Comparación de la

capacidad de
separación de:
Beckman Coulter
MoFlo XDP y
Becton Dickinson
FACSAria™ I y II
PLANTEAMIENTO

◦ El análisis y separación de poblaciones raras como células madre,

requiere de separadores de células precisos y de alto rendimiento.
Beckman Coulter desarrolló 3 ensayos de sorting celular para
analizar la capacidad de separación de el equipo Beckman Coulter
MoFlo™ XDP y compararlo con los equipos Becton Dickinson
FACSAria™ I y II.
RESUMEN DE EXPERIMENTO

1. En el primer ensayo, para establecer una línea base de

comparación del desempeño del equipo, perlas fluorescentes (3%
de la población de la muestra) en varias concentraciones fueron
separadas a diferentes velocidades. Estadísticos fueron registrados
como eventos por segundo (EPS), tasa de aborto duro, pureza y
velocidad de separación.
2. En el segundo ensayo, sangre lisada fue separada para eventos
positivos a CD19-PE (2% de la población de la muestra) para
diferenciar separación biológica de la separación de las perlas.
3. Finalmente, la sangre completa fue separada para eventos positivos
a CD4-APC, (0.1% de la población de la muestra).
RESUMEN DE RESULTADOS

◦ Los resultados se utilizaron para analizar los efectos del

tamaño de la población separada en las estadísticas de
sorting.
◦ A bajas velocidades, el XDP y el Aria demostraron un
desempeño similar. Sin embargo, a velocidades sobre 20K
EPS, el XDP produjo menos eventos perdidos y abortos
duros, mientras que alcanzó pureza y velocidad de
separación mas alta que el Aria I y II.
 Componentes Características

Sistema de fluidos Celda de flujo unique

fixed alignment
technology
Bomba de aire 2–75 psi (14–517 kPa)

Sistema óptico de 3 Lasers de 488 nm

lasers (octagón), 633 nm, y
405 nm (trigon)
Sort rate 70,000 eventos por
segundo
Detecta 15 parámetros
simultáneamente

Componentes Características
Nozzle (boquilla) tip 75 um y 100 um
size
Way sorting 2 y 4 tubos o en placas
multiposo con ACDU
(automated cell
Becton Dickinson FACSAria™ I deposition unit)
 Componentes Características

Sistema de fluidos Celda de flujo unique

fixed alignment
technology
Bomba de aire 2–75 psi (14–517 kPa)

Sistema óptico de 3 Lasers de 488 nm

lasers (octagón), 633 nm, y
405 nm (trigon)
Sort rate 70,000 eventos por
segundo
Detecta 15 parámetros
simultáneamente

Componentes Características
Nozzle (boquilla) tip 75 um y 100 um
size
Way sorting 2 y 4 tubos o en placas
multiposo con ACDU
(automated cell
Becton Dickinson FACSAria™ I deposition unit)
 Componentes Características
Sistema de fluidos Celda de flujo unique
fixed alignment
technology
Bomba de aire 2–75 psi (14–517 kPa)
Sistema óptico, de 4 Lasers de 488 nm
lasers (octagón), 633 nm, 405
nm y 375 nm (nearUV)
(trigon)
Sort rate 70,000 eventos por
segundo
Detecta 15 parámetros
simultáneamente

Componentes Características
Nozzle (boquilla) tip 70, 85, 100, y 130 um
size
Way sorting 2 y 4 tubos o en placas
multiposo con ACDU
(automated cell
Becton Dickinson FACSAria™ II deposition unit)
 Componentes Características
Sistema de fluidos Celda de flujo unique
fixed alignment
technology
Bomba de aire 2–75 psi (14–517 kPa)
Sistema óptico, de 4 Lasers de 488 nm
lasers (octagón), 633 nm, 405
nm y 375 nm (nearUV)
(trigon)
Sort rate 70,000 eventos por
segundo
Detecta 15 parámetros
simultáneamente

Componentes Características
Nozzle (boquilla) tip 70, 85, 100, y 130 um
size
Way sorting 2 y 4 tubos o en placas
multiposo con ACDU
(automated cell
Becton Dickinson FACSAria™ II deposition unit)

*unique fixed alignment technology

 Componentes Características

Sistema de fluidos Celda de flujo

Bomba de aire 4–100 psi

Sistema óptico, de 4 Lasers de 488 nm

lasers (octagón), 647 nm, 404
nm y 532 nm
Análisis rate/Sort rate 100,000 eps/70,000 eps

Detecta 13 parámetros
simultáneamente

Componentes Características

Nozzle (boquilla) tip 50, 70, 80, 90, 100, 120,

size 150 y 200µm
Way sorting 2 y 4 tubos o 6-1536
well plates, 60 well
Beckman Coulter MoFlo XDP Terasak)
 Componentes Características

Sistema de fluidos Celda de flujo

Bomba de aire 4–100 psi

Sistema óptico, de 4 Lasers de 488 nm

lasers (octagón), 647 nm, 404
nm y 532 nm
Análisis rate/Sort rate 100,000 eps/70,000 eps

Detecta 13 parámetros
simultáneamente

Componentes Características

Nozzle (boquilla) tip 50, 70, 80, 90, 100, 120,

size 150 y 200µm
Way sorting 2 y 4 tubos o 6-1536
well plates, 60 well
Beckman Coulter MoFlo XDP Terasak)
INTRODUCCIÓN

◦ Beckman Coulter MoFlo XDP es capaz de ◦ Becton Dickinson (BD) FACSAria™ II es

separar 70,000 EPS con una pureza mayor al capaz de separar 25,000 EPS con una pureza
99% similar al 99%
◦ Libera la muestra al punto de interrogación a ◦ Libera la muestra al punto de interrogación a
través de jet-in-air través de una cubeta
◦ Divide la decisión de separación en 2 partes. ◦ El usuario elige entre
▫ 1) Sort Mode, para seleccionar la ▫ 1) 4 métodos de separación: single
precisión de la separación de salida: cell, yield, purity, or 4-way purity
single, purify,or enrich ▫ 2) 1/32avo de 3 mascaras para Drop
▫ 2) Drop Envelope: para seleccionar el Envelope: yield, purity and phase.
número de gotas con el cual el Sort
Mode será aplicado (0.5, 1, 1-2, 2 o
3)
◦ Ambos equipos dividen la corriente en gotas para su separación mediante un cristal piezoeléctrico que
vibra a una frecuencia específica para diferentes tipos de puntas de boquillas y presión. Por ejemplo,
para uso general XDP, utiliza una boquilla de 70 µm (a 96 KHz frequency/60 psi pressure). Mientras
que Aria, ocupa una boquilla de 70 µm (89KHz/70psi).
Figura 1. Modos de clasificación para XDP y Aria. Verde indica gotas clasificadas, rojo indica abortado. Configuración del
modo de clasificación se describen debajo de las etiquetas del modo de clasificación. Las partículas ubicadas dentro de las
gotas verdes clasificadas pueden estar en cualquiera de las ubicaciones dentro de la gota, pero solo en una. Si hay más de
una partícula en una gota, se abortará la gota.
Figure 2. Bead Sort Results.
A. The observed EPS
graphed vs. the expected
EPS.
B. The hard abort rate vs.
EPS.
C. Purity of bead sorted
sample vs. EPS.
D. Sort rate vs. EPS.
Figure 3. Lysed Blood Sort
Results.
A. Expected EPS vs.
observed EPS.
B. Observed EPS vs. hard
abort rate.
C. EPS vs purity of lysed
blood sort.
D. EPS vs. sort rate with
efficiency, EPS, and
percent sorted compared
between instruments..
D. Se grafica altura contra
área para eliminar los
dobletes y solo ver las
células

Figure 4. Lysed Blood Sort on the MoFlo XDP. Lysed blood sort gating scheme from (A) to (B), CD4-FITC negative cells
were gated to (C) and then to (D). After sorting, the population was rerun with (E) to (F) with purity stated on the histogram of
99.91% (The above example demonstrates the gating and reanalysis scheme using the 7K EPS sort.)
Figure 5. Lysed Blood Sort on the Aria II. Lysed blood sort gating scheme from (A) to (B), CD4-FITC negative cells were
gated to (C) and then to (D). After sorting, the population was rerun with (E) to (F) with purity stated on the histogram of
99.40%. (The above example demonstrates the gating and reanalysis scheme using the 7K EPS sort.)
Figure 6. Whole Blood Sort
Data.
A. Sample tube (in increasing
concentrations) vs. EPS.
B. EPS vs. hard abort rate.
C. EPS vs purity.
D. EPS vs. sort rate
Figure 7. Whole Blood Sort on the MoFlo XDP. Cells not included in (A) were gated to (B), which included two separate
populations of CD3-APC positive and CytoCount Beads. The CD3-APC positive population was then gated to (C) with the
CD41-FITC negative population gated to (D) in which the CD135-PE negative population was gated to the sort gate (E). The
CytoCount beads were analyzed on the RPE-Cy7 channel on the XDP (F). Purity was determined by gating from (G) to (H)
with enlarged scatter gates and sort gates showing 99.48% purity
Figure 8. Whole Blood Sort on the Aria II. Cells not included in (A) were gated to (B), which included two separate
populations of CD3-APC positive population and CytoCount Beads. The CD3-APC positive population was then gated to (C)
with the CD41-FITC negative population gated to (D) in which the CD135-PE negative population was then gated to the sort
gate (E). The CytoCount beads were analyzed on the Per-CP channel on the Aria (F). Purity was determined by gating from
(G) to (H) with enlarged scatter gates and sort gates showing 94.61% purity.
CONCLUSIONES

◦ EL XDP y el Aria tiene diferentes estructuras de adquisición electrónica de estructuras y métodos de entrega de
muestra. Los cálculos teóricos indican que el ancho de pulso del Aria es casi cinco veces más largo (3,96 μs frente
al XDP 0,82 μs) para una celda de 13 μm, y es incluso más ancho cuando se usa con la extensión de ventana
recomendada para análisis multilaser
◦ El ancho de pulso se vuelve importante para el rendimiento del instrumento a medida que aumentan la velocidad
y la concentración de la muestra. A velocidades superiores a 20K, el XDP mide más partículas para el mismo
ancho de flujo central y tasa de flujo que el Aria. A medida que aumenta la velocidad, el Aria pierde eventos
posiblemente debido a la ventana de adquisición más amplia.
◦ Durante el análisis de láser múltiple, se deben realizar ajustes en el ancho del pulso para tener en cuenta los
cambios en la velocidad de las partículas. El XDP utiliza un método de "ventana deslizante" para detectar eventos
en los tres orificios de detección láser. Por el contrario, la Guía del usuario de BD FACSAria II recomienda que
los usuarios implementen una extensión de ventana fija de 2 μs cuando realicen análisis con múltiples láser. En
cálculos teóricos, el ancho de pulso resultante aumenta de 3,96 μs a 5,96 μs para una celda de 13 μm, lo que hace
que el ancho de pulso sea siete veces más largo que el ancho de pulso XDP. Cuando las muestras se procesan con
un EPS más alto, la tasa de abortos bruscos aumenta drásticamente para el Aria. Esto puede deberse a que
aumenta el número de partículas dentro de una ventana de análisis y, por lo tanto, se cancelan. Los usuarios de
Aria pueden ajustar la extensión de la ventana, pero la resolución de la muestra puede verse afectada.
CONCLUSIONES

◦ La pureza de la muestra clasificada es el resultado de varios factores: configuración de clasificación

y retraso de entrega, EPS y decisiones de clasificación. El XDP y el Aria demostraron una pureza de
clasificación comparable hasta 20K EPS, pero a medida que aumentaba la velocidad de
clasificación, el XDP logró una mayor pureza de la muestra que el Aria en todos los ensayos. La
discrepancia de pureza puede explicarse por contaminantes o eventos perdidos, no detectados en la
muestra. Los eventos perdidos contaminan la muestra clasificada porque no son detectados por la
electrónica de adquisición y pueden pasar a la muestra clasificada. A medida que aumenta la
velocidad, el efecto del ancho del pulso se vuelve más significativo porque no se detectan más
eventos perdidos y contaminan las gotas clasificadas. La pureza de clasificación XDP es mayor a
velocidades más rápidas debido a un ancho de pulso más estrecho y sin extensión de ventana. Por lo
tanto, XDP puede ofrecer una mejor pureza de clasificación que Aria a tasas de eventos superiores a
20K EPS y más rápido
◦ La eficiencia de clasificación fue equivalente entre instrumentos. Esto indica que el Sort Mode y el
Drop Envelope (o el Sort Mode y Masks para Aria) se establecieron de manera comparable con el
mismo caudal de muestra en todas las concentraciones de muestra. Esto reconfirma que el proceso
de desarrollo y prueba del protocolo fue realizado con precisión.
CONCLUSIONES

◦ La tasa de clasificación del XDP fue mucho más alta que la del Aria a velocidades superiores a 20K
EPS. Con EPS, eficiencia de clasificación y porcentaje de población clasificada similar entre
instrumentos, el XDP clasifica hasta tres veces más rápido que el Aria. La tasa de clasificación más
rápida en el XDP se debe al menor número de eventos perdidos del instrumento y abortos forzosos a
velocidades más altas. Aunque la tasa de clasificación para el XDP y el Aria fue similar a
velocidades más bajas, el XDP sobresale en clasificar más rápido a tasas de eventos superiores a
20K EPS y hasta 80K EPS. Para el tipo de sangre completa (0,1% de la población clasificada), el
XDP fue 3,7 veces más rápido que el Aria. El XDP requirió 53 minutos para clasificar, mientras que
el Aria requirió 3 horas y 20 minutos. Para el tipo de sangre lisada (2,8% de la población
clasificada), el XDP fue 1,3 veces más rápido con un tiempo de clasificación de 50 minutos en
contraste con los 67 minutos requeridos en el Aria. En todos los ensayos de clasificación, el XDP
logró una tasa de clasificación más rápida que el Aria a velocidades superiores a 20K EPS.
GLOSARIO

◦ CD19 es antígeno de células B (del inglés cluster of differentiation 19)

◦ PE (ficoeritrina) es un pigmento fotosintético que se encuentra en las algas rojas. Existe in
vitro como una proteína de 240 kDa con 23 cromóforos por molécula
◦ Hard abort se refiere cuando el instrumento no puede procesar la información en tiempo
para realizar la decisión de separación. Hard abort lo utiliza el XPD, mientras que
electronic abort lo ocupa el Aria
◦ “Coincidencia” ocurre cuando dos eventos están muy cerca uno del otro en la ventana de
adquisición de datos y entonces ambos eventos son abortados
◦ Soft abort es un evento definido como positivo por la ventana de separación que falló en
pasar el criterio en el Sort Mode, Drop Envelope o steam procedence
◦ Pureza de la muestra es definida como el porcentaje de células deseadas en el tubo de
colección divididas por el total de células sorteadas.
◦ Drop delay es definido como el tiempo que le toma a una particula viajar del punto de
separación de la gota de la corriente al punto de interrogación del disparador del laser.