Producción de Tubérculos-Semillas de Papa Manual de Capacitación

Fascículo4.2

Cultivo de Tejidos para la Eliminación de Patógenos con fines de Producción de Semilla de Papa
Ana Panta, Ali Golmirzaie

Introducción
Los patógenos vegetales, tales como nematodos, hongos, bacterias, micoplasmas, virus y viroides pueden ser transmitidos de plantas enfermas y plantas sanas de papa. Sin embargo, no todas as células resultan infectadas; los tejidos meristemáticos se encuentran algunas veces libres de patógenos por lo que es posible recobrar plantas no infectadas mediante técnicas de cultivo de meristemas in vitro, y lograr su crecimiento coma plantas sanas. La termoterapia, tratamiento de las plantas y temperaturas altas, también se aplica en la erradicación de virus. Desde hace muchos años se utiliza con éxito en la erradicación de virus de claveles, geranios, fresas y cítricos; para ella, las plantas son tratadas y temperaturas altas bajo condiciones de invernadero o cámara de crecimiento. Actualmente el método estándar para erradicar virus en muchos cultivos propagados vegetativamente es la termoterapia combinada con el cultivo de meristemas.

S. • Fasc. 4.2 - 97 • 1

CENTRO INTERNACIONAL DE LA PAPA (CIP)

por tanto. No todas las células en una planta enferma llegan y ser infectadas con patógenos. La ocurrencia de una enfermedad no sólo depende de la presencia del huésped. el patógeno y el ambiente.2 . el virus del enrollamiento de la hoja de la papa (PLRV) y los micoplasmas están restringidos al tejida vascular de una planta.97 • 2 CENTRO INTERNACIONAL DE LA PAPA (CIP) . libres de ellos.Este documento describe los métodos que pueden aplicarse para eliminar los patógenos del material infectado y producir plantas “libres de patógenos. Los virus que se ubican tan solo en el floema (PLRV) no pueden invadir los tejidos meristemáticos debido y la ausencia de diferenciación celular. algunas veces. solamente la cúpula y los primeros primordios foliares se encuentran libres de virus. para la distribución internacional y propagación en programas de producción de semillas de papa. Naturaleza de los Patógenos Los patógenos que afectan y la papa pueden ser transmitidos de plantas enfermas y plantas sanas por vectores y través de la semilla. Debido y la gran actividad metabólica en las células meristemáticas del huésped. los virus que infectan los tejidos no vasculares se diseminan de célula y célula y través de los conductos intercelulares (plasmodesmos). • Fasc. los virus no pueden tornar el control de la maquinaria biosintética del mismo. El tamaño relativo de estos patógenos varia mucho. Los virus y viroides son los más pequeños y se requiere de la ayuda de un microscopio electrónico para su observación. Por ejemplo. Alta concentración de auxinas: Los tejidos meristemáticos de las plantas tienen una concentración S. Pseudomonas solanacearum. 4. Este es un proceso lento por lo quo resulta relativamente difícil que los virus infecten en su totalidad y las células que vienen dividiéndose rápidamente. En esta zona meristemática. sin embargo. se cree que uno ó más de los siguientes factores podrían ser responsables de ello: Alta actividad metabólica: Los virus se multiplican acompañando el curso del metabolismo del huésped. Entre los patógenos vegetales los nematodos son los más grandes y pueden ser observados fácilmente con un microscopio estereoscópico. especialmente la humedad y la temperatura que juegan un papel importante en el desarrollo de una enfermedad. En algunas ocasiones. La distribución de los diferentes patógenos dentro de y planta enferma varia también mucha. sino también de las condiciones ambientales. Carencia de tejido vascular: Los virus se diseminan rápidamente y través del sistema vascular. Se desconoce la razón exacta de este problema. Los tejidas meristemáticos de la raíz y brotes terminales de una planta infectada están. La enfermedad. Erwinia carotovora y el virus X de la papa (PVX). invaden tanto el tejido vascular coma el resto de los tejidos de la planta. tal como sucede en la papa con el PVX y el TRV (Tobacco Rattle Virus). puede definirse coma el producto de y interacción del huésped.

y las yemas axilares se encuentran creciendo mientras reciben el tratamiento de calor Un régimen de temperatura diana de 3600 por 16 horas. baja luz continua de alta intensidad (10000 lux = 108 mEm-2s-1) mejoró las tasas de eliminación de virus.2 . Meristemas. tan solo utilizando termoterapia. Termoterapia Experimentos llevados y cabo con huéspedes y sus virus han demostrado que el tratamiento de plantas con temperaturas elevadas (termoterapia) lleva y una reducción en la concentración del virus en la planta (Kassanis. La termoterapia aplicada y la planta entera.97 • 3 CENTRO INTERNACIONAL DE LA PAPA (CIP) . sometiéndolas luego al tratamiento de termoterapia antes mencionado. 1977]. Posiblemente no es solo una. et al. Se han dado diferentes explicaciones para este fenómeno. Entre estas explicaciones está la de la competencia entre las células del huésped que se encuentran en proceso de rápida división y las partículas del virus por lugares de síntesis de ácidos nucleicos y proteínas lo cual puede llevar y un cambio en el balance entre la síntesis y degradación de las partículas del virus. et al. especialmente del virus del enrollamiento de la hoja (PLRV). lo que inactive al virus y disminuye la concentración del mismo..más alta de auxinas que los tejidos de otras partes de las mismas. portador de su información genética. coma de las yemas apicales. 1991). Al cabo de un mes. Las plantas son mantenidas baja estas condiciones por cuatro semanas. y permitir el ataque de las nucleasas. 1957. al igual que y aplicada y tubérculos ya brotados. la unión entre estas subunidades se vuelve más débil. A altas temperaturas. seguida por cultivo de meristemas. Otra es y del ácido nucleico del virus. los mejores resultados se han obtenido cuando la planta es decapitada antes de ser tratada por termoterapia. La termoterapia antes descrita se puede aplicar y plántulas in vitro. Las cajas se incuban baja las condiciones antes reportadas (Espinoza. son aisladas y cultivadas coma se muestra más adelante. y mantenerlos hasta S. 1970:Pennazio y Redolfi. es posible recobrar plantas no infectadas mediante técnicas de cultivo de meristemas in vitro. sino una combinación de ellas la responsable de y reducción en la concentración de virus. 4. En el procedimiento estándar empleado en el CIP. 1973). se pueden abrir aberturas temporales. Algunos autores indican que estas auxinas inhiben y multiplicación de los virus. Nudos (20 nudos/caja) con una yema se colocan en cajas de plástico (Magenta GA-7) que contienen medio semisólido de propagación (Espinoza. tanto de las yemas axilares. Quak. Se ha observado una reducción en la concentración de virus. ha sido exitosamente utilizada para la eliminación de muchos virus de y papa (StaceSmith y Mellor. los meristemas apicales se aislan y siembran en un medio de cultivo apropiado. Cultivo de Meristemas Debido y quo los tejidos meristemáticos algunas veces se encuentran libros de patógenos. Las cajas son selladas con cinta adhesiva cuando las plantas alcanzan aproximadamente 3 cm de altura y presentan un buen sistema radicular. este está protegido del ataque de enzimas degradantes por una cubierta compuesta de muchas subunidades de proteína. La termoterapia ha sido aplicada y tubérculos de papa en reposo. • Fasc. habiéndose logrado eliminación total de este virus. 1991). y 30 C por 8 horas.

2 . se recomiendan el lavado en una mezcla S. Es un agente esterilizador común de la superficie para eliminar bacterias y hongos. la escisión y aislamiento del meristema. 4. Luego del tratamiento con hipoclorito. Estas productas comerciales contienen normalmente 5. Etanol de 70% es más efectiva cama agente esterilizador que el de 95-100%. • Fasc. Muchas laboratorios utilizan lejía (hipoclorito de sodio) de uso doméstico tal como el Clorox. La solución de bicloruro de mercurio es volátil y temperatura ambiente y puede provocar un envenenamiento por mercurio. Por lo tanto: no recomendamos su uso como agente esterilizador! Bactericidas y fungicidas. El bicloruro de mercurio (HgCl2) ha sido utilizado coma desinfectante pese y que es extremadamente toxica. Para material altamente contaminado.0 y es más efectiva fijando la solución y alrededor de pH 6. la solución esterilizadora normalmente se aplica por 10-15 minutas. La mayoría de las contaminantes de la superficie del tejida. Bicloruro de mercurio. Esterilización de superficie. La sal de calcio es preferida porque es menos fitotóxica. para eliminar completamente el desinfectante. El lavada es muy importante para eliminar el exceso del agente esterilizador el cual puede inhibir el crecimiento de la planta. La superficie del tejido recientemente disecado y sumergido completamente en la solución de hipoclorito (de Ca ó Na). y su cultivo en un medio baja condiciones adecuadas. y frecuentemente es utilizada para un lavado breve (30’) antes de aplicar otros tratamientos de esterilización de superficie.0.obtener plantas adultas sanas. ésta es eliminada y el material vegetal lavado por agitación en agua destilada estéril 3 d 4 veces durante 5 minutas cada vez . Es necesaria esterilizar y superficie del material vegetal en case esté. La superficie del material vegetal también puede ser esterilizada con soluciones acuosas de hipoclorito de sodio (NaOCl) y de hipoclorito de calcio (CaOCl).97 • 4 CENTRO INTERNACIONAL DE LA PAPA (CIP) . El cultivo de meristemas incluye un proceso de esterilización de superficie. pueden ser eliminados del material vegetal utilizando un agente esterilizador apropiada. el material tratado debe ser lavada cuidadosamente con varios cambios de agua destilada. Tiene una baja tensión superficial por la cual puede penetrar fácilmente entre las pilosidades foliares y mojar la superficie de la planta. la solución esterilizadora resultante debe contener no menos de 05% de NaOCl. Alcohol (etanol).25% de NaOCl coma producta active. queda esterilizada después de una exposición de 10-15 minutes. Baja condiciones asépticas. 1. Debido y la disociación completa. el hipoclorito tiene una actividad relativamente baja y un pH superior y 8. contaminada con patógenos y saprofitas dada que algunas de as contaminantes crecen rápidamente y pueden matar al tejido y órgano (explante) de la planta sembrada en un medio de cultivo. Hipoclorito de sodio o de calcio. Cuando se es diluye con agua (1 parte de lejía 9 partes de agua). Cuando el material vegetal proviene de in vitro no es necesaria la esterilización de superficie.

Esta es una de las razones principales del porqué. • Fasc. El aislamiento del punto meristemático en condiciones asépticas y su cultivo en un medio nutritivo aséptico. Aislamiento y cultivo de meristemas. pueden llegar a la zona meristemática del ápice sólo moviéndose lentamente de célula en célula. los elementos vasculares de los primordios foliares son incipientes. Es una zona pequeña compuesta de células (meristemáticas) dividiéndose rápidamente. La disección aséptica del meristema es un proceso delicado y requiere muchas horas de práctica. en una planta infectada la concentración de los virus disminuye desde la base hacia los meristemas tanto del ápice como de las yemas axilares. El desarrollo del meristema en condiciones in vitro se lleva acabo en forma similar al que se realiza en una planta normal. Debe recordarse.97 • 5 CENTRO INTERNACIONAL DE LA PAPA (CIP) . El meristema es el punto activo de crecimiento del ápice de la planta. 2. El domo de la yema apical contiene las verdaderas células meristemáticas V está rodeada por primordios foliares y hojas primarias.comercial bactericida / fungicida antes de proceder a la esterilización de su superficie. las partículas de virus que puedan estar presentes en el sistema vascular. 4. Debido a que los tejidos vasculares más diferenciados se encuentran alejados de los meristemas (hacia los tejidos más viejos del tallo). La nutrición de los tejidos de la sección disecada es proporcionada por el medio artificial. sin embargo. permite el desarrollo de plántulas. S. Por lo tanto. que este tratamiento no tiene efecto sobre infecciones sistémicas. Las células del meristema se dividen y continua la diferenciación de tejidos nuevos.2 . y no han hecho aún contacto con la parte principal del sistema vascular en el tallo.

El medio de cultivo utilizado para este trabajo esta basado en las sales de Murashige y Skoog (1962) y S. 4. se eliminan las hojuelas que rodean el punto de crecimiento hasta que solamente quede la cúpula de la yema apical y unos cuantos primordios foliares (generalmente dos). 4. El meristema disecado se transfiere semanalmente a medio fresco.2 .97 • 6 CENTRO INTERNACIONAL DE LA PAPA (CIP) . Escisión de meristemas: Bajo un microscopio binocular de disección. • Fasc. las cuales deben ser micro propagadas para su indexación.3. Después de 6-8 semanas de cultivo se obtienen plántulas. Cultivo del meristemas: La cúpula y dos primordios foliares se disecan y transfieren a! medio de cultivo de meristemas.

1990. H. Cultivo de tejidos en la Agricultura: Fundamentos y aplicaciones. prueba serológica de ELISA y prueba de plantas indicadoras (International Potato Center. 19 p. Estos compuestos son caros y no existe ninguno que será efectivo para controlar todos los organismos contaminantes. 0. Espinoza. En el dR las infecciones con bacterias y levaduras pueden ser eliminadas satisfactoriamente.. 1991. Siguenas. Lizarraga. 0 Cefatoxime sódica (Claforan) 200 mg/L. Roca. W. S. Cuando la infección es con levaduras se añade al medio de cultivo 0. feds. 0. y Mroginski. 970. Antes de decidir utilizar antibióticos se recomienda eliminar todas las posibles fuentes de contaminación (Reed and Tanprasert.25 a 0.5 mg/L. Para bacterias se utiliza Rifampicina (Rimactan 300-) a una concentración de 60 mg/L. 5..suplementado con 2 mg/L de glicina. L. En el CIP las pruebas que se realizan son: NASH para la detección de PSTVd.. Para ella los productos antibióticos son añadidos al medio de cultivo a las concentraciones que se indican a continuación. durante 15 minutos. Estreptomicina. 1993). Effect of chemical and heat therapy on virus S. N.04 mg/L de kinetina y 2. Gentainicina. Rifampicina. 0. M.) Cali. C.6%) y se esteriliza en autoclave a 15 lb de presión. Bactericina y Sparsomicina (Lizárraga et al. H. Cefatoxine (Mefoxin) también puede ser utilizado a la concentración de 200 mg/L. p. Las siguientes combinaciones de antibióticos se han aplicado con éxito en cultivo de tejidos de plantas: Cefotaxime.5 mg/L de ácido nicotínico 0. conservación y exportación de germoplasma de papa. Cultivo de tejidos: Micro propagación.I. xii. La búsqueda de partículas virales mediante el microscopio electrónico se realiza en forma opcional. Griffiths. Usa de Antibióticos En cultivo de tejidos vegetales. 4. los antibióticos solo son empleados cuando los microorganismos no pueden ser eliminados par otros métodos.1 mg/L de ácido giberélico. 1991]. 0. Buitrón. Dodds.5 mg/L de piridoxina. F. J. Nystatina + Carbenicilina. de Amphotericin B. • Fasc. R. Guía de investigación CIP 1.. 1995). Slack and .. Gentamicina + Amphotericina B. Todas estas pruebas se pueden realizar en un periodo de 2 meses. Dodds. Lima.2 .M.H. 1991. Centro Internacional de la Papa. El medio es gelificado con agar (0.A.4 mg/L de tiamina. 12100.5 % de sacarosa. Bibliografía CIAT (Centro International de Agricultura Tropical). son probadas para detectar cualquier infección persistente de virus. Vancomicina HCI + Mycostatin and Streptoinicina + Carbenicilina. Pruebas de indexación: Las plantas desarrolladas a partir de meristemas. Existen reportes de toxicidad causada en algunos cultivos par: Penicilina. Perú.97 • 7 CENTRO INTERNACIONAL DE LA PAPA (CIP) .. Colombia. A.

Basic techniques in plant virology. Physiologia Plantarum 15: 473-497. L. R. 4.. Jayashinge. y J. A revised medium for rapid growth and bioessays with tobacco tissue cultures. L. 68: 1515-1521. pp. 235: 1324-1325. R.. Roca. A. feds. Lizárraga. W.E. C. Jayashinge.. Lime. Kassanis. edited by J.C. R. L..). Panta.concentrations in vitro potato plantlets. Stace-Smith. Guerison de dahlias atteints d’une maladie virus. 1962. Phytopathology 70: 754-755. Peru. • Fasc. U. Paris. (Technical Training Unit 1). Bot. F. Lizárraga. Salazar. International Potato Center. Tissue. Annals of Applied Biology 45: 422-427. pp. 1977. fed. B. U. 1993. Virus -free potatoes by tissue culture.E. Morel.. In: Plant Cell. Bajaj. 199 pp. CIP Lima. and Organ Culture. Effect of meristem size on eradication of potato spindle tuber viroid. 118-119.J. Martin. Perú. 1952. Reinert and Y. J. 1980. Berlin Heidelberg New York. L.H.). Schilde-Rentscheler. Research for the potato in the year 2000. F. 1957. 6 16635. Dodds.M. Lima. S. C.2 . Mellor. W.. Murashige.. International Potato Center (CIP). Springer-Verlag. Tissue culture for elimination of pathogens.F. T.H. Lizarraga.PS.F. Can. International Potato Center (CIP). G. The use of tissue culture to produce virus free clones from infected potato varieties. and R. 1991. F. 1962.. Salazar.97 • 8 CENTRO INTERNACIONAL DE LA PAPA (CIP) . DIP Research Guide 3. Elimination of potato spindle tuber viroid by low temperature and meristem culture. In Hooker. Salazar. Comptes rendus hebdomaire des seances de IAcademie des Sciences. Skoog.

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