinario

La microbiota vaginal se encarga de mantener la salud vaginal y la
protección del hospedero contra los patógenos. La microbiota vaginal se agrupa en

97
un número limitado de comunidades, que generalmente se clasifican según su
demanda de oxígeno (aeróbica o anaerobia). De éstos, los anaerobios predominan
sobre los aerobios en relación aproximada de 10 a 1 (Mendling, 2016). Ciertos tipos
de comunidades están más asociados con resultados reproductivos deficientes y
las enfermedades de transmisión sexual (ETS); Las comunidades dominadas por
las especies de Lactobacillus, particularmente Lactobacillus crispatus, están más
asociadas con la salud vaginal (Lewis et al., 2017). Durante el parto, el producto
adquiere al estreptococo del grupo B, que posteriormente genera septicemia
neonatal y meningitis. La microbiota vaginal también comprende con frecuencia
estreptococo α-hemolítico, estreptococos anaerobios (peptoestreptococos),
especies de Prevotella, clostridios, Gardnerella vaginalis, Ureaplasma urealyticum
y en ocasiones especies de Listeria o Mobiluncus (Ver cuadro 9.1) (Carroll, 2013;
Hemsell et al., 2009). Los microorganismos vaginales comensales normales
previenen la colonización de bacterias patógenas, incluyendo aquellos
responsables de la vaginosis bacteriana (VB), infecciones de levadura, infecciones
de transmisión sexual e infecciones del tracto urinario (Donders et al., 2017).
La porción anterior de la uretra en ambos sexos contiene un pequeño
número del mismo tipo de microorganismos encontrados en la piel y perineo. En el
pene, en el área situada por debajo del prepucio del varón incircunciso, puede
albergar Mycobacterium smegmatis, junto con otras bacterias grampositivas (Röse
et al., 2004). La circuncisión se asocia con un cambio significativo en la microbiota
general con un predominio de géneros anaeróbicos facultativos tales como
Pseudomonas spp y Janthinobacterium spp (Price et al., 2010).

Agentes patógenos relacionados con las enfermedades de transmisión sexual

El estudio común de las ETS considera los agentes causantes (Ver cuadro
9.2 y 9.3), con énfasis en las diferentes clases, géneros, especies y características
microbiológicas (Krieger, 2014).

La causa de la gonorrea es el diplococo Gramnegativo Neisseria gonorrhoeae. La

gonorrea se presenta como uretritis aguda en hombres y cervicitis en mujeres,
sin embargo; la faringe y el recto también pueden ser infectados. En la uretritis, los

98
pacientes se quejan de secreción uretral y disuria. A la exploración, la secreción
puede ser purulenta o mucopurulenta. Las infecciones asintomáticas son comunes.
Los patógenos más importantes son bacterias, Neisseria gonorrhoeae y Chlamydia
trachomatis (Krieger, 2014). La uretritis no gonocócica se diagnostica cuando no se
pueden definir microorganismos intracelulares gramnegativos en la exploración
microscópica.
Cuadro 9.1 Microbiota bacteriana de la porción inferior del aparato reproductor femenino
(modificado de Hemsell et al., 2009)
Especie o grupo de microorganismos
Aerobios
Grampositivos
Lactobacillus sp.
Diphtheroides
Staphylococcus aureus
Sthapylococcus epidermidis
Estreptococo del grupo B
Enterococcus faecalis
Staphylococcus sp.
Gramnegativos
Escherichia coli
Klebsiella sp.
Proteus sp.
Enterobacter sp.
Acinetobacter sp.
Citrobacter sp.
Pseudomonas sp.
Anaerobios
Cocos grampositivos
Peptostreptococcus sp.
Clostridium sp.
Bacilos grampositivos
Lactobacillus sp.
Propionibacterium sp.
Eubacterium sp.
Bifidobacterium sp.
Gramnegativos
Prevotella sp.
Bacteroides sp.
Grupo de Bacteroides fragilis
Fusobacterium sp.
Veillonella sp.

La cervicitis mucopurulenta mantiene muchos paralelos con la uretritis en

hombres. De manera característica, los pacientes presentan exudado endocervical
purulento o mucopurulento visible en el conducto endocervical o en una muestra de
exudado endocervical (Janier et al., 2016).

99
 El herpes genital (VHS) es la causa más común de úlceras. Otras
consideraciones importantes son sífilis (T. pallidum) y chancroide (H. ducreyi). En
contraste, linfogranuloma venéreo y granuloma inguinal (donovanosis) son causas
poco comunes de úlceras genitales en algunos países (Krieger, 2014).

La vaginosis bacteriana (VB) es un síndrome microbiológico muy común

entre las mujeres en edad fértil. VB se caracteriza por un desplazamiento de la
microbiota vaginal del Lactobacillus dominante a una microbiota polimicrobiana. La
lista de posibles agentes continúa expandiéndose e incluye miembros de varios
géneros, incluyendo Gardnerella, Atopobium, Prevotella, Peptostreptococcus,
Mobiluncus, Sneathia, Leptotrichia, Mycoplasma y bacteria 1 asociada a la VB
(VBAB1) a VBAB3 (Onderdonk et al., 2016). Amsel et al. (1983) fueron los primeros
en describir los criterios para el diagnóstico clínico, que comprenden: 1) la
valoración microscópica de una preparación en fresco de la secreción vaginal, 2)
medición del pH vaginal y 3) la liberación de aminas volátiles producidas por el
metabolismo anaerobio. Las células guía constituyen los indicadores más confiables
de vaginosis bacteriana y originalmente fueron descritos por Gardner y Dukes
(1955).

Cuadro 9.2 Patógenos causantes de ETS

Causantes de Causantes de Causante de Uretritis no Causante de
secreción úlceras Condilomas gonococcica: condilomas
planos acuminados
1. Chlamydia 1. Haemophylus 1. Treponema 1. Ureaplasma 1. Virus del
trachomatis ducreyi pallidum urealyticum papiloma
2. Gardnerella 2. Treponema 2. Chlamydia humano
vaginalis pallidum trachomatis
3. Neisseria 3. Virus del 3. Mycoplasma
gonorrhoeae herpes simple genitalium
4. Candida tipo 2 4. Virus del herpes
albicans simple tipo 2
(levadura) 5. Citomegalovirus.
5. Trichomonas
vaginalis
(protozoario)

El molluscum contagiosum produce lesiones benignas de aspecto similar

a las verrugas. El agente etiológico responsable de esta enfermedad es un miembro
de la familia de los poxvirus. El contagio puede ser de origen venéreo o a través de

100
contacto no sexual en los niños. Las lesiones suelen ser pequeñas, de 3 a 5 mm de
diámetro, y múltiples. En los adultos se agrupan en la región genital o inguinal, el
periné o la cara interna de los muslos. Poseen un color perla y un centro umbilicado
que a menudo sólo se aprecia tras una inspección minuciosa (Augenbraun MH,
2015).

Otro de los agentes infecciosos importantes es el virus del papiloma humano

(VPH). El VPH se considera el agente de transmisión sexual más común en todo el
mundo. Múltiples estudios han asociado la infección causada por el VPH con el
desarrollo de cáncer cervicouterino (CaCU) y lo han considerado como el principal
factor etiológico de este tipo de cáncer (Baseman et al., 2005). Las lesiones del VPH
visibles en la exploración clínica suelen estar producidas por virus que poseen un
potencial oncogénico bajo (es decir, los tipos 6 y 11). La mayor parte de las
infecciones producidas por él son asintomáticas. Las lesiones pueden oscilar desde
pápulas planas o relativamente discretas hasta masas de gran tamaño,
pedunculadas, verrucosas, con forma de coliflor, denominadas condilomas
acuminados (Augenbraun MH, 2015).

Cuadro 9.3 Patógenos y síndromes de enfermedades de transmisión sexual

Agente etiológico
Neisseria gonorrhoeae
Chlamydia trachomatis
Gardnerella vaginalis
Treponema pallidum
Haemophilus ducreyi
Virus del herpes simple 2
Virus del papiloma humano
Poxvirus
Descripción del cuadro clínico
Uretritis y cervicitis: secreción uretral purulenta y disuria.
Epididimitis
Agente causal del lifogranuloma venéreo y tracoma en recién
nacidos. Uretritis y cervicitis. Epididimitis.
De los síntomas, el más característico es una secreción
transvaginal fétida no irritante, que no siempre aparece. La
vagina no suele encontrarse eritematosa y el examen del
cuello uterino no revela anomalías
Agente causal de la sífilis. La lesión principal de la infección
se denomina chancro, donde abundan las espiroquetas.
Chancroide. Al principio esta enfermedad se manifiesta en
forma de una pápula eritematosa que se convierte en pústula
y, en 48 h se ulcera.
Las lesiones genitales características empiezan como
pápulas o vesículas dolorosas.
La mayor parte de las infecciones producidas son
asintomáticas. Las lesiones pueden oscilar desde pápulas
planas hasta condilomas acuminados. Cáncer cerviocuterino
Molusco contagiosos

101
Métodos diagnósticos de las enfermedades sexualmente transmisibles

1. Diagnóstico epidemiológico
a) Mal higiene personal
b) Vida sexual activa
c) Promiscuidad
d) Múltiples parejas
e) Inmunodeprimidos
2. Diagnóstico clínico
a) Signos y síntomas
3. Diagnóstico de laboratorio

Recolección, almacén y transporte de la muestra.

Del mismo modo que para otros microorganismos patógenos, el éxito del
aislamiento depende de la recolección de las muestras y para que esto sea fiable
debemos de tomar en cuenta el sexo, el nivel de madurez sexual, el sitio anatómico
expuesto y del cuadro de presentación clínica (Elias et al., 2015). En todos los
casos, deben recolectarse muestras de sitios genitales (uretra masculina,
endocérvix femenino). Si el paciente tiene antecedentes de contactos sexuales
anogenitales u urogenitales, también es adecuada la recolección de muestras del
conducto anal u orofaríngeas. En los casos sospechosos de infección gonocócica
diseminada, se deben obtener muestras de sangre para hemocultivos y muestras
de sitios genitales y extragenitales (Ver cuadro 9.4 y cuadro 9.5) (Winn et al., 2006).
Las muestras deben recolectarse con hisopos de dacrón o rayón, debido a que
algunas marcas de algodón tienen ácidos grasos e inhiben el crecimiento de los
gonococos. Se deben evitar los hisopos de alginato de calcio debido a la toxicidad
para los gonococos (Elias et al., 2015).

Los medios de transporte semisólidos tamponados basados en Amies o de Stuart

pueden usarse para transportar hisopos de N. gonorrhoeae al laboratorio. Sin
embargo, las muestras enviadas al laboratorio en sistemas de transporte con hisopo
deben permanecer a temperatura ambiente y procesarse lo antes posible después
de la recolección (Winn et al., 2006). Similar a las muestras de cultivo, los

102
especímenes para la detección molecular de N. gonorrhoeae se recomienda que se
tome la muestra con hisopos de punta rayon o dacron, debido a que se ha reportado
que el alginato de calcio puede inhibir la PCR (Elias et al., 2015).

Cuadro 9.4 Obtención de muestras para cultivo de N. gonorrhoeae (modificado de Winn et al.,
2006)
Paciente Sitio (s) primario (s) Sitio (s) secundario (s)
Mujer Endocérvix Recto, uretra, faringe
Varón, heterosexual Uretra Faringe
Varón, heterosexual o bisexual Uretra, recto, faringe
Mujer con infección Sangre, endocérvix, Faringe, lesiones cutáneas (cuando se
diseminada recto presenta), liquido articular (cultivar si
hay presencia de artritis)
Varón con infección Sangre, uretra Faringe, recto, lesiones cutáneas,
diseminada liquido articular(cultivar si hay presencia
de artritis)

Medios de cultivo selectivos.

Se dispone de diversos medios selectivos enriquecidos para el cultivo de N.

gonorrhoeae, entre los que se incluyen el medio de Thayer-Martin modificado
(MTM), el medio de Martin-Lewis (ML), el medio GC-Lect® (BD Biosciences) y el
medio New York City® (NYC). MTM, ML y GC-Lect son medios en base a agar
chocolate suplementados con factores de crecimiento para microorganismos con
requerimientos nutricionales especiales, mientras que el medio NYC® es una base
de agar almidón de maíz-peptona purificado que contiene levadura dializada,
plasma equino citratado y eritrocitos de caballo Usados. Estos medios contienen
antibióticos que inhiben el desarrollo de otros microorganismos y permiten el
aislamiento selectivo de N. gonorrhoeae, N. meningitidis y N. lactamica (Winn et al.,
2006).

Exudado uretral y vaginal

(Se realizará en el Hospital de habilidades y destrezas de ésta Facultad)

¿Qué medidas debe tomar en cuenta su paciente, previo a un exudado vaginal

y uretral?

1. Abstinencia sexual y en el caso de los varones no masturbarse 72 horas.

2. No estar bajo tratamiento antibiótico, antiparasitario o antimicótico.

103
 3. No aplicar óvulos o duchas vía vaginal.
4. Llegar aseado a la toma de muestra.
5. Se recomienda que la toma de muestra sea por la mañana.
6. Evitar el uso de lubricantes.
7. Evitar hacer el estudio en un periodo menstrual (5 días antes y 5 días
después, es lo recomendable).
8. En el caso de los varones, ante la búsqueda de Neisseria gonorrhoeae,
recolectar el primer chorro de orina.

Cuadro 9.5 Procedimientos de recolección de muestra para el diagnóstico de infecciones

gonocócicas (modificado de Winn et al., 2006)
Muestra Procedimiento de recolección
Uretra La secreción purulenta se puede extraer presionando la parte anterior del pene y
masculina recolectando el material con un hisopo. Las muestras de varones asintomáticos
se obtienen por inserción de un hisopo nasofaríngeo de alginato cálcico en el
interior de la uretra. El hisopo se rota con cuidado para retirarlo.
Endocérvix Después de que el espéculo está colocado, eliminar algún moco cervical con
algodón o gasa. Insertar el hisopo y recoger la muestra con un movimiento suave.
Dar tiempo para que los microorganismos se absorban en el hisopo. Tomar
cualquier secreción cervical presente.
Recto Insertar el hisopo 4-5 cm en el conducto anal y moverlo con suavidad de un lado
a otro para tomar la muestra de las criptas anales. Dar algunos segundos para
que los microorganismos se absorban en el hisopo y rotar despacio mientras se
retira. Si se observa una densa contaminación fecal en el hisopo, recoger otra
muestra con un hisopo nuevo
Orofaringe Con la ayuda de un bajalenguas, hisopar con firmeza las áreas de las amígdalas
y la faringe posterior.
Sangre Después de la punción venosa, inocular la sangre en el medio de cultivo adecuado
(caldo tripticasa soja, caldo de Columbia que contenga polianetosulfonato de
sodio (SPS). Si se usan los tubos Vacutainer SPS® para la recolección de la
muestra, transferir la muestra de sangre del tubo al medio de cultivo lo más rápido
posible, porque la exposición a altas concentraciones de SPS puede inhibir a los
gonococos.
Líquido El líquido articular se puede aspirar con una aguja y jeringa e inocular en un frasco
articular de hemocultivo aerobio.
Lesiones Las muestras de punción biopsia se recogen y se colocan en un recipiente estéril
cutáneas con una pequeña cantidad de caldo o solución fisiológica estéril y se remiten al
laboratorio.
Conjuntiva La secreción conjuntival se recoge de la cara interna del párpado inferior con un
pequeño hisopo nasofaríngeo. Preparar frotis para tinciones de Gram como se
describe en el texto.

104
Exudado vaginal:

Condiciones para la toma de muestra: debe hacerse directamente de las lesiones

cuando estas sean evidentes como en el caso de una cervicitis, blenorragia crónica,
úlcera de genitales externos.

1. Se coloca a la paciente en posición ginecológica y se introduce en la vagina

un espejo estéril, evitando el uso de lubricantes como la vaselina o
antiséptico.
2. Se localiza el cuello uterino, se abre y se fija el espejo.
3. Se toman las muestras con hisopo estéril del cérvix y/o fondo de saco
posterior.

Se toman con hisopos diferentes al menos dos muestras, con una se hace un frote
directo (para la tinción de Gram) y se coloca el hisopo en un tubo de SS estéril para
el examen en fresco, la segunda toma se realiza un frote para la tinción de May-
Grünwald-Giemsa y el hisopo se coloca en un medio de cultivo de transporte,
alternativamente algunos laboratorios inoculan un hisopo en agar Biggy para
identificación de Candida.

Figura 9.1. Método de obtención de muestras de exudado cervical, para cultivo,

tinción de Gram y medios de cultivo.

105
Obtención de la muestra (Ver figura 9.2):

1. Se obtiene la muestra de la secreción que brote del meato urinario.

2. Realizar un examen en fresco, utilizar tinción de Gram y realizar sembrados
en medios de cultivo como agar chocolate, Mac Conkey, Thayer Martin,
Biggy.

Procedimiento:

1. El profesor junto con los alumnos analizarán un caso clínico de ETS para
posteriormente simular la obtención de la secreción vaginal y uretral en el
hospital de habilidades y destrezas (Maniquí Chloe y masaje prostático).
2. En el laboratorio, se observarán laminillas proporcionadas por el profesor en
el microscopio óptico a 100X.
3. Anotar sus observaciones.

Figura 9.2. Método de identificación en exudados cervicales y algoritmo para la

detección de microorganismos.

Completa las siguientes tablas:

106
 Ejercicios orientados para consolidar el conocimiento.
VULVOVAGINITIS
Candida albicans Vaginosis T. vaginalis
Síntoma
predominante
Aspecto
Color
Prurito
Olor
Especuloscopía
Ph
Prueba de aminas

Ejercicios orientados para evaluar el conocimiento adquirido.

Reporte de estudio Bacteria presuntiva Enfermedad que ocasiona
Si en la tinción de Gram de
secreción vaginal te reportan
diplococos G(-) intracelulares y
extracelulares y presencia de
leucocitos:
Si en la tinción de Gram de
secreción vaginal te reportan
células clave, prueba con
hidróxido de potasio (KOH)
positiva y actividad del bacilo
de Döderlein disminuida:
Si en la exploración genital
observas presencia de
condilomas planos:
Si en la tinción con Giemsa te
reportan cuerpo elemental:
Si se observan espirilos por
microscopía de campo oscuro a
partir de muestra obtenida de
úlcera en genitales:

107
 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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109
 PRÁCTICA 10
DIAGNÓSTICO DE INFECCIONES SISTÉMICAS

PROPÓSITO
AL FINALIZAR ESTA PRÁCTICA EL ALUMNO SERÁ CAPAZ DE:

 Comprender la importancia del hemocultivo como el principal recurso de

laboratorio para el diagnóstico de las Infecciones Sistémicas producidas por
bacterias, a través de la revisión de un caso clínico en conjunto con el
profesor de laboratorio.
 Realizar adecuadamente la indicación, obtención, conservación y
transporte de las muestras para hemocultivo.
 Interpretar correctamente los resultados del hemocultivo y del estudio de
LCR de manera crítica y concisa.

INTRODUCCIÓN
Las infecciones sistémicas (IS) son aquellas que pueden ser causadas por la
presencia y multiplicación de microorganismos que se propagan por todo el
organismo a través de capilares o por vasos linfáticos desde un foco extra e
intravascular: y según el agente biológico implicado puede causar viremia,
bacteriemia o fungemia. Los focos de infección habitualmente se originan por
infecciones de vías urinarias, abscesos, heridas quirúrgicas, catéteres u otros
métodos diagnósticos invasivos. Sepsis, sepsis grave y shock séptico son los
términos que se usan con mayor frecuencia para describir las respuestas peligrosas
sistémicas del organismo a la infección. Dado que no existe una clasificación
bioquímica precisa de estos síndromes, ni se comprenden bien sus causas, los
expertos los han definido aplicando los datos clínicos y de laboratorio a un marco
probable de la patogenia (Mundford, R. et al, 2016). La sepsis hasta el 2001 se
define como un síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SRIS, es un término
antiguo para la respuesta sistémica a una amplia gama de agresiones y los criterios
en adultos incluían dos o más de los siguientes: Temperatura >38°C ó <36°C, F.C.
>90 lpm, F.R. >20 rpm, o PaCO2 <32 mmHg, Leucocitos >12 000 cels/mm3 o <4000

110
cels/mm3 o >10% de formas inmaduras en banda) como resultado de una infección
ya sea confirmada o sólo sospecha de ésta (Martínez R. 2017). En la versión más
reciente de las definiciones de consenso publicada en 2012 se desechó la
nomenclatura del SRIS y se define a la Sepsis como una respuesta sistémica y
peligrosa del huésped a la infección que lleva a una sepsis grave (disfunción aguda
orgánica secundaria a una infección documentada o sospechada) y a un shock
séptico (sepsis grave más hipotensión que no revierte con fluidoterapia).

Ninguna prueba de laboratorio proporciona un diagnóstico definitivo. La

expresión de las respuestas del organismo a la infección varía considerablemente
dependiendo de la persona y del momento, por lo que no existe un perfil ni pruebas
de laboratorio útiles para el diagnóstico. Por otro lado, algunos hallazgos son lo
bastante sugestivos como para realizar una evaluación más extensa. Además de
los signos de comprenden SRIS, hallazgos como la alteración del nivel de
consciencia, hiperbilirrubinemia inexplicada, lactatemia, acidosis metabólica o
alcalosis respiratoria y trombocitopenia pueden ser claves útiles. (Mundford, et al,
2016).

Existen estudios de laboratorio convencionales para el diagnóstico de sepsis

y en la actualidad han aparecidos nuevos métodos de diagnóstico molecular que
aún no se encuentran disponibles para el uso generalizado. Los métodos de
diagnóstico convencional son:

10.1 Hemocultivo

Se define como al cultivo microbiológico de una muestra de sangre obtenida por

una punción independiente. Existen numerosos estudios que muestran que la
sobrevida de los pacientes sépticos aumenta entre un 30-40% cuando se conoce el
microorganismo causal y el paciente recibe tratamiento de acuerdo a la
susceptibilidad antibiótica (Bouza, et al, 1993; Bothelo, N., 2009). La mayoría de los
microorganismos son capaces de invadir el torrente circulatorio. En la actualidad,
los grampsitivos (especialmente estafilococcos y enterococcos) igualan o superan

111
en frecuencia a los gramnegativos. Ellos es debido a múltiples causas, entre las que
destacan la utilización indiscriminada de antibióticos de amplio espectro, el uso
generalizado de catéteres intravasculares y el empleo de métodos de diagnóstico
invasivo (Bouza, E., et al, 1993).

El aislamiento del agente responsable es trascendente, además, para

conocer su sensibilidad a los antimicrobianos e instaurar el tratamiento o las
modificaciones necesarias a la terapia empírica ya establecida. En ocasiones,
puede orientar el diagnóstico de enfermedades como la neoplasia de colon
(asociada a bacteriemia por Staphylococcus bovis), e incluso infección por el VIH
(Salmonella, enterococo). Por otra parte, permite en la mayoría de las ocasiones, la
diferenciación de los casos de verdadera bacteriemia de aquellos en los que la
positividad es debida a un inadecuado procedimiento de extracción y
procesamiento.

Recientemente han ocurrido varios cambios, por ejemplo el aumento del

número de pacientes inmunocomprometidos, la necesidad de aislar
microorganismos no habituales y el advenimiento de sistemas automatizados para
hemocultivos. Es por ello que es importante revisar algunos aspectos como:
indicación de los hemocultivos, su clasificación, toma de muestra (momento de la
obtención, número de hemocultivos y volumen de sangre), diferenciación de
bacteriemia versus contaminación, sangre por catéter versus punción periférica,
utilidad de los hemocultivos anaerobios, utilidad de los hemocultivos con resinas,
microorganismos especiales, sistemas de hemocultivos e impacto de la
automatización e interpretación de los resultados obtenidos.

¿Cuándo debo solicitar hemocultivo?

La indicación clásica de obtener hemocultivos, es tras la sospecha de bacteriemia
en el paciente con o sin foco aparente de infección. Los factores clásicos asociados
a la presencia de bacteriemia verdadera, son la presencia de escalofríos y fiebre de
38.5°C, existencia de enfermedades subyacentes severas (usualmente mortales a
un plazo no mayor de 5 años), cuadros de abdomen agudo y el antecedente de
drogadicción intravenosa (Bates, D.W., 1990). Sería imposible detallar todas las

112
situaciones en las que debe extraer hemocultivos, pero de forma general, deben
realizarse, antes de la administración de la terapia antimicrobiana sistémica,
siempre que exista sospecha clínica de sepsis, meningitis, osteomielitis,
pielonefritis, infección intraabdominal, artritis, infecciones graves de la piel y tejidos
blandos, neumonía, endocarditis y fiebre de origen desconocido (absceso oculto,
fiebre tifoidea, brucelosis, tularemia, etc.) los signos que orientan esta sospecha
incluyen: fiebre o hipotermia, escalofríos, leucocitosis o granulocitopenia, deterioro
uni o multiorgánico de etiología no aclarada, shock, compromiso hemodinámico de
causa desconocida y combinaciones de alguno de ellos. La extracción de
hemocultivos está indicada de igual manera en niños pequeños o ancianos con
disminución súbita de la vitalidad, ya que en estas poblaciones puede no
presentarse los signos y síntomas típicos antes mencionados (Bouza, E., et al.,
1993).

¿Cómo clasificar los diferentes tipos de hemocultivos?

Los hemocultivos se pueden clasificar según por ejemplo por el tipo de paciente, ya
que los microorganismos son distintos según si se trata de un paciente
inmunosuprimido o inmunocompetente, también si se trata de pacientes adultos o
pediátricos o si se trata de enfermos que están o no bajo terapia antimicrobiana. Y
según la forma de la muestra pueden ser hemocultivos periféricos o centrales
(obtenidos a través de un catéter central) (Garcia, P., et al).
También pueden clasificarse por el tipo de microorganismos que se esté
investigando, ya que se requieren distintos sistemas de hemocultivos si se
sospechan de bacterias aeróbicas, anaeróbicas, micobacterias u hongos. Por
último, se pueden clasificar según la metodología de los distintos sistemas de
hemocultivos, en métodos convencionales (manuales), en sistemas automatizados,
como el sistema Lisis-centrifugación o en sistemas automatizados como BACTEC,
BacT/Alert, Septichek, etc. (Garcia, P., et al) (Ver figura 10.1)

113
 Clasificación de los Hemocultivos

Según toma de Según tipo de

Según tipo paciente Según metodología
muestra microorganismo

Adulto Centrales Bacterias Aérobicas Manuales

Bacterias
Pediátrico Periféricos Semi-automatizados
Anaérobicas

Inmunocompetente Hongos Automatizados

Inmunosuprimido Micobacterias

Fig. 10.1 Se muestra la clasificación de los hemocultivos de acuerdo al tipo de

paciente, toma de muestra, tipo de microorganismo y metodología utilizada.

Por otra parte las diferentes metodologías tienen un distinto rendimiento en cuanto
a sensibilidad y rapidez en la detección de las bacterias en el torrente sanguíneo
(Wilson, M.L., et al., 1994). En general existen tres tipos de sistemas de
hemocultivos: 1) Manuales o convencionales, 2) Semiautomatizados (Lisis-
centrifugación), 3) Automatizados.

¿Cuándo debo de tomar la muestra para el hemocultivo?

La extracción del hemocultivo inmediatamente antes o durante el pico febril es el
momento idóneo. Como este hecho es imposible de predecir con exactitud, se
recomienda que la sangre para hemocultivo sea extraída lo antes posible después
del inicio de la fiebre y escalofríos o siempre o siempre que se sospeche de una
infección grave. No obstante, es más importante el volumen que el momento para
la detección de microorganismos en una bacteriemia. Las bacteriemias en adultos,
en términos generales, contienen escasas bacterias por mililitro de sangre,
aproximadamente 1 bacteria/ml de sangre (Doern, G.I. et al., 1976; Henry, N.K., et

114
al., 1983; Kellog, J.A., et al., 1984). El momento de extracción de la sangre es
indiferente si la bacteriemia es continua como en la endocarditis y otras infecciones
intravasculares en las primeras semanas de la fiebre tifoidea o brucelosis.

¿Cuál es el número de extracciones recomendadas?

El óptimo es de 2 a 3, mayor es desaconsejable. En endocarditis sobre prótesis o
con hemocultivos inicialmente positivos puede ser útil la disponibilidad de un mayor
número de extracciones.

¿Cuál es el volumen de extracción óptimo?

 Adultos: 10 ml por toma
 Neonatos y niños hasta 1 año (<4kg): 2 ml por toma
 Niños mayores de un año: 4 ml por toma

Dilución frascos de hemocultivo (10 ml caldo cultivo/fresco)

 Adultos: Poner 5 ml de sangre en cada frasco de hemocultivo (anaerobio y
aerobio)
 Neonatos y niños menores de 1 año: Poner 1 ml en cada frasco de
hemocultivo (anaerobio y aerobio).
 Niños mayores de 1 año: Poner 2 ml en cada frasco de hemocultivo
(anaerobio y aerobio).

115
 Durante la
toma

Limpieza de la •Limpiar tapones con clorhexidina

•Cada muestra debe extraerse
de diferentes lugares sin
intervalo entre las muestras
•Ponerse gorro y mascarilla
•Lavado de mano
•Colocación de guantes no
estériles
•Palpar la zona
Muestra
acuosa al 2%
piel •Ponerse guantes estériles
• Agua fría y jabón •Crear campo estéril
•Extraer muestra aséptica (sin hablar ni
•Alcohol 70% por 3" en
toser)
círculo de 2-4 cm
•Inocular rapidamente para evitar la
•Clorhexidina acuosa al 2%
•Dejar secar coagulación de la sangre en la jeringa
en posición vertical
•No poner nada no estéril sobre la aguja
al momento de sacarla de la vena
•Introducir la sangre en los frascos 1°
anaerobio, 2° aerobio
•Invertir varias veces los frascos para
mezclar la sangre y el medio de cultivo
•No cambiar la aguja cuando se
introduzca la sangre en los frascos de
hemocultivo ya que el cambio de aguja
no disminuye la tasa de contaminación
y si el riesgo de pinchazo

Transporte:

Debe ser inmediato y debidamente identificado con los datos del paciente poniendo
el número de toma y fecha en cada frasco. Se deben mantener los frascos sólo a
temperatura ambiente y por periodos cortos de tiempo (máx. 18 h).

En cuanto a los hemocultivos procesados en sistemas automáticos pueden

mantenerse entre 35 y 37°C nunca deben de refrigerarse ni mucho menos
congelarse.

10.2 Diagnóstico de Infecciones sistémicas asociadas a meningitis:

Es importante mencionar que el cultivo de la sangre debe complementarse con el

de otros fluidos, tales como el LCR, orina, muestras del tracto respiratorio inferior o
líquido sinovial en pacientes con sospecha de meningitis (Ver tabla 10.1),
pielonefrits, neumonía o artritis séptica, respectivamente.

116
Tabla 10.1 Se muestran las diferencias de los parámetros del LCR encontrados
en las meningitis bacteriana, viral y tuberculosa.

MATERIALES:

 2 Jeringas 10 mL
 Cubrebocas
 Guantes, campos, gorros y batas (ESTÉRILES)
 Isodine quirúrgico
 Frasco para hemocultivo

DESARROLLO DE LA PRÁCTICA:

Se revisará un caso clínico de Infección sistémica donde se utilice el Hemocultivo

como prueba diagnóstica de apoyo. En equipo ser realizará la correcta toma de
muestra.

117
 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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119
 PRACTICA 11
MÉTODOS MOLECULARES PARA EL DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES
INFECCIOSAS

PROPÓSITOS:

AL FINALIZAR ESTA PRÁCTICA EL ALUMNO SERÁ CAPAZ DE:

 Reflexionar la importancia que tienen en la actualidad los métodos moleculares

para el diagnóstico de enfermedades infecciosas.
 Comprender los fundamentos y conceptos básicos de las técnicas de Biología
Molecular utilizadas en la Microbiología Médica.
 Interpretar resultados de manera crítica y concisa.

INTRODUCCIÓN:

En la microbiología médica las técnicas de Biología Molecular permiten la

detección de porciones de ácidos nucleicos (ADN o ARN) que son específicos de
cada microorganismo, en diferentes materiales clínicos. Su aplicación, surge como
una necesidad para poder detectar microorganismos de difícil crecimiento en
cultivos o desarrollos tardíos y donde las técnicas serológicas de detección de
antígenos y anticuerpos carecen de suficiente sensibilidad y especificidad
diagnóstica. Esta circunstancia se ajusta principalmente a la detección de virus, es
por ello, que el desarrollo de técnicas moleculares comenzó en esta área.

¿Cuáles son las ventajas y desentajas de las técnicas de Biología Molecular?

Ventajas:
 Tienen un alto porcentaje de sensibilidad y especificidad con respecto a otras
técnicas de diagnóstico tradicionales.
 La característica de detectar “presencia de ácidos nucleicos” en vez de
“viabilidad de microorganismos” permite su realización en una gran variedad
de muestras.

120
  Algunas técnicas (Q-PCR) permiten conocer la cantidad específica de ácidos
nucleicos y por consiguiente su aplicación médica ha sido en conocer la
carga viral en pacientes con VIH.

Desventajas:
 La falta de estandarización de las técnicas.
 La probabilidad de resultados falsos positivos por contaminación con
productos de amplificados anteriores “Amplicones”, hace necesario una
cuidadosa evaluación de sus resultados.
 La probabilidad de falsos negativos por la presencia de inhibidores o
inconvenientes en los diferentes pasos de las técnicas, esto se controla y
detecta con la incorporación de controles internos.
 No permite el aislamiento del microorganismo para la posterior detección de
resistencia.
 Elevados costos para el paciente.

Fundamentos básicos de Técnicas de Biología Molecular

Muchos estudios en el área de Microbiología médica comienzan con la extracción
del ADN, hay diferentes procedimientos para su obtención, pero en general consiste
en tres etapas consecutivas:
1.- Disgregación de las células o tejidos (lisis celular).
2.- Inactivación de las nucleasas intracelulares.
3.- Separación de los ácidos nucleicos de los demás componentes celulares.

La lisis celular depende en gran medida del tipo de muestra que se va a

procesar, se liberan las moléculas en una fase acuosa que es separada de los
restos celulares por centrifugación. Las proteínas son removidas de la fase acuosa
con solventes orgánicos (fenol, cloroformo). El ADN que permanece en la fase
acuosa precipita junto al etanol, posteriormente es purificado y resuspendido en un
amortiguador adecuado.

121
 Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
La PCR (del inglés polymerase chain reaction) es una técnica de Biología Molecular
que se utiliza para amplificar cantidades considerablemente pequeñas de ADN
específico que está presente en las
muestras clínicas de pacientes con
enfermedades infecciosas. La PCR
utiliza una ADN polimerasa
termoestable para producir una
amplificación doble de ADN
“preseleccionado” en cada sitio de
temperatura. La PCR corriente
Fig. 11.1 Fundamento de PCR utiliza tres reacciones seriadas:
desnaturalización, hibridación y
extensión de la reacción. El ADN extraído de la muestra clínica, junto con los
oligonucleótidos específicos de los iniciadores, nucleótidos, la ADN polimerasa y el
amortiguador se calientan a 90-95°C para separar o desnaturalizar las dos cadenas
de ADN seleccionado. Se disminuye la temperatura de la reacción, por lo común a
45-60°C, con bases en los cebadores para permitir la hibridación de estos con el
ADN preseleccionado. Hecho lo anterior, se extiende cada cebador por medio de la
ADN polimerasa al agregar nucleótidos complementarios del ADN preseleccionado
y de esta forma se genera la amplificación doble. El ciclo se repite 30-40 veces hasta
obtener la amplificación del fragmento de ADN preseleccionado, incluso 105 a 106
veces.

El segmento amplificado puede ser identificado por electroforesis en gel que

permite separar, analizar y caracterizar los ácidos nucleicos; los materiales más
utilizados son polímeros como la poliacrilamida o la agarosa. Los geles se
comportan como un tamiz molecular y permiten separar moléculas cargadas en
función de su tamaño y forma. Así, moléculas de ADN de diferente tamaño, van a
emigrar de forma distinta. La distancia recorrida por cada fragmento de ADN va a
ser inversamente proporcional al logaritmo de su peso molecular. Es importante la
utilización de marcadores de peso molecular (fragmentos de ADN de tamaño

122
conocido) porque nos permitirán calcular el tamaño aproximado de las muestras de
ADN problema. En el caso de los geles de agarosa, se le añade bromuro de etidio,
sustancia que se intercala entre las bases del ADN y es fluorescente cuando se
ilumina con luz ultravioleta (UV). Tras la electroforesis, se visualiza el gel con una
lámpara de luz UV, y se verán las bandas correspondientes a las muestras de ADN
y los marcadores de peso molecular.

Fig. 11.2 Electroforesis en gel de agarosa

Reacción en cadena de la polimerasa por transcriptasa inversa (RT-PCR)

La RT-PCR (del inglés Reverse transcription polymerase chain reaction) es una
variante de PCR que se fundamente en retrotranscribir una hebra de ARN en ADN
complementario (ADNc) usando una transcriptasa inversa aislada de Thermus
thermophilus dependiente de Mn2+. Una vez obtenido el ADNc, se adiciona Mg2++ y
EGTA [ácido etilen glicol-bis(ß-aminoetil eter)-N,N,N',N' tetraacético], éste último
actúa como quelante de los cationes Mn2+ y permite polimerasa cambie su
especificidad de ARN a ADN, es decir, utilice como templado al ADN en lugar de
ARN. Gracias a esta doble actividad, una sola enzima es capaz de copiar ARN en
cADN y amplificarlo mediante PCR mediante un simple cambio en el amortiguador
de reacción. La aplicación médica de es que permite la amplificación del ARN
provenientes de muestras con virus cuyo genoma se basa en ARN, por ejemplo
Virus de Hepatitis C, Influenza, Picornavirus, etc.

123
 PCR en tiempo real (Q-PCR)
La Q-PCR (del inglés Quantitative polymerase chain reaction) es un método
que permite la cuantificación de ácidos nucleicos con gran exactitud y fiabilidad.

Está basada en la monitorización de la PCR usando técnicas de

fluorescencia. Esta técnica ofrece una gran cantidad de aplicaciones al ser capaz
de cuantificar de manera absoluta o relativa moléculas molde de ADN o ARN. De
este modo, la Q-PCR se usa para determinar la carga vírica, el título de gérmenes
y contaminantes en la comida, sangre u otro tipo de muestras, la expresión génica
en distintos tejidos, tratamientos o estadios del desarrollo, la discriminación alélica,
y la deleción o el grado de amplificación de los genes. Para llevar a cabo estas
aplicaciones se necesita un termociclador con capacidad para detectar y medir la
fluorescencia (Ver figura 12.2)

Fig. 11.3 Amplificación y cuantificación de ácidos nucleicos por Q-PCR

La señal fluorescente es proporcional a la cantidad de producto de la PCR y

la generan los fluoróforos específicos de DNA bicatenario o las sondas
fluorescentes específicas de la secuencia.

El SYBR-Green I es el fluoróforo específico de ADN bicatenario más usado

en la Q-PCR. Este fluoróforo se une con gran afinidad al surco menor del ADN
bicatenario, aumentando su fluorescencia unas 1000 veces. Para detectar
específicamente una secuencia se utilizan sondas de oligonucleótidos etiquetadas

124
con fluoróforos. La intensidad de la señal se relaciona con la cantidad de productode
PCR de dos formas: a) una disminución del amortiguamiento de la fluorescencia
dependiente de producto, en la que el fluoróforo (la molécula delatora) y el
amortiguador (quencher) se separan al unirse la sonda a la diana; b) un incremento
de la transferencia de energía resonante fluorescente (FRET) del donador al
fluoróforo aceptor al quedar cercanos cuando se une la sonda a la diana. En otras
palabras esto hace posible medir la fluorescencia en cada ciclo de amplificación y
ello constituye la evaluación de “tiempo real” de los resultados.

Tabla. 12-1. Utilidad de la PCR en el diagnóstico microbiológico

Objetivo de la PCR Agentes biológicos Tipos de muestras
Detección Mycobacterium Expectoración, lavado
tuberculosis broncoalveolar, LCR, tejido, orina,
líquido articular y peritoneal, sangre
total
Detección Mycoplasma pneumoniae Aspirado bronquial
Detección Bordetella pertussis Aspirado nasofaríngeo
Detección Chlamydia trachomatis Orina, secreción uretral, secreción y
vaginal
Detección Virus herpes simplex 1 y 2 L.C.R., sangre, lesión cutánea
Detección Parvovirus B-19 Sangre
Detección Virus del Sarampión Sangre
Detección Varicella-Zóster Sangre
Detección Epstein Barr Sangre, L.C.R
Carga viral Virus hepatitis B Sangre
Detección Virus hepatitis C Virus hepatitis C
Carga viral por RT- Virus hepatitis C Sangre
PCR
Detección Virus del Papiloma Hisopado uretral
Humano
Detección Herpes simple 1 y 2 Sangre
Detección Poliomavirus JC L.C.R.
Detección Citomegalovirus Sangre, L.C.R.
Carga viral VIH I y II Sangre
Detección VIH I Semen
Detección Virus HTLV-1 Sangre
Detección Virus Influenza Exudado faríngeo
Detección Trypanosoma cruzi Sangre
Detección Toxoplasma gondii Sangre
Detección Cisticerco LCR y Sangre
Detección Coccidiodes spp Espectoración
Detección Pneumocystis jiroveci Lavado broncoalveolar, aspirado
nasofaríngeo

125
 EXTRACCIÓN DE ADN DE BACTERIAS

MATERIALES
● Tubo Falcon con 10 ml de cultivo líquido TSA
● Cepa bacteriana problema
● Asa bacteriológica calibrada
● Gel de agarosa
● TAE 1x

PROCEDIMIENTO:

- Inocula en tu tubo Falcon dos asadas de la cepa bacteriana.

- Incubar por 18 horas a 37°C.
- Después de haber incubado el cultivo, centrifugar por 5 minutos a 10 000
rpm.
- Decanta el sobrenadante.
- Agrega 1 mililitro de agua inyectable estéril en el mismo tubo y re suspende
las bacterias.
- Colócalo a baño María a 95° C por 15 minutos.
- Una vez pasado el tiempo, centrifuga el tubo por 10 minutos a 12 000 rpm.
- Obtén el sobrenadante con la ayuda de una pipeta y colócalo en un tubo
limpio y estéril.
- En esta fase se encuentra tu material genético, puedes utilizarlo para una
electroforesis, PCR, etc.

126
 Figura 11.4 Esquema de extracción de material genético

127
 ELECTROFORESIS
1.- Tomar 5 microlitros del ADN extraído y disolver en 1 ml de agua destilada para
su separación por electroforesis en gel.
8.- Colocar un gel de agarosa previamente hecho dentro de la cámara de
electroforesis, los pocillos deben de estar cerca del cátodo (polo negativo, color
negro).
9.- Añadir amortiguador de electroforesis TAE 1x de forma que cubra bien el gel de
agarosa.
10.- Cargar 2 microlitros del marcador de peso molecular en el primer pocillo del gel
y 5 microlitros de la muestra de ADN preparada en dos de los siguientes pocillos.
11.- Conectar la fuente de alimentación, comprobando que los electrodos estén bien
posicionados.
12.- Programar la fuente a unos 100 voltios que permitirá correr la electroforesis de
unos 30-45 minutos.
13.- Una vez acabada la electroforesis, teñir el gel con bromuro de etidio (Utilizar
guantes siempre) y visualizar los fragmentos de ADN mediante luz UV en el
transiluminador.

11. 5 de electrodos en la electroforesis de ADN

128
Actividad para reforzar el conocimiento:

Contesta las siguientes preguntas según la practica realizada:

1.- ¿Cuál es la utilidad de la extracción de material genético?

2.- ¿En qué paso de la extracción del material genético realizaste la lisis celular?
3.- ¿Qué otro mecanismo crees que serviría para lisar células bacterias?
4.- Explique porque es posible ver moléculas de ADN a simple vista.
5.- Explique cómo le hacen las células para poder guardar estas moléculas en un
espacio tan reducido.
6.- Mencione las propiedades del ADN que le permiten migrar hacia el polo positivo.

Preguntas orientadas para evaluar el conocimiento adquirido

7.- ¿Pudiste identificar en qué momento inactivas las nucleasas de la bacteria?
8.- Realiza un dibujo ejemplificando que sucede con la célula bacteriana en cada
paso de extracción

9.- Dibuje e interprete el resultado observado en el transiluminador UV.

10.- Suponga que en un gel de agarosa usted carga en cada carril diferentes
muestras de ADN amplificadas y cortadas con enzimas de la siguiente manera:

Carril 1:

Carril 2:

Carril 3:

Carril 4:

Carril 5:

129
Dibuje como se verían separadas en un gel de agarosa de acuerdo con el marcador
de peso molecular.

Marcador de
Carril I Carril 2 Carril 3 Carril 4 Carril 5
peso molecular
5000 pb

4000 pb

3000 pb

2000 pb

1000 pb

500 pb

130
 Referencias bibliográficas

Betancor L, Gadea MP, Flores K. (2008). Genética Bacteriana. En: Instituto de Higiene,
Facultad de Medicina (UDELAR). Temas de Bacteriología y Virología Médica. 3ra Ed.
Montevideo: Oficina del Libro FEFMUR, p. 59-80

Graumann, P.L. (2004). «Cytoskeletal elements in bacteria». Current Opinion in

Microbiology 7 (6): 565-571. doi: 10.1016/j.mib.2004.10.010.

Shih YL, Rothfield L (2006). «The bacterial cytoskeleton». Microbiol. Mol. Biol. Rev. 70 (3):
729-54. doi:10.1128/MMBR.00017-06.

Silvia Hernáez y José Leiva. (2005). Bacterias multiresistentes: ventana a otras

especialidades. GH Continuada. 4(4), 191-195

131
 PRÁCTICA 12
HEMAGLUTINACIÓN DE ERITROCITOS

PROPÓSITOS:

AL FINALIZAR ESTA PRÁCTICA EL ALUMNO SERÁ CAPAZ DE:

 Conocer un nuevo método de diagnóstico de Hemaglutinación.

 Comprender los fundamentos básicos de detección de virus en el laboratorio.
 Interpretar resultados de Hemaglutinación de manera crítica y concisa.

INTRODUCCIÓN
El fundamento de la hemaglutinación se basa en la unión de las glicoproteínas de
superficie de diferentes virus denominadas hemaglutininas, con el ácido siálico
presente en la membrana de los eritrocitos. Algunos virus pertenecientes a la familia
Orthomyxoviridae (virus de la Influenza A y B) y Paramyxoviridae (virus de la
Parotiditis, virus de Newcastle, etc). Los virus que pertenecen a la familia
Orthomyxoviridae como los virus de influenza A poseen una glicoproteína de
superficie denominada hemaglutinina (HA), mientras que los virus que pertenecen
a la familia Paramyxoviridae como el virus de parotiditis, virus de la parainfluenza
humana y el virus de Newcastle la glicoproteína se denomina Hemaglutinina-
Neuraminidasa (HN), la cual reconoce al ácido siálico como su receptor. Esta
técnica se lleva a cabo mediante diluciones seriadas del virus que son mezcladas
con una cantidad determinada de eritrocitos y depositadas en pozos de una placa
de cultivo con fondo en U. Los eritrocitos que no se unen al virus caen al fondo de
los pozos y forman botones mientras que los que sí se unen al virus forman un
entramado o “hemaglutinación” que cubre el pozo. El título de hemaglutinación se
expresa como el reciproco de la dilución en la que se presenta el efecto
hemaglutinante.

132
MATERIALES
 Placa de 96 pozos con fondo en U.
 Tubo para muestra de sangre con EDTA
 Vacuna atenuada contra el virus de Newcastle
 Pipeta automática de 20-100 µl
 Puntas para pipeta de 100 µl
 Solución salina isotónica

DESARROLLO DE LA PRÁCTICA
Parte I
1. Extraer sangre periférica en un tubo con anticoagulante.
2. Centrifugar el tubo a 3000 rpm por 5 min.
3. Retirar el plasma del tubo
4. Agregar solución salina fisiológica
5. Centrifugar 3000 rpm por 5 min.
6. Repetir el paso 5 hasta que el sobrenadante esté claro.
7. Hacer una solución de eritrocitos al 3% con solución salina.

Parte II
8. Colocar 50 µl de solución salina en cada uno de los pozos
9. Colocar 50 µl de la vacuna atenuada contra el virus de Newcastle en el primer
pozo y mesclar con la punta de la pipeta.
10. Transferir 50 µl del primer pozo al siguiente pozo y mezclar con la pipeta.
11. Repetir el paso 10 con los siguientes pozos de la placa.
12. Una vez que se termine la dilución seriada del virus, colocar 50 µl de la
solución de eritrocitos al 3%.
13. Incubar la placa a 4°C por 30 min.

133
En caso de que se observe una capa uniforme de eritrocitos, la prueba se considera
positiva y se toma la dilución más baja a la que se observe la hemaglutinación. En
caso de que se observe un botón eritrocitario en el fondo de la placa, la prueba se
considera negativa.

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