Protocolo de Inmunohistoquímica para IBA-1
1) Se desparafinará e hidratará la lámina con la muestra.
2) Se recuperará el antígeno sumergiendo la muestra en buffer Citrato pH 6 con
Tween-20 0.05 % durante 30 min a 95°C. Luego se realizarán lavados con PBS
1X pH 7,2 (2 veces) con 3 min de reposo entre cada lavado.
3) Se bloqueará la peroxidasa endógena agregando peróxido de hidrógeno H2O2
al 3 % por 30 min a TA. Luego se realizarán lavados con PBS 1X pH 7,2 (4
veces) con 3 min de reposo entre cada lavado.
4) Se bloquearán las proteínas añadiendo suero de conejo al 5 %, suero de caballo
al 2,5 %, albúmina de suero bovino (BSA) al 2,5 % y Triton X-100 al 0,05 % por
60 min a TA. Luego se realizarán lavados con PBS 1X pH 7,2 (5 veces) con 3
min de reposo entre cada lavado.
5) Se incubará el anticuerpo primario Anti-Iba1 de cabra policlonal (AB5076, 1:100,
Abcam) a 4°C durante la noche. Luego se realizarán lavados con PBS 1X pH
7,2 (5 veces) con 3 min de reposo entre cada lavado.
6) Se incubará el anticuerpo secundario de conejo anti-cabra HRP (1:100 KPL) por
60 min a TA. Luego se realizarán lavados con PBS 1X pH 7,2 (3 veces) con 3
min de reposo entre cada lavado.
7) Se incubará con estreptividina HRP por 60 min a TA. Luego se realizarán
lavados con PBS 1X pH 7,2 (3 veces) con 3 min de reposo entre cada lavado.
8) Se revelará con Diaminobencidina (DAB) por 30 s y se detendrá la reacción con
agua destilada.
9) Se contrastará con hematoxilina por 2 s a TA.
10)Se deshidratará con alcohol etílico 80°, alcohol etílico 96°, alcohol etílico 100° (2
cambios, 2 min c/u), estufa por 2 min y Neo Clear sustituto de xilol por 5 min.
11)Finalmente se montará con entellan y se cubrirá con una lámina cubreobjetos.
Protocolo de Inmunohistoquímica para la detección de la Proteína Glial fibrilar acídica
(GFAP):
1) Se desparafinará e hidratará la lámina con la muestra.
2) Se recuperará el antígeno sumergiendo la muestra en buffer Citrato pH 6 con
Tween-20 0.05 % durante 30 min a 95°C. Luego se realizarán lavados con PBS
1X pH 7,2 (2 veces) con 3 min de reposo entre cada lavado.
3) Se bloqueará la peroxidasa endógena agregando peróxido de hidrógeno H2O2
al 2 % por 30 min a TA. Luego se realizarán lavados con PBS 1X pH 7,2 (4
veces) con 3 min de reposo entre cada lavado.
4) Se bloquearán las proteínas añadiendo suero de cabra al 2 %, leche al 2 %,
Triton X-100 al 0.05 % + Tween-20 0.05 % por 30 min a TA. Luego se realizarán
lavados con PBS 1X pH 7,2 (4 veces) con 3 min de reposo entre cada lavado.
5) Se incubará el anticuerpo primario Anti-GFAP humano monoclonal de ratón
(Clona 6F2-Isotipo IgG1 Kappa, 1:1000, Dako) a 4°C durante la noche. Luego
se realizarán lavados con PBS 1X pH 7,2 (5 veces) con 3 min de reposo entre
cada lavado.
6) Se incubará el anticuerpo secundario de ratón IgG, suero porcino 2 %, Triton-
100, Tween-20 por 60 min a TA. Luego se realizarán lavados con PBS 1X pH
7,2 (3 veces) con 3 min de reposo entre cada lavado.
7) Se incubará con la enzima peroxidasa 1/3000 por 60 min a TA. Luego se
realizarán lavados con PBS 1X pH 7,2 (3 veces) con 3 min de reposo entre cada
lavado.
8) Se revelará con Diaminobencidina (DAB) por 30 s y se detendrá la reacción con
agua destilada.
9) Se contrastará con hematoxilina por 2 s a TA.
10)Se deshidratará con alcohol etílico 80°, alcohol etílico 96°, alcohol etílico 100° (2
cambios, 2 min c/u), estufa por 2 min y Neo Clear sustituto de xilol por 5 min.
11)Finalmente se montará con entellan y se cubrirá con una lámina cubreobjetos.
Protocolo de Inmunohistoquímica para el Factor VIII
1) La lámina con la muestra se colocará en la estufa 60ºC durante 30 min y luego
se utilizará el sistema EnVision™ FLEX, Dako.
2) Se desparafinará, rehidratará y recuperará el antígeno con la solución
recuperadora de antígeno Tres en uno (Tris/EDTA) pH 9 durante 20 min a 95°C.
Luego se realizarán lavados con buffer Tris con Tween, pH 7.6 (2 veces) con 5
min de reposo entre cada lavado.
3) Se bloqueará la peroxidasa endógena agregando peróxido de hidrógeno H2O2
por 5 min a TA. Luego se realizarán lavados con agua destilada y con buffer Tris
con Tween, pH 7.6 (2 veces) con 5 min de reposo entre cada lavado.
4) Se incubará el anticuerpo primario de conejo anti Factor VIII (Factor Von
Willebrand) policlonal CCIS527 durante 20 min a TA. Luego se realizarán
lavados con buffer Tris con Tween, pH 7.6 (2 veces) con 5 min de reposo entre
cada lavado.
5) Se incubará con el complejo polímero/peroxidasa por 20 min a TA. Luego se
realizarán lavados con buffer Tris con Tween, pH 7.6 (2 veces) con 5 min de
reposo entre cada lavado.
6) Se revelará con Diaminobencidina (DAB) por 5 min y se detendrá la reacción
con agua destilada (dos veces) con 5 min de reposo entre cada lavado.
7) Se contrastará con hematoxilina por 2 s a TA.
8) Se deshidratará con alcohol etílico 80°, alcohol etílico 96°, alcohol etílico 100° (2
cambios, 2 min c/u), estufa por 2 min y Neo Clear sustituto de xilol por 5 min.
9) Finalmente se montará con entellan y se cubrirá con una lámina cubreobjetos.
