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Zakrzewski et al. Investigación y terapia con células madre (2019) 10:68
https://doi.org/10.1186/s13287-019-1165-5
REVISIÓN
Células madre: pasado, presente y futuro
Wojciech Zakrzewski1 *, Maciej Dobrzynorteesquí2, María Szymonowicz1 y Zbigniew Rybak1
Abstracto
En los últimos años, la terapia con células madre se ha convertido
en un tema de investigación científica muy prometedor y
avanzado. El desarrollo de métodos de tratamiento ha suscitado
grandes expectativas. Este artículo es una revisión centrada en el
descubrimiento de diferentes células madre y las posibles terapias
basadas en estas células. La génesis de las células madre es
seguida por pasos de laboratorio de cultivo y derivación
controlados de células madre. Los ensayos de control de calidad y
de formación de teratomas son procedimientos importantes para
evaluar las propiedades de las células madre analizadas. Los
métodos de derivación y la utilización de medios de cultivo son
cruciales para establecer las condiciones ambientales adecuadas
para una diferenciación controlada. Entre muchos tipos de
aplicaciones de tejido del tallo, el uso de andamios de grafeno y el
potencial de las terapias basadas en vesículas extracelulares
requieren atención debido a su versatilidad. La revisión se resume
en los desafíos que la terapia con células madre debe superar para
ser aceptada en todo el mundo. Una amplia variedad de
posibilidades hace que esta terapia de vanguardia sea un punto de
inflexión en la medicina moderna, brindando esperanza para
enfermedades intratables.
Palabras clave: Células madre, diferenciación, pluripotencia, células
madre pluripotentes inducidas (iPSC), ensayo de formación de
teratomas, derivación de células madre, medios de crecimiento,
bancos de tejidos, trasplante de tejidos
Clasificación de células madre
Las células madre son células no especializadas del cuerpo humano.
Son capaces de diferenciarse en cualquier célula de un organismo y
tienen la capacidad de autorrenovarse. Las células madre existen tanto
en embriones como en células adultas. Hay varios pasos de
especialización. La potencia del desarrollo se reduce con cada paso, lo
que significa que una célula madre unipotente no puede diferenciarse
en tantos tipos de células como una pluripotente. Este capítulo se
centrará en las células madre
* Correspondencia: tekwoj@hotmail.com
1Departamento de Investigación de Biomateriales y Cirugía Experimental, Universidad
Médica de Wroclaw, Bujwida 44, Wrocław 50-345, Polonia
La lista completa de información del autor está disponible al final del artículo.
© El autor (es). 2019Acceso abierto Este artículo se distribuye bajo los términos de la licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0 (
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Acceso abierto
clasificación para facilitar al lector la comprensión de los
siguientes capítulos.
Las células madre totipotentes pueden dividirse y diferenciarse en
células de todo el organismo. La totipotencia tiene el mayor potencial
de diferenciación y permite que las células formen estructuras
embrionarias y extraembrionarias. Un ejemplo de una célula
totipotente es un cigoto, que se forma después de que un
espermatozoide fertiliza un óvulo. Posteriormente, estas células
pueden convertirse en cualquiera de las tres capas germinales o
formar una placenta. Después de aproximadamente 4 días, el
blastocisto'La masa celular interna se vuelve pluripotente. Esta
estructura es la fuente de células pluripotentes.
Las células madre pluripotentes (CEP) forman células de todas
las capas germinales, pero no de las estructuras
extraembrionarias, como la placenta. Las células madre
embrionarias (ESC) son un ejemplo. Las ESC se derivan de la masa
celular interna de los embriones antes del implante. Otro ejemplo
son las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) derivadas de
la capa de epiblasto de embriones implantados. Su pluripotencia
es un continuo, comenzando por células completamente
pluripotentes como ESC y iPSC y terminando en representantes
con menos potencia.-células multi, oligo o unipotentes. Uno de los
métodos para evaluar su actividad y espectro es el ensayo de
formación de teratomas. Las iPSC se generan artificialmente a
partir de células somáticas y funcionan de manera similar a las
PSC. Su cultivo y utilización son muy prometedores para la
medicina regenerativa presente y futura.
Las células madre multipotentes tienen un espectro de
diferenciación más estrecho que las PSC, pero pueden especializarse
en células discretas de linajes celulares específicos. Un ejemplo es una
célula madre hematopoyética, que puede convertirse en varios tipos
de células sanguíneas. Después de la diferenciación, una célula madre
hematopoyética se convierte en una célula oligopotente. Sus
habilidades de diferenciación se restringen luego a las células de su
linaje. Sin embargo, algunas células multipotentes son capaces de
convertirse en tipos de células no relacionadas, lo que sugiere
nombrarlas células pluripotentes.
Las células madre oligopotentes pueden diferenciarse en varios
tipos de células. Una célula madre mieloide es un ejemplo que se
puede dividir en glóbulos blancos pero no en glóbulos rojos. Las
células madre unipotentes se caracterizan por tener las capacidades
de diferenciación más estrechas y una propiedad especial de
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dividiendo repetidamente. Su última característica los convierte
en candidatos prometedores para uso terapéutico en medicina
regenerativa. Estas células solo pueden formar un tipo de célula,
por ejemplo, dermatocitos.
Biología de células madre
Un blastocisto se forma después de la fusión de la fertilización de
los espermatozoides y los óvulos. Su pared interior está revestida
de células madre de vida corta, es decir, células madre
embrionarias. Los blastocistos se componen de dos tipos de
células distintos: la masa celular interna (ICM), que se convierte en
epiblastos e induce el desarrollo del feto, y el trofectodermo (TE).
Los blastocistos son responsables de la regulación del
microambiente ICM. El TE continúa desarrollándose y forma las
estructuras de soporte extraembrionarias necesarias para el
origen exitoso del embrión, como la placenta. A medida que el TE
comienza a formar una estructura de soporte especializada, las
células ICM permanecen indiferenciadas, completamente
pluripotentes y proliferativas [1]. La pluripotencia de las células
madre les permite formar cualquier célula del organismo. Las
células madre embrionarias humanas (hESC) se derivan del ICM.
Durante el proceso de embriogénesis, las células forman
agregaciones llamadas capas germinales: endodermo,
mesodermo y ectodermo (Fig.1), cada uno eventualmente dando
lugar a células y tejidos diferenciados del feto y, más tarde, del
organismo adulto [2]. Después de que las hESC se diferencien en
Figura 1 Desarrollo de ovocitos y formación de células madre: el blastocele, que se forma a partir de ovocitos, está formado por células madre embrionarias que
luego se diferencian en células mesodérmicas, ectodérmicas o endodérmicas. Blastocoel se convierte en la gástrula.
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una de las capas germinales, se convierten en células madre
multipotentes, cuya potencia se limita únicamente a las células de
la capa germinal. Este proceso es corto en el desarrollo humano.
Después de eso, las células madre pluripotentes se encuentran en
todo el organismo como células indiferenciadas, y sus habilidades
clave son la proliferación mediante la formación de la próxima
generación de células madre y la diferenciación en células
especializadas bajo ciertas condiciones fisiológicas.
Las señales que influyen en el proceso de especialización de
las células madre se pueden dividir en externas, como el
contacto físico entre las células o la secreción química por el
tejido circundante, e internas, que son señales controladas
por genes en el ADN.
Las células madre también actúan como sistemas de reparación
internos del cuerpo. La reposición y formación de nuevas células
son ilimitadas mientras un organismo esté vivo. La actividad de
las células madre depende del órgano en el que se encuentran;
por ejemplo, en la médula ósea, su división es constante, aunque
en órganos como el páncreas, la división solo se produce en
condiciones fisiológicas especiales.
División funcional de células madre
Desarrollo de todo el cuerpo
Durante la división, la presencia de diferentes células madre
depende del desarrollo del organismo. Se pueden distinguir
las ESC de células madre somáticas. Aunque la derivación de
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Es posible tener ESC sin separación del TE, tal combinación
tiene límites de crecimiento. Debido a que las acciones de
proliferación son limitadas, generalmente se evita la co-
cultura de estas. Los ESC se derivan de la masa celular
interna del blastocisto, que es una etapa del embrión de
preimplantación ca. 4 días después de la fertilización.
Después de eso, estas células se colocan en un plato de
cultivo lleno de medio de cultivo. El paso es un proceso
ineficiente pero popular de subcultivo de células a otros
platos. Estas células pueden describirse como pluripotentes
porque eventualmente pueden diferenciarse en todos los
tipos de células del organismo. Desde el comienzo de sus
estudios, ha habido restricciones éticas relacionadas con el
uso médico de los ESC en terapias. La mayoría de las células
madre embrionarias se desarrollan a partir de óvulos que han
sido fertilizados en una clínica in vitro.
Las células madre somáticas o adultas no se diferencian y se
encuentran entre las células diferenciadas en todo el cuerpo
después del desarrollo. La función de estas células es permitir la
curación, el crecimiento y el reemplazo de las células que se
pierden cada día. Estas celdas tienen un rango restringido de
opciones de diferenciación. Entre muchos tipos, existen los
siguientes:
- Las células madre mesenquimales están presentes en muchos tejidos. En
la médula ósea, estas células se diferencian principalmente en
Figura 2 Cambios en la potencia de las células madre en el desarrollo del cuerpo humano. La potencia varía desde células pluripotentes del blastocisto hasta células unipotentes
de un tejido específico en un cuerpo humano, como la piel, el SNC o la médula ósea. La pluripotencia invertida se puede lograr mediante la formación de células madre
pluripotentes inducidas utilizando el factor de transcripción de unión al octámero (Oct4), la región Y determinante del sexo (Sox2), el factor 4 similar a Kruppel (Klf4) o el gen Myc.
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los huesos, cartílagos y células grasas. Como células madre, son
una excepción porque actúan de manera pluripotente y pueden
especializarse en las células de cualquier capa germinal.
- Las células nerviosas dan lugar a células nerviosas y sus
células de soporte.-oligodendrocitos y astrocitos.
- Las células madre hematopoyéticas forman todo tipo de células
sanguíneas: rojas, blancas y plaquetas.
- Las células madre de la piel forman, por ejemplo,
queratinocitos, que forman una capa protectora de la piel.
El tiempo de proliferación de las células madre somáticas es
más largo que el de las ESC. Es posible reprogramar las
células madre adultas a su estado pluripotente. Esto se puede
realizar transfiriendo el núcleo adulto al citoplasma de un
ovocito o mediante fusión con la célula pluripotente. La
misma técnica se utilizó durante la clonación de la famosa
oveja Dolly.
Las hESC están involucradas en el desarrollo de todo el cuerpo.
Pueden diferenciarse en células pluripotentes, totipotentes,
multipotentes y unipotentes (fig.2) [2].
Las células pluripotentes pueden denominarse totipotentes si
además pueden formar tejidos extraembrionarios del embrión.
Las células multipotentes tienen restricciones para diferenciarse
de cada tipo de célula de tejido dado. Cuando el tejido contiene
solo un linaje de células, las células madre que las forman se
denominan oligo o unipotentes.
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Control de calidad iPSC y reconocimiento por
diferencias morfológicas
La comparabilidad de las líneas de células madre de diferentes
individuos es necesaria para que las líneas de iPSC se utilicen en
terapéutica [3]. Entre los procedimientos críticos de calidad, se pueden
distinguir los siguientes:
Análisis de repetición en tándem corto-Esta es la comparación de
loci específicos en el ADN de las muestras. Se utiliza para medir un
número exacto de unidades repetidas. Una unidad consta de 2 a 13
nucleótidos que se repiten muchas veces en la cadena de ADN. Se
utiliza una reacción en cadena de la polimerasa para comprobar la
longitud de las repeticiones cortas en tándem. Se recomienda el
procedimiento de genotipado del tejido de origen, las células y los
bancos de células madre e semilla iPSC.
Análisis de identidad-El cambio involuntario de líneas, que da como
resultado la contaminación de otra línea de células madre, requiere un
ensayo riguroso para la identificación de la línea celular.
Prueba de vector residual-La aparición de vectores de
reprogramación integrados en el genoma del huésped es
peligrosa y probar su presencia es un procedimiento obligatorio.
Es un procedimiento de uso común para generar líneas iPSC de
alta calidad. Un umbral aceptable en colecciones de líneas iPSC de
grado de investigación de alta calidad es≤ 1 copia de plásmido por
100 células. Durante el procedimiento, se deben utilizar 2
regiones diferentes, comunes a todos los plásmidos, como dianas
específicas, como las secuencias EBNA y CAG [3]. Para representar
con precisión las reacciones de prueba, es necesario preparar una
curva estándar en un portador de ADNg de una línea de hPSC
bien caracterizada. Para los cálculos de copias de plásmido por
célula, es crucial incorporar secuencias de ADNg de referencia
internas para permitir la cuantificación de, por ejemplo,
ribonucleasa P (RNasaP) o transcriptasa inversa de telomerasa
humana (hTERT).
Cariotipo-Un cultivo a largo plazo de hESC puede acumular
mutaciones impulsadas por el cultivo [4]. Por eso, es crucial
prestar más atención a la integridad genómica. Las pruebas
de cariotipo se pueden realizar resucitando alícuotas
representativas y cultivándolas durante 48-72 h antes de
recolectar las células para el análisis cariotípico. Si se
encuentran anomalías dentro de los primeros 20 cariotipos, el
análisis debe repetirse en una muestra nueva. Cuando se
repite esta situación, la línea se evalúa como anormal. Deben
registrarse las anomalías repetidas. Aunque la cariología es
un procedimiento crucial en el control de la calidad de las
células madre, la matriz de polimorfismo de un solo
nucleótido (SNP), que se analiza más adelante, tiene una
resolución aproximadamente 50 veces mayor.
Pruebas virales-Al evaluar la calidad de las células madre,
deben realizarse todas las pruebas de agentes adventicios
humanos nocivos (por ejemplo, hepatitis C o virus de
inmunodeficiencia humana). Este procedimiento debe realizarse
en el caso de agentes de cultivo no libres de xeno.
Bacteriología-Las pruebas de esterilidad bacteriana o fúngica se pueden
dividir en pruebas basadas en cultivo o en caldo. Todos los trámites
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debe ser recomendado por la farmacopea de la
jurisdicción en la que se realiza el trabajo.
Matrices de polimorfismo de un solo nucleótido-Este procedimiento
es un tipo de microarreglo de ADN que detecta polimorfismos de
población al permitir la detección de cambios subcromosómicos y la
pérdida de heterocigosidad de copia neutral, así como una indicación
de transformación celular. El ensayo SNP consta de tres componentes.
El primero consiste en marcar secuencias de ácido nucleico
fragmentadas con tintes fluorescentes. El segundo es una matriz que
contiene sondas de oligonucleótidos específicos de alelo (ASO)
inmovilizadas. El último componente detecta, registra y eventualmente
interpreta la señal.
Citometría de flujo-Esta es una técnica que utiliza la luz para contar y
perfilar las células en una mezcla de fluidos heterogénea. Permite a los
investigadores recopilar datos de forma precisa y rápida a partir de
mezclas de fluidos heterogéneos con células vivas. Las células pasan a
través de un canal estrecho una por una. Durante la iluminación de la
luz, los sensores detectan la luz emitida o refractada por las células. El
último paso es el análisis, la compilación y la integración de datos en
una imagen completa de la muestra. Ensayos de pluripotencia
fenotípica-El reconocimiento de células indiferenciadas es
fundamental para el éxito de la terapia con células madre. Entre otras
características, las células madre parecen tener una morfología
distinta con una alta proporción de núcleo a citoplasma y un nucléolo
prominente. Las células parecen ser planas con bordes definidos, en
contraste con las colonias diferenciadas, que aparecen como células
poco ubicadas con bordes rugosos [5]. Es importante que las imágenes
de las colonias ideales y de mala calidad para cada línea celular se
mantengan en los laboratorios, por lo que siempre que exista duda
sobre la calidad del cultivo, siempre se podrá verificar de acuerdo con
la imagen representativa. Se debe realizar la formación de cuerpos
embrioides o la diferenciación dirigida de cultivos de monocapa para
producir tipos de células representativos de las tres capas germinales
embrionarias. Es importante señalar que las colonias cultivadas en
diferentes condiciones pueden tener diferentes morfologías [6].
Modificación de histonas y metilación del ADN-El control de
calidad se puede lograr mediante el uso de herramientas de
análisis epigenético como la modificación de histonas o la
metilación del ADN. Cuando las células madre se diferencian, el
proceso de metilación silencia los genes de pluripotencia, lo que
reduce el potencial de diferenciación, aunque otros genes pueden
sufrir desmetilación para expresarse [7]. Es importante destacar
que la identidad de las células madre, junto con sus
características morfológicas, también está relacionada con su
perfil epigenético [8, 9]. Según Brindley [10], existe una relación
entre los cambios epigenéticos, la pluripotencia y las condiciones
de expansión celular, lo que enfatiza que las regiones no
metiladas parecen ser dependientes del suero.
Derivación y medios de hESC
Las hESC se pueden derivar utilizando una variedad de métodos,
desde el cultivo clásico hasta metodologías asistidas por láser o
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microcirugía [11]. Debe especificarse la diferenciación de hESC
para evitar la formación de teratomas (ver Fig.3).
hESCs se diferencian espontáneamente en cuerpos
embrionarios (EBs) [12]. Los EB se pueden estudiar en lugar de
embriones o animales para predecir sus efectos en el desarrollo
humano temprano. Hay muchos métodos diferentes para adquirir
EB, como el cultivo en biorreactor [13], cultura de gota colgante [
12], o tecnología de micropocillos [14, 15]. Estos métodos
permiten la formación in vitro de precursores específicos [dieciséis
]. La parte esencial de estos procedimientos de cultivo es una
separación de la masa celular interna para cultivar futuras hESC
(Fig.4) [17]. Rosowski y col. [18] hace hincapié en que se debe
prestar especial atención al control de la diferenciación
espontánea. Cuando la colonia alcanza el tamaño apropiado, las
células deben separarse. La aparición de células pluripotentes
dura 1-2 días. Debido a que la utilización clásica de hESC provocó
preocupaciones éticas sobre las gástrulas utilizadas durante los
procedimientos, Chung et al. [19] descubrió que también es
posible obtener hESC de embriones de cuatro células, lo que deja
una mayor probabilidad de supervivencia del embrión. Además,
Zhang et al. [20] se utilizó únicamente en células con crecimiento
detenido por fertilización in vitro.
El paso de células se utiliza para formar grupos más pequeños de
células en una nueva superficie de cultivo [21]. Hay cuatro
procedimientos de pasaje importantes.
Disociación enzimática es una acción cortante de las enzimas
sobre las proteínas y los dominios de adhesión que se unen a la
colonia. Es un método más suave que el pasaje manual. Es
fundamental no dejar a las hESC solas después del pase. Las
células solitarias son más sensibles y pueden sufrir fácilmente la
muerte celular; colagenasa tipo IV es un ejemplo [22, 23].
Fig. 3 La diferenciación espontánea de las hESC provoca la formación de una población celular heterogénea. Sin embargo, hay un resultado diferente cuando se
aplican señales de compromiso (en forma de factores solubles y condiciones de cultivo) que permiten la selección de células progenitoras.
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Paso manual, por otro lado, se centra en el uso de rascadores
de células. No es necesaria la selección de determinadas celdas.
Esto debe hacerse en las primeras etapas de la derivación de la
línea celular [24].
Utilización de tripsina permite un paso sano y automatizado de
hESC. La tripsina recombinante de grado de Buenas Prácticas de
Fabricación (GMP) está ampliamente disponible en este
procedimiento [24]. Sin embargo, existe el riesgo de disminuir la
pluripotencia y la viabilidad de las células madre [25]. La
utilización de tripsina se puede detener con un inhibidor de la
proteína quinasa asociada a rho (ROCK) [26].
Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) suprime indirectamente las
conexiones de célula a célula mediante la quelación de cationes
divalentes. Su supresión promueve la disociación celular [27]. Las
células madre requieren una mezcla de factores de crecimiento y
nutrientes para diferenciarse y desarrollarse. El medio debe cambiarse
todos los días.
Los métodos de cultivo tradicionales utilizados para las
hESC son los fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) como
capa alimentadora y el suero bovino [28] como medio. Martin
y col. [29] demostró que las hESC cultivadas en presencia de
productos animales expresan el ácido siálico no humano,
NORTE-ácido glicolilneuramínico (NeuGc). Las capas
alimentadoras evitan la proliferación descontrolada con factores
como el factor inhibidor de la leucemia (LIF) [30].
El cultivo sin la primera capa alimentadora se puede
complementar con reemplazo de suero, combinado con laminina [
31]. Esto provoca cariotipos estables de células madre y
pluripotencia que dura más de un año.
El medio de cultivo inicial puede ser suero (por ejemplo,
suero fetal de ternera FCS), reemplazo artificial como sintético
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Figura 4 Cultivo de células madre pluripotentes in vitro. Tres días después de la fertilización, se forman células totipotentes. Los blastocistos con ICM se forman el
sexto día después de la fertilización. Las células madre pluripotentes de ICM se pueden transmitir con éxito en un plato
sustituto de suero (SSS), reemplazo de suero knockout
(KOSR) o StemPro [32]. El medio de cultivo más simple
contiene solo ocho elementos esenciales: DMEM / F12
medio, selenio, NaHCO3, L-ácido ascórbico, transferrina,
insulina, TGFβ1 y FGF2 [33]. Aún no se conoce del todo
si los sistemas de cultivo desarrollados para hESCs pueden
permitirse sin adaptación en cultivos de iPSC.
Punto de inflexión en la terapia con células madre
El punto de inflexión en la terapia con células madre apareció en
2006, cuando los científicos Shinya Yamanaka, junto con
Kazutoshi Takahashi, descubrieron que es posible reprogramar
células madre adultas multipotentes al estado pluripotente. Este
proceso evitó poner en peligro al feto' vida en el proceso.
Transducción de fibroblastos de ratón mediada por retrovirus con
cuatro factores de transcripción (Oct-3/4, Sox2, KLF4 y c-Myc) [34]
que se expresan principalmente en células madre embrionarias
podría inducir a los fibroblastos a volverse pluripotentes (Fig. 5) [
35]. Esta nueva forma de células madre se denominó iPSC. Un año
después, el experimento también tuvo éxito con células humanas [
36]. Tras este éxito, el método abrió un nuevo campo en la
investigación de células madre con una generación de líneas iPSC
que pueden personalizarse y ser biocompatibles con el paciente.
Recientemente, los estudios se han centrado en reducir la
carcinogénesis y mejorar el sistema de conducción.
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El punto de inflexión estuvo influenciado por descubrimientos
anteriores que ocurrieron en 1962 y 1987.
El primer descubrimiento fue sobre el científico John
Gurdon clonando ranas con éxito transfiriendo un núcleo de
una rana.'s células somáticas en un ovocito. Esto provocó una
reversión completa del desarrollo de las células somáticas [37
]. Los resultados de su experimento se convirtieron en un
descubrimiento inmenso, ya que anteriormente se creía que
la diferenciación celular es una calle de un solo sentido, pero
su experimento sugirió lo contrario y demostró que incluso es
posible que una célula somática vuelva a adquirir
pluripotencia [38].
Este último fue un descubrimiento realizado por Davis RL que
se centró en la sustracción de ADN de fibroblastos. Se
encontraron tres genes que aparecieron originalmente en los
mioblastos. La expresión forzada de solo uno de los genes,
denominada diferenciación miogénica 1 (Myod1), provocó la
conversión de fibroblastos en mioblastos, lo que demuestra que
es posible reprogramar células, e incluso se puede utilizar para
transformar células de un linaje a otro [39].
iPSC
Aunque la pluripotencia puede ocurrir naturalmente solo en las células
madre embrionarias, es posible inducir a las células diferenciadas
terminalmente a volverse pluripotentes nuevamente. El proceso de
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Figura 5 La transducción mediada por retrovirus induce pluripotencia en células somáticas aisladas de pacientes. Las células diana pierden su papel como células somáticas y,
una vez más, se vuelven pluripotentes y pueden diferenciarse en cualquier tipo de célula del cuerpo humano.
la reprogramación directa convierte las células somáticas
diferenciadas en líneas iPSC que pueden formar todos los tipos de
células de un organismo. La reprogramación se centra en la
expresión de oncogenes como Myc y Klf4 (factor 4 similar a
Kruppel). Este proceso se ve reforzado por una regulación a la
baja de genes que promueven la estabilidad del genoma, como
p53. Además, la reprogramación celular implica la alteración de
las histonas. Todos estos procesos pueden causar un riesgo
potencial mutagénico y luego conducir a un mayor número de
mutaciones. Quinlan y col. [40] verificó las iPSC de ratón
completamente pluripotentes utilizando algoritmos de detección
de variación estructural (SV) y secuenciación del ADN del genoma
completo. Con base en esos estudios, se confirmó que aunque
había mutaciones únicas en la región no genética, había
inserciones sin retrotransposón. Esto llevó a la conclusión de que
los métodos de reprogramación actuales pueden producir iPSC
totalmente pluripotentes sin alteraciones genómicas graves.
Durante el curso del desarrollo de hESC pluripotentes a células
somáticas diferenciadas, aparecen cambios cruciales en la
estructura epigenética de estas células. Existe una restricción o
permiso para la transcripción de genes relevantes para cada tipo
de célula. Cuando las células somáticas se reprograman utilizando
factores de transcripción, toda la arquitectura epigenética debe
reacondicionarse para lograr
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iPSC con pluripotencia [41]. Sin embargo, las células de cada
tejido se someten a una metilación genómica somática específica.
Esto influye en la transcripción, que puede causar además
alteraciones en la pluripotencia inducida [42].
Fuente de iPSC
Debido a que las células pluripotentes pueden propagarse
indefinidamente y diferenciarse en cualquier tipo de célula,
pueden ser una fuente ilimitada, ya sea para reemplazar tejidos
perdidos o enfermos. Las iPSC evitan la necesidad de embriones
en la terapia con células madre. Porque están hechos del paciente'
s propias células, son autólogas y ya no generan ningún riesgo de
rechazo inmunológico.
Al principio, los fibroblastos se utilizaron como fuente de iPSC.
Debido a que se necesitaba una biopsia para lograr este tipo de
células, la técnica se sometió a más investigaciones. Los investigadores
investigaron si se podrían usar células más accesibles en el método.
Además, se utilizaron otras células en el proceso: células de sangre
periférica, queratinocitos y células epiteliales renales que se
encuentran en la orina. Una estrategia alternativa al trasplante de
células madre puede ser estimular a un paciente's células madre
endógenas para dividirse o diferenciarse, que ocurren naturalmente
cuando las heridas de la piel están cicatrizando. En
2008, se demostró que las células exocrinas pancreáticas
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reprogramado a células beta funcionales productoras de
insulina [43].
La mejor fuente de células madre parecen ser los fibroblastos,
lo que resulta más tentador en el caso de la logística ya que su
estimulación puede ser rápida y mejor controlada [44].
Ensayo de formación de teratoma
Las capacidades de autorenovación y diferenciación de las iPSC
han ganado un gran interés y atención en las ciencias de la
medicina regenerativa. Para estudiar sus capacidades, se necesita
un ensayo de control de calidad, de los cuales uno de los más
importantes es el ensayo de formación de teratomas. Los
teratomas son tumores benignos. Los teratomas son capaces de
crecer rápidamente in vivo y son característicos debido a su
capacidad para convertirse en tejidos de las tres capas germinales
simultáneamente. Debido a la alta pluripotencia de los teratomas,
este ensayo de formación se considera una evaluación de iPSC.'s
habilidades [45].
Se observó, por ejemplo, que la tasa de formación de teratoma
estaba elevada en las iPSC humanas en comparación con la de las
hESC [46]. Esta diferencia puede estar relacionada con diferentes
métodos de diferenciación y orígenes celulares. Más
comúnmente, el ensayo de teratoma implica una inyección de
iPSCs examinadas por vía subcutánea o debajo del testículo o la
cápsula renal en ratones, que son inmunodeficientes [47].
Después de la inyección, se puede observar un tejido inmaduro
pero reconocible, como los túbulos renales, el hueso, el cartílago
o el neuroepitelio [30]. El lugar de la inyección puede tener un
impacto en la eficiencia de la formación del teratoma [48].
En este ensayo se utilizan tres grupos de marcadores para
diferenciar las células de las capas germinales. Para el tejido
endodérmico, hay insulina / péptido C y alfa-1 antitripsina [49].
Para el mesodermo, se pueden usar derivados, por ejemplo,
proteína de matriz de cartílago para el hueso y azul alcián para el
cartílago. Como marcadores ectodérmicos, la botulina o queratina
de clase III B se puede utilizar para los queratinocitos.
Los ensayos de formación de teratomas se consideran
el estándar de oro para demostrar la pluripotencia de las
iPSC humanas, demostrando sus posibilidades en
condiciones fisiológicas. Debido a su formación de tejido
real, podrían usarse para la caracterización de muchos
linajes celulares [50].
Diferenciación dirigida
Para que sean útiles en la terapia, las células madre deben convertirse
en los tipos de células deseados según sea necesario o, de lo contrario,
todo el proceso de la medicina regenerativa no tendrá sentido. La
diferenciación de las ESC es crucial porque las ESC indiferenciadas
pueden causar la formación de teratomas in vivo. Comprender y
utilizar las vías de señalización para la diferenciación es un método
importante para el éxito de la medicina regenerativa. En la
diferenciación dirigida, es probable que imite las señales que reciben
las células cuando pasan por etapas sucesivas de desarrollo [51]. El
microambiente extracelular juega
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un papel importante en el control del comportamiento
celular. Al manipular las condiciones de cultivo, es posible
restringir vías de diferenciación específicas y generar cultivos
que se enriquecen en ciertos precursores in vitro. Sin
embargo, lograr un efecto similar in vivo es un desafío. Es
crucial desarrollar condiciones de cultivo que permitan la
promoción de una diferenciación homogénea y mejorada de
las ESC en tejidos funcionales y deseados.
Con respecto a la autorrenovación de las células madre
embrionarias, Hwang et al. [52] señaló que el método de cultivo
ideal para la terapia celular y tisular basada en hESC sería un
cultivo definido libre de la capa alimentadora o de componentes
animales. Esto se debe a que la terapia celular y tisular requiere el
mantenimiento de grandes cantidades de hESC indiferenciadas, lo
que no hace que las células alimentadoras sean adecuadas para
tales tareas.
La mayoría de los protocolos de diferenciación dirigida se forman
para imitar el desarrollo de una masa celular interna durante la
gastrulación. Durante este proceso, las células madre pluripotentes se
diferencian en progenitores ectodérmicos, mesodérmicos o
endodérmicos. Las moléculas de Mall o los factores de crecimiento
inducen la conversión de células madre en células progenitoras
apropiadas, que luego darán lugar al tipo de célula deseado. Existe
una variedad de intensidades de señal y familias moleculares que
pueden afectar el establecimiento de capas germinales in vivo, como
los factores de crecimiento de fibroblastos (FGF) [53]; la familia Wnt [54
] o superfamilia de factores de crecimiento transformadores-β (TGFβ);
y proteínas morfogénicas óseas (BMP) [55]. Cada factor candidato
debe probarse en varias concentraciones y, además, aplicarse a varias
duraciones porque se desconocen las concentraciones precisas y los
tiempos durante los cuales las células en desarrollo de los embriones
se ven influenciadas durante la diferenciación. Por ejemplo, los
antagonistas moleculares de BMP endógena y la señalización de Wnt
pueden usarse para la formación de ectodermo por ESC [56]. Sin
embargo, Wnt transitorio y concentraciones más bajas de TGFβ familia
desencadena la diferenciación mesodérmica [57]. Con respecto a la
formación del endodermo, puede ser necesaria una concentración
más alta de activina A [58, 59].
Existen numerosos protocolos sobre los métodos de formación de
progenitores de células de cada una de las capas germinales, como los
cardiomiocitos [60], hepatocitos [61], células renales [62], células
pulmonares [63, 64], neuronas motoras [sesenta y cinco], células
intestinales [66], o condrocitos [67].
Diferenciación dirigida de iPSC o ESC en,
por ejemplo, los hepatocitos, podrían influir y desarrollar el estudio de
los mecanismos moleculares en el desarrollo del hígado humano.
Además, también podría brindar la posibilidad de formar hepatocitos
exógenos para las pruebas de toxicidad de fármacos [68]. Los niveles
de concentración y la duración de la acción con una molécula de
señalización específica pueden causar una variedad de factores.
Desafortunadamente, por ahora, es probable que un alto costo de los
factores recombinantes limite su uso a mayor escala en la medicina. La
técnica más prometedora se centra en el uso de moléculas pequeñas.
Estos se pueden utilizar para
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activar o desactivar vías de señalización específicas.
Mejoran la eficiencia de la reprogramación al crear células
que son compatibles con el tipo de tejido deseado. Es un
método más económico y no inmunogénico.
Uno de los ejemplos exitosos de terapias con células de
moléculas pequeñas son los antagonistas y agonistas de la vía
Hedgehog. Demuestran ser muy útiles en la regeneración de
neuronas motoras [69]. Las moléculas pequeñas endógenas con
su función en el desarrollo embrionario también pueden usarse
en métodos in vitro para inducir la diferenciación de células; por
ejemplo, el ácido retinoico, que es responsable de modelar el
sistema nervioso in vivo [70], sorprendentemente indujo la
formación de células retinianas cuando el procedimiento de
laboratorio involucró hESCs [71].
La eficacia de los factores de diferenciación depende de la
madurez funcional, la eficiencia y, finalmente, la introducción de
las células producidas en su equivalente in vivo. La topografía, el
esfuerzo cortante y la rigidez del sustrato son factores que
influyen en el fenotipo de las células futuras [72].
El control de las señales biofísicas y bioquímicas, el
entorno biofísico y una guía adecuada de diferenciación
de hESC son factores importantes en las células madre
cultivadas de forma adecuada.
Utilización de células madre y sus estándares de fabricación y
sistemas de cultivo.
La Agencia Europea de Medicamentos y la Administración de Alimentos y
Medicamentos han establecido pautas de Buenas Prácticas de Fabricación
(GMP) para un trasplante de células madre seguro y apropiado. En el
pasado, los protocolos utilizados para el trasplante de células madre
requerían productos derivados de animales [73].
El riesgo de introducir antígenos o patógenos animales provocó
una restricción en su uso. Debido a tales limitaciones, la técnica
requería una actualización obvia [74]. Ahora, es esencial utilizar
equivalentes libres de xeno cuando se establecen líneas celulares
que se derivan de embriones frescos y se cultivan a partir de
líneas de células alimentadoras humanas [75]. En este método, es
crucial reemplazar cualquier material no humano con
equivalentes libres de xeno [76].
NutriStem con LN-511, TeSR2 con laminina recombinante
humana (LN-511) y RegES con fibroblastos de prepucio
humano (HFF) son sistemas de cultivo libres de xeno de uso
común [33]. Hay muchas organizaciones e iniciativas
internacionales, como el Banco Nacional de Células Madre,
que proporcionan líneas de células madre para el tratamiento
o la investigación médica [77].
Uso de células madre en medicina
Las células madre tienen un gran potencial para convertirse en
uno de los aspectos más importantes de la medicina. Además del
hecho de que juegan un papel importante en el desarrollo de la
medicina restauradora, su estudio revela mucha información
sobre los eventos complejos que ocurren durante el desarrollo
humano.
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La diferencia entre una célula madre y una célula diferenciada
se refleja en las células.' ADN. En la primera célula, el ADN se
organiza libremente con genes activos. Cuando las señales
ingresan a la célula y comienza el proceso de diferenciación, los
genes que ya no son necesarios se desactivan, pero los genes
requeridos para la función especializada permanecerán activos.
Este proceso se puede invertir y se sabe que dicha pluripotencia
se puede lograr mediante la interacción en secuencias de genes.
Takahashi y Yamanaka [78] y Loh et al. [79] descubrió que el factor
de transcripción de unión al octamer 3 y 4 (Oct3 / 4), la región
determinante del sexo Y (SRY) -box 2 y los genes Nanog funcionan
como factores de transcripción centrales para mantener la
pluripotencia. Entre ellos, Oct3 / 4 y Sox2 son esenciales para la
generación de iPSC.
Muchas afecciones médicas graves, como defectos de nacimiento o
cáncer, son causadas por una diferenciación o división celular inadecuada.
Actualmente, son posibles varias terapias con células madre, entre las que
se encuentran los tratamientos para la lesión de la médula espinal, la
insuficiencia cardíaca [80], degeneración retiniana y macular [81], roturas de
tendones y diabetes tipo 1 [82]. La investigación con células madre puede
ayudar aún más a comprender mejor la fisiología de las células madre. Esto
puede resultar en la búsqueda de nuevas formas de tratar enfermedades
actualmente incurables.
Trasplante de células madre hematopoyéticas
Las células madre hematopoyéticas son importantes porque son, con
mucho, las células madre específicas de tejido mejor caracterizadas;
después de todo, se han estudiado experimentalmente durante más
de 50 años. Estas células madre parecen proporcionar un sistema de
modelo de paradigma preciso para estudiar células madre específicas
de tejido, y tienen potencial en la medicina regenerativa.
El trasplante de células madre hematopoyéticas
multipotentes (HSC) es actualmente la terapia con células
madre más popular. Las células diana suelen derivar de la
médula ósea, la sangre periférica o la sangre del cordón
umbilical [83]. El procedimiento puede ser autólogo (cuando
el paciente'se utilizan células propias), alogénicas (cuando la
célula madre proviene de un donante) o singénicas (de un
gemelo idéntico). Las HSC son responsables de la generación
de todos los linajes hematopoyéticos funcionales en sangre,
incluidos eritrocitos, leucocitos y plaquetas. El trasplante de
HSC resuelve problemas causados por un funcionamiento
inadecuado del sistema hematopoyético, que incluye
enfermedades como la leucemia y la anemia. Sin embargo,
cuando se toman en consideración las fuentes convencionales
de HSC, existen algunas limitaciones importantes. Primero,
hay un número limitado de células trasplantables y aún no se
ha encontrado una forma eficiente de recolectarlas. También
existe un problema para encontrar un donante compatible
con antígeno adecuado para el trasplante, y la contaminación
viral o cualquier inmunorreacción también provocan una
reducción de la eficacia en los trasplantes convencionales de
HSC. Debe reservarse el trasplante hematopoyético.
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para pacientes con enfermedades potencialmente mortales porque
tiene un carácter multifactorial y puede ser un procedimiento
peligroso. El uso de iPSC es crucial en este procedimiento. El uso de un
paciente'Las propias células somáticas no especializadas como células
madre proporcionan la mayor compatibilidad inmunológica y
aumentan significativamente el éxito del procedimiento.
Las células madre como objetivo de las pruebas farmacológicas
Las células madre se pueden usar en nuevas pruebas de drogas. Cada
experimento en tejido vivo se puede realizar de forma segura en células
diferenciadas específicas de células pluripotentes. Si aparece algún efecto
indeseable, las fórmulas de los medicamentos se pueden cambiar hasta que
alcancen un nivel suficiente de efectividad. El fármaco puede ingresar al
mercado farmacológico sin dañar a los probadores en vivo. Sin embargo,
para probar los medicamentos correctamente, las condiciones deben ser
iguales al comparar los efectos de dos medicamentos. Para lograr este
objetivo, los investigadores deben obtener el control total del proceso de
diferenciación para generar poblaciones puras de células diferenciadas.
Células madre como alternativa a la artroplastia
Uno de los mayores temores de los deportistas profesionales es
sufrir una lesión, que suele significar el final de su carrera
profesional. Esto se aplica especialmente a las lesiones de
tendones que, debido a las opciones de tratamiento actuales que
se centran en el tratamiento conservador o quirúrgico, a menudo
no proporcionan resultados aceptables. Los problemas con los
tendones comienzan con su capacidad de regeneración. En lugar
de regenerarse funcionalmente después de una lesión, los
tendones simplemente se curan formando tejidos cicatriciales que
carecen de la funcionalidad de los tejidos sanos. Los factores que
pueden causar esta respuesta de curación fallida incluyen
hipervascularización, depósito de materiales calcificados, dolor o
hinchazón [84]. Además, además de los problemas con los
tendones, existe una alta probabilidad de adquirir una condición
patológica de las articulaciones llamada osteoartritis (OA) [85]. La
OA es común debido a la naturaleza avascular del cartílago
articular y su baja capacidad regenerativa [86]. Aunque la
artroplastia es actualmente un procedimiento común en el
tratamiento de la OA, no es ideal para pacientes más jóvenes
porque pueden sobrevivir al implante y requerirán varios
procedimientos quirúrgicos en el futuro. Estas son situaciones en
las que la terapia con células madre puede ayudar al detener la
aparición de OA [87]. Sin embargo, estos procedimientos no están
bien desarrollados y el mantenimiento a largo plazo del cartílago
hialino requiere más investigación.
La osteonecrosis de la cadera femoral (ONFH) es una
enfermedad refractaria asociada con el colapso de la cabeza
femoral y el riesgo de artroplastia de cadera en poblaciones más
jóvenes [88]. Aunque la artroplastia total de cadera (ATC) tiene
éxito clínico, no es ideal para pacientes jóvenes, principalmente
debido a la vida útil limitada de la prótesis. Un número creciente
de estudios clínicos han evaluado el efecto terapéutico de las
células madre sobre ONFH. La mayoría de los autores
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demostró resultados positivos, con reducción del dolor,
mejora de la función o evitación de la ATC [89-91].
Rejuvenecimiento mediante programación celular
El envejecimiento es un proceso epigenético reversible. El primer
estudio de rejuvenecimiento celular se publicó en 2011 [92]. Las
células de las personas mayores tienen diferentes firmas
transcripcionales, altos niveles de estrés oxidativo, mitocondrias
disfuncionales y telómeros más cortos que en las células jóvenes [
93]. Existe la hipótesis de que cuando las células somáticas
adultas humanas o de ratón se reprograman a iPSC, su edad
epigenética se restablece virtualmente a cero [94]. Esto se basó en
un modelo epigenético, que explica que en el momento de la
fecundación, todas las marcas de envejecimiento parenteral se
borran del cigoto.'s genoma y su reloj de envejecimiento se pone
a cero [95].
En su estudio, Ocampo et al. [96] utilizó los genes Oct4, Sox2,
Klf4 y C-myc (genes OSKM) y afectó a las células del páncreas y del
músculo esquelético, que tienen poca capacidad regenerativa. Su
procedimiento reveló que estos genes también se pueden utilizar
para un tratamiento regenerativo eficaz [97]. El principal desafío
de su método fue la necesidad de emplear un enfoque que no
utilice animales transgénicos y no requiera una aplicación
indefinidamente larga. El primer abordaje clínico sería preventivo,
centrado en detener o ralentizar el ritmo de envejecimiento.
Posteriormente, se puede intentar el rejuvenecimiento progresivo
de los ancianos. En el futuro, este método puede plantear algunos
problemas éticos, como la superpoblación, lo que provocará una
menor disponibilidad de alimentos y energía.
Por ahora, es importante aprender a implementar la tecnología
de reprogramación celular en humanos y animales ancianos no
transgénicos para borrar las marcas del envejecimiento sin
eliminar las marcas epigenéticas de la identidad celular.
Terapias basadas en células
Se puede inducir a las células madre a convertirse en un tipo de
célula específico que se requiere para reparar tejidos dañados o
destruidos (Fig. 6). Actualmente, cuando la necesidad de tejidos y
órganos trasplantables supera el posible suministro, las células
madre parecen ser una solución perfecta para el problema. Las
afecciones más comunes que se benefician de dicha terapia son
las degeneraciones maculares [98], trazos [99], osteoartritis [89, 90
], enfermedades neurodegenerativas y diabetes [100]. Gracias a
esta técnica, es posible generar células del músculo cardíaco
sanas y luego trasplantarlas a pacientes con enfermedades
cardíacas.
En el caso de la diabetes tipo 1, las células productoras de
insulina en el páncreas se destruyen debido a una reacción
autoinmunológica. Como alternativa a la terapia de
trasplante, puede ser posible inducir a las células madre a
diferenciarse en células productoras de insulina [101].
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Figura 6 Experimentos con células madre en animales. Estos experimentos son uno de los muchos procedimientos que demostraron que las células madre son un factor crucial en

futura medicina regenerativa

Células madre y bancos de tejidos SHED puede ser útil para familiares cercanos del donante
Las células iPS con sus capacidades de propagación y diferenciación
teóricamente ilimitadas son atractivas para las ciencias presentes y futuras. Enfermedades de la fertilidad

Se pueden almacenar en un banco de tejidos para que sean una fuente
esencial de tejido humano utilizado para exámenes médicos. El problema
con las células de tejido diferenciado convencionales que se mantienen en el
laboratorio es que sus características de propagación disminuyen con el
tiempo. Esto no ocurre en las iPSC.
Se sabe que el cordón umbilical es rico en células madre
mesenquimales. Debido a su criopreservación inmediatamente
después del nacimiento, sus células madre se pueden almacenar y
utilizar con éxito en terapias para prevenir enfermedades futuras
potencialmente mortales de un paciente determinado.
[102] (Mesa 1). Las técnicas de recolección, aislamiento y
almacenamiento son simples y no invasivas. Entre las
ventajas de la banca, las celdas SHED están:
En 2011, dos investigadores, Katsuhiko Hayashi et al. [107],
mostró en un experimento con ratones que es posible formar
esperma a partir de iPSC. Lograron dar a luz crías sanas y
fértiles en ratones infértiles. El experimento también fue
exitoso para ratones hembra, donde las iPSC formaron
huevos completamente funcionales.
Los adultos jóvenes en riesgo de perder sus células madre
espermatogoniales (SSC), en su mayoría pacientes con cáncer, son el
principal grupo objetivo que puede beneficiarse del tejido testicular.
tabla 1 Tipos de células madre en dientes deciduos exfoliados
humanos
Tipo de cobertizo Papel en la medicina regenerativa Referencias

Adipocitos Regeneración del músculo cardíaco, prevención [169-171]

de enfermedades cardiovasculares, tratamiento
de afecciones de la columna y ortopédicas,
insuficiencia cardíaca congestiva, Crohn's
enfermedad
Autotrasplante de donante compatible garantizado que no
provoca reacción inmunitaria y rechazo de células [103] Sencillo Condrocitos Crecimiento de cartílago, adecuado [130, 172]
para trasplantes
e indoloro tanto para el niño como para los padres
Osteoblastos Tejidos óseos aptos para trasplante, [173, 174]
Menos de un tercio del costo del almacenamiento de sangre del cordón
crecimiento de dientes, defectos
umbilical No está sujeto a las mismas preocupaciones éticas que las células craneofaciales, regeneración ósea
madre embrionarias [104]
Reparación y restauración de lesiones mesenquimales de la médula espinal [103, 105, 121,
A diferencia de las células madre de la sangre del cordón umbilical, de sentimiento y movimiento en paralizado 170, 175]
las células SHED pueden regenerarse en tejidos sólidos como tejido pacientes, tratamiento de Alzheimer'sy Parkinson's
enfermedades
conectivo, neural, dental o óseo [105, 106]
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criopreservación y autotrasplante. Hay Eficaz
disponibles métodos de congelación para tejido testicular
adulto y prepuberal [108].
Qiuwan y col. [109] proporcionó evidencia importante de
que el trasplante de células epiteliales amnióticas humanas
(hAEC) podría mejorar eficazmente la función ovárica al
inhibir la apoptosis celular y reducir la inflamación en el tejido
ovárico lesionado de ratones, y podría ser una estrategia
prometedora para el tratamiento de la insuficiencia ovárica
prematura en hembras sobrevivientes de cáncer.
Por ahora, lograr tratamientos de infertilidad exitosos en
humanos parece ser solo una cuestión de tiempo, pero hay varios
desafíos que superar. Primero, el proceso debe tener una alta
eficiencia; en segundo lugar, las posibilidades de que se formen
tumores en lugar de óvulos o espermatozoides deben reducirse al
máximo. La última barrera es cómo madurar los espermatozoides
y los óvulos humanos en el laboratorio sin trasplantarlos a
condiciones in vivo, lo que podría causar un riesgo de tumor o un
procedimiento invasivo.
Terapia de enfermedades neurodegenerativas incurables
Gracias a la terapia con células madre, no solo es posible
retrasar la progresión de enfermedades neurodegenerativas
incurables como el Parkinson's enfermedad, Alzheimer's (EA)
y la enfermedad de Huntington, pero también, lo más
importante, para eliminar la fuente del problema. En
neurociencia, el descubrimiento de células madre neurales
(NSC) ha anulado la idea anterior de que el SNC adulto no era
capaz de neurogénesis [110, 111]. Las células madre neurales
son capaces de mejorar la función cognitiva en modelos
preclínicos de roedores con EA [112-114]. Awe et al. [115] iPSC
humanas relevantes clínicamente derivadas de biopsias
cutáneas para desarrollar un enfoque basado en células
madre neurales para el tratamiento de la EA. Degeneración
neuronal en Parkinson'La enfermedad (EP) es focal, y las
neuronas dopaminérgicas se pueden generar eficientemente
a partir de hESC. La EP es una enfermedad ideal para la
terapia celular basada en iPSC [116]. Sin embargo, esta
terapia aún se encuentra en fase experimental (https://
www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/ articles / PMC4539501/). Se
utilizó tejido cerebral de fetos abortados en pacientes con
Parkinson's enfermedad [117]. Aunque los resultados no
fueron uniformes, mostraron que las terapias con células
madre puras son una terapia importante y alcanzable.
Uso de células madre en odontología
Los dientes representan un material muy desafiante para
la medicina regenerativa. Son difíciles de recrear por su
función en aspectos como la articulación, la masticación o
la estética por su complicada estructura. Actualmente,
existe la posibilidad de que las células madre se utilicen
más ampliamente que los materiales sintéticos. Los
dientes tienen la gran ventaja de ser la fuente más natural
y no invasiva de células madre.
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Por ahora, sin el uso de células madre, los tratamientos
periodontológicos más comunes son factores de crecimiento, injertos
o cirugía. Por ejemplo, hay células madre en el ligamento periodontal [
118, 119], que son capaces de diferenciarse en osteoblastos o
cementoblastos, y sus funciones también fueron evaluadas en células
neurales [120]. La ingeniería de tejidos es un método exitoso para el
tratamiento de enfermedades periodontales. Las células madre de las
áreas apicales de la raíz pueden recrear el ligamento periodontal. Uno
de los posibles métodos de ingeniería de tejidos en periodoncia es la
terapia génica realizada utilizando factores de crecimiento que
contienen adenovirus [121].
Como resultado de estudios en animales, la regeneración de dentina es
un proceso efectivo que da como resultado la formación de puentes de
dentina [122].
El esmalte es más difícil de regenerar que la dentina.
Después de la diferenciación de las células de ameloblastoma
en el esmalte, el primero se destruye y la reparación es
imposible. Los estudios médicos han logrado diferenciar las
células madre de la médula ósea en ameloblastoma [123]. El
tejido dental sano tiene una gran cantidad de células madre
regulares, aunque este número se reduce cuando el tejido
está traumatizado o inflamado [124]. Hay varios grupos de
células madre dentales que se pueden aislar (Fig.7).
Célula madre de la pulpa dental (DPSC) Estas fueron las primeras
células madre dentales aisladas de la pulpa dental humana, que
fueron [125] ubicado dentro de la pulpa dental (Tabla 2). Tienen
potencial osteogénico y condrogénico. Las células madre
mesenquimales (MSC) de la pulpa dental, cuando se aíslan,
parecen altamente clonogénicas; pueden aislarse de tejido adulto
(p. ej. médula ósea, tejido adiposo) y fetal (p. ej. cordón umbilical) [
126] tejido, y son capaces de diferenciar densamente [127]. Las
CMM se diferencian en células similares a odontoblastos y
osteoblastos para formar dentina y hueso. Sus mejores
ubicaciones de origen son los terceros molares [125]. Las DPSC
son la fuente dental más útil de ingeniería de tejidos debido a su
fácil acceso quirúrgico, posibilidad de criopreservación, mayor
producción de tejidos de dentina en comparación con las células
madre no dentales y sus capacidades antiinflamatorias. Estas
células tienen el potencial de ser una fuente para
reconstrucciones maxilofaciales y ortopédicas o reconstrucciones
incluso más allá de la cavidad bucal. Las DPSC son capaces de
generar todas las estructuras del diente desarrollado [128]. En
particular, se pueden lograr resultados beneficiosos en el uso de
DPSC cuando se combinan con otras terapias nuevas, como la
fotobiomodulación del tejido periodontal (estimulación con láser),
que es una técnica eficaz en la estimulación de la proliferación y la
diferenciación en distintos tipos de células [129]. Se puede inducir
a las DPSC para que formen células neurales que ayuden a tratar
los déficits neurológicos.
Las células madre de los dientes deciduos exfoliados humanos
(SHED) tienen una tasa de proliferación más rápida que las DPSC y
se diferencian en un número aún mayor de células.
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Figura 7 Localización de células madre en tejidos dentales. Las células madre de la pulpa dental (DPSC) y las células madre de los dientes deciduos humanos (SHED) se encuentran en la pulpa dental.

Las células madre de los ligamentos periodontales se encuentran en el ligamento periodontal. La papila apical consta de células madre de la papila apical (SCAP)

por ejemplo, otros derivados de células madre mesenquimales y
no mesenquimales, como las células neurales [130]. Estas células
poseen una gran desventaja: forman in vivo un complejo no
completo de dentina / pulpa. Los SHED no sufren las mismas
preocupaciones éticas que las células madre embrionarias. Tanto
las DPSC como las SHED pueden formar tejidos similares a huesos
in vivo [131] y se puede utilizar para la regeneración periodontal,
dentinaria o pulpar. Las DPSC y las SHED se pueden utilizar para
tratar, por ejemplo, los déficits neuronales [132]. Las DPSC solas
se probaron y aplicaron con éxito para la reconstrucción del
hueso alveolar y la mandíbula [133].
Células madre del ligamento periodontal (PDLSC) Estas células se
utilizan en la regeneración de tejido de cemento o ligamento
periodontal. Pueden diferenciarse en linajes de células mesenquimales
para producir células formadoras de colágeno, adipocitos, tejido de
cemento, Sharpey.'s fibras y células similares a osteoblastos in vitro.
Los PDLSC existen tanto en la raíz como en el alveolar.
superficies óseas; sin embargo, en el último, estas células tienen
mejores capacidades de diferenciación que en el primero [134].
Los PDLSC se han convertido en el primer tratamiento para la
terapia de regeneración periodontal debido a su seguridad y
eficiencia [135, 136].
Células madre de la papila apical (SCAP) Estas células son
estructuras mesenquimales ubicadas dentro de raíces inmaduras.
Se aíslan de la papila apical permanente inmadura humana. SCAP
son la fuente de odontoblastos y causan apexogénesis. Estas
células madre pueden inducirse in vitro para formar células
similares a odontoblastos, células similares a neuronas o
adipocitos. Las SCAP tienen una mayor capacidad de proliferación
que las DPSC, lo que las convierte en una mejor opción para la
regeneración de tejidos [137, 138].
Células madre del folículo dental (DFC) Estas células son tejidos
conectivos laxos que rodean al germen del diente en desarrollo.

Tabla 2 Información detallada sobre la diferenciación de las DPSC y los estudios relacionados con ellas [176]
Tipo de célula Tiempo Estrategia de diferenciación Métodos de detección Referencias

Ectodermo Células odontogénicas 4-8 semanas Implantación subcutánea En vivo [177-181]

Osteocitos de células neurales 15 días Factor inductor In vitro [182]

Mesodermo y de Schwann 3 semanas Inductor de factores In vitro [183]

Osteoblastos 3 meses Inductor de factores In vitro [184-186]

Adipocitos 3 semanas Inductor de factores In vitro [187-189]

Células miogénicas 1 mes Inductor de factores In vitro [190]

Células condrogénicas 3 semanas Co-cultivo inductor de factor con In vitro [191-196]

condrocitos costales humanos

Melanocitos 120 días Inductor de factores In vitro [197]

Entoderm Celulas hepáticas 40 días Inductor de factores In vitro [198, 199]

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Las DFC contienen células que pueden diferenciarse en
cementoblastos, osteoblastos y células del ligamento periodontal [139,
140]. Además, estas células proliferan incluso después de más de
30 pases [141]. Los DFC se extraen con mayor frecuencia del saco
de un tercer molar. Cuando los DFC se combinan con una matriz
de dentina tratada, pueden formar un tejido similar a una raíz con
un complejo pulpa-dentina y, finalmente, formar raíces dentales [
141]. Cuando las láminas DFC son inducidas por Hertwig's células
de la vaina de la raíz epitelial, pueden producir tejido periodontal;
por lo tanto, los DFC representan un material muy prometedor
para la regeneración dental [142].
Regeneración pulpar en endodoncia
Las células madre de la pulpa dental pueden diferenciarse en
odontoblastos. Existen pocos métodos que permitan la
regeneración de la pulpa.
El primero es un método ex vivo. Las células madre
adecuadas se cultivan en un andamio antes de implantarse
en el canal de la raíz [143].
El segundo es un método in vivo. Este método se centra en
inyectar células madre en los canales de la raíz desinfectados
después de la apertura del ápice in vivo. Además, es necesario
el uso de un andamio para evitar el movimiento de células
hacia otros tejidos. Por ahora, solo se han creado con éxito
estructuras similares a la pulpa.
Los métodos para colocar células madre en el canal de la raíz
constituyen un andamio blando [144] o la aplicación de células
madre en apexogénesis o apexificación. Los dientes inmaduros
son la mejor fuente [145]. La regeneración de la red de nervios y
vasos sanguíneos es extremadamente vital para mantener sano el
tejido pulpar.
El potencial de las células madre dentales se relaciona
principalmente con la regeneración de la dentina y la pulpa
dañadas o la reparación de cualquier perforación; en el futuro,
parece incluso posible generar el diente completo. Un éxito tan
inmenso conduciría a la sustitución gradual de los tratamientos
con implantes. Los defectos mandibulares y maxilares pueden ser
uno de los problemas dentales más complicados que deben
abordar las células madre.
Adquirir células de tejido no dental mediante diferenciación de células
madre dentales
En 2013, se informó que es posible hacer crecer los dientes a
partir de células madre obtenidas extraoralmente, por ejemplo,
de la orina [146]. Se indujeron células madre pluripotentes
derivadas de orina humana y se generaron estructuras similares a
dientes. Las propiedades físicas de las estructuras eran similares a
las naturales excepto por la dureza [127]. No obstante, parece ser
una técnica muy prometedora porque no es invasiva y tiene un
costo relativamente bajo, y se pueden usar células somáticas en
lugar de células embrionarias. Más importante aún, las células
madre derivadas de la orina no formaron ningún tumor y el uso
de células autólogas reduce las posibilidades de rechazo [147].
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Uso de grafeno en terapia con células madre
En los últimos años, el grafeno y sus derivados se han utilizado cada
vez más como materiales de andamiaje para mediar en el crecimiento
y la diferenciación de las células madre [148]. Tanto el grafeno como el
óxido de grafeno (GO) representan una alta rigidez en el plano [149].
Debido a que el grafeno tiene una red aromática y de carbono,
funciona de forma covalente o no covalente con biomoléculas; Además
de sus propiedades mecánicas superiores, el grafeno ofrece una
química versátil. El grafeno presenta biocompatibilidad con las células
y su adecuada adhesión. También probó positivamente para mejorar
la proliferación o diferenciación de células madre [148]. Después de
experimentos positivos, el grafeno reveló un gran potencial como
andamiaje y guía para linajes específicos de diferenciación de células
madre [150]. El grafeno se ha utilizado con éxito en el trasplante de
hMSC y su diferenciación guiada a células específicas. También se
investigaron las habilidades de aceleración de la diferenciación y
división del grafeno. Se descubrió que el grafeno puede servir como
una plataforma con una mayor adhesión tanto para los factores de
crecimiento como para los productos químicos de diferenciación.
También se descubrió queπ-π la unión fue responsable de una mayor
adhesión y jugó un papel crucial en la inducción de la diferenciación de
hMSC [150].
Potencial terapéutico de las terapias basadas en vesículas
extracelulares
Las vesículas extracelulares (VE) pueden ser liberadas por
prácticamente todas las células de un organismo, incluidas las células
madre [151], y participan en la comunicación intercelular a través de la
entrega de sus ARNm, lípidos y proteínas. Como Oh et al. [152]
prueban, las células madre, junto con sus factores paracrinos.-
exosomas-pueden convertirse en agentes terapéuticos potenciales en
el tratamiento de, por ejemplo, el envejecimiento de la piel. Los
exosomas son pequeñas vesículas de membrana secretadas por la
mayoría de las células (30-120 nm de diámetro) [153]. Cuando los
endosomas se fusionan con la membrana plasmática, se convierten en
exosomas que tienen ARN mensajeros (ARNm) y microARN (miARN),
algunas clases de ARN no codificantes (IncRNA) y varias proteínas que
se originan en la célula huésped [154]. Los incRNA pueden unirse a loci
específicos y crear reguladores epigenéticos, lo que conduce a la
formación de modificaciones epigenéticas en las células receptoras.
Debido a esta característica, se cree que los exosomas están
implicados en la comunicación de célula a célula y en la progresión de
enfermedades como el cáncer [155]. Recientemente, muchos estudios
también han demostrado el uso terapéutico de exosomas derivados
de células madre, por ejemplo, daños en la piel y lesiones renales o
pulmonares [156].
En el envejecimiento de la piel, el factor más importante es la
exposición a la luz ultravioleta, denominada "fotoenvejecimiento"[157],
que causa daño cutáneo extrínseco, caracterizado por sequedad,
aspereza, pigmentación irregular, lesiones y cánceres de piel. En el
envejecimiento cutáneo intrínseco, por otro lado, la pérdida de
elasticidad es un rasgo característico. La dermis de la piel está formada
por fibroblastos, que son responsables de la síntesis de
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elementos cruciales de la piel, como procolágeno o fibras
elásticas. Estos elementos forman los componentes básicos de la
matriz extracelular del marco de la dermis de la piel o juegan un
papel importante en la elasticidad del tejido. La eficiencia y
abundancia de fibroblastos disminuyen con el envejecimiento [158
]. Las células madre pueden promover la proliferación de
fibroblastos dérmicos al secretar citocinas como el factor de
crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento
transformante.β (TGF-β), y factor de crecimiento de fibroblastos
básico. Huh y col. [159] mencionó que un medio de células madre
derivadas del líquido amniótico humano (hAFSC) afectó
positivamente la regeneración de la piel después de la radiación
ultravioleta de onda larga (UVA, 315-400 nm) fotoenvejecimiento
aumentando la proliferación y migración de fibroblastos
dérmicos. Se descubrió que, además de la inducción de la
fisiología de los fibroblastos, el trasplante de hAFSC también
mejoraba las enfermedades en casos de patología renal, varios
cánceres o accidentes cerebrovasculares [160, 161]. Oh [162]
también presentó otra opción para el tratamiento de heridas en la
piel, ya sea por daño físico o por úlceras diabéticas. El medio
acondicionado con células madre pluripotentes inducidas (iPSC-
CM) sin ningún componente derivado de animales indujo la
proliferación y migración de fibroblastos dérmicos.
La cicatrización natural de heridas cutáneas se divide en tres
pasos: hemostasia / inflamación, proliferación y remodelación.
Durante el paso crucial de la proliferación, los fibroblastos migran
y aumentan en número, lo que indica que es un paso crítico en la
reparación de la piel, y factores como iPSC-CM que lo impactan
pueden mejorar todo el proceso de cicatrización de la herida
cutánea. Las acciones paracrinas realizadas por las iPSC también
son importantes para este efecto terapéutico [163]. Estas acciones
dan como resultado la secreción de citocinas como TGF-β,
interleucina (IL) -6, IL-8, proteína quimiotáctica de monocitos 1
(MCP-1), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor
de crecimiento derivado de plaquetas-AA (PDGF-AA) y factor de
crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) ). Bae y col. [164]
mencionó que TGF-β indujo la migración de queratinocitos.
También se demostró que los factores iPSC pueden mejorar la
cicatrización de heridas en la piel in vivo e in vitro cuando Zhou et
al. [165] mejoró la cicatrización de heridas, incluso después de la
rejuvenecimiento con láser de dióxido de carbono en un estudio
in vivo. Peng y col. [166] investigó los efectos de los EV derivados
de las hESC en células de Müller progenitoras de la glía
retiniana cultivadas in vitro, que se sabe que se diferencian en
neuronas retinianas. Los EV parecen de tamaño heterogéneo y
pueden ser internalizados por células de Müller cultivadas, y sus
proteínas están involucradas en la inducción y mantenimiento de
la pluripotencia de las células madre. Estas vesículas derivadas de
células madre fueron responsables de la transdiferenciación
neuronal de células de Müller cultivadas expuestas a ellas. Sin
embargo, el artículo de investigación señala que el procedimiento
se logró solo en la retina adquirida in vitro.
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Desafíos relacionados con la terapia con células madre
Aunque las células madre parecen ser una solución ideal para la
medicina, todavía existen muchos obstáculos que deben
superarse en el futuro. Uno de los primeros problemas es la
preocupación ética.
Las células madre pluripotentes más comunes son las ESC.
Las terapias relativas a su uso en sus inicios fueron, y siguen
siendo, fuente de conflictos éticos. La razón detrás de esto
comenzó cuando, en 1998, los científicos descubrieron la
posibilidad de eliminar las ESC de embriones humanos. La
terapia con células madre pareció ser muy eficaz en el
tratamiento de muchas enfermedades, incluso antes
incurables. El problema fue que cuando los científicos aislaron
las ESC en el laboratorio, el embrión, que tenía potencial para
convertirse en humano, fue destruido (Fig.8). Debido a esto,
los científicos, al ver un gran potencial en este método de
tratamiento, centraron sus esfuerzos en hacer posible aislar
las células madre sin poner en peligro su origen.-el embrión.
Por ahora, aunque las hESC siguen siendo una fuente de células
éticamente discutible, son herramientas potencialmente
poderosas que se pueden utilizar para aplicaciones terapéuticas
de regeneración de tejidos. Debido a la complejidad de los
sistemas de control de células madre, aún queda mucho por
aprender a través de las observaciones in vitro. Para que las
células madre se conviertan en un procedimiento popular y
ampliamente accesible, se debe evaluar el riesgo de tumor. El
segundo problema es lograr una tolerancia inmunológica exitosa
entre las células madre y el paciente.'s cuerpo. Por ahora, una de
las mejores ideas es utilizar al paciente's propias células y las
devuelven a su etapa pluripotente de desarrollo.
Las células nuevas deben tener la capacidad de reemplazar
completamente las células naturales perdidas o que funcionan
mal. Además, existe preocupación por la posibilidad de obtener
células madre sin riesgo de morbilidad o dolor para el paciente o
el donante. La proliferación incontrolada y la diferenciación de
células después de la implementación también deben evaluarse
antes de su uso en una amplia variedad de procedimientos
regenerativos en pacientes vivos [167].
Uno de los argumentos que limitan el uso de las iPSC es su
infame papel en la tumorigenicidad. Existe el riesgo de que la
expresión de oncogenes aumente cuando se reprograman las
células. En 2008, se descubrió una técnica que permitió a los
científicos eliminar oncogenes después de que una célula
alcanzara la pluripotencia, aunque aún no es eficiente y
requiere más tiempo. El proceso de reprogramación puede
mejorarse mediante la eliminación del gen supresor de
tumores p53, pero este gen también actúa como un
regulador clave del cáncer, lo que hace que sea imposible de
eliminar para evitar más mutaciones en la célula
reprogramada. La baja eficiencia del proceso es otro
problema, que se va reduciendo progresivamente año tras
año. Al principio, la tasa de reprogramación de células
somáticas en Yamanaka's estudio fue de hasta 0,1%. El uso de
factores de transcripción crea un riesgo de
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Figura 8 Uso de células madre pluripotentes de masa celular interna y su estimulación para diferenciarse en los tipos celulares deseados
inserción y posterior mutación del genoma de la célula diana.
Por ahora, la única operación éticamente aceptable es una
inyección de hESCs en embriones de ratón en el caso de la
evaluación de pluripotencia [168].
Obstáculos de células madre en el futuro
Los avances científicos y médicos pioneros siempre deben
vigilarse cuidadosamente para garantizar que sean éticos y
seguros. Debido a que la terapia con células madre ya tiene un
gran impacto en muchos aspectos de la vida, no debe tratarse de
manera diferente.
Actualmente, existen varios desafíos relacionados con las células
madre. Primero, el más importante se trata de comprender
completamente el mecanismo por el cual las células madre funcionan
primero en modelos animales. Este paso no se puede evitar. Para la
aceptación generalizada y mundial del procedimiento, el miedo a lo
desconocido es el mayor desafío a superar.
La eficiencia de la diferenciación dirigida por células madre debe
mejorarse para que las células madre sean más fiables y dignas de
confianza para un paciente habitual. La escala del procedimiento es
otro desafío. Las futuras terapias con células madre pueden ser un
obstáculo importante. El trasplante de órganos nuevos y
completamente funcionales fabricados mediante terapia con células
madre requeriría la creación de millones de células cooperantes
funcionales y biológicamente precisas. Llevar procedimientos tan
complicados a la medicina regenerativa generalizada y generalizada
requerirá una colaboración interdisciplinaria e internacional.
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La identificación y el aislamiento adecuado de las células madre de
un paciente.'s tejidos es otro desafío. El rechazo inmunológico es una
barrera importante para el éxito del trasplante de células madre. Con
ciertos tipos de células madre y procedimientos, el sistema
inmunológico puede reconocer las células trasplantadas como cuerpos
extraños, lo que desencadena una reacción inmunológica que da
como resultado el trasplante o el rechazo celular. Una de las ideas que
pueden hacer que las células madre sean un"a prueba de fallos"
se trata de implementar una opción de autodestrucción si se
vuelven peligrosos. Un mayor desarrollo y versatilidad de las
células madre pueden reducir los costos de tratamiento para las
personas que padecen enfermedades actualmente incurables.
Cuando se enfrenta a una insuficiencia orgánica determinada, en
lugar de someterse a un tratamiento farmacológico
extraordinariamente costoso, el paciente podría utilizar la terapia
con células madre. El efecto de una operación exitosa sería
inmediato y el paciente evitaría el tratamiento farmacológico
crónico y sus inevitables efectos secundarios.
Aunque estos desafíos a los que se enfrenta la ciencia de las
células madre pueden ser abrumadores, el campo está logrando
grandes avances cada día. La terapia con células madre ya está
disponible para tratar varias enfermedades y afecciones. Su
impacto en la medicina del futuro parece ser significativo.
Conclusión
Después de varias décadas de experimentos, la terapia con células madre se
está convirtiendo en un magnífico cambio de juego para la medicina.
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Con cada experimento, las capacidades de las células madre
aumentan, aunque todavía quedan muchos obstáculos por superar.
Independientemente, la influencia de las células madre en la medicina
regenerativa y la transplantología es inmensa. Actualmente, las
enfermedades neurodegenerativas intratables tienen la posibilidad de
volverse tratables con terapia con células madre. La pluripotencia
inducida permite el uso de un paciente's propias células. Los bancos
de tejidos son cada vez más populares, ya que recolectan células que
son la fuente de la medicina regenerativa en una lucha contra las
enfermedades presentes y futuras. Con la terapia con células madre y
todos sus beneficios regenerativos, estamos en mejores condiciones
de prolongar la vida humana que en cualquier otro momento de la
historia.
Abreviaturas
bFGF: Factor de crecimiento de fibroblastos básico; BMP: proteínas morfogénicas óseas; DFC:
células madre de folículos dentales; DPSC: células madre de la pulpa dental; EB: cuerpos
embrionarios; ESC: células madre embrionarias; FGF: factores de crecimiento de fibroblastos; BPF:
Buenas prácticas de fabricación; GO: óxido de grafeno; hAFSC: células madre derivadas del líquido
amniótico humano; HESC: células madre embrionarias humanas; HFF: fibroblastos de prepucio
humano; ICM: masa celular interna; IncRNA: ARN no codificante; iPSC: células madre pluripotentes
inducidas; FIV: Fecundación in vitro; KOSR: reemplazo de suero Knockout; LIF: factor inhibidor de
la leucemia; MCP-1: proteína quimiotáctica 1 de monocitos; MEF: fibroblastos;
ARNm: ARN mensajero; MSC: células madre mesenquimales de la pulpa dental; Myod1:
diferenciación miogénica; OA: osteoartritis; Oct3 / 4: factor de transcripción de unión a
octamer 3 y 4; PDGF: factor de crecimiento derivado de plaquetas; PDGF-AA: factor de
crecimiento derivado de plaquetas-AA; PDLSC: células madre del ligamento periodontal;
ROCK: proteína quinasa asociada a Rho; SCAP: células madre de la papila apical; SHED:
Células madre de dientes deciduos exfoliados humanos; SSS: sustituto de suero sintético;
TE: trofectodermo; VEGF: factor de crecimiento endotelial vascular;β (TGFβ):
Transformando los factores de crecimiento
Agradecimientos
No aplica.
Fondos
Este trabajo es apoyado por Wrocław Universidad de Medicina de Polonia.
Disponibilidad de datos y materiales
Comuníquese con el autor para solicitudes de datos.
Autores' contribuciones
WZ es el autor principal y fue responsable del primer borrador del
manuscrito. WZ y ZR fueron responsables del concepto de la revisión. SRA,
MD y ZR fueron responsables de la revisión del artículo y de la adquisición de datos.
Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.
Aprobación ética y consentimiento para participar
No aplica.
Consentimiento para la publicación
No aplica.
Conflicto de intereses
Los autores declaran que no tienen intereses en competencia.
Editor's Nota
Springer Nature permanece neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales
en mapas publicados y afiliaciones institucionales.
Detalles del autor
1Departamento de Investigación de Biomateriales y Cirugía Experimental, Universidad
Médica de Wroclaw, Bujwida 44, Wrocław 50-345, Polonia. 2Departamento de
Odontología Conservadora y Pedodoncia, Krakowska 26, Wrocław 50-425, Polonia.
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