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CAPÍTULO

27 Hongos de importancia médica

Connie FC Gibas y Nathan P. Wiederhold

BOSQUEJO DEL CAPÍTULO

- CARACTERÍSTICAS GENERALES Agentes de micosis subcutáneas
Levaduras versus mohos Agentes de micosis sistémicas Agentes
Hialino versus feoide de micosis oportunistas Agentes de
Reproducción de dimorfismo y infecciones por hongos
polimorfismo Infección por Pneumocystis
- TAXONOMÍA - DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO DE HONGOSProblemas

Mucorales de seguridad
Ascomycota Recogida, manipulación y transporte de muestras
Basidiomycota Examen microscópico directo de muestras
Hongos imperfectos Métodos de aislamiento
- Micosis Identificación de hongos
Micosis superficiales - INMUNODIAGNÓSTICO DE LAS ENFERMEDADES Fúngicas
Micosis cutáneas - SUSCEPTIBILIDAD ANTIMICOS
Micosis subcutáneas Agentes antifúngicos
Micosis sistémicas Prueba de susceptibilidad antifúngica
- ESPECIES CLÍNICAMENTE SIGNIFICATIVAS
Agentes de micosis superficiales Agentes
de micosis cutáneas

OBJETIVOS
Después de leer y estudiar este capítulo, debería poder:
1. Describe las características y estructuras generales de los hongos. 8. Analizar los procedimientos apropiados de recolección de muestras, los métodos de

2. Compare la reproducción asexual y sexual de hongos. tinción y las técnicas de cultivo que se utilizan en el laboratorio de micología.

3. Haz una lista de las divisiones de los hongos. 9. Describa las características clave asociadas con la identificación de los
4. Describe las enfermedades causadas por hongos. hongos clínicamente significativos.
5. Identifica las principales causas de las infecciones por hongos. 10. Evaluar los métodos utilizados para identificar hongos.

6. Enumere los saprobios oportunistas comunes asociados con infecciones en 11. Compare y contraste la cromoblastomicosis y el micetoma
huéspedes inmunodeprimidos. eumicótico.
7. Caracterizar los siguientes tipos diferentes de micosis, definiendo los tejidos a 12. Desarrolle un protocolo de laboratorio para la identificación de la levadura clínicamente

los que afectan: significativa.

una. Superficial
B. Cutáneo
C. Subcutáneo
D. Sistémico
mi. Saprobios oportunistas

Se realizó biopsia. La evaluación microscópica del tejido reveló

Caso en punto
Una mujer de 32 años presentó fiebre 12 días después del trasplante
de médula ósea. Se inició tratamiento antimicrobiano de amplio
espectro, pero persistió la fiebre. El día 17, la paciente desarrolló
lesiones cutáneas en todo el cuerpo y extremidades inferiores; a
elementos hifales. Ese mismo día, después de 4 días de incubación,
los hemocultivos del paciente fueron positivos con una colonia
levadura. Aunque se inició tratamiento antifúngico, el paciente falleció
el día 22.

580
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 Capitulo 27 Hongos de importancia médica 581

Temas a considerar
Después de leer la historia clínica del paciente, considere:
- Los hongos con mayor probabilidad de estar implicados en la infección de este
Pulpa Madre hija
paciente
formación celda celular
- Pasos que seguirá el laboratorio para resolver la discrepancia entre lo
HIGO. 27,1 Formación de blastoconidios en levaduras.
que se ve en los portaobjetos de tejido y lo que crece a partir del
hemocultivo
- Los pasos necesarios para llegar a una identificación final de este agente de
enfermedad. Aéreo
micelio

Términos clave Vegetativo

micelio
Anamorfo Micelio
Artroconidio Micosis
Ascosporas Onicomicosis HIGO. 27,2Los micelios aéreos dan al moho el aspecto "lanudo". Los
micelios vegetativos son los encargados de absorber los nutrientes
Asca Hongos polimórficos
del medio.
Blastoconidio Tubo pseudo-germinal
Conidio Pseudohifas
Dermatofitos Mucormicosis rinocerebral La identificación de levaduras se basa principalmente en pruebas
Hongos dimórficos Rizoides bioquímicas y métodos de diagnóstico molecular. Las levaduras se
Micetoma eumicótico Saprobe reproducen por gemación o fisión. La brotación implica la maduración de
Tubo germinativo Esporangióforos la yema a unblastoconidio (célula hija), como se muestra en Figura 27.1.
Hifas Esporangiosporas Este proceso implica la lisis de la pared celular de la levadura para que se
Macroconidio Synanamorphs pueda formar un blastoconidio. A medida que esta estructura se agranda,
Microconidio Teleomorfo el núcleo de la célula madre sufre mitosis. Una vez que el nuevo núcleo
Molde Levadura
pasa a la célula hija, se forma un tabique y la célula hija se libera. Durante
la fisión, se forman dos células de igual tamaño. Estas células continúan

F
ungi constituyen un grupo extremadamente diverso de organismos y
generalmente se clasifican como moldes o levaduras. Algunos han sido
reconocidos como patógenos clásicos, mientras que otros solo se
conocen como patógenos ambientales. saprobios, viviendo de material
inanimado. Los hongos pueden causar infecciones leves; desencadenar
reacciones alérgicas, incluido el asma; y producen una enfermedad grave que
pone en peligro la vida. Con el uso generalizado de quimioterapia y radioterapia
y enfermedades como el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) que
afectan el sistema inmunológico, la línea entre patógeno y saprobe se ha
difuminado. El aislamiento de todos los microorganismos, especialmente en el
paciente inmunodeprimido, debe considerarse inicialmente un hallazgo
significativo y debe evaluarse a la luz de la historia clínica del paciente y los
resultados del examen físico.
creciendo desde las puntas de las células y se dividen solo después de que
se forma una fisión medial.
La mayoría de los mohos tienen un aspecto borroso o lanoso debido a la
formación de micelio (Figura 27.2). Los micelios están formados por muchas
hebras largas de estructuras tubulares llamadashifas, que son aéreos o
vegetativos. Los micelios aéreos se extienden por encima de la superficie de la
colonia y son responsables de la apariencia borrosa. Además, los micelios aéreos
sostienen las estructuras reproductivas que producen los conidios. Los conidios,
en muchos casos, se utilizan para identificar diferentes géneros de hongos. El
micelio vegetativo se extiende hacia abajo en el medio para absorber los
nutrientes.
La apariencia microscópica a menudo ayuda en la identificación de mohos.
En algunas especies, se forman hifas de asta, raqueta, rizoide o espiral (Figura
27.3A). Las hifas de la cornamenta tienen puntas hinchadas y ramificadas que se
asemejan a las cornamentas de los alces. Las hifas de la raqueta contienen áreas

Características generales
Las características de los hongos difieren de las de las plantas o las bacterias.
Como las plantas, los hongos son eucariotas; poseen un verdadero núcleo, con
una membrana nuclear y mitocondrias. Las bacterias son procariotas y carecen
de estas estructuras. A diferencia de las plantas, los hongos carecen de clorofila
y deben absorber nutrientes del medio ambiente. Además, las paredes celulares
de los hongos están hechas de quitina, mientras que las de las plantas contienen
celulosa. La mayoría de los hongos son aerobios obligados que crecen mejor a
un pH neutro, aunque toleran un amplio rango de pH. La humedad es necesaria
para el crecimiento, pero las esporas y los conidios sobreviven en condiciones
secas durante períodos prolongados.
Levaduras versus mohos
Las levaduras son células vegetativas individuales que típicamente forman una
colonia suave, cremosa, parecida a una bacteria sin hifas aéreas. Debido a que
sus morfologías macroscópicas y microscópicas son similares,
agrandadas en forma de maza. Las hifas espirales están muy enrolladas.
Rizoides (verFigura 27.3B), estructuras parecidas a raíces, pueden verse en
algunos de los Zygomycetes, y su presencia y ubicación pueden ayudar con la
identificación. Con frecuencia, cuando se describen hifas de hongos, se las
conoce comoseptar o escasamente septados. Hifas septadas (Figura 27.4A)
muestran frecuentes paredes transversales que ocurren perpendiculares a las
paredes externas de las hifas, mientras que las hifas escasamente septadas (ver
Figura 27.4B) tienen pocas paredes transversales a intervalos irregulares. El
términoaseptate que significa ausencia de tabiques, se ha utilizado
históricamente para describir las hifas de los Zygomycetes. El examen
microscópico de las hifas asociadas con los Zygomycetes a menudo revela
tabiques ocasionales; por lo tanto, estas hifas se denominan más correctamente
escasamente septados Opuesto a aseptate.
Hialino versus feoide
Otra característica útil en la identificación es la pigmentación. Las
hifas hialinas (moniláceas) no están pigmentadas o son ligeramente

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582 PARTE 2 Identificación de laboratorio de aislamientos significativos

Hifas de asta Hifas de raqueta Hifas espirales Rizoides

B
HIGO. 27,3A, Estructuras especializadas formadas en micelios vegetativos por determinadas especies de hongos.
B, Rhizopus spp., mostrando rizoides (sin teñir, ×200).

A B
HIGO. 27,4A, Feoacremonio sp. mostrando hifas septadas (sin teñir,×200). B, Las hifas mucorales en el tejido
aparecen escasamente septadas (tinción de plata con metenamina de Gomori, ×400).

pigmentadas, mientras que las hifas feoides (dematiáceas) son de pigmentación

oscura (Figura 27.5) debido a la presencia de melanina en la pared celular.
Dependiendo de la cantidad de melanina presente, las hifas aparecerán pálidas a
marrón oscuro o casi negras. Tenga en cuenta que las hifas oscuras que se ven
en la sección de tejido enFigura 27.4B es de color oscuro debido a las manchas
que mejoran la visualización de los elementos fúngicos en el tejido y no debido a
la melanina. Todos los elementos fúngicos aparecen negros cuando se usa la
tinción de metileno Gomori. Otra tinción que se utiliza a menudo para
determinar la pigmentación de las hifas en los tejidos es la tinción de Fontana-
Masson. Esta mancha tiñe específicamente la melanina, lo que hace que las hifas
feoides se vean marrones, mientras que las hialinas se tiñen de rosa a rojo.

Dimorfismo y polimorfismo HIGO. 27,5Bipolaris sp. es un ejemplo de hongo feoide. Tenga en

El término dimorfismo se refiere a la capacidad de algunos hongos de existir en dos cuenta la pigmentación oscura, que es causada por la presencia de
formas, dependiendo de las condiciones de crecimiento. Hongos dimórficos melanina en la pared celular (sin teñir,×200).

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incluyen una fase de moho y una fase de levadura o esférula. El estado de
la levadura o del tejido se observa in vivo o cuando el organismo se cultiva
a 37 ° C con una mayor concentración de dióxido de carbono (CO2). La fase
de moho se ve cuando el organismo crece a temperatura ambiente (22 ° a
25 ° C) en condiciones de aire ambiente. Las especies de hongos
térmicamente dimórficos asociadas con enfermedades humanas incluyen
Blastomyces dermatitidis, Coccidioides immitis, Coccidioides posadasii,
Emmonsia spp., Histoplasma capsulatum, Paracoc cidioides brasiliensis,
Sporothrix schenckii, y Penicillium marneffei. Varios otros hongos también
poseen esta capacidad, pero no se han descrito como agentes de micosis (
infecciones causadas por hongos). Hongos polimórficos tienen formas de
levadura y moho en el mismo cultivo. Esta característica ocurre a pesar de
las condiciones de crecimiento y se observa mejor enExophiala spp., en la
que la fase de levadura se observa típicamente inicialmente, seguida de la
fase de moho a medida que la colonia envejece.
Reproducción
Los hongos pueden reproducirse asexualmente (imperfecto) o sexualmente
(perfecto). La reproducción asexual da como resultado la formación de conidios
(singular,conidio) después de la mitosis. La reproducción asexual se lleva a cabo
mediante estructuras de fructificación especializadas conocidas comocélulas
conidiógenas.Estas estructuras forman conidios, que contienen todo el material
genético necesario para crear una nueva colonia de hongos. Dos células
conidiógenas comunes son los phialides y annellides. Los fialides son estructuras
parecidas a vasos que producen fialoconidios (Figura 27.6), mientras que los
annelidos son estructuras anilladas que producen annelloconidios. Ambos
forman sus conidios blásticamente (brotación) como muchas levaduras; la célula
madre se agranda y se forma un tabique para separar la célula conidial. Otro
tipo de conidios son los artroconidios (singular,artroconidio). Estos conidios se
forman por fragmentación de hifas fértiles en lugar de estar formados por
células conidiógenas (Figura 27.7).
En el laboratorio clínico, la mayoría de las identificaciones de
moho se basan en las estructuras formadas como resultado de la
reproducción asexual. La reproducción sexual requiere la unión de
dos núcleos compatibles, seguida de meiosis (Figura 27.8). Un hongo
que se reproduce sexualmente se conoce comoteleomorfo.
Ocasionalmente, estos hongos también se reproducirán
asexualmente. Cuando esto ocurre, la forma asexual se denomina
anamorfo. Si más de un anamorfo está presente para el mismo
teleomorfo, las cepas anamórficas se denominan sinanamorfos.El
mejor ejemplo del fenómeno es el teleomorfo. Pseud allescheria
boydii, que tiene dos anamorfos, Scedosporium boydiiy Graphium
spp. Estos dos anamorfos son sinanamorfos entre sí.
Conidios
Fialida
Hifas
Conidióforo
HIGO. 27,6Un ejemplo de reproducción asexual es la producción de
fialoconidios. Los conidios se forman a partir de células conidiógenas como
la fialida (una estructura parecida a un vaso). Las fialoconidias son
"expulsadas" de la fialida.
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Capitulo 27 Hongos de importancia médica 583
Taxonomía
Hay más de 100.000 especies de hongos con nombre y se estima que
entre 1 y 10 millones de especies no descubiertas. La mayoría de los
agentes causantes de infecciones clínicas se encuentran en cuatro
grupos de hongos. Consisten en los phyla Ascomycota y
Basidiomycota, subfilo Mucoromycotina y la división de formas Fungi
Imperfecti (Deuteromycota).
Mucorales
Los Zygomycota tradicionales han sufrido cambios taxonómicos. Los
taxones colocados tradicionalmente en el filo Zygomycota ahora se
asignan entre el filo Glomeromycota y cuatro subfilos,
Entomophthoromycotina, Mucoromycotina, Kickxellomycotina y
Zoopagomycotina. Las especies clínicamente más significativas pertenecen
al subfilo Mucoromycotina e incluyen los génerosActinomucor,
Apophysomyces, Cokeromyces, Cunninghamella, Lichtheimia (antes
Absidia), Mucor, Rhizomucor, Rhizopus, Saksenaea, y Syncephalastrum. Los
miembros de la orden son organismos de rápido crecimiento que
normalmente se encuentran en el suelo. A menudo son patógenos
oportunistas en huéspedes inmunodeprimidos.
Los mucorales, el orden clínicamente más significativo, generalmente
producen micelios aéreos profusos, de color gris a blanco, caracterizados
por la presencia de hifas hialinas escasamente septadas. La reproducción
asexual se caracteriza por la presencia deesporangióforos y
esporangiosporas. Las esporas asexuales (esporangiosporas) se producen
en una estructura conocida como esporangio, que se desarrolla a partir de
una estructura de soporte denominada esporangióforo (Figura 27.9).
Hifas
Artroconidias
HIGO. 27,7Las artroconidias, otra forma de reproducción
asexual, se forman por fragmentación de hifas fértiles.
Hifa Hifa
1 2
Fusión de hifas
Fusión de
núcleos
Zygospore
HIGO. 27,8La reproducción sexual ocurre por la fusión de núcleos
compatibles y la subsecuente producción de una zigospora.
584 PARTE 2 Identificación de laboratorio de aislamientos significativos
Esporangiosporas
Esporangio
Columela
Columela
Esporangióforo
HIGO. 27,9La reproducción asexual de Mucorales se caracteriza por
la producción de esporas (esporangiosporas) desde el interior de un
esporangio.
Aunque algunos Mucorales son capaces de reproducirse sexualmente dando
como resultado la producción de cigosporas, estas estructuras no se ven de
forma rutinaria en los laboratorios clínicos.
Ascomycota
Aproximadamente el 50% de todos los hongos nombrados se clasifican en
el filo Ascomycota. Los hongos asociados con la clase Ascomycetes se
caracterizan por la producción de esporas sexuales conocidas como
ascosporas. Las ascosporas se forman dentro de una estructura en forma
de saco conocida como asca (plural, asci). Sin embargo, es importante
señalar que generalmente se identifican sobre la base de estructuras
asexuales características. Los organismos representativos incluyen
Microsporum spp.,Trichophyton spp., y Scedosporium boydii.
Basidiomycota
Solo unos pocos miembros del filo Basidiomycota son clínicamente
significativos. El patógeno principal esFilobasidiella neoformans, la
forma perfecta (teleomorfo) de Cryptococcus neoformans var.
neoformans. Miembros de los géneros Malassezia y Trichosporon
también se asocian con infecciones humanas. Los mohos
basidiomicetosos se están recuperando en cantidades cada vez
mayores en el laboratorio, pero su importancia clínica no se
comprende con claridad. La comunicación cercana entre el médico y
el laboratorio ayudaría a determinar si el aislado es un contaminante
ambiental o un agente de enfermedad.
Cuando se recuperan mohos basidiomicetosos en el laboratorio,
normalmente permanecen estériles, lo que complica el proceso de
identificación. Una pista de que un molde es un basidiomiceto es la
presencia de conexiones de abrazadera. Las conexiones de
abrazadera se producen en los tabiques de las hifas vegetativas y son
fácilmente visibles con un microscopio óptico. Una porción de la hifa
en un lado del tabique crece y se conecta a la hifa en el otro lado del
tabique, evitando así el tabique. Las conexiones de abrazadera no
siempre están presentes. La tinción con azul de diazonio B o el cultivo
en medio de cultivo suplementado con benomyl puede ayudar a
identificar un aislado de basidiomiceto putativo.
Hongos imperfectos
La división de formas Fungi Imperfecti contiene la mayor cantidad de
organismos que son agentes causantes de micosis, incluidas
enfermedades cutáneas, subcutáneas y sistémicas. Los organismos son
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Queratinizado
capa
Epidermis
Dermis
(fibras elásticas,
fibras de colágeno,
folículo capilar,
glándula sudorípara)
Subcutáneo
capa
HIGO. 27.10Capas de piel y tejidos en los que pueden producirse las infecciones
por hongos.
colocados dentro de este grupo cuando no se ha identificado ningún modo
de reproducción sexual. Por lo tanto, se identifican sobre la base de
estructuras reproductivas asexuales características.
Micosis
Las micosis (singular, micosis) son enfermedades causadas por hongos.
Las enfermedades fúngicas se clasifican con frecuencia en función del sitio
de la infección: micosis superficiales, cutáneas, subcutáneas y sistémicas.
Figura 27.10 muestra las diferentes capas de tejidos en los que pueden
producirse las infecciones por hongos. Con la ayuda de esta figura, es más
fácil clasificar las infecciones de la piel, dependiendo de dónde se produzca
la infección. Las infecciones que no involucran la piel o tejidos más
profundos justo debajo de la piel se denominansistémico. Las micosis
superficiales y cutáneas son causadas por hongos que pueden degradar la
queratina (dermatofitos) y hongos que no pueden degradar la queratina
(no dermatofitos).
Micosis superficiales
Las micosis superficiales son infecciones limitadas a la capa más externa
de la piel o el cabello. Debido a que en un momento se creía que las
infecciones de la piel, el cabello y las uñas eran el resultado de gusanos
excavadores que formaban patrones en forma de anillo en la piel, el
términotiña (El latín, que significa "gusano") se aplicó a cada enfermedad,
junto con el término latino para el sitio del cuerpo. Un ejemplo de tiña no
dermatofítica es la tiña versicolor (pitiriasis versicolor). Esta enfermedad se
caracteriza por decoloración o despigmentación y descamación de la piel y
es causada por la levadura.Malassezia furfurcomplejo. La enfermedad se
manifiesta en personas de tez oscura o en aquellas que no se broncean
normalmente.
Otra infección superficial no dermatofítica es la tiña negra. Esta
enfermedad casi siempre es causada porHortaea werneckii y se caracteriza
por parches maculares marrones o negros, principalmente en

palmas. La biopsia y el cultivo del sitio son importantes para distinguir esta
infección del melanoma, una enfermedad no fúngica mucho más grave.
Otra infección superficial, la piedra, se limita al tallo del cabello y se
caracteriza por nódulos compuestos por hifas y una sustancia parecida al
cemento que lo adhiere al tallo del cabello. La piedra negra es causada por
Piedraia hortae, y la piedra blanca es causada por Trichophyton ovoides y
T. inkin. Onicomicosis, causada por Onychocola canadensis y O. kanei, es
también una micosis superficial no dermatofítica caracterizada por
infecciones subungueales blancas superficiales y laterales distales de la
uña del pie mayor.
Micosis cutáneas
Las dermatomicosis se definen como enfermedades fúngicas de los tejidos
queratinizados de humanos y otros animales. Aunque las especies no
dermatofitas pueden causar infecciones similares, este síndrome suele ser
el resultado de una infección con un dermatofito; de ahí el término
dermatofitosis. Tenga en cuenta que este término no debe usarse hasta
que el agente causante se haya identificado como dermatofito. Los
géneros en este grupo incluyenTrichophyton, Microsporum, y
Epidermophyton. Las infecciones dermatofíticas suelen afectar a una
región restringida del hospedador; tradicionalmente, estas enfermedades
se nombran con respecto a la parte del cuerpo afectada. Las diversas
formas de tiña continúan describiéndose en estos términos, como se
muestra enCuadro 27.1.
Cada lesión de tiña es el resultado de la inoculación local de la piel con el
agente causal. Las lesiones aumentan de tamaño con el tiempo, por lo general y
la mayor parte de la inflamación ocurre en el borde de avance de la lesión.
Algunos casos de tiña son subclínicos y muestran solo una lesión seca y
escamosa sin inflamación. Los síntomas de las micosis cutáneas incluyen
picazón; escamas o parches en forma de anillo en la piel; cabello quebradizo y
quebradizo; y uñas gruesas y descoloridas.
Micosis subcutáneas
Las micosis subcutáneas afectan las capas más profundas de la piel, así como los
músculos, el tejido conectivo y los huesos. Excepto en determinadas poblaciones
de pacientes, no se produce la diseminación a través de la sangre a los órganos
principales. Las manifestaciones clínicas características incluyen úlceras
progresivas que no cicatrizan y presencia de conductos sinusales que drenan. En
áreas tropicales, algunos agentes, comoPhialophora spp. yEsporium clado spp.,
causan cromoblastomicosis, que se caracteriza por nódulos verrugosos que a
menudo se ulceran y forman costras. Esta enfermedad se diagnostica por la
presencia de lesiones características.
MESA 27,1 Varias formas de dermatofitosis y
los respectivos sitios afectivos
Tipo de tiña Sitio afectado
Tiña de la cabeza Cabeza
Tiña favosa Cabeza (enfermedad distintiva)
Tiña de la barba Barba
Tiña corporal Cuerpo (piel glabra)
Tinea manuum Mano
Tinea unguium Clavos
Tinea cruris Ingle
Tiña del pie Pies
Tiña imbricada Cuerpo (lesión distintiva)
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Capitulo 27 Hongos de importancia médica 585
acompañados de cuerpos microscópicos escleróticos, a menudo
denominados "monedas de cobre" debido a su forma y propiedades de
tinción en secciones de tejido.
Micetoma eumicótico es causada por hongos y da como resultado el
drenaje de los tractos sinusales y la destrucción de los tejidos. Los granos
(gránulos), que son hifas fuertemente unidas, se pueden recolectar de los
líquidos que drenan de las vías sinusales y son útiles para identificar el agente
causal. La enfermedad puede ser cutánea o subcutánea. En todo el mundo,
alrededor del 40% de los micetomas son eumicóticos y el resto son
actinomicóticos, causados porActinomicetos bacterias (ver Capítulo 16).
Esporotricosis, causada por la Sporothrix schenckii especie compleja,
comúnmente se presenta como una infección linfocutánea progresiva, que
comienza con una única lesión drenante y progresa a lo largo de las
extremidades a través del sistema linfático, formando múltiples lesiones
drenantes. Sin embargo, los gránulos no se forman, por lo que esta
infección no se califica como micetoma. La diseminación de esta especie
causante de esporotricosis sistémica es mucho más común y,
recientemente,S. schenckii se ha relacionado con neumonía refractaria a la
terapia antifúngica.
Micosis sistémicas
Las micosis sistémicas o diseminadas son infecciones que afectan los
órganos internos o los tejidos profundos del cuerpo. Con frecuencia, el
sitio inicial de infección es el pulmón, desde el cual el organismo se
disemina por vía hematógena a otros órganos, incluida la piel. Los
síntomas generalizados incluyen fiebre y fatiga. La tos crónica y el dolor en
el pecho también pueden acompañar a estas infecciones. Históricamente,
el términomicosis sistémicas se ha utilizado para describir enfermedades
causadas por hongos térmicamente dimórficos, que incluyen Histoplasma,
Coccidioides,y Blastomyces spp. Otros agentes fúngicos son capaces de
causar enfermedades sistémicas e incluyenAspergillus, Fusarium,
Scedosporium,y Curvularia spp. así como algunas levaduras, incluidas
Candiday Cryptococcus spp. Es importante señalar que cualquier hongo
puede diseminarse desde el sitio primario de infección en el huésped
inmunodeprimido.
Especies clínicamente significativas
Agentes de micosis superficiales
Las micosis superficiales son enfermedades fúngicas que afectan solo a las capas
cornificadas (estrato córneo) de la epidermis. Los pacientes que tienen
infecciones micóticas superficiales no muestran ningún síntoma evidente porque
los agentes fúngicos no activan ninguna respuesta tisular o reacción
inflamatoria. Los pacientes generalmente buscan atención médica para abordar
problemas cosméticos en lugar de médicos causados por estos hongos.
Malassezia furfur
Manifestaciones clínicas. los Malassezia furfur complejo causa tiña
versicolor, una enfermedad caracterizada por lesiones parcheadas o
descamación de pigmentación variada. También se cree que es una causa de
caspa. Las lesiones asociadas con la tiña versicolor suelen aparecer como
manchas pálidas en personas con piel de pigmentación oscura, pero también
pueden describirse como manchas hepáticas de color beige en personas con tez
clara. Las lesiones se vuelven especialmente evidentes en los meses cálidos,
cuando es más probable la exposición al sol. La tiña versicolor puede afectar
cualquier área del cuerpo, pero los sitios más prevalentes incluyen la cara, el
pecho, el tronco y el abdomen. La terapia antimicótica no suele estar indicada,
pero la aparición de lesiones puede ser
586 PARTE 2 Identificación de laboratorio de aislamientos significativos
disminuido por el tratamiento con champús anticaspa. Curiosamente,
M. furfur El complejo también se ha relacionado con infecciones diseminadas en
pacientes que reciben terapia de reemplazo de lípidos (nutrición parenteral
total), particularmente en bebés. La eliminación de las líneas de alimentación
permanentes suele ser suficiente para eliminar las infecciones sin utilizar una
terapia antimicótica.
M. furfur es un colonizador cutáneo endógeno común. A pesar de que
las razones del crecimiento excesivo por M. furfur que dan lugar a
manifestaciones clínicas aún se desconocen, parece estar relacionado con las
tasas de recambio de células escamosas. Esto se evidencia por la mayor
incidencia de tiña versicolor entre las personas que reciben terapia con
corticosteroides, lo que disminuye la tasa de renovación de las células epiteliales
escamosas. Los investigadores han identificado la influencia genética, la mala
nutrición y la sudoración excesiva como otros factores que contribuyen al
crecimiento excesivo del organismo en la piel. Este organismo se encuentra en
todo el mundo, con mayor prevalencia en lugares cálidos, húmedos y tropicales.
Diagnóstico de laboratorio. M. furfur puede identificarse
visualizando raspaduras de piel de lesiones características en una
preparación de hidróxido de potasio (KOH) o observando
fluorescencia amarilla con la lámpara de Wood al examinar el sitio del
cuerpo infectado. El examen microscópico del frotis directo en
preparaciones de KOH revela levaduras en gemación,
aproximadamente de 4 a 8µm, junto con elementos hifales septados,
a veces ramificados. Esta apariencia microscópica ha ganadoM. furfur
el apodo el hongos espaguetis y albóndigas (Figura 27.11).
M. furfur requiere lípidos para el crecimiento y no crecerá en
medios fúngicos de rutina que no han sido suplementados con una fuente de
lípidos. Debido a sus requisitos nutricionales especiales, los cultivos de hongos
de rutina son negativos para el crecimiento. Las colonias típicas similares a
levaduras se pueden observar solo después de que el medio de cultivo se haya
cubierto con aceite de oliva. Las colonias son de color crema, húmedas y suaves.
HIGO. 27.11La típica apariencia de los llamados espaguetis y albóndigas (
flecha superior hifa flecha inferior célula de levadura) de Malassezia furfur
en una preparación de hidróxido de potasio (×400).
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Piedraia hortae
Manifestaciones clínicas. Piedraia hortae es el agente causante de la
piedra negra, una infección de los pelos del cuero cabelludo. El organismo
infectante produce nódulos arenosos duros, de color marrón oscuro a
negro, que se adhieren firmemente al tallo del cabello. Estos nódulos
consisten en ascos (estructuras en forma de saco) que contienen ocho
ascosporas. La enfermedad es endémica en áreas tropicales de África, Asia
y América Latina.
Diagnóstico de laboratorio. Cuando se eliminan los pelos infectados y se
colocan en KOH del 10% al 20%, los nódulos se pueden triturar para revelar los
ascos. Se observan células romboides de paredes gruesas que contienen
ascosporas.P. hortae crece lentamente en agar dextrosa Sabouraud a
temperatura ambiente. Forma colonias marrones restringidas que permanecen
estériles.
Trichosporon spp.
Manifestaciones clínicas. Trichosporon beigelii había sido descrito
como un patógeno humano. Sin embargo, el examen del genoma de los
miembros del género ha revelado queT. beigelii ya no es una especie
válida que infecta a los humanos. Existen al menos 37 especies distintas,
peroTrichosporon ovoides, T. asteroides, T. cutaneum,y T. inkin han sido
implicados en la mayoría de los casos de micosis superficiales. La especie
más importante de este género esT. asahii,que está implicado en una
enfermedad grave y frecuentemente mortal en huéspedes
inmunodeprimidos. Aunque se encuentra con menos frecuencia,
T. mucoides también causa enfermedad sistémica (meningitis) y se
recupera con frecuencia del líquido cefalorraquídeo (LCR). La colonia
se asemeja a las colonias jóvenes deCryptococcus neoformans pero se
diferencia fácilmente sobre la base de características fisiológicas y
morfológicas.
Trichosporon spp. se encuentran ocasionalmente como parte de la biota cutánea
normal y también pueden aislarse de los animales y del suelo. La piedra blanca se
presenta en el tallo del cabello y se caracteriza por una estera micelial suave que rodea
el cabello del cuero cabelludo, la cara y la región púbica. Los miembros de este género
también han sido reconocidos como patógenos sistémicos oportunistas. Aunque raras,
las enfermedades sistémicas causadas por estos hongos con frecuencia son mortales y
ocurren con mayor frecuencia en el hospedador inmunodeprimido, comúnmente
aquellos que tienen trastornos hematológicos o neoplasias malignas o están recibiendo
quimioterapia. Las infecciones en pacientes inmunodeprimidos incluyen infecciones de
la sangre, el líquido cefalorraquídeo y los órganos. La piedra blanca es endémica en
áreas tropicales de América del Sur, África y partes de Asia.
Diagnóstico de laboratorio. Trichosporon spp. crecen rápidamente en
medios fúngicos primarios y producen artroconidios, hifas y blastoconidios
(Figura 27.12). Las colonias son de color pajizo a crema y se asemejan a
levaduras. Las colonias son variadas y pueden ser lisas o arrugadas, secas
o húmedas y de apariencia cremosa o aterciopelada. La identificación a
nivel de especie se confirma mediante reacciones bioquímicas, ausencia de
fermentación de carbohidratos, uso de nitrato de potasio, asimilación de
azúcares y positividad de ureasa. Los enfoques moleculares y proteómicos,
como el análisis de la secuencia del ácido desoxirribonucleico (ADN) y el
tiempo de vuelo de ionización / desorción láser asistida por matriz (MALDI-
TOF), respectivamente, junto con reacciones bioquímicas, conducen a una
identificación precisa de las especies dentro de este género.
Hortaea werneckii
Manifestaciones clínicas. Tiña negra, caracterizada por máculas no escamosas de
color marrón a negro que ocurren con mayor frecuencia en las palmas y

HIGO. 27.12Apariencia microscópica de Trichosporon especies en la
preparación de azul de algodón de lactofenol que muestra la
presencia de blastoconidios y artroconidios (×600).
HIGO. 27.13Estructuras microscópicas de Hortaea werneckii, mostrando
característicos annelloconidios en ciernes (×400). H. werneckii Causa tiña
negra.
suelas, es causada por H. werneckii. Sinónimos obsoletos de H. werneckii
incluir Phaeoannellomyces werneckii y Exophiala werneckii. Esta
enfermedad no implica ninguna reacción inflamatoria u otra reacción
tisular al hongo infectante. Sin embargo, la presentación clínica es tan
similar a la de otras afecciones que pueden producirse diagnósticos
erróneos, lo que da lugar a procedimientos quirúrgicos innecesarios,
especialmente cuando se confunden con melanoma maligno. La
enfermedad es endémica en las áreas tropicales de América Central y del
Sur, África y Asia.
Diagnóstico de laboratorio. El diagnóstico de tiña negra se puede realizar
mediante el examen directo de los raspados de piel colocados en KOH del 10% al
20%. El examen microscópico muestra elementos hifales septados y células en
gemación (Figura 27.13). Los cultivos más jóvenes se componen principalmente
de blastoconidios en gemación, mientras que la porción micelial más antigua de
la colonia muestra hifas anchas y profusamente septadas con blastoconidios en
racimos. Las annelloconidias se observan en colonias de hifas más antiguas.H.
werneckii produce colonias brillantes, húmedas y parecidas a levaduras que
comienzan con una coloración pardusca que eventualmente se vuelve verde
oliva a negro verdoso.
Agentes de micosis cutáneas
Características generales
Tres géneros de hongosTrichophyton, Microsporum, y
Epidermophyton—son agentes causantes de dermatofitosis. Especies
dentro de estos géneros, denominadosdermatofitos, están
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Capitulo 27 Hongos de importancia médica 587
queratinofílico; es decir, están adaptados para crecer en el cabello, las uñas y las
capas cutáneas de la piel que contienen la escleroproteína queratina. La
infección del tejido profundo por estos hongos es rara, pero ocasionalmente
puede resultar en inflamación extensa y afectación del lecho ungueal o
enfermedad diseminada.
La mayoría de los agentes de las dermatofitosis viven libremente en el
medio ambiente (geofílicos), pero algunos se han adaptado casi
exclusivamente a vivir en animales (zoofílicos) o tejidos humanos
(antropofílicos), y rara vez se recuperan de otras fuentes. La distribución de
estas especies es generalmente mundial, aunque algunas se encuentran
solo en regiones geográficas restringidas. Se han descrito
aproximadamente 43 especies de dermatofitos y hongos similares a los
dermatofitos, y se ha documentado que aproximadamente 24 de ellos
causan infección humana.
Los dermatofitos suelen formar dos tamaños de células reproductivas,
macroconidio o microconidio. Ambos son conidios anamórficos o asexuales, y
su tamaño, forma y características superficiales distintivos los convierten en
estructuras valiosas para la identificación de especies. Se sabe que algunos
dermatofitos también tienen etapas teleomórficas, en las que las ascosporas son
las células reproductoras. Los teleomorfos de este grupo de organismos no se
observan en los estudios de laboratorio de rutina de los aislados de pacientes
porque los dermatofitos son heterotálicos y requieren la combinación de dos
tipos de apareamiento distintos. Aunque algunos laboratorios de referencia
realizan pruebas de apareamiento con conocidostester cepas, este
procedimiento no se realiza con regularidad en los laboratorios clínicos.
La mayoría de los hongos geofílicos producen un gran número de conidios y,
por lo tanto, se encuentran entre las especies más identificadas. Los
dermatofitos zoofílicos no se encuentran comúnmente viviendo libremente en el
suelo o sobre sustratos orgánicos muertos. A menudo causan infecciones en
animales y pueden propagarse como agentes de enfermedad en humanos. Los
hongos zoofílicos producen menos conidios que las especies geofílicas. Aunque
las especies antropofílicas casi siempre se encuentran como agentes de
enfermedades humanas, las infecciones rara vez son inflamatorias. La
identificación de especies puede resultar difícil porque la mayoría de las especies
antropofílicas producen pocas conidias.
No solo hay diversos sitios en el hospedador involucrados en infecciones,
sino que ciertas especies también causan lesiones distintivas. El ejemplo notable
es la tiña imbricata, causada porTrichophyton concentricum.Con el tiempo, las
porciones afectadas del tronco desarrollan anillos concéntricos de tejido de
descamación distintivos para el diagnóstico. En algunas formas de tiña, una
reacción alérgica persistente, dermatofítida, se manifiesta en la formación de
lesiones estériles con picazón en sitios del cuerpo distantes del punto de
infección. Los síntomas de las infecciones por dermatofitos varían de leves a
moderados y ocasionalmente graves.
Infecciones que afectan al cabello
Los diferentes sitios del cuerpo manifiestan diferentes síntomas de micosis. Las
infecciones del cuero cabelludo, en las que los folículos pilosos son los sitios de
iniciación, pueden estar entre las formas más graves y desfigurantes de micosis.
La tiña favosa, o favus, comienza como una infección del folículo piloso por
Trichophyton schoenleinii y progresa a una lesión costrosa formada por células
epiteliales muertas y micelio fúngico. Copos crujientes en forma de copa,
llamadosscutula, están formados. Por lo general, se produce la pérdida de
cabello y la formación de tejido cicatricial.
Dos formas distintas de tiña de la cabeza (tiña del parche gris y tiña del
punto negro) son causadas por diferentes especies de dermatofitos. La
tiña del parche gris es una enfermedad infantil común que se transmite
fácilmente entre los niños. El hongo coloniza principalmente
588 PARTE 2 Identificación de laboratorio de aislamientos significativos
la parte exterior de los tallos del cabello, la llamada participación del cabello
ectothrix. Las lesiones rara vez se inflaman, pero se puede perder el brillo y el
color del tallo del cabello.Microsporum audouinii y Microsporum ferrugineum
son agentes causantes de esta enfermedad. La tiña del punto negro consiste en
la afectación del vello endotrix. El folículo piloso es el sitio inicial de la infección y
el crecimiento de hongos continúa dentro del tallo del cabello, lo que hace que
se debilite. Los tallos de cabello quebradizos e infectados se desprenden en el
cuero cabelludo, dejando los tallos de puntos negros.Tricho phyton tonsurans y
Trichophyton violaceum son los hongos más comunes implicados en esta forma
de dermatofitosis.
Infecciones que afectan a las uñas
Onicomicosis, que es una infección de las uñas, suele ser causada por
dermatofitos, pero también puede ser el resultado de una infección por
otros hongos. Estas infecciones de las uñas y del lecho ungueal pueden
estar entre las dermatomicosis más difíciles de tratar. La terapia costosa a
largo plazo con terbinafina o itraconazol se ha considerado el mejor
tratamiento, pero los resultados a menudo no son satisfactorios. Existe
una asociación directa entre las infecciones dermatofíticas de los pies o las
manos y las infecciones de las uñas. Es poco probable que alguien que
sufre de tinea pedis escape en cierta medida a la onicomicosis. La forma
subungueal es la forma más común de onicomicosis, descrita como lateral,
distal o proximal. Cualquiera de los extremos de la uña se infecta primero y
la propagación continúa hasta la placa de la uña. Las uñas se vuelven
gruesas, decoloradas y escamosas. Algunos agentes comunes que infectan
las uñas sonTrichophyton rubrum, T. mentagrophytes,y T. tonsurans, al
igual que Epidermophyton floccosum.
Tiña pedis
Entre la población humana que usa zapatos, la tinea pedis (pie de atleta) es una
enfermedad común. La infección surge cuando las escamas de la piel infectadas
entran en contacto con la piel expuesta a través de una alfombra, el piso de la
ducha u otras superficies compartidas para caminar / estar de pie donde no
siempre se usan zapatos. Se cree que las personas tienen una predisposición
genética a desarrollar la enfermedad porque no todas las personas que
encuentran escamas de piel infectadas se infectan. Las infecciones dentro de
una familia son comunes. Pueden estar afectados varios sitios del pie, pero la
tiña del pie suele afectar las plantas y las membranas de los dedos. En casos más
graves, la suela puede desarrollar descamación extensa, con fisuras y eritema.
La enfermedad puede progresar alrededor de los lados del pie desde la planta,
dando lugar al uso del términopie de mocasín, descriptivo del aspecto del área
infectada. Las infecciones de la piel glabra varían desde leves, con escamas y
eritema mínimos, hasta lesiones gravemente inflamadas.
Infecciones sistémicas por dermatofitos
Las personas inmunodeprimidas pueden sufrir infecciones sistémicas por
dermatofitos. La enfermedad diseminada aparece en diferentes formas. En
algunos pacientes, se manifiesta como granulomas, mientras que en otros
pueden desarrollarse nódulos del tamaño de un guisante o del tamaño de una
nuez. La biopsia de estos nódulos revela elementos fúngicos que se recuperan
fácilmente en cultivo. Este fenómeno se ha observado principalmente en
receptores de trasplante de riñón y se cree que se ha propagado a partir del pie
de atleta o la onicomicosis.
Epidermophyton floccosum
A pesar de que Epidermophyton floccosum produce solo un tamaño de
conidios, estos conidios se describen como macroconidios debido a su
tamaño. Los macroconidios lisos de paredes delgadas se producen
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en grupos o individualmente. El extremo distal del conidio es ancho o espatulado
y recuerda a la cola de un castor. Ocasionalmente, los conidios pueden ser
unicelulares, pero generalmente están separados en dos a cinco celdas por
paredes transversales perpendiculares.
Colonias de E. floccosum son de color amarillo a amarillo-tostado, son planas
con bordes emplumados y siguen siendo de pequeño diámetro. Epider
mophyton los aislados son conocidos por desarrollar mechones pleomórficos de
hifas estériles en cultivos más antiguos. Epidermophyton se distribuye en todo el
mundo.
Microsporum canis
Macroconidios de Microsporum canis tienen forma de huso, con paredes
gruesas y equinuladas; miden de 12 a 25µmetro × 35 hasta 110 µmy tener
de 3 a 15 celdas (Figura 27.14). Los extremos distales espinosos ahusados,
a veces alargados, de los macroconidios son características clave que
distinguen a esta especie. La mayoría de los aislamientos forman
abundantes microconidios, y estos pueden ser los únicos conidios
mantenidos en cultivos que se han transferido en serie. Las colonias son
esponjosas y blancas, y el reverso de la colonia generalmente desarrolla un
pigmento amarillo limón, especialmente en agar papa dextrosa. Este
hongo tiene una distribución mundial.
Microsporum gypseum
Los conidios fusiformes, de paredes moderadamente gruesas (Figura 27.15) típico de
Microsporum gypseum medir 8 a 15 µmetro × 25 hasta 60 µmy puede tener hasta seis
celdas. En algunos aislamientos, el extremo distal del macroconidio puede tener una
cola filamentosa delgada. Las abundantes macroconidias y microconidias producidas
por la mayoría de los aislamientos de esta especie dan como resultado una apariencia
granular y pulverulenta en las superficies de las colonias. Las colonias que forman
masas de conidias de color tostado a pulido son típicas de los aislados frescos, pero
esta especie tiende a desarrollar mechones pleomórficos de hifas blancas estériles en
cultivos envejecidos y después de transferencias seriadas. Se puede formar abundante
pigmento de color marrón a rojo debajo de algunas cepas, pero otras permanecen
incoloras.M. gypseum es una especie geofílica de rápido crecimiento que se encuentra
en suelos de todo el mundo.
Microsporum audouinii
Dermatofito antropomórfico de crecimiento lento, Microsporum audouinii
fue responsable de la mayor parte de la tinea capitis del parche gris en los
niños hasta hace unas décadas, cuando T. tonsurans reemplazado
HIGO. 27,14Microsporum canis mostrando macroconidios
equinulados en forma de huso con paredes gruesas y extremos
cónicos, que son características clave en la identificación de esta
especie (sin teñir,×450).

HIGO. 27.15Microsporum gypseum mostrando macroconidios fusiformes de
paredes moderadamente gruesas que contienen varias células (preparación de
azul de algodón de lactofenol, ×450).
HIGO. 27.16Trichophyton mentagrophytes mostrando microconidios
globosos en forma de lágrima (óptica Nomarski, ×450).
es la principal causa de infección del cuero cabelludo. En cultivo, los conidios
rara vez se producen. Algunas cepas forman inflamaciones de tipo
clamidoconidio en forma terminal en las hifas. Colonias deM. audouinii aparecen
de color blanco algodonoso y generalmente forman poco o ningún pigmento en
el reverso.
Trichophyton mentagrophytes
La microconidia (Figura 27.16) de Trichophyton mentagrophytesson
principalmente globosos, pero pueden tener forma de lágrima y medir entre 2,5
y 4 µm de diámetro. Los microconidios se encuentran principalmente en grupos
descritos como en forma de uva ("en grappe"). Los macroconidios son de
paredes delgadas, lisas y con forma de cigarro, con cuatro a cinco células
separadas por paredes transversales paralelas. Estos conidios miden alrededor
de 7µmetro × 20 hasta 50 µmy se producen individualmente en hifas
indiferenciadas.
La morfología de las colonias varía con el grado de producción de conidios.
Se observan colonias granulares cuando se forman abundantes microconidios.
En la forma vellosa, los conidios son menos abundantes. Comparado con otros
dermatofitos,T. mentagrophytes es un hongo de crecimiento relativamente
rápido. Esta especie se distribuye por todo el mundo.
Trichophyton rubrum
A pesar de que Trichophyton rubrum se sabe que produce macroconidios
cilíndricos de tres a ocho células que miden algo más pequeño
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Capitulo 27 Hongos de importancia médica 589
HIGO. 27,17Trichophyton rubrum mostrando microconidios en forma de
clavícula o clavija (preparación de azul de algodón de lactofenol, ×450).
que los de T. mentagrophytes, estos rara vez se observan en aislados clínicos.
Una imagen microscópica típica deT. rubrum contiene microconidios en forma
de clavícula o clavija (Figura 27.17) formado a lo largo de hifas indiferenciadas, e
incluso estas pueden ser escasas. Las colonias generalmente permanecen
blancas en la superficie, pero pueden ser de color amarillo a rojo. La mayoría de
las cepas desarrollan un pigmento de color vino rojo a burdeos intenso en el
reverso que se difunde en el agar. Esta especie tiene una distribución mundial.
Trichophyton tonsurans
Trichophyton tonsurans poseen microconidios que son extremadamente
variables en forma, que van desde una forma redonda hasta una forma de
clavija. Cuando se cultivan en agar dextrosa Sabouraud, las colonias suelen
formar un pigmento de color óxido en el reverso de la colonia.T. tonsurans,
que infecta la piel, el cabello y las uñas, se ha convertido en la principal
causa de tinea capitis en niños en muchas partes del mundo, incluido
Estados Unidos.
Agentes de micosis subcutáneas
Las micosis subcutáneas son enfermedades fúngicas que afectan
al tejido subcutáneo. Estas micosis suelen ser el resultado de la
implantación traumática de objetos extraños en las capas
profundas de la piel, lo que permite que el hongo ingrese al
huésped. Los agentes causales responsables son organismos que
se encuentran comúnmente en el suelo o en la vegetación en
descomposición; por lo tanto, los trabajadores agrícolas son los
más afectados. Los organismos que causan micosis subcutáneas
pertenecen a una variedad de géneros en la clase de forma
Hyphomycetes. Aunque algunos son moniliáceos (hialinos o de
color claro), muchos son feoides, producen colonias de
pigmentación oscura y contienen melanina en sus paredes
celulares. Las infecciones suelen ser crónicas y suelen incitar al
desarrollo de lesiones en el lugar del traumatismo.
Cromoblastomicosis
También conocido como dermatitis verrugosa y cromomicosis, La
cromoblastomicosis ocurre en todo el mundo, pero es más común en las
regiones tropicales y subtropicales de América y África. En los Estados
Unidos, la mayoría de los casos ocurren en Texas y Louisiana. Varios
organismos son responsables de la enfermedad y ciertos organismos
parecen residir en áreas endémicas específicas en todo el mundo. La
cromoblastomicosis es causada por varios agentes infecciosos, a saber,
590 PARTE 2 Identificación de laboratorio de aislamientos significativos
Fonsecaea compacta, Fonsecaea pedrosoi, Phialophora verrucosa,
Cladophialophora carrionii, y Rhinocladiella aquaspersa.
Manifestaciones clínicas. La cromoblastomicosis, una de las micosis
subcutáneas más comunes, es una infección crónica de la piel y el tejido
subcutáneo y se desarrolla durante un período de meses o, más comúnmente,
años. En su mayoría es asintomático en ausencia de complicaciones secundarias,
como infecciones bacterianas, degeneración carcinomatosa y elefantiasis. Las
lesiones generalmente se limitan a las extremidades, a menudo los pies y la
parte inferior de las piernas, y son el resultado de un traumatismo en estas
áreas. Las lesiones de la cromoblastomicosis suelen aparecer como nódulos
verrugosos que pueden ulcerarse y formar costras. Las lesiones de larga
duración tienen una superficie similar a la de una coliflor. En los tejidos se
observan cuerpos escleróticos redondos y marrones, que son estructuras que no
forman protuberancias que se presentan individualmente o en grupos. Estos
cuerpos escleróticos se reproducen dividiéndose en varios planos, dando lugar a
formas multicelulares. De vez en cuando, También se ven elementos hifales
cortos. La presencia de cuerpos escleróticos es diagnóstica de esta enfermedad.
Los machos están predominantemente infectados, lo que indica el papel de las
hormonas sexuales en el desarrollo de la enfermedad.Fonsecaea,
Cladophialophora carrionii, y Phialophora verrucosa causa la mayoría de los
casos de cromoblastomicosis.
Diagnóstico de laboratorio. La morfología microscópica de cada
uno de los agentes se describe en Cuadro 27.2. P. verrucosa y
C. carrionii se muestran en Figura 27.18. Los aislamientos se identifican sobre la
base de estructuras características, como la disposición de los conidios y la
forma en que nacen los conidios. Los organismos que causan la
cromoblastomicosis tienen una pigmentación oscura. El crecimiento es de
moderado a lento, y las colonias son aterciopeladas a lanudas y de color marrón
grisáceo a negro oliváceo. Las especies no se diferencian por la morfología de las
colonias porque todas producen características similares. Los enfoques
moleculares, como la secuenciación de genes ribosómicos, proporcionan una
identificación precisa a nivel de especie.
Micetomas eumicóticos
El micetoma es una infección granulomatosa crónica de los tejidos subcutáneos
y cutáneos que surge en el lugar de la inoculación. La enfermedad se caracteriza
por hinchazón, con un exudado característico que drena hacia la superficie de la
piel a través de los conductos nasales. Los micetomas pueden ser causados por
hongos o bacterias. Los causados por bacterias se denominanmicetomas
actinomicóticos, y los causados por
A B
HIGO. 27.18A, Conidios de Phialophora verrucosa en las puntas de fialidas con collaretes (óptica Nomarski, ×
1000). B, Disposición conidial de Cladophialophora carrionii (preparación de azul de algodón lactofenol, ×
1250). (Cortesía del Dr. Michael McGinnis.)
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Los agentes fúngicos se denominan micetomas eumicóticos. Aunque las
manifestaciones clínicas son similares para ambos tipos, la causa debe
determinarse porque la terapia para cada uno es diferente.
Los micetomas ocurren principalmente en áreas tropicales y
subtropicales, pero también se observan en zonas templadas. La
enfermedad es endémica en India, África y América del Sur. Aunque el
micetoma es una micosis poco común en los Estados Unidos, las siguientes
especies (en orden de aparición) son los agentes incriminados con mayor
frecuencia:Scedosporium boydii, Acremonium falciforme, también
conocido como Neocosmospora falciformis, Madurella mycetomatis,
Madurella grisea, y Exophiala spp. Examen microscópico directo de
MESA 27,2 Morfología microscópica de hongos
Causando Cromoblastomicosis
Organismo Morfología microscópica
Phialophora Células conidiógenas, feoides, en forma de matraz
verrucosa fialidas, con collaretes
Los conidios ovalados, unicelulares, ocurren en bolas en
puntas de fialides
Fonsecaea Conidios primarios unicelulares formados en
pedrosoi conidióforos simpodiales
Los conidios primarios funcionan como conidiógenos.
células para formar conidios unicelulares secundarios.
Algunas conidias son similares a las que se observan en
Cladophialophora sp., algunos son similares
a los de Rhinocladiella sp., y algunas son
similares a las de Phialophora sp. Similar aF.
Fonsecaea pedrosoi pero con mas compacta
compactum cabezas de conidios
Los conidios son subglobosos en lugar de ovoides.
Cladophialophora Conidióforos erectos con cadenas ramificadas.
carrionii de blastoconidios marrones unicelulares
Conidium cerca de la punta del conidióforo,
llamado celda de escudo
Cadenas frágiles
Rhinocladiella Conidióforos erectos, oscuros, con conidios
aquaspersa sólo en la porción superior cerca de la punta
Conidios elípticos, unicelulares, producidos
simpodialmente
 Capitulo 27 Hongos de importancia médica 591

A B
HIGO. 27.19Micetoma actinomicótico mostrando varillas filamentosas de ramificación fina en una muestra de tejido (
A), en comparación con los elementos hifas (tinción de hematoxilina y eosina ×1000) (B) visto en infecciones
eumicóticas (tinción de plata con metenamina de Gomori, ×1000).

MESA 27,3 Descripción de los gránulos que se ven en

Micetomas eumicóticos

Hongo Color Tamaño (mm) Textura

Scedosporium boydii blanco 0,5-1,0 Suave

Acremonium falciforme blanco 0,2-0,5 Suave

Madurella mycetomatis Negro 0,5–5,0 Duro

Madurella grisea Negro 0,3-0,6 Suave

Exophiala spp. Negro 0,2-0,3 Suave

los gránulos recogidos de la lesión que supura inmediatamente diferencian los

micetomas eumicóticos de los actinomicóticos (Cuadro 27.3).Figura 27.19A
muestra las varillas filamentosas ramificadas de actinomicetos en contraste con
HIGO. 27.20Scedosporium boydii anamorfo de Pseudallescheria
boydii (Óptica Nomarski, ×625).
los elementos hifales que se observan en las infecciones eumicóticas (ver Figura
27.19B).
Scedosporium boydii. Anteriormente, se pensaba que
Scedosporium apiospermum era el estado anamórfico de S. boydii,
pero la caracterización molecular ha revelado que S. boydii y S.
apiospermum son especies diferentes. Pseudoallescheria boydii, el
teleomorfo y el anamorfo, S boydii, se consideran actualmente como
la misma especie. Similar,P. apiospermia (teleomorfo) y su anamorfo
S. apiospermia son la misma especie. El anamorfoS boydii, produce
conidios ovalados por separado en las puntas de las células
conidiógenas (células que producen conidios) conocidas como
annellides (Figura 27.20). El teleomorfoP. boydii, se nota por la
formación de cleistotecios que contienen ascosporas (Figura 27.21).
Este fenómeno ocurre en hongos que son homotálicos (capacidad de
un solo organismo de experimentar reproducción sexual sin pareja).
Este aislado crece rápidamente y produce colonias de color blanco a
gris oscuro en agar papa dextrosa a 22 ° y 35 ° C. Las opiniones sobre HIGO. 27.21Estructuras sexuales (cleistotecios que contienen ascosporas)
este hongo difieren en relación a que sea hialino o feoide. de Pseudallescheria boydii (Óptica Nomarski, ×325).
Fusarium falciforme. Fusarium (Acremonium) falciformeproduce
grupos mucoides de conidios unicelulares o bicelulares ligeramente
curvados que nacen de fialides en las puntas de conidióforos largos, no Aproximadamente el 50% de los aislamientos de M. mycetomatis producen
ramificados y multiseptados. Los conidios se mantienen juntos en grupos conidios de las puntas de los fialides, pero muchos permanecen estériles. Esta
mucoides en los ápices de los fialides. Este aislado es un moho hialino, especie crece muy lentamente, pero inicialmente es blanca, y se vuelve amarilla,
tabicado y filamentoso. Las colonias crecen lentamente y son de color olivácea o marrón, con un pigmento marrón difusible característico con la edad.
marrón grisáceo, volviéndose violeta grisáceo. Crece mejor a 37 ° C, con un crecimiento más lento a 40 ° C. El análisis de ADN
Madurella. Madurella mycetomatis causa la mayoría de los casos de condujo a la formación de nuevas especies anteriormente nombradasM.
micetoma eumicótico. Madurella spp. son hongos feoides septados. mycetomatis.

ERRNVPHGLFRVRUJ
592 PARTE 2 Identificación de laboratorio de aislamientos significativos

Feohifomicosis subcutánea
La feifomicosis es una enfermedad micótica causada por hongos de
pigmentación oscura u hongos que tienen melanina en sus paredes
celulares. El término "feofifomicosis" se acuñó para distinguir varias
infecciones clínicas causadas por hongos feoides de las distintas
entidades clínicas conocidas como cromoblastomicosis. En el tejido,
estos hongos pueden formar células parecidas a levaduras que son
solitarias o en cadenas cortas o hifas que están septadas, ramificadas
o no ramificadas y, a menudo, hinchadas hasta convertirse en
toruloides (irregulares o con cuentas). Los agentes responsables de
estas micosis son organismos que se encuentran comúnmente en la
naturaleza, que abarcan muchos géneros de Hyphomycetes,
Coelomycetes y Ascomycetes. Los hongos que parecen estar
asociados regularmente con esta afección incluyenExophiala spp.,
como Exophiala dermatitidis. En Recuadro 27.1.
Con la mayoría Exophiala spp., los conidios nacen de annellides, con conidios
que se agregan en masas en las puntas del conidióforo, como se ve en Figura
27.22. E. dermatitidis, sin embargo, forma conidios en las puntas de los fialides (
Figura 27.23). Este grupo de hongos produce colonias de oliváceas a negras que
inicialmente son similares a las levaduras pero se vuelven aterciopeladas en la
madurez.
Sporothrix schenckii Complejo de especies
Manifestaciones clínicas. La presentación más común de
Sporothrix schenckii La infección del complejo de especies es la
esporotricosis linfocutánea. Esta infección crónica se caracteriza por
lesiones nodulares y ulcerativas a lo largo de los canales linfáticos que
CAJA 27,1 Géneros feoides que incitan a la vía subcutánea
drenar el sitio principal de inoculación. Los estados patológicos que se
observan con menos frecuencia incluyen la esporotricosis cutánea fija, en
la que la infección se limita al sitio de inoculación y la esporotricosis
mucocutánea, una afección relativamente rara. También puede ocurrir
esporotricosis pulmonar primaria y secundaria y formas extracutáneas y
diseminadas de la enfermedad.
Los miembros de este complejo se recuperan comúnmente del suelo y
están asociados con vegetación en descomposición. Se pueden distribuir
en todo el mundo, especialmente en áreas cálidas y áridas, como México, y
también en regiones húmedas y húmedas, como Brasil, Uruguay y
Sudáfrica. En países templados, como Francia, Canadá y Estados Unidos, la
mayoría de los casos de esporotricosis están asociados con la jardinería, en
particular con la exposición a espinas de rosas (enfermedad del
manipulador de rosas) y musgo sphagnum.
Diagnóstico de laboratorio. El examen directo del tejido puede revelar
miembros del S. schenckii especies complejas como pequeñas levaduras en
forma de cigarro (Figura 27.24A). Aunque el microorganismo se ve
ocasionalmente en un frotis teñido con Gram, las cantidades húmedas de
material a menudo no son gratificantes debido a la pequeña cantidad de
microorganismos presentes. El examen microscópico del cultivo revela hifas
delgadas y delicadas con conidios que se desarrollan en forma de roseta en los
extremos de los delicados conidióforos. Los conidios de paredes oscuras
también se producen a lo largo de los lados de las hifas y pueden verse más
fácilmente que las rosetas en cultivos maduros (verFigura 27.24B).
Debido a que los miembros de este complejo son dimórficos, los cultivos se
examinan a 22 ° y 37 ° C. Estos hongos crecen bien en la mayoría de los medios
de cultivo, incluidos los que contienen cicloheximida. La morfología de la colonia
a 22 ° C puede ser variable. A esta temperatura, las colonias suelen ser
inicialmente blancas, glabras y parecidas a levaduras, volviéndose más oscuras y
más miceliales a medida que maduran. La demostración del dimorfismo es

Feohifomicosisa importante para la identificación de estas especies. Para inducir la conversión del
micelio en levadura, el hongo se inocula en agar de infusión de cerebro-corazón
Alternaria Mycocentrospora (BHI) suplementado con glóbulos rojos de oveja y se incuba a 37 ° C en un CO2
Bipolaris Ochroconis / Verruconis incubadora. La formación de colonias de levadura puede requerir varios
Chaetomium Oidiodendron subcultivos. Rara vez ocurre una conversión completa, pero una parte de la
Cladosporium Feosclera
colonia desarrollará células similares a levaduras.
Curvularia Phialophora
Dactylaria Phoma
Exophiala Ulocladium
Fonsecaea Xilohipha Agentes de micosis sistémicas
Los organismos que causan enfermedades fúngicas sistémicas clásicas
aEsta lista no es del todo inclusiva.
históricamente se han clasificado juntos porque comparten varios

HIGO. 27.23Conidios de Exophiala dermatitidis en las puntas de los

HIGO. 27.22Conidios de Exophiala sp. soportado en las puntas de los fialidos, así como el sinanamorfo de levadura negra (óptica Nomarski,
annelides (óptica Nomarski,×1250.) ×1250.)

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 Capitulo 27 Hongos de importancia médica 593

A B
HIGO. 27,24A, Fase de levadura de Sporothrix schenckii mostrando células de levadura en forma de cigarro típicas
de la especie (óptica Nomarski, ×625). B, Fase de molde de S. schenckii revelando conidios hialinos que nacen en los
extremos del conidióforo en "rosetas", así como conidios feoides a lo largo de los lados de las hifas (óptica Nomarski,
×625).

MESA 27,4 Morfología de hongos sistémicosa MESA 27,5 Conversión de moho a levadura de térmicamente
Hongos dimórficosa
Macroscópico
Hongo Morfología Morfología microscópica
Medios de cultivo y
Hongo Temperatura Forma de levadura
Blastomyces Lento a moderado Ovalada, piriforme a globosa
dermatitis crecimiento conidios suaves transmitidos
Blastomyces Agar sangre, 37 ° C Levadura grande (8-12 µm)
Colonias jóvenes de blanco a en corto, lateral dermatitis Blastoconidios adheridos
bronceado oscuro conidióforos en forma de hifal
por amplia base
tenaz, mayor Histoplasma Pinos medio, Levadura pequeña y ovalada
colonias glabras capsulatum glucosa-cisteína- (2-5 µmetro)
a lanoso sangre, o BHI
Histoplasma Crecimiento lento Microconidios pequeños, uno
agar-sangre, 37 ° C
capsulatum Blanco a bronceado oscuro celular, redondo, liso Paracoccidioides Agar BHI-sangre Múltiples blastoconidias
con edad (2-5 µmetro)
brasiliensis agar, 37 ° C brotando de
Lanoso, algodonoso o Macroconidios tuberculados levadura grande
granular grande, redonda (7-12 µm) (15-30 µmetro)
Conidióforos en forma de hifas,
Coccidioides Crecimiento rápido unicelulares alternos, BHI, Infusión cerebro-corazón.
immitis, Blanco para broncear "En forma de barril" aCoccidioides immitis se puede convertir a la fase esférica en medio Converse
Coccidioides gris oscuro artroconidios con modificado a 40 ° C en dióxido de carbono del 5% al 10%. Se prefiere la prueba con
posadasii Colonias jóvenes celdas disyuntivas sonda de ADN a este procedimiento en el laboratorio clínico de rutina.
tenaz, mayor
colonias algodonosas
Tienden a crecer en
anillos concéntricos cuando se incuba a 35 ° a 37 ° C en medios enriquecidos con mayor
Paracoccidioides Crecimiento lento Colonias frecuentemente solo
concentración de CO2 (Cuadro 27.5). Cada agente tiene un área
brasiliensis Blanco a beige Producen hifas estériles. Los
endémica bastante bien definida. Las enfermedades se contraen
Colonia glabra, aislados frescos pueden
generalmente por inhalación de conidios infecciosos.Cuadro 27.6
correoso, plano para producir conidios
arrugado, doblado similares a los de B. resume las micosis sistémicas, sus agentes y sus características.
o aterciopelado dermatitis Todos los procedimientos de laboratorio para recuperar e identificar
estos agentes deben realizarse en una cabina de seguridad biológica.
aA 22 ° C.
Blastomyces dermatitidis
Manifestaciones clínicas. La blastomicosis es más prevalente en hombres
características, como modo de transmisión, dimorfismo y de mediana edad, al igual que otras micosis sistémicas, presumiblemente
diseminación sistémica. Aunque el términosistémico generalmente se porque la exposición ocupacional y recreativa al suelo suele ser mayor entre los
refiere a los organismos descritos aquí, debe entenderse que hombres. Aunque los pacientes con infección primaria pueden presentar
cualquier hongo, en un huésped inmunodeprimido, tiene el potencial síntomas parecidos a los de la gripe, la mayoría son asintomáticos y no pueden
de volverse invasivo y diseminarse a sitios muy alejados de la puerta definir con precisión el momento de aparición. Cuando la enfermedad primaria
de entrada. no se resuelve, puede aparecer una enfermedad pulmonar con tos, pérdida de
La morfología del dimórfico sistémico a 22 ° C se describe en Cuadro peso, dolor torácico y fiebre. Puede seguir una enfermedad pulmonar progresiva
27.4. Se produce la conversión a la forma de levadura o esférula. o invasiva, lo que resulta en lesiones ulcerativas de la piel y

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594 PARTE 2 Identificación de laboratorio de aislamientos significativos

MESA 27,6 Resumen de micosis sistémicas

Hongo Ecología Enfermedad clínica Forma de tejido

Blastomyces dermatitidis Valles de los ríos Mississippi y Ohio Pulmón primario Levadura grande (8-12 µm)
Hueso cutáneo crónico Brote de base ancha
Sistémico, multiorgánico
Histoplasma capsulatuma Ohio, Misuri y Misisipi Pulmón primario Levadura pequeña y ovalada (2-5 µm) en

valles de los ríos Asintomático histiocitos, fagocitos

Guano de aves y Huéspedes inmunodeficientes propensos a

murciélagos Suelo alcalino enfermedad diseminada

Coccidioides immitis, C. Regiones semiáridas: suroeste Pulmón primario Esferulas (30–60 µmetro)
posadasii Estados Unidos, México, Asintomático que contiene endosporas
Centro y Sudamérica Cavitario secundario
En suelo Pulmonar progresivo
Multisistema
Paracoccidioides América Central y del Sur En Pulmón primario Levaduras de pared gruesa (15-30 µm)
brasiliensis suelo Granulomatoso Varias yemas, "mariner's
Lesiones ulcerativas nasales y bucales rueda"
Afectación de los ganglios linfáticos
Suprarrenales

aHistoplasma capsulatum (teleomorfo Ajellomyces capsulatus). Histoplasma capsulatum var. duboisii es endémica en África Central.

hueso. En el paciente inmunodeprimido, pueden estar involucrados múltiples

sistemas orgánicos y el curso puede ser rápidamente fatal.
La blastomicosis también se conoce como Enfermedad de Gilchrist,
blastomicosis norteamericana, y Enfermedad de Chicago. Ocurre
principalmente en América del Norte y partes de África. En los Estados
Unidos, es endémica en las cuencas de los ríos Mississippi y Ohio. También
se han producido brotes esporádicos de fuentes puntuales en la cuenca del
río San Lorenzo. El reservorio natural no se ha establecido de manera
inequívoca, aunque el organismo se ha recuperado del suelo y de algunos
ambientes naturales. Aparentemente, solo una gama muy estrecha de
condiciones apoya su crecimiento. En áreas en las que el organismo parece
endémico, la enfermedad natural ocurre en perros y caballos, y el proceso
de la enfermedad imita el observado en las infecciones humanas.
Actualmente, dos especies de Blastomyces son conocidos, Blastomyces
dermatitidis y Blastomyces gilchristii. Morfológicamente, las dos especies HIGO. 27.25Conversión de la fase de molde de Blastomyces dermatitidis a
son indistinguibles. B. gilchristii puede identificarse utilizando las la forma de levadura de cogollos de base amplia (óptica Nomarski,×1250).

secuencias del espaciador transcrito interno 2 del gen del ácido

ribonucleico ribosómico nuclear (ARN). El teleomorfo o forma sexual deB.
dermatitidis es nombrado Ajellomyces dermatitidis.Ocurre solo en
ambientes rígidamente controlados mediante el apareamiento de
aislamientos con cepas de prueba para producir gimnotecia que contiene
ascosporas. Este teleomorfo no ocurre en el laboratorio de rutina porque
la especie es heterotálica y requiere dos cepas de apareamiento para
producir la forma sexual.
Diagnóstico de laboratorio. El examen de tejido o material purulento
en las lesiones cutáneas de la piel puede revelar células de levadura
grandes, esféricas y refráctiles, 8 a 15 µm de diámetro, con una pared de
doble contorno y brotes conectados por una base ancha (Figura 27.25). Se
puede usar KOH (10%) o calcofluor white (un tinte fluorescente) para
mejorar la detección de las células de levadura. En la fase del moho, los
conidios nacen en ramas laterales cortas que tienen forma de ovoide a
mancuerna y varían en diámetro de 2 a 10µmetro. Debido a que se
parecen a una variedad de otros hongos, los microconidios no son
diagnósticos (Figura 27.26). Un inmunoensayo enzimático (EIA) realizado
en suero y sangre tiene una sensibilidad de aproximadamente el 89%, pero HIGO. 27.26Fase de molde de Blastomyces dermatitidis cultivado en
la especificidad es baja (79%). agar copos de patata (óptica Nomarski, ×1250).

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 Capitulo 27 Hongos de importancia médica 595

En cultivo a 22 ° C, el organismo puede producir una variedad de

morfologías de colonias —blancas, tostadas o pardas— y pueden ser esponjosas
o glabras. Con frecuencia, las áreas elevadas, denominadasespículas, se ven en
los centros de las colonias. Cuando se cultiva a 37 ° C en un medio adecuado,B.
dermatitidis produce células de levadura características, de base amplia y en
ciernes. La fase micelial de los hongos dimórficos sistémicos:B. dermatitidis, B.
gilchristii, Cocccidioides immitis, Cocccidioides posadasii, Histoplasma
capsulatum, y Paracoccidioides brasiliensis—Requiere identificación
confirmatoria, típicamente mediante sonda de ADN y secuenciación de ADN.
Debido a su baja sensibilidad y especificidad, generalmente no se utilizan
métodos de detección de antígenos.

Coccidioides Especies
Manifestaciones clínicas. Coccidioides spp. son probablemente los HIGO. 27.27Esferulas de Coccidioides immitis en tejido×300).
más virulentos de todos los agentes micóticos humanos. Dos especies muy
similares que infectan a los humanos sonC. immitis y C. posadasii. La
inhalación de unas pocas artroconidias produce coccidioidomicosis
primaria. Las infecciones clínicas incluyen enfermedad pulmonar
asintomática y manifestaciones alérgicas. La alergia puede manifestarse
como eritema tóxico, eritema nudoso (protuberancias del desierto),
eritema multiforme (fiebre del valle) y artritis (reumatismo del desierto). La
enfermedad primaria generalmente se resuelve sin terapia y confiere una
inmunidad fuerte y específica a la reinfección, que se detecta mediante la
prueba cutánea de coccidioidina.
En pacientes sintomáticos, pueden presentarse fiebre, dificultad
respiratoria, tos, anorexia, cefalea, malestar y mialgia durante 6 semanas o
más. Luego, la enfermedad puede progresar a coccidioidomicosis
secundaria, que puede incluir nódulos, enfermedad pulmonar cavitaria y /
o enfermedad pulmonar progresiva. La diseminación de un solo sistema o
multisistema sigue en aproximadamente el 1% de esta población. Los HIGO. 27.28Fase de molde de Coccidioides immitis, 25 ° C (óptica
filipinos y los negros corren el mayor riesgo de diseminación, siendo la
Nomarski, ×1250).

afectación meníngea un resultado común de la enfermedad diseminada.

Se ha informado que la proporción de distribución por sexos para la
enfermedad clínicamente aparente favorece a los hombres. La excepción
son las mujeres embarazadas, en las que la tasa de difusión es igual o
superior a la de los hombres.
Coccidioides spp. residen en un estrecho nicho ecológico conocido
como elZona de vida del Bajo Sonora, que se caracteriza por la escasez de
precipitaciones y las condiciones semiáridas. Las áreas altamente
endémicas incluyen el Valle de San Joaquín de California, los condados de
Maricopa y Pima de Arizona y el suroeste de Texas. Fuera de los Estados
Unidos, las áreas endémicas se encuentran en el norte de México,
Guatemala, Honduras, Venezuela, Paraguay, Argentina y Colombia. Debido
a que son morfológicamente idénticos, se requiere una evaluación
molecular para diferenciarC. immitis de C. posadasii. Parece que la especie
se puede rastrear hasta ubicaciones geográficas específicas. C. immitisse
encuentra en la región del Valle de San Joaquín de California, mientras que
C. posadasii se encuentra en las áreas desérticas del suroeste de Estados
Unidos, México y América del Sur.
Diagnóstico de laboratorio. Después de la inhalación, las artroconidias en forma
de barril, que miden 2,5 a 4 µmetro × 3 hasta 6 µm, redondee hacia arriba a medida
que se convierten en esférulas. En la madurez, las esférulas (30 a 60µm) producir
endosporas mediante un proceso conocido como escisión progresiva;la ruptura de la
pared de la esférula libera las endosporas en el torrente sanguíneo y los tejidos
circundantes. Estas endosporas, a su vez, forman nuevas esférulas (Figura 27.27). El
examen de frotis directo de las secreciones puede revelar las esférulas que contienen
las endosporas. Se debe tener precaución cuando el diagnóstico se realiza únicamente
por medios histopatológicos. Las esférulas pequeñas y vacías pueden parecerse a la
levadura.
células de B. dermatitidis, y las endosporas se pueden confundir con las
células de C. neoformans, H. capsulatum, y P. brasiliensis.Los métodos de
detección directa de antígenos son limitados.
El examen microscópico del cultivo muestra hifas fértiles que surgen en
ángulo recto con las hifas vegetativas, produciendo artroconidias hialinas
alternas (separadas por una célula disyuntiva) (Figura 27.28). Cuando se
liberan, los conidios tienen un volante anular en ambos extremos. A
medida que envejece el cultivo, las hifas vegetativas también se
fragmentan en artroconidios. A pesar de queCoccidioides spp. no se
convierten fácilmente a la etapa de esférula a 37 ° C en el laboratorio,
producen una variedad de morfologías de moho a 22 ° C. El crecimiento
inicial, que ocurre dentro de 3 a 4 días, es de blanco a gris, húmedo y
glabro. Las colonias desarrollan rápidamente abundante micelio aéreo y la
colonia parece agrandarse en una flor circular. Las colonias maduras
generalmente se vuelven de color bronceado a marrón a lavanda.
Histoplasma capsulatum
Manifestaciones clínicas. La histoplasmosis se adquiere por inhalación de
las microconidias de Histoplasma capsulatum. Los microconidios son
fagocitados por macrófagos en el parénquima pulmonar. En el huésped con
defensas inmunitarias intactas, la infección es limitada y generalmente
asintomática, con las únicas secuelas de áreas de calcificación en los pulmones,
hígado y bazo. Sin embargo, con una exposición intensa, puede producirse una
enfermedad pulmonar aguda. En la forma leve de la enfermedad, los
organismos viables permanecen en el huésped, inactivos durante años, y son la
presunta fuente de reactivación.

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596 PARTE 2 Identificación de laboratorio de aislamientos significativos

en personas con sistemas inmunitarios abrogados. En individuos
inmunodeprimidos,H. capsulatum puede causar una enfermedad
diseminada progresiva y potencialmente mortal. También puede ocurrir
histoplasmosis pulmonar crónica en pacientes con enfermedad pulmonar
obstructiva crónica. Otras diversas manifestaciones de la enfermedad
incluyen mediastinitis, pericarditis y lesiones mucocutáneas.
H. capsulatum causa histoplasmosis, también conocida como retículo
citomicosis endotelial, enfermedad de las cavernas, enfermedad del
espeleólogo, yEnfermedad de Darling. La histoplasmosis ocurre en todo el
mundo. La endemicidad más alta en los Estados Unidos se encuentra en los
deltas de los ríos Ohio, Missouri y Mississippi. Este organismo reside en suelos
con un alto contenido de nitrógeno, particularmente en áreas muy
contaminadas con guano de murciélagos y aves. Las pruebas cutáneas
demostraron previamente que alrededor del 80% de la población de residentes a
largo plazo en áreas endémicas ha sido infectada.H. capsulatum var. duboisii,
endémica en África Central, causa una forma clínicamente distinta de
enfermedad que afecta principalmente a la piel y los huesos, mientras que H.
capsulatum var. farciminosumcausa linfangitis epizoótica en caballos y mulas.
Histoplasma capsulatum, igual que B. dermatitidis, es un ascomiceto
heterotálico que produce un estado teleomórfico, Ajellomyces capsulatus,
cuando se combina con las cepas de prueba adecuadas.
Diagnóstico de laboratorio. El examen cuidadoso de las preparaciones de
frotis directo de muestras para histoplasmosis revela con frecuencia las
pequeñas células de levadura de H. capsulatum, particularmente en infecciones
observadas en huéspedes inmunodeficientes. Las células de levadura miden de
2 a 3µmetro× 4 a 5 µmetro. Cuando los frotis se tiñen con tinción de Giemsa o
Wright, las células de levadura se ven comúnmente dentro de los monocitos y
macrófagos, ocurriendo en cantidades significativas, como se muestra enFigura
27.29A. Las células pequeñas, cuando se encuentran en el tejido (verFigura
27.29B), se asemejan a las blastoconidias de Candida glabrata,pero pueden
diferenciarse mediante técnicas o cultivo de anticuerpos fluorescentes (FA).
midiendo 2 a 5 µmetro. A medida que la colonia madura, se forman grandes
macroconidios equinulados o tuberculados característicos de la especie (Figura
27.30).
La detección directa de antígenos y los procedimientos serológicos para el
diagnóstico de histoplasmosis pueden ser complementos de los métodos de
cultivo. Usando métodos de EIA,H. capsulatum el antígeno se puede detectar en
suero, LCR y orina con una sensibilidad de aproximadamente el 95%. Otros
ensayos incluyen fijación del complemento, inmunodifusión y aglutinación de
látex para detectar anticuerpos circulantes, junto con microscopía FA para
detectar elementos fúngicos viables o no viables en secciones de tejido.
Actualmente, la prueba más útil para el diagnóstico rápido de histoplasmosis es
la combinación de un sistema de hibridación de ADN y secuenciación de ADN. Sin
embargo, el costo de mantenimiento de equipos para procedimientos
moleculares sigue siendo un desafío para las regiones con recursos limitados.
Paracoccidioides brasiliensis
Manifestaciones clínicas. Aunque la principal vía de infección para
Paracoccidioides brasiliensis es pulmonar y la infección suele ser
asintomática y no aparente, la diseminación posterior conduce a la
formación de lesiones granulomatosas ulcerativas de la mucosa bucal,
nasal y ocasionalmente gastrointestinal. También es evidente una
afectación concomitante de los ganglios linfáticos llamativos. A pesar de
queP. brasiliensis tiene un rango de temperatura bastante estrecho

Aunque los microconidios pueden parecerse Chrysosporium spp. y las

macroconidias se asemejanSepedonio spp., ambos saprobios no producen
dos tipos de conidios en un solo cultivo, ni son dimórficos. La conversión
de la forma de moho a la forma de levadura, utilizando agar BHI incubado
a 37 ° C, es confirmatoria paraH. capsulatum.Aunque rara vez se observa
una conversión completa, una combinación de formas de micelio y
levadura es suficiente para la identificación.
H. capsulatum crece como un moho de color blanco a marrón. El crecimiento HIGO. 27.30Grandes macroconidios tuberculados de Histoplasma
temprano del cultivo de micelios produce microconidios redondos a piriformes capsulatum (Óptica Nomarski, ×1250).

A B
HIGO. 27,29A, Aspirado de médula ósea teñido con tinción de Giemsa que muestra las células de levadura de
Histoplasma capsulatum dentro de los monocitos×1200). B, Fase tisular de H. capsulatum (Tinción de metileno
Gomori, ×1200).

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HIGO. 27,31Fase de levadura ("rueda de marinero") de Paracoccidioides
brasiliensis con brotación multipolar (óptica Nomarski, ×1250).
la tolerancia, como lo demuestra su predilección por el crecimiento en áreas más
frías del cuerpo (nasal y orofaríngea), la diseminación a otros órganos,
particularmente las glándulas suprarrenales, ocurre con las defensas
comprometidas del huésped. P. brasiliensis es el agente causante de la
paracoccidioidomicosis (blastomicosis sudamericana, blastomicosis brasileña,
enfermedad de Lutz-Splendore-Almeida, granuloma paracoccidioide), una
enfermedad fúngica crónica y progresiva endémica de América Central y del Sur.
Las áreas geográficas de mayor incidencia son típicamente áreas húmedas, de
alta precipitación, con condiciones de suelo ácidas.
Diagnóstico de laboratorio. El examen microscópico directo de las
lesiones cutáneas y mucosas demuestra las células de levadura
características. La levadura en ciernes típica mide de 15 a 30µm de
diámetro con brotes multipolares en la periferia, que se asemejan a la
rueda de un marinero (Figura 27.31). Estas células hijas (2 a 5µm) están
conectados por una base estrecha, a diferencia del accesorio de base
amplia en B. dermatitidis. Pueden producirse muchos brotes de varios
tamaños, o puede haber solo unos pocos brotes, lo que da la apariencia de
la llamada gorra de Mickey Mouse a la célula de levadura.
P. brasiliensis produce una variedad de morfologías de moho cuando
cultivadas a 22 ° C.Las colonias planas son glabras a coriáceas, arrugadas a
dobladas, flojas a aterciopeladas y de rosa a beige a marrón con un
reverso de color marrón amarillento, que se asemeja a las de B.
dermatitidis.Microscópicamente, la forma del molde produce pequeños (2
a 10 µm de diámetro), conidios unicelulares, generalmente indistinguibles
de los observados con la fase de moho de B. dermatitidis o las
microconidias de H. capsulatum. En agar sangre BHI, a 37 ° C, la fase
micelial se convierte rápidamente en la fase de levadura.
Talaromyces marneffei
Manifestaciones clínicas. Talaromyces (Penicillium) marneffeies único
entre los Talaromyces spp., siendo dimórfico. Es el único patógeno
verdadero del género.T. marneffei es una causa común de infección
sistémica en pacientes inmunodeprimidos que han visitado la región
endémica del sudeste asiático. Esto incluye a pacientes con SIDA,
neoplasias hematológicas o enfermedades autoinmunes y pacientes que
se someten a trasplantes de órganos. Las infecciones suelen ser de
diseminación, con afectación de múltiples órganos. El hongo se puede
aislar de lesiones cutáneas, que están presentes con frecuencia en
individuos infectados. La enfermedad diseminada suele ser mortal. Los
estudios mostraron que la tasa de mortalidad fue de aproximadamente el
28% entre los pacientes que no tenían SIDA y que recibieron la terapia
antimicótica adecuada.
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Capitulo 27 Hongos de importancia médica 597
Diagnóstico de laboratorio. Las células de levadura de T. marneffei
puede detectarse en frotis teñidos con Wright de lesiones cutáneas o
muestras de biopsia. Las celdas deT. marneffei parecerse a los de H.
capsulatum, ovalada a cilíndrica, de 3 a 6 µm de largo, y puede tener una
pared transversal. La forma del moho tiene hifas vegetativas aéreas de
color verde escaso y marrón rojizo y produce un pigmento difusible de
color rojo. Se han descrito pruebas de reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) para confirmar la identificación. Se ha demostrado que las pruebas
serológicas son importantes en el diagnóstico temprano; sin embargo, no
están disponibles comercialmente.
Agentes de micosis oportunistas
Los términos saprobe y saprofito se han utilizado para describir
microorganismos de vida libre que están presentes en el medio ambiente
pero que no suelen ser motivo de preocupación con respecto a las
enfermedades humanas. La línea entre organismos sapróbicos y parásitos
o patógenos es cada vez más borrosa. La principal razón de este desarrollo
es el creciente número de personas con defectos en su sistema
inmunológico. Durante varias décadas, la ciencia médica ha realizado
avances en los tratamientos para prolongar y prolongar la vida. Un efecto
secundario grave de procedimientos como el trasplante de órganos y la
quimioterapia contra el cáncer es la agresión a las defensas del huésped a
corto o largo plazo. La propagación del SIDA ha agravado enormemente el
problema. Las personas con SIDA constituyen los principales objetivos de
infección por una amplia variedad de microorganismos, incluidos los
hongos patógenos reconocidos y una lista creciente de hongos que antes
se consideraban inofensivos.
Los tipos de enfermedades causadas por estos hongos son tan variados
como la especie, a veces más, porque un hongo dado puede tener múltiples
presentaciones clínicas. Las heridas quirúrgicas son puntos ideales de
inoculación, lo que permite que los saprobios se conviertan en agentes
oportunistas de la enfermedad. Las infecciones de la piel y del lecho ungueal, así
como las infecciones respiratorias graves, pueden ser causadas por una variedad
de hongos en pacientes con SIDA. A continuación se presenta una discusión de
los saprobios más comunes que se han asociado con infecciones oportunistas.
Se han descrito las características morfológicas de cada especie de hongos. Estos
hongos se encuentran en todo el mundo en el medio ambiente, a menudo
asociados con la vegetación en descomposición.
Mucorales
Los mucorales son aislamientos ambientales comunes asociados con el
suelo y las plantas. Contaminan cereales, panes y frutas y, con mayor
frecuencia, se asocian con infecciones de los senos nasales, los pulmones y
la piel de pacientes inmunodeprimidos. Los estudios han indicado una
mayor incidencia de mucormicosis. La diabetes es un factor de riesgo
importante para estas infecciones.
Cunninghamella. Cunninghamella spp. se puede recuperar de los senos
nasales u otros órganos durante la enfermedad diseminada. Encontrado en todo
el mundo, este aislado es común en el medio ambiente. Los esporangióforos
están erectos y se ramifican en varias vesículas que llevan esporangióolos (
Figura 27.32), y puede estar cubierto de espinas largas y finas. Estos organismos
crecen rápidamente y forman una colonia algodonosa que inicialmente es
blanca pero se vuelve gris con la edad.
Lichtheimia. Lichtheimia spp. tienen predilección por la invasión
vascular, provocando trombosis y necrosis de los tejidos. Este agente,
junto con otros hongos del orden Mucorales, suele encontrarse en
pacientes con diabetes y cetoacidosis. En esta población de pacientes,
la infección suele comenzar en los senos paranasales, donde los
conidios se inhalan y se instalan. De los senos nasales
598 PARTE 2 Identificación de laboratorio de aislamientos significativos
HIGO. 27,32Cunninghamella sp. (lactofenol algodón azul,×450).
HIGO. 27,33Lichtheimia sp. (Óptica Nomarski,×450).
la infección se propaga rápidamente a las órbitas, la cara, el paladar y el
cerebro. Esta presentación se conoce comomucormicosis rinocerebral. Se
han observado otros sitios de infección en pacientes con cáncer, en los que
ocurren enfermedades cutáneas, subcutáneas y sistémicas.Lichtheimia
spp. se encuentran en todo el mundo y a menudo se asocian con el suelo o
la materia orgánica en descomposición.
Lichtheimia Las hifas son anchas y en forma de cinta, con pocos tabiques (
Figura 27.33). Los esporangióforos erectos, solitarios o en grupos (ligeramente
ramificados), terminan en una apófisis rodeada por un esporangio. Las
esporangiosporas son lisas y ovoides. Internodalrizoides (están presentes
proyecciones cortas y delgadas que anclan las células en crecimiento al
sustrato). Las colonias son lanosas y crecen rápidamente, cubriendo
completamente el medio de cultivo. El color de la colonia es inicialmente blanco,
volviéndose de gris a marrón grisáceo con la edad.
Mucor. Como ocurre con otros Mucorales, Mucor spp. se han implicado en la
mucormicosis rinocerebral además de en la enfermedad diseminada.Mucor spp.
son comúnmente aislados del medio ambiente en todo el mundo. Las
esporangiosporas se forman en esporangios en esporangióforos erectos (Figura
27.34). Los rizoides, típicos de algunos Mucorales, están ausentes en la mayoría
deMucor spp. Los esporangios permanecen intactos con frecuencia, a diferencia
deRhizopus spp., en el que los esporangios suelen colapsar. Mucor spp. crecen
rápidamente y forman colonias algodonosas y blancas sucias que se vuelven de
un marrón ratonil a gris con la edad.
Rhizopus. Rhizopus spp. son los mucorales más comunes que causan
enfermedades humanas. Estos suelen estar implicados en pacientes con
diabetes y cetoacidosis, que se presentan como mucormicosis
rinocerebral.Rhizopus spp. puede ser refractario al tratamiento y
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HIGO. 27,34Mucor sp. (sin manchar,×450).
HIGO. 27,35Rhizopus sp. (Óptica Nomarski,×450).
se puede recuperar de casi cualquier fuente. Con distribución mundial,
este aislado se recupera fácilmente del medio ambiente en vegetación en
descomposición.
Rhizopus spp. están creciendo rápidamente y tienen esporangióforos
erectos que terminan en esporangios oscuros y esporangiosporas (Figura 27.35).
En la base de los esporangióforos hay rizoides marrones. Los estolones se unen
a grupos separados de esporangióforos, filamentos arqueados que terminan en
los rizoides. Los esporangios son típicamente frágiles y no se retienen fácilmente
cuando se hacen preparaciones de cultivo en portaobjetos, lo que da como
resultado una estructura en forma de paraguas al final de los conidióforos.
Rhizopus spp. producen colonias lanudas de rápido crecimiento que cubren toda
la superficie del medio de cultivo. Las colonias son inicialmente blancas pero se
vuelven de gris a marrón con la edad.
Syncephalastrum. Syncephalastrum Rara vez está implicado en
enfermedades humanas, pero se ha documentado en infecciones
cutáneas. Este hongo se encuentra en el suelo y la vegetación en
descomposición. Microscópicamente, se observan esporangióforos
erectos. Cada esporangióforo tiene una gran columela en la que se forman
merosporangios, que contienen pilas de esporangiosporas (Figura 27.36).
Los aislamientos a veces se confunden conAspergilo en el examen inicial.
Las colonias crecen rápidamente e inicialmente son blancas y se vuelven
grises con la edad. La tasa de crecimiento es rápida, con colonias que
cubren toda la superficie del agar.
Saprófitos septados e hialinos
Aspergilo. Aspergilo spp. son saprófitos ambientales
ubicuos y con frecuencia se pueden aislar de una serie de

HIGO. 27,36Syncephalastrum sp. (Óptica Nomarski,×450).
sitios hospitalarios, incluidos los sistemas de ventilación y alimentos.
Aspergilli es el segundo hongo más comúnmente aislado después de
Candidaspp. A. fumigatus es la especie que se ve con mayor frecuencia;
otras especies patógenas incluyenA. flavus, A. terreus, y A. niger. Sus
conidios se inhalan constantemente, pero generalmente se eliminan
fácilmente en individuos sanos e inmunocompetentes. La mortalidad por
infecciones causadas por aspergilli sigue siendo alta, especialmente en el
huésped inmunodeprimido.
Aspergilo spp. son la causa más frecuente de enfermedad en los
receptores de trasplantes de médula ósea, además de otros receptores de
trasplantes y aquellos con cáncer. La infección se inicia tras la inhalación de
conidios. En los espacios de aire de los pulmones, los conidios germinan en
hifas, que invaden el tejido, incluidos los vasos sanguíneos. Aunque no
todos los pacientes tienen dolor en el pecho, no es infrecuente que
aparezcan síntomas similares a los de la neumonía. La infección se
propaga fácilmente por vía hematógena y no es infrecuente encontrar
afectación de múltiples órganos, incluidos el cerebro, el hígado, el corazón
y los huesos.Aspergilospp. también desencadenan reacciones alérgicas y
son una causa común de sensibilidad a los mohos. Otra presentación
frecuente es la de las llamadas bolas de hongos en los pulmones de los
trabajadores agrícolas que habitualmente están en contacto con conidios
de hongos de fuentes ambientales. La aspergilosis pulmonar crónica
puede ocurrir en pacientes con daño estructural en los pulmones causado
por otras enfermedades, como tuberculosis y sarcoidosis.
Aspergilli puede ser uniseriado o biseriado. Las especies uniseriadas
son aquellas cuyos fialides se adhieren directamente a la vesícula al final
del conidióforo. Las especies biseriadas poseen una estructura de soporte
llamadametula. Metulae se adhieren directamente a la vesícula, y unidas a
cada una de las metulae son phialides (Figura 27.37). Los conidios se
producen a partir de los fialides. Otras características incluyen un
conidióforo erecto que surge de una célula del pie dentro de las hifas
vegetativas. También es importante tener en cuenta si los fialoconidios
permanecen o no en cadenas largas o si se alteran fácilmente en
fialoconidios individuales. Las cadenas de conidios se pueden alinear en
columnas muy rectas y paralelas o en un patrón radiante alrededor de la
vesícula, y los conidios pueden ser rugosos o lisos.
El color de Aspergilo spp. colonias se deriva de conidios. Los colores van del
negro al blanco e incluyen amarillo, marrón, verde, gris, rosa, beige y tostado.
Algunas especies también forman pigmentos subsuperficiales difusibles en una
variedad de medios. Se observa una textura granular en especies con abundante
formación de conidios. La mayoría de los patógenos conocidos de este grupo
forman colonias de color verde a tostado. Muchas especies de aspergilli se han
relacionado con enfermedades humanas.
ERRNVPHGLFRVRUJ
Capitulo 27 Hongos de importancia médica 599
HIGO. 27,37Aspergilo sp. (Óptica Nomarski,×450).
HIGO. 27,38Beauveria sp. (Óptica Nomarski,×450).
algunos se distinguen fácilmente de otros, las pruebas moleculares y
proteómicas ayudan a la identificación definitiva a nivel de especie.
Beauveria. Beauveria bassiana es un aislado humano poco común, poco
común asociado con queratitis. Este hongo es un insecto patógeno conocido y se
encuentra en todo el mundo en la vegetación y el suelo. En los símpodulos se
forman abundantes simpoduloconidios unicelulares en forma de lágrima, que se
estrechan extremadamente a partir de una base bastante hinchada (Figura 27.38
). Los conidióforos pueden agruparse en algunos aislados para formar
mechones radiales. Las colonias son colonias esponjosas, hialinas, de
crecimiento moderadamente rápido, que a veces desarrollan una superficie
polvorienta que recuerda aT. mentagrophytes.
Chrysosporium. Una causa rara de enfermedad Chrysosporiumspp. se
han recuperado de uñas y lesiones cutáneas.Chryso sporium zonatum se
ha relacionado con neumonía y osteomielitis en pacientes
inmunodeprimidos. Estos organismos se encuentran en el medio ambiente
en todo el mundo. Los conidios unicelulares, microscópicamente simples y
de base amplia se producen en células no especializadas (Figura 27.39). La
célula conidiógena se desintegra o se rompe para liberar conidios. Se
pueden observar tanto artroconidios como aleurioconidios. Las colonias
son hialinas con una tasa de crecimiento moderada y con la edad pueden
desarrollar tonos claros de pigmento rosado, gris o tostado.
Fusarium. Fusarium spp. se observan con frecuencia en la queratitis
micótica. En los Estados Unidos, en 2006 se informó un brote multiestatal
que involucró a más de 100 personas que usaban lentes de contacto
blandos. El brote se asoció con una marca particular de solución para
lentes de contacto y se presentó típicamente en pacientes que usaron
lentes continuamente sin quitarlos durante varios días a tiempo.
600 PARTE 2 Identificación de laboratorio de aislamientos significativos
HIGO. 27,39Chrysosporium sp. (Óptica Nomarski,×450).
HIGO. 27.40Fusarium sp. (sin manchar,×450).
En los receptores de trasplante de médula ósea con infecciones causadas por
fusaria, la tasa de mortalidad se acerca al 100%. A menos que un paciente
recupere algo de inmunidad mediada por células, la mortalidad es segura
debido a la capacidad de estos hongos para crecer y continuar invadiendo a
pesar de la terapia antifúngica. Los pacientes presentan fiebre alta,
posiblemente lesiones cutáneas diseminadas y, en algunos pacientes, fungemia.
Fusariumspp. se recuperan fácilmente en los sistemas de hemocultivo. Se debe
tener cuidado al revisar los hemocultivos positivos porque los aislados suelen
tener apariencia de levadura en la recuperación inicial.
Normalmente, se producen abundantes macroconidios con menos
microconidios en hifas vegetativas (Figura 27.40). Los macroconidios tienen
forma de plátano o canoa y se forman individualmente, en pequeños grupos, o
agrupados en esteras denominadasesporodoquia. Los macroconidios suelen ser
multicelulares. Fusarium es un hongo hialino de rápido crecimiento que puede
desarrollar varios colores con la edad, desde el rosa al malva, pasando por el
púrpura y el amarillo.
Verificación de caso 27,1
A diferencia de la mayoría de los moldes, Fusarium spp. se recuperan comúnmente de la
sangre. Como se demostró en el caso en cuestión, se debe tener cuidado con el diagnóstico
adecuado porque las colonias pueden parecer inicialmente levaduras en el subcultivo, pero
rápidamente adquieren un aspecto lanoso a medida que se forman las hifas.
Geotrichum. Geotrichum se ha implicado en la enfermedad pulmonar
en pacientes inmunodeprimidos. La evaluación microscópica revela
abundantes artroconidios formados a partir de hifas vegetativas
ERRNVPHGLFRVRUJ
HIGO. 27,41Geotrichum sp. (Óptica Nomarski,×650).
HIGO. 27,42Paecilomyces sp. (Purpureocillium) (Óptica
Nomarski, ×650).
que ocurren individualmente o pueden estar ramificados (Figura 27.41). Las
colonias aparecen de color blanco a crema y como levadura y pueden
confundirse conTrichosporonspp. Ocasionalmente, se forma micelio aéreo,
produciendo colonias que se asemejan a las deCoccidioides spp.
Purpureocillium. Purpureocillium Purpureocillium lilacinum,
previamente Paecilomyces lilacinus, se ha asociado con infecciones
cutáneas y subcutáneas, además de pielonefritis, endocarditis e
infecciones pulmonares en pacientes inmunodeprimidos e
inmunocompetentes. Se recuperó en un brote hospitalario con una alta
tasa de muerte asociada. Microscópicamente, se debe tener cuidado para
evitar confusiones entrePurpureocillium y Penicilliumspp. Fialides de
Purpureocillium son generalmente más largas y más obviamente
ahusadas, y pueden estar formadas individualmente o dispuestas en un
patrón verticilado, en el que se forman largas cadenas de conidios en
forma de huso o algo cilíndricos (Figura 27.42).
Purpureocillium spp. crecen rápidamente y generalmente forman
colonias planas, granulares a aterciopeladas en tonos de bronceado,
dorado pardusco o malva. Los colores verde o azul verdoso no se ven.
Infecciones conPurpureocillium spp. son potencialmente graves y difíciles
de tratar; Se debe tener cuidado al encontrar hongos de color malva. Se
recomienda realizar pruebas moleculares para obtener una identificación
definitiva de la especie.
Penicillium. Porque muchos Penicillium spp. se inhiben a 37 ° C, rara vez
causan infecciones. La mayoría de los informes de enfermedad involucran
sinusitis fúngica crónica. De naturaleza ubicua, estos hongos se pueden
recuperar de cualquier lugar del mundo. Los conidióforos son erectos, a veces
ramificados, con metulae que llevan una o varias fialidas en las que se forman
conidios ovalados a ovoides en cadenas largas y sueltas.

HIGO. 27,43Penicillium sp. (Óptica Nomarski,×650).
HIGO. 27,44Scopulariopsis sp. (lactofenol algodón azul,×450).
(Figura 27.43). Este hongo que se ve comúnmente es un crecimiento rápido, con
colonias generalmente en tonos de verde o azul verdoso.
Scopulariopsis. Scopulariopsis spp. se aíslan comúnmente de muestras de
uñas y se han relacionado con enfermedades pulmonares en pacientes
inmunodeprimidos. Este hongo se recupera del medio ambiente en todo el
mundo. Los conidióforos ocurren de forma singular o pueden estar en grupos (
Figura 27.44). Los conidios se forman a partir de annelides, que aumentan de
longitud a medida que se forman los conidios. Los conidios de base truncada
tienden a permanecer encadenados en los annelides.Scopulariopsiscrece
moderadamente rápido y forma colonias cubiertas por conidios de color canela a
beige. Algunas especies son feoides.
Trichoderma. Trichoderma spp. están emergiendo como patógenos que
pueden causar una variedad de infecciones, incluidas infecciones pulmonares y
cutáneas, en el huésped inmunodeprimido. Este aislado se recupera fácilmente
del medio ambiente en todo el mundo.Trichodermaspp. están creciendo
rápidamente y forman hifas hialinas que dan lugar a parches de conidios de
color amarillo verdoso a verde formados en grupos de fialidas ahusadas (Figura
27.45). Los conidios pueden permanecer agrupados en bolas en las puntas de
los fialidos. Las colonias maduras son intensamente verdes y granulares, con
abundancia de conidios.
Saprófitos septados y feoides
Alternaria. A pesar de que Alternaria spp. pueden recuperarse de casi cualquier
fuente, están principalmente implicados en la sinusitis fúngica crónica. La enfermedad
a menudo se diagnostica erróneamente y los pacientes suelen ser tratados durante un
período prolongado por sinusitis bacteriana. La infección rara vez se propaga más allá
de los senos nasales en huéspedes inmunocompetentes, pero
ERRNVPHGLFRVRUJ
Capitulo 27 Hongos de importancia médica 601
HIGO. 27.45Trichoderma sp. (Óptica Nomarski,×650).
HIGO. 27,46Alternaria sp. (sin manchar,×450).
se puede encontrar sistémicamente en personas con inmunosupresión.
Alternaria spp. se encuentran en todo el mundo en pastos y hojas. Se han
relacionado con la pudrición del tomate y se recuperan fácilmente del medio
ambiente en placas de sedimentación al aire.
La evaluación microscópica revela conidióforos cortos con conidios en
cadenas que se alargan de forma acropetal (Figura 27.46). Los conidios
multicelulares tienen paredes transversales angulares y se estrechan hacia
el extremo distal.Alternaria spp. son hongos feoides de rápido crecimiento
con colonias que van desde tonos de gris a marrón a negro.
Aureobasidium. Infecciones por Aureobasidium spp. son raros, pero
se han relacionado con líneas de diálisis, catéteres y dispositivos similares
contaminados. Este organismo se puede recuperar de sangre, tejidos y
abscesos. Se recupera en todo el mundo principalmente en entornos
húmedos, como los de los azulejos de las duchas y las líneas de agua.
El examen microscópico revela hifas hialinas que dan lugar a conidios
hialinos directamente de las hifas vegetativas. Con la edad, las hifas
feoides se desarrollan y se descomponen en artroconidios, que no llevan
conidios hialinos. Estas artroconidias son responsables del oscurecimiento
de la morfología de la colonia.Aureobasidium spp. crecen de moderada a
rápido a significativamente rápido y tienen una consistencia similar a la de
la levadura. Los cultivos jóvenes son de color blanquecino a rosado, pero
se vuelven negros con la edad, con la producción de artroconidios de
pigmentación oscura.
Chaetomium. Infecciones por Chaetomium Se han informado organismos
en el cerebro de pacientes con enfermedad del sistema nervioso central. Varios
de estos pacientes han sido identificados como drogadictos por vía intravenosa.
Estos hongos se encuentran en el medio ambiente y tienen
602 PARTE 2 Identificación de laboratorio de aislamientos significativos
predilección por los productos de celulosa. Se sabe que devastan
la literatura impresa y las bibliotecas y se han asociado con
problemas en la calidad del aire interior.
Microscópicamente, se ven típicamente numerosos peritecios (Figura
27.47). Estos peritecios tienen forma de piña y están adornados con pelos o
setas lisos o rizados. Los ascos contenidos dentro del peritecio son
evanescentes, por lo que en la madurez, las ascosporas pigmentadas en
forma de limón se liberan dentro del peritecio. Las colonias son de
crecimiento moderadamente rápido a rápido y comienzan a tener un color
gris sucio y se vuelven feoides con la edad. Algunas especies producen un
pigmento difusible que vuelve el agar completamente rojo.
Cladosporium. Una causa poco frecuente de enfermedad, Cladosporium
spp. se recuperan principalmente como contaminantes de laboratorio. Las
infecciones generalmente se limitan a los senos nasales o después de una
inoculación traumática. De naturaleza ubicua, este aislado se puede recuperar
de casi cualquier lugar del mundo.
Cladosporium spp. forman hifas y conidios de color marrón a oliva a negro (
Figura 27.48). Los conidióforos son erectos y pueden ramificarse en varias
células conidiógenas. Los conidios esféricos a ovoides se forman blásticamente
en el extremo de cada conidio previamente formado. Las células ramificadas que
contienen conidio pueden desprenderse y las tres cicatrices en cada una de estas
células les dan la apariencia de un escudo. Generalmente, las cadenas de
conidios de las especies saprofitas se rompen fácilmente, mientras que las de las
especies patógenas permanecen conectadas. Estos organismos son hongos
feoides de crecimiento lento a moderado, con colonias granulares
aterciopeladas a esponjosas, que varían en color de oliva a marrón o negro.
HIGO. 27,47Chaetomium sp. (sin manchar,×650).
HIGO. 27,48Cladosporium sp. (Óptica Nomarski,×650).
ERRNVPHGLFRVRUJ
Curvularia. Curvularia spp. los aislados suelen estar implicados en la
sinusitis crónica en pacientes inmunocompetentes. Este hongo, que se
encuentra en todo el mundo, se recupera con frecuencia de la hierba, las hojas y
la vegetación en descomposición. Los conidios multicelulares se producen en
conidióforos simpodiales (Figura 27.49). Este género se encuentra entre los más
fáciles de identificar debido a los conidios en forma de media luna que se ven
con frecuencia con tres a cinco células de tamaño desigual y una célula central
agrandada. Varias especies previamente clasificadas en el géneroBipolarisahora
se consideran miembros de Curvularia. Estos hongos forman una colonia de
feoides de rápido crecimiento que es algodonosa y de color gris sucio a negro.
Phoma. Enfermedad causada por Phoma spp. suele ser secundaria a
una inoculación traumática.Phoma spp. producen picnidios, que aparecen
como cuerpos fructíferos negros que son globosos y revestidos por dentro
con conidióforos cortos (Figura 27.50). Se generan grandes cantidades de
conidios hialinos en el picnidio y fluyen por un pequeño poro apical.Phoma
spp. producen una colonia de color gris a marrón de crecimiento
moderadamente rápido.
Pithomyces. Enfermedad causada por Pithomyces spp. suele ser
secundaria a una inoculación traumática. Los conidios tienen forma de
barril, formados individualmente en conidióforos cortos simples (Figura
27.51). Los conidios tienen paredes transversales transversales y
longitudinales y a menudo son equinulados.Pithomyces spp. producen
colonias feoides de rápido crecimiento.
Ulocladium. Ulocladium spp. a veces están implicados en infecciones
subcutáneas, generalmente después de una inoculación traumática. Los
conidióforos tienen conidios multicelulares oscuros en simpodial
HIGO. 27.49Curvularia sp. (Óptica Nomarski,×450).
HIGO. 27,50Phoma sp. (Óptica Nomarski,×650).

HIGO. 27,51Pithomyces sp. (Óptica Nomarski,×450.)
HIGO. 27,52Ulocladium sp. (lactofenol algodón azul,×450).
los conidióforosFigura 27.52). Los conidios tienen paredes transversales
angulares y, en algunas especies, superficies equinuladas.Ulocladium spp. son
hongos feoides de rápido crecimiento, que forman colonias que varían en color
del marrón al oliváceo al negro.
Agentes de infecciones por hongos
La creciente incidencia de levaduras y hongos similares a levaduras aislados de
muestras de pacientes ha enfatizado la importancia de identificar los aislados de
levadura a nivel de especie. Con una mayor inmunosupresión, la variedad de
organismos implicados en la enfermedad también se expande.Candida albicans
es la cuarta causa más común de infección de transmisión sanguínea en los
Estados Unidos y representa del 10% al 15% de todos los casos de septicemia
adquirida en el hospital. También está aumentando el aislamiento de otras
levaduras a partir de muestras clínicas. Las infecciones causadas por muchas
levaduras son extremadamente agresivas y difíciles de tratar.
Los hongos de levadura se pueden clasificar en uno de dos grupos: levaduras y hongos
similares a las levaduras. Los aislamientos que se reproducen sexualmente, formando
ascosporas o basidiosporas, son verdaderamente levaduras. La mayoría de los aislamientos
que no son capaces de reproducirse sexualmente o cuyo estado sexual aún no se ha
descubierto se denominan correctamentehongos similares a la levadura.Para facilitar la
discusión, aquí se hace referencia a todos los aislamientos como levaduras.
Características generales
Los mohos y las levaduras son morfológicamente muy diferentes, pero algunas de las
características macroscópicas utilizadas como ayudas para identificar los mohos también
pueden utilizarse para identificar las levaduras. Las características macroscópicas incluyen el
color y la textura de la colonia. El color de una colonia de levadura
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Capitulo 27 Hongos de importancia médica 603
varía de blanco a crema o tostado, con algunas especies formando
colonias de color rosa a salmón. Algunos aislados de levadura,
denominadoslevaduras feoides, tienen pigmentación oscura debido a la
melanina en sus paredes celulares. Las levaduras feoides están asociadas
con varias especies de hongos polimórficos y se tratan en otra parte de
este capítulo.
La textura de las colonias de levadura también es diferente. Por ejemplo,
Cryptococcus spp. tienden a ser mucoides y pueden fluir a través de la placa, un
rasgo compartido por algunas bacterias, comoKlebsiella spp. Algunas levaduras
son parecidas a la mantequilla y otras varían en textura, desde aterciopeladas
hasta arrugadas. La variación de la textura de una cepa a otra puede notarse
dentro de una especie.
Candida
Candida spp. son los agentes más notorios de la candidiasis. La
enfermedad clínica varía desde infecciones cutáneas superficiales hasta
enfermedades diseminadas.C. albicans es la principal causa de candidiasis
en el mundo. Se recupera como biota normal de una variedad de sitios,
incluida la piel, la mucosa oral, el tracto digestivo y la vagina. Sin embargo,
cuando se alteran las condiciones del hospedador, este organismo es
capaz de causar enfermedades en casi cualquier sitio. En individuos con un
sistema inmunológico intacto, las infecciones son localizadas y limitadas.
Una de las manifestaciones más reconocidas deC. albicansLa infección es
aftas (candidiasis orofaríngea), una infección de la mucosa oral. La
candidiasis también se reconoce como un indicador de inmunosupresión.
Entre las personas infectadas con el virus de la inmunodeficiencia humana
(VIH) y las que reciben terapia antibacteriana prolongada u otros agentes
quimioterapéuticos, la candidiasis se manifiesta como una infección grave
capaz de diseminarse.
C. glabrata también es un común Candida especie que causa
enfermedad y puede representar el 21% de todos los aislados de levadura
urinaria. Infecciones asociadas conC. glabrata tienden a ser agresivos en
pacientes con múltiples comorbilidades y pueden ser difíciles de tratar con
la terapia antifúngica tradicional. Este organismo tiene diferentes patrones
de asimilación de azúcar, notablemente asimilación rápida de trehalosa, de
los deC. albicans y por lo tanto se pueden diferenciar fácilmente.
Recientemente, C. auris ha surgido como una levadura multirresistente
vinculada a altas tasas de mortalidad asociadas con infecciones adquiridas en
hospitales en todo el mundo. Es probable que la levadura se transmita de un
paciente a otro en entornos de atención médica y ha causado varios brotes en
numerosos países. Los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades
(CDC) recomiendan que se siga un protocolo de prevención de contacto para los
residentes en hogares de ancianos colonizados o infectados conC. auris y que se
alojen en habitaciones individuales, si están disponibles.
C. auris puede identificarse erróneamente como varias otras especies de levadura.
Los ensayos MALDI-TOF pueden identificar esta especie; sin embargo, el organismo no
está en la base de datos de todos los dispositivos.
Otras especies notables de Candida incluir C. krusei y C. tropicalis.
Además, C. parapsilosis se ha convertido en una de las principales causas
de brotes de infecciones nosocomiales. Estos aislados se identifican por las
diferencias en sus patrones de asimilación de carbohidratos y otros
procedimientos de prueba secundarios.Cuadro 27.7 muestra importantes
características diferenciadoras entre Candida spp. y otras levaduras.
Cryptococcus
Cryptococcus spp. son causas importantes de meningitis, enfermedad pulmonar
y septicemia.C. neoformans, el patógeno más notable de este género, es una de
las principales causas de infección oportunista en pacientes con SIDA. El
organismo se encuentra comúnmente en suelos contaminados.
604 PARTE 2 Identificación de laboratorio de aislamientos significativos

MESA 27,7 Características diferenciadoras de las levaduras

Crecimiento en Agar de harina de maíz

37 ° C 42 ° C 45 ° C Pseudofifas Hifas verdaderas Artroconidias Ciclohexamida Urea Nitrato

Candida
C. albicans + + + + + - R - -
C. dubliniensis + - - + + - R - -
C. glabrata + + + - - - S - -
C. guilliermondii + + - + - - R - -
C. krusei + + - + - - S V -
C. lusitaniae + + + + - - V - -
C. parapsilosis + - - + - - S - -
C. stellatoidea + + + + + - S - -
C. tropicalis + + + + - - V - -
Cryptococcus
C. albidus - - - - - - S + +
C. neoformans + - - - - - S + -
C. gattii + - - - - - R + -
Trichosporon spp. + V - + + + R + -

+, Positivo; -, negativo; R, resistente; S, sensible; V, variable.

para uso rutinario en laboratorios de microbiología clínica. Los ensayos de

HIGO. 27,53La preparación de tinta china se utiliza principalmente para
examinar el líquido cefalorraquídeo en busca de la presencia de levadura
encapsulada.Cryptococcus neoformans. Esta es una preparación de tinta china a
partir de un exudado que contiene levaduras en ciernes encapsuladas (×400).
con excrementos de paloma y muy probablemente se adquiere por inhalación.
C. gattii es un patógeno emergente, particularmente en el noroeste del Pacífico
de los Estados Unidos. Las infecciones causadas por esta especie son similares a
las causadas porC. neoformans, dirigido principalmente a pacientes
inmunodeprimidos. Sin embargo,C. gattii también puede causar enfermedad en
huéspedes inmunocompetentes, y es importante distinguir las dos especies
porque el curso clínico y los resultados del tratamiento pueden ser diferentes.
Cryptococcus spp. Expresan una cápsula que produce la característica
colonia mucoide. La cápsula se puede detectar rodeando la levadura en
ciernes en LCR con la ayuda de tinta china o nigrosina (Figura 27.53). El
líquido de fondo es negro y se ven halos claros sin teñir alrededor de las
células de levadura individuales. El uso de la preparación de tinta china
está siendo reemplazado por el uso de pruebas de antígeno criptocócico
debido a la baja sensibilidad de la primera. Se recomiendan los ensayos de
antígeno criptocócico y un ensayo de flujo lateral fácil de usar.
antígeno detectanC. neoformans y C. gattii en LCR y suero.
Cryptococcus spp. se destacan por producir blastoconidios solamente,
sin producir hifas verdaderas opseudohifas en agar harina de maíz. Todas
las especies del género son ureasa positivas y la reacción del nitrato es
diferente. La producción de fenol oxidasa es una característica
diferenciadoraC. neoformans de muchos otros Cryptococcus spp. Las
asimilaciones de azúcar también difieren entre las especies (verCuadro
27.7). Es extremadamente dificil de distinguirC. neoformans de C. gattii.
Una característica clave del laboratorio es que C. gattii utiliza glicina como
única fuente de carbono y nitrógeno en presencia de canavanina, mientras
que C. neoformans no. El agar azul de bromotimol glicina canavanina está
disponible comercialmente para este propósito y se puede utilizar para
diferenciar entreC. neoformans y C. gattii.
Rhodotorula
Rhodotorula spp. destacan por su brillante color rosa salmón. Se
parecen a los criptococos porque llevan una cápsula y son ureasa
positivos. Algunas especies también son positivas a los nitratos. No
son agentes comunes de enfermedad, pero se sabe que causan
infecciones oportunistas.
Pneumocystis
Pneumocystis spp. puede habitar los pulmones de muchos mamíferos.
Pneumocystis carinii originalmente se clasificó con los protozoos, pero la
secuenciación de ácidos nucleicos mostró de manera concluyente que el
organismo es un hongo. Es evidente a partir de estudios de ácidos nucleicos que
P. cariniino es una sola especie. P. carinii es la especie que se encuentra más
comúnmente en ratas, y P. jirovecii es la especie que se recupera con mayor
frecuencia de los seres humanos.
Manifestaciones clínicas
Pneumocystis spp. la infección se adquiere a una edad temprana; Los estudios
serológicos han demostrado que la mayoría de los seres humanos tienen anticuerpos o
antígenos entre los 2 y 4 años de edad. En individuos inmunocompetentes, la infección

ERRNVPHGLFRVRUJ

es asintomático; sin embargo, en pacientes inmunodeprimidos, se puede
desarrollar una neumonía grave potencialmente mortal.Pneumocystis
inicialmente se identificó como el agente causante de la neumonía intersticial de
células plasmáticas observada en bebés desnutridos o prematuros. Desde
principios de la década de 1980, sigue siendo una de las principales infecciones
oportunistas que se encuentran en pacientes con SIDA. Una alta incidencia de
enfermedad también resulta del uso de fármacos inmunosupresores en
pacientes con neoplasias malignas y en receptores de trasplantes de órganos.
Los defectos subyacentes en la inmunidad celular aparentemente hacen que los
pacientes sean susceptibles a la infección clínica con el organismo.
Pacientes infectados con Pneumocystis puede tener tos no productiva,
dificultad para respirar y fiebre baja. Las radiografías de tórax pueden ser
normales o mostrar un infiltrado intersticial difuso. La respuesta inmune al
organismo después de que se adhiere a las células alveolares y las
destruye es en parte responsable de este patrón radiográfico. Cuando se
examina el infiltrado, se encuentra que contiene células de los alvéolos y
células plasmáticas.
Ciclo vital
Pneumocystis es un hongo no filamentoso. La terminología que se refiere
a las diversas formas del ciclo de vida, sin embargo, se refleja en el hecho
de que primero se consideró un protozoo. El ciclo de vida dePneu mocystis
sp. tiene tres etapas: el trofozoíto, que es de 1 a 5µm de tamaño y forma
irregular; el prequiste, 5 a 8µmetro; y el quiste, que es una esfera de
paredes gruesas de aproximadamente 8µm que contiene hasta ocho
cuerpos intraquísticos.
Se sabe que la transmisión del organismo ocurre por vía respiratoria,
siendo el quiste la etapa infecciosa. Las esporas o cuerpos intraquísticos se
liberan del quiste en el pulmón y estas formas tróficas se multiplican
asexualmente por fisión binaria en la superficie de las células epiteliales
(neumocitos) que recubren el pulmón. También se produce la
reproducción sexual por trofozoítos, primero produciendo un prequiste y
luego el quiste que contiene esporas o cuerpos intraquísticos.
Diagnóstico de laboratorio
Tradicionalmente, el diagnóstico se hacía al encontrar el quiste o trofozoíto en
tejido obtenido mediante biopsia pulmonar abierta. Las muestras que se utilizan
ahora incluyen líquido de lavado broncoalveolar (BAL), muestras de biopsia
transbronquial, aspirado traqueal, líquido pleural y esputo inducido. El esputo,
sin embargo, es el espécimen menos productivo. Las muestras de lavado y
esputo a menudo se preparan utilizando una citocentrífuga.
A B
HIGO. 27,54A, Pneumocystis jirovecii quistes (tinción de plata). B, P. jirovecii (Tinción de Giemsa). Nótese la
disposición circular de los cuerpos intraquísticos dentro de un contorno tenue de la pared del quiste en el centro del
campo. (A, B, ×1000).
ERRNVPHGLFRVRUJ
Capitulo 27 Hongos de importancia médica 605
Se utilizan tinciones histológicas, como las tinciones de plata con
metenamina de Giemsa y Gomori. Con la tinción de plata metenamina, la pared
del quiste se tiñe de negro. Los quistes a menudo tienen la apariencia de una
pelota de ping-pong perforada. Con la tinción de Giemsa, el organismo aparece
redondo y la pared del quiste es apenas visible. Los cuerpos intrasticísticos se
ven alrededor del interior del organismo.Figura 27.54A muestra el quiste
característico de tinción negra de P. jiroveci con tinción de plata metenamina.
Figura 27.54B muestra el quiste teñido con tinción de Giemsa. La pared del
quiste no recoge la mancha, pero los núcleos de todas las formas se tiñen de
rosa y los cuerpos intraquísticos pueden demostrarse como una disposición
circular dentro del quiste.
Calcofluor white se puede utilizar para cribar muestras para Pneu
mocystis y otros hongos. Esta tinción detecta cualquier organismo que
contenga quitina en su pared celular. Hongos, levaduras yPneumocystis
spp. emitirá fluorescencia con un color azul-blanco cuando se tiñe y se
mira microscópicamente con luz ultravioleta. Las tinciones de anticuerpos
monoclonales inmunofluorescentes están disponibles comercialmente y se
utilizan ampliamente.
Diagnóstico de laboratorio de hongos
Problemas de seguridad
Debido al peligro adicional de las conidias en el aire, se debe utilizar una cabina
de seguridad biológica de clase 2 para reducir la exposición del personal a los
elementos fúngicos. El procesamiento y el enchapado de las muestras se deben
realizar en un gabinete de seguridad que funcione y que se mantenga
adecuadamente. Se recomienda el uso de un incinerador eléctrico cerrado para
eliminar los peligros de las llamas de gas abiertas y para contener las partículas
en aerosol emitidas cuando se incineran bucles o agujas. El gabinete debe
revisarse diariamente para ver que ninguna de las entradas o salidas de flujo de
aire esté bloqueada por suministros, incineradores o contenedores de
eliminación de desechos.
El uso de placas de Petri en el laboratorio de micología es peligroso; En su lugar, se
recomiendan tubos con tapón de rosca. La posibilidad de liberación de conidios en el
aire es menos probable con los medios entubados. Los tubos con tapón de rosca
también tienden a reducir la deshidratación de los medios en comparación con las
placas de Petri y se manipulan y almacenan más fácilmente. Sin embargo, las placas de
Petri tienen una superficie más grande para el aislamiento de colonias y son más fáciles
de manipular cuando se hacen preparaciones para el examen microscópico.
606 PARTE 2 Identificación de laboratorio de aislamientos significativos
Recolección, manipulación y transporte
de muestras
La recolección de muestras apropiadas es el criterio principal para el diagnóstico
preciso de infecciones micóticas. Todas las muestras para micología deben
transportarse y procesarse lo antes posible. Debido a que muchos hongos
patógenos crecen lentamente, cualquier retraso en el procesamiento
compromete la calidad de la muestra y disminuye la probabilidad de aislar el
agente causante como resultado del crecimiento excesivo de contaminantes.
Además, todos los laboratorios deben mantener un protocolo para el rechazo de
muestras insatisfactorias o mal etiquetadas.
Aunque casi cualquier tejido o fluido corporal puede enviarse para
cultivo de hongos, las muestras más comunes son secreciones
respiratorias, cabello, piel, uñas, tejido, sangre, médula ósea y LCR.Cuadro
27.8 presenta los sitios de cultivo predominantes para la recuperación de
los agentes causantes de enfermedades fúngicas. Figura 27.55 presenta
una guía esquemática para ayudar a hacer un diagnóstico de una micosis.
El cabello, la piel o las uñas sometidos a cultivo de dermatofitos
generalmente están contaminados con bacterias, hongos de rápido
crecimiento o ambos. Con este tipo de muestras, el medio de aislamiento
primario debe contener agentes antimicrobianos. Se recomiendan los
siguientes procedimientos para recolectar y procesar muestras clínicas
enviadas para estudios de hongos.
Cabello
La lámpara de Wood emite luz ultravioleta de longitud de onda superior a 365
nm y puede ser útil para identificar los cabellos infectados. Cabellos infectados
con hongos comoMicrosporum audouinii emiten fluorescencia cuando la luz de
la lámpara Wood se enfoca en el cuero cabelludo. Deben utilizarse fórceps
estériles para tirar del cabello afectado. Un método menos útil consiste en cortar
los pelos cerca del cuero cabelludo con unas tijeras esterilizadas. Los pelos se
colocan directamente en una placa de Petri estéril. Se inoculan algunos
mechones de cabello en medio fúngico y se incuban entre 22 y 30 ° C.
Piel
La piel debe limpiarse con alcohol isopropílico al 70% antes de tomar la muestra.
Las muestras de piel se raspan del borde exterior de una lesión superficial. Se
prepara un montaje húmedo de KOH con algunos de los raspados; el KOH
descompone el tejido, lo que facilita la visualización de las hifas de los hongos. El
material restante se inocula directamente sobre el agar.
Clavos
Las uñas se limpian con alcohol isopropílico al 70% antes de raspar la
superficie. Las muestras de uñas pueden enviarse como raspados o
MESA 27,8 Sitios de cultivo predominantes para la recuperación de agentes causalesa
Infección Respiratorio Sangre Médula ósea
Blastomicosis + +
Histoplasmosis + +
Coccidioidomicosis + +
Paracoccidioidomicosis + +
Esporotricosis + +
Cromoblastomicosis
Micetoma eumicótico
Feohifomicosis
aLos organismos pueden recuperarse de múltiples sitios en infecciones diseminadas.
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esquejes y ocasionalmente como una uña completa. Se necesitan raspados más
profundos para preparar una preparación de KOH e inocular el medio. Las tijeras
estériles se utilizan para cortar uñas completas en pequeñas tiras delgadas, que
se utilizan para inocular los medios.
Sangre y médula ósea
La sangre de pacientes septicémicos puede albergar hongos patógenos y
oportunistas conocidos, siendo los más comunes Candida spp. El sistema
de centrifugación por lisis, el tubo Isolator (Wampole, Cranbury, NJ), es el
método más sensible para la recuperación de mohos y hongos dimórficos.
Sin embargo, este método tiene una alta tasa de contaminación. La lisis de
los glóbulos blancos (WBC) y los glóbulos rojos libera microorganismos,
que luego se concentran en el sedimento durante la centrifugación. El
sedimento se inocula en medios de cultivo sólidos. También se puede
utilizar un sistema bifásico (caldo y agar), como el Septi-Chek (Becton-
Dickinson Diagnostic Systems, Sparks, MD). Los sistemas de hemocultivo
de monitorización continua y automatizada cuentan con medios diseñados
para la recuperación de hongos. Al igual que con la bacteriología, el
volumen de sangre y la proporción de sangre a caldo son importantes para
la recuperación óptima de los hongos. Los estudios indican de 20 a 30 ml
de sangre de adultos divididos en dos botellas y lo ideal es una dilución de
5 a 10 veces. Las muestras de médula ósea heparinizadas deben colocarse
en placas directamente sobre el medio junto a la cama; No se recomienda
el uso de frascos de hemocultivo.
Fluido cerebroespinal
El LCR y otros fluidos corporales estériles deben concentrarse mediante
centrifugación antes de la inoculación. Una gota del concentrado se utiliza
para la preparación de tinta china o la aglutinación de látex paraCryptococ
cus, y el resto se inocula en un medio. Si se envían más de 5 ml, el LCR se
puede filtrar a través de un filtro de membrana y se pueden colocar partes
del filtro en el medio. No debería ser necesario el uso de medios con
agentes antimicrobianos porque el LCR normalmente es estéril.
Líquido de absceso, exudados de heridas y tejido
Con un microscopio de disección, se puede examinar el líquido del absceso
y el exudado de las heridas para detectar la presencia de gránulos. Si no
hay gránulos presentes, el material puede colocarse directamente sobre el
medio. El tejido debe picarse suavemente antes de la inoculación. Se ha
recomendado triturar el tejido, pero este proceso podría destruir los
elementos fúngicos frágiles, especialmente si hay un cigomiceto presente.
Aunque puede ser necesario triturar el tejido para las preparaciones de
KOH y blanco de calcofluor, no debe hacerse a menos que sea suficiente
Tejido Piel Moco Hueso
+ +
+
+
+
+ +
+ +
+ +
+ +
 Capitulo 27 Hongos de importancia médica 607

MUESTRA CLÍNICA

Examen directo Cultura

Tejido
Fluido cerebroespinal
• Tinción de histología 30° C
• Tinta china 22° hasta 25° C
• Anticuerpo fluorescente (sospechar
• Antígeno criptocócico
(organismos seleccionados) dimórfico)

Crecimiento Sin crecimiento

Piel, cabello, uñas,
y otros seleccionados
especímenes
Levadura Molde

KOH / KOH con blanco de calcofluor

Hifal Sin hifas

elementos elementos
• Ancho
• Hialino frente a dematiáceo
• Septados frente a escasamente septados

Medios suplementarios especiales

CRECIMIENTO
22° hasta 25° C

Levadura
Molde

Germen Bioquímicos
Microscópico Macroscópico
tubo • Asimilación
Especial • Fermentación
(LPCB) • Color / pigmento

medios de comunicación
• Textura
• Tasa de crecimiento

Conidios Sin conidias

• Tamaño
Harina de maíz Otro • Forma
• Blastoconidios • Alpiste • Arreglo
• Clamidosporas • Ácido cafeico
Cultura de diapositivas

• Urea Hifas
• Hialino frente a dematiáceo
• Septados frente a escasamente septados
• Rizoides
HIGO. 27,55Directriz para la identificación de aislados de hongos. KOH, Hidróxido de potasio;LPCB,
lactofenol algodón azul.

el tejido está presente para picar y moler. Cuando se envían grandes
secciones de tejido, las áreas sospechosas, como las secciones
purulentas o descoloridas, se seleccionan para picar y triturar antes
del cultivo posterior.
Muestras respiratorias
Debido a que muchas infecciones fúngicas tienen un foco primario en los
pulmones, comúnmente se envían secreciones del tracto respiratorio inferior (p.
Ej., Esputo, aspirados transtraqueales) y líquidos de lavado pleural. Los pacientes
deben obtener esputos de una tos profunda poco después de levantarse por la
mañana. Si el paciente no puede producir esputo, un nebulizador
se puede utilizar para inducir el esputo. Todas las muestras de esputo deben
recogerse en un recipiente estéril con tapa de rosca.
Si el material no es demasiado viscoso, las muestras se pueden inocular
en un medio con una pipeta estéril. Con materiales viscosos, como un
aspirado traqueal espeso, se puede usar un hisopo de Dacron para
inocular el material en el medio, o preferiblemente la muestra se puede
digerir con el agente mucolítico.norte-acetilo-L-cisteína y concentrada
antes de la inoculación. Además de los medios no selectivos, se debe
utilizar un medio con agentes antimicrobianos para prevenir el crecimiento
excesivo de bacterias. También se debe hacer una preparación de KOH. La
candidiasis orofaríngea se diagnostica fácilmente con frotis directo

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608 PARTE 2 Identificación de laboratorio de aislamientos significativos
y Cultura. Las muestras de senos nasales obtenidas quirúrgicamente se pueden colocar
en placas directamente en un medio que contenga agentes antimicrobianos, excepto la
cicloheximida, que puede inhibir algunos hongos.
Muestras urogenitales y fecales
Los científicos de laboratorio a menudo reciben orina, heces y secreciones
vaginales como muestras para cultivo bacteriológico; en ocasiones, estos
especímenes producen una levadura que requiere identificación. La orina
enviada específicamente para cultivo de hongos debe centrifugarse y el
sedimento debe usarse para hacer frotis para examen microscópico e
inocular el medio. Se prefiere una muestra de orina evacuada por la
mañana.
Examen microscópico directo de
muestras
El examen directo del material clínico en busca de elementos fúngicos tiene
varios propósitos. Primero, ayuda a proporcionar un informe rápido al médico, lo
que puede resultar en el inicio temprano del tratamiento. En segundo lugar, en
algunos casos, las características morfológicas específicas proporcionan una
pista sobre el género del organismo. A su vez, cualquier medio especial indicado
para la identificación de especies puede inocularse inmediatamente. En tercer
lugar, el examen directo podría proporcionar evidencia de infección a pesar de
los resultados del cultivo negativos. Tal situación puede ocurrir con muestras de
pacientes que están recibiendo terapia antifúngica, que puede inhibir el
crecimiento in vitro aunque la infección todavía pueda estar presente en el
paciente.
Aunque la tinción de Gram realizada en el laboratorio de microbiología de
rutina a menudo da la primera evidencia de infecciones por bacterias y
levaduras, otras tinciones directas brindan información más específica sobre las
infecciones por moho. Los tipos de examen directo utilizados en la identificación
de infecciones fúngicas incluyen preparaciones húmedas, como KOH, tinta china
y blanco de calcofluor. También pueden ser útiles las tinciones histológicas para
tejidos.
Preparación de KOH
Una solución de KOH del 10% al 20% es útil para detectar elementos fúngicos
incrustados en la piel, el cabello, las uñas y los tejidos. En este procedimiento, se
agrega una gota de la preparación de KOH a un portaobjetos. Se agregan a la
gota raspados de uñas, cabello, escamas de piel o láminas delgadas de tejido y
se coloca un cubreobjetos. A continuación, el portaobjetos se calienta
suavemente y luego se deja enfriar durante aproximadamente 15 minutos. El
KOH y el calor descomponen la queratina y las capas de la piel, revelando más
claramente los hongos presentes en la muestra. La interpretación de los
portaobjetos de KOH sigue siendo difícil y los elementos fúngicos aún pueden
evadir la detección.
Las modificaciones de la prueba de KOH pueden proporcionar
resultados más fáciles y confiables. Estas preparaciones incorporan
dimetilsulfóxido (DMSO) y una mancha en la solución de KOH. El DMSO
facilita la descomposición más rápida de los desechos celulares sin
requerir calor, mientras que los elementos fúngicos absorben la mancha,
haciéndolos fácilmente visibles en el examen microscópico de la
preparación del portaobjetos.
KOH con Calcofluor White
Se puede agregar una gota de blanco de calcofluor a la preparación de KOH
antes de agregar un cubreobjetos. Calcofluor white se une a los polisacáridos
presentes en la quitina del hongo oa la celulosa. Los elementos fúngicos
presentan una fluorescencia verde manzana o azul-blanca, según la combinación
de filtros utilizados en el microscopio; por lo tanto, cualquier elemento con un
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el esqueleto de polisacárido emite fluorescencia. La estructura fúngica real
debe verse antes de que se informe una preparación positiva. Se debe
tener cuidado al utilizar este proceso porque existe mucha variabilidad
entre los fabricantes e incluso en diferentes lotes de tinte preparados por
el mismo fabricante.
Tinta china
Se pueden usar preparaciones de tinta china o nigrosina para examinar el
LCR en busca de la presencia de la levadura encapsulada C. neoformans.
Se mezcla una gota de tinta china con una gota de sedimento de una
muestra de LCR centrifugada y se examina la preparación con un gran
aumento (×400). Con esta tinción negativa, las células de levadura en
ciernes rodeadas por una gran área clara sobre un fondo negro son una
presunta evidencia deC. neoformans (ver Figura 27.53). Los glóbulos
blancos y otros artefactos pueden parecerse a organismos encapsulados;
por lo tanto, es necesario un examen cuidadoso. Sin embargo, muchos
laboratorios ahora usan un ensayo de antígeno criptocócico (ver “Antígeno
criptocócico”Más adelante en este capítulo) en lugar del examen de tinta
china. El rendimiento de estos ensayos ha mejorado a lo largo de los años
y ahora se recomiendan sobre las preparaciones de tinta china en el
cribado de LCR paraC. neoformans.
Manchas de tejido
Las tinciones tisulares habituales que se utilizan en el departamento de
histología para la detección de elementos fúngicos incluyen las tinciones de
ácido periódico-Schiff (PAS), metenamina de Gomori-nitrato de plata,
hematoxilina y eosina (H&E), Giemsa y Fontana-Masson. La tinción de Giemsa se
utiliza principalmente para detectarH. capsulatum en sangre o médula ósea
Figura 27.56). La tinción de PAS se adhiere a los polisacáridos en la pared del
hongo y tiñe los hongos de rosa. El método de Fontana-Masson tiñe melanina en
la pared celular e identifica la presencia de hongos feoides.Cuadro 27.9enumera
las reacciones fúngicas características observadas con tinciones seleccionadas.
Verificación de caso 27,2
Cuando se observan elementos hifales en secciones de tejido, la enfermedad se
atribuye con frecuencia a Aspergilo especies. A pesar de queAspergilo es la
enfermedad más común que causa el moho en el paciente inmunodeprimido,
docenas de otros hongos, como Fusarium en el caso en cuestión, dan la misma
apariencia. Para documentar la infección, el moho debe verse en el tejido y
crecer en cultivo. Cuando no se observan hifas en el tejido, el cultivo positivo
puede ser causado por un contaminante y, a la inversa, cuando se observan hifas
en el tejido pero no crecen en cultivo, no se puede determinar el agente causal.
HIGO. 27,56Médula ósea teñida con tinción de Giemsa que muestra
la fase de levadura de Histoplasma capsulatum (×1000).
 Capitulo 27 Hongos de importancia médica 609

MESA 27,9 Características de tinción de los hongos MESA 27.10 Resumen de hongos primarios
Medios culturales
Fondo
Mancha Color del elemento fúngico Color
Medio Resultados de crecimiento esperados

Ácido periódico-Schiff Magenta Rosa o verde

A 22 ° C
Metenamina de Gomori Negro Verde
SDA Aislamiento inicial de patógenos y saprobios Los
plata
hongos dimórficos pueden exhibir su micelio
Giemsa Levadura de violeta a azul con Rosa a morado
fase
halo claro (cápsula)
SDA con antibióticosa Los saprobios generalmente se inhiben en este medio
Tinta china Levadura con halo transparente Negro
Dermatofitos y la mayoría de los hongos
(cápsula)
los patógenos considerados primarios crecen
KOH Refráctil Claro
Agar BHI Aislamiento inicial de patógenos y saprobios
KOH – calcofluor blanco Fluorescente Oscuro
Agar BHI con antibióticos Recuperación de hongos patógenos
Masson-Fontana marrón Rosa a morado
Los dermatofitos no suelen recuperarse
Agar inhibidor de mohos Aislamiento inicial de patógenos excepto
KOH, Hidróxido de potasio.
dermatofitos
Cicloheximida Recuperación primaria de dermatofitos

Métodos de aislamiento
Medios culturales
En general, los hongos no comparten la amplia gama de necesidades
nutricionales y ambientales que caracterizan a las bacterias, por lo que se
necesitan relativamente pocos tipos de medios estándar para el aislamiento
primario. Estos incluyen agar Sabouraud dextrosa, agar Sabouraud dextrosa con
agentes antimicrobianos, agar patata dextrosa o agar patata en escamas
ligeramente modificado, y agar BHI enriquecido con sangre y agentes
antimicrobianos. La gentamicina o el cloranfenicol y la cicloheximida son los
antimicrobianos que generalmente se incluyen con los medios fúngicos. La
gentamicina y el cloranfenicol inhiben el crecimiento bacteriano, mientras que la
cicloheximida inhibe las bacterias y muchos de los hongos ambientales que
normalmente se consideran contaminantes. El pH de la modificación de Emmons
del agar dextrosa Sabouraud es casi neutro y es un medio más eficaz para el
aislamiento primario en comparación con la formulación original.Cuadro 27.10
muestra los resultados de crecimiento esperados con algunos de los medios
fúngicos estándar. Los agares cromogénicos selectivos, como CHROMagar
Candida (CHROMagar, París, Francia) y Candida ID (bioMérieux, Durham, NC),
proporcionan una identificación preliminar rápida.
Los medios fúngicos se pueden verter en placas de Petri o tubos de ensayo
grandes. Las placas de Petri tienen la ventaja de tener una superficie mayor,
pero son más propensas a la deshidratación debido a la incubación prolongada
necesaria para la recuperación de algunos hongos. Las placas de Petri deben
verterse más espesas que un medio estándar para el crecimiento bacteriano. Las
placas se pueden sellar con cinta o parafilm o sellar en bolsas semipermeables
para minimizar la deshidratación y prevenir la propagación de esporas de
hongos. También están disponibles comercialmente varios ejemplos de bandas
de sellado retráctil semipermeables. Los medios en tubo tienen la ventaja de ser
más seguros de manipular y menos susceptibles al secado. Las placas y tubos
para hongos deben abrirse solo en un gabinete de seguridad biológica.
Incubación
La mayoría de los laboratorios incuban rutinariamente cultivos de hongos a
temperatura ambiente o a 30 ° C. Los hongos crecen de manera óptima a estas
temperaturas, mientras que las bacterias tienen una tasa de crecimiento más lenta. Si
el agente causal que se sospecha es un hongo dimórfico, los cultivos también deben
incubarse a 35 ° C. Los cultivos generalmente se mantienen durante 4 a 6 semanas y
deben examinarse dos veces por semana para determinar el crecimiento. Mucorales,
comoMucor y Rhizopus spp., crecen rápidamente y pueden llenar el tubo
A 37 ° C
SDA La forma de levadura de hongos dimórficos y
otros organismos crecen
Los dermatofitos crecen mal
Agar BHI con sangre Levaduras, tales como Cryptococcus, crecer bien La
forma de levadura de Histoplasma capsulatum
absorbe algo del pigmento hemo en el medio
y se vuelve bronceado claro, con una textura
granulada y arrugada
BHI, Infusión cerebro-corazón; SDA, Agar Sabouraud dextrosa.
aLos antibióticos generalmente utilizados son cicloheximida y cloranfenicol.
o placa de Petri con micelio aéreo en unos pocos días, mientras que los
organismos de crecimiento más lento, como Fonsecaea o Phialophoraspp.,
pueden requerir 2 semanas o más antes de que se observe el crecimiento.
La información que debe registrarse sobre un aislado incluye el
número de días hasta el primer crecimiento visible y el número de días
necesarios para ver las estructuras de fructificación, si se recuperan las
formas de moho o levadura, el medio en el que se aísla el hongo, la
temperatura a la que se produce el crecimiento y la morfología de las
colonias.
Identificación de hongos
Aunque el número de especies de hongos descritas supera las 100.000, el
número que se sabe que causa enfermedades en humanos es una pequeña
fracción de este número, y aunque el número de especies que se observan
habitualmente como causantes de infección es bastante bajo, continuamente se
están implicando nuevas especies. La mayoría de las enfermedades son
causadas por un puñado de especies, lo que hace que la identificación, al menos
a nivel de género, sea bastante fácil. El punto de partida tradicional es decidir si
el aislado es una levadura o un moho. Sin embargo, los moldes no siempre
producen estructuras que faciliten la identificación. A menudo, los cultivos de
muestras clínicas son estériles o atípicos.
Ninguna de las siguientes pruebas por sí sola es suficiente para una
identificación adecuada, pero cuando se usan juntas, la identificación
precisa a menudo se logra fácilmente. Pruebas moleculares y proteómicas,
ya sean basadas en cultivos (hibridación de ADN mediante sondas,
secuenciación de ADN y MALDI-TOF) o basadas en PCR (p. Ej., Método de
amplificación isotérmica mediada por bucle [LAMP] paraHistoplasma),
cuando se utiliza con estos procedimientos de prueba, permite al científico
del laboratorio identificar los aislados de hongos más comunes.

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610 PARTE 2 Identificación de laboratorio de aislamientos significativos
Examen macroscópico de cultivos
Una vez que un organismo ha crecido, las colonias deben examinarse en
busca de características macroscópicas. Los rasgos morfológicos
generales, como el color, la textura y la tasa de crecimiento, son
observaciones iniciales que deben realizarse. Puede observarse pigmento
en el reverso de la colonia o en el micelio aéreo, pero no siempre es útil,
especialmente con los hongos feoides.
Examinación microscópica
El procedimiento más común para el examen microscópico es el montaje directo
del aislado fúngico. Esto se logra preparando una montura de burla o una
montura de cinta de celofán. Muchos hongos que se recuperan de forma
rutinaria pueden identificarse mediante cualquiera de estos dos métodos.
Debido al riesgo de conidios en el aire, estos portaobjetos deben prepararse en
una cabina de seguridad biológica. Cuando los hongos son atípicos o se
recupera una especie poco común, se debe preparar un cultivo en portaobjetos.
Los montajes de burla y cinta suelen alterar los conidios, impidiendo ver cómo se
forman, mientras que los cultivos en portaobjetos proporcionan una muestra
más intacta. Las estructuras fructíferas, así como la disposición de los conidios,
se observan mejor con este método. Las características microscópicas que deben
observarse son:
• Hifas septadas versus escasamente septadas
• Hifas hialinas o feoides
• Estructuras fructíferas
• Los tipos, tamaño, forma y disposición de los conidios.Tease Mount. Para
la montura de provocación, se utilizan dos agujas de provocación para
eliminar una parte del micelio del tercio medio de la colonia. Los micelios
se colocan en una gota de azul de algodón lactofenol (LPCB) en un
portaobjetos y se separan suavemente con las agujas. Una modificación de
este procedimiento es más práctica y permite la retención de más
estructura fructífera. En lugar de usar dos agujas burladoras, una parte de
la colonia puede ser removida con una aguja burladora o con un aplicador
estéril. Luego, los micelios se colocan en una gota de LPCB en un
portaobjetos, se agrega un cubreobjetos y el portaobjetos se examina
microscópicamente con aumentos bajos y altos.
LPCB se utiliza para fijar y teñir los soportes de cinta o burla de
cultivos. La combinación de ácido láctico, fenol y el tinte mata,
conserva y tiñe el organismo. Las hifas absorben el LPCB, pero la
tinción no funciona bien con los hongos feoides porque conservan su
color oscuro. La principal desventaja de este procedimiento es la
ruptura de los conidios durante el proceso de burla.
Preparación de la cinta de celofán. Las preparaciones de cinta de
celofán implican tocar suavemente la superficie de la colonia con un trozo
de cinta transparente, con el lado adhesivo hacia abajo, y luego retirarlo.
La cinta no debe presionarse contra la colonia, solo debe tocar suavemente
la superficie. La cinta esmerilada no funciona porque los hongos no son
visibles a través de este tipo de cinta. La cinta se coloca sobre una gota de
LPCB en un portaobjetos y se examina. Una ventaja de este procedimiento
es que se conserva la disposición conidial. Una gran desventaja es la
posible contaminación de la colonia y la naturaleza temporal de esta
preparación. Las preparaciones de la cinta deben leerse dentro de los 30
minutos y luego desecharse. No se necesita un cubreobjetos si se utiliza la
técnica de la cinta de celofán porque la cinta sirve como cubreobjetos.
Slide Culture. Los cultivos en portaobjetos son útiles para demostrar la
morfología natural de las estructuras fúngicas y para estimular la
conidiación en algunos hongos de mala fructificación. Se han ideado varios
métodos para construir cultivos de portaobjetos (verApéndice C).
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Otra ventaja de "la cultura de diapositivas" es que se puede conservar
indefinidamente. Esto es particularmente útil cuando el cultivo en portaobjetos
de un aislado conocido se almacena en una colección para futuras
comparaciones con aislamientos en espera de identificación.
Pruebas diversas para la identificación de
moldes
Prueba de perforación del cabello. En las pruebas de perforación del
cabello, se hacen flotar fragmentos de cabello estériles de 5 a 10 mm en
agua estéril complementada con unas gotas de extracto de levadura estéril
al 10%. Los conidios o hifas del dermatofito en cuestión se inoculan en la
superficie del agua. Los tallos de pelo se retiran y se examinan
microscópicamente en LPCB a intervalos semanales durante hasta 1 mes.
Tricho phyton rubrum, que puede ser morfológicamente similar a T.
mentagrophytes, Por lo general, solo causa erosión superficial de los tallos
del cabello en esta prueba, mientras que T. mentagrophytes típicamente
forma una penetración perpendicular o clavijas en forma de cuña en los
tallos del cabello (Figura 27.57). Algunos laboratorios han utilizado esta
prueba para distinguir las capacidades de penetraciónMicrosporum canis
de M. equinum, que no penetra el cabello.
Prueba de ureasa. Otra prueba utilizada para ayudar a diferenciar T.
mentagrophytes de T. rubrum es la prueba de ureasa de 5 días. Los tubos de
agar urea Christensen se inoculan muy ligeramente con el dermatofito y se
mantienen durante 5 días a temperatura ambiente. La mayoría de los
aislamientos deT. mentagrophytes demostrar la producción de ureasa, lo que
resulta en un cambio de color del medio de melocotón a fucsia brillante dentro
de ese período, mientras que la mayoría T. rubrum los aislados son negativos o
requieren más de 5 días para dar una reacción positiva. Esta prueba también es
útil para otros mohos y levaduras.
Requisito de tiamina. Algunos dermatofitos no pueden sintetizar
determinadas vitaminas y, por tanto, no crecen en medios exentos de
vitaminas. Aunque se reconocen varias deficiencias de vitaminas en los
hongos, la prueba de la necesidad de tiamina es quizás la prueba
nutricional más útil para los dermatofitos. Se inoculan tubos de medio con
y sin tiamina con una pequeña porción libre de medio de la colonia y se
observa el crecimiento después de 10 a 14 días. Se debe tener mucho
cuidado para evitar la transferencia del medio de cultivo con el inóculo
porque incluso cantidades minúsculas de vitamina transportadas pueden
suplir adecuadamente el requerimiento y, por lo tanto, dar como resultado
una falsa reacción de crecimiento.
HIGO. 27,57Un resultado positivo de la prueba de perforación del cabello
muestra la penetración del agente fúngico en el tallo del cabello (Ver flecha). Esta
es la reacción típica deTrichophyton mentagrophytes, mientras queTrichophyton
rubrum sólo provoca la erosión superficial del tallo del cabello. (Sin manchar,×
1000).
 Capitulo 27 Hongos de importancia médica 611

Trichophyton Agars. Se utilizan siete agares Trichophyton diferentes, albicans será positivo, y otras especies, en particular C. tropicalis, puede producir
numerados del 1 al 7, para determinar los requisitos nutricionales de resultados falsos positivos. Los verdaderos tubos germinativos carecen de
Trichophyton spp. Cada uno de los medios tiene diferentes ingredientes constricción en sus bases, donde se adhieren a la célula madre. Si hay una
nutricionales; después de la inoculación y la incubación, el crecimiento se constricción en la base de un tubo germinativo, la levadura no pertenece a
puntúa en una escala de 1 a 4. En función del patrón de crecimiento, se ninguna de las dos especies. Estos tubos germinativos constreñidos, llamados
realiza la identificación. tubos de pseudogermo, son más característicos de C. tropicalis (Figura 27.60).
Crecimiento en granos de arroz. Aislamientos deficientemente C. dubliniensis se diferencia de C. albicans por su incapacidad para
esporulantes de M. canis puede ser difícil de diferenciar de M. audouinii, una crecer a 42 ° C.
especie que típicamente forma pocas esporas. El arroz estéril no enriquecido se Asimilación de carbohidratos. Las pruebas de fermentación del azúcar,
inocula ligeramente con una porción de una colonia. Después de 10 días de aunque valiosas, requieren mucho tiempo y trabajo, lo que las hace poco
incubación a temperatura ambiente, se observa el crecimiento del medio.M. prácticas para su uso en el laboratorio de microbiología de rutina. Sin embargo,
canisy casi todos los demás dermatofitos crecen bien y suelen formar muchos las pruebas de asimilación de carbohidratos se pueden realizar fácilmente como
conidios, mientras que M. audouinii no crece, pero los granos de arroz se parte de los protocolos de identificación de rutina. Las pruebas de asimilación
vuelven marrones. identifican qué carbohidratos puede utilizar una levadura aeróbicamente como
única fuente de carbono. Los patrones de asimilación se pueden determinar a
Pruebas diversas para la partir de métodos tales como un sistema de identificación automatizado o varios
identificación de levaduras procedimientos manuales y kits comerciales. El laboratorio individual debe
Producción de tubos germinativos. los tubo de germen La prueba es adoptar el método que se pueda implementar de manera práctica en su entorno
probablemente la prueba más importante y fácil de realizar para la identificación de trabajo particular.
de levaduras. Figura 27.58 muestra un diagrama esquemático de cómo se puede
utilizar la prueba del tubo germinativo para identificar presuntamente especies
de levadura. AmbosC. albicans y C. dubliniensis se identifican con la producción
de tubos germinativos (Figura 27.59). El procedimiento estándar (verApéndice C)
requiere el uso de suero o plasma, como suero fetal bovino. También se puede
utilizar plasma fresco congelado vencido del banco de sangre. Sin embargo, esto
no se recomienda debido al riesgo potencial en el manejo de patógenos
transmitidos por la sangre y debido a preocupaciones sobre la reproducibilidad.
Muchos otros medios líquidos (p. Ej., Agar BHI, caldo de tripticasa de soja, caldo
de nutrientes) se han utilizado con éxito como alternativa. El sustrato se inocula
y luego se incuba a 35 ° C durante 3 horas. Se debe tener cuidado de no incubar
la prueba más allá de las 3 horas porque otras especies son capaces de formar
tubos germinales con incubación prolongada.

Una presunta identificación de C. albicans o C. dubliniensisse puede fabricar

cuando hay verdaderos tubos germinativos. Esta prueba proporciona solo una HIGO. 27,59Producción de tubos germinativos por Candida albicans. Un
identificación presuntiva porque no todas las cepas deC. verdadero tubo germinativo no tiene constricción en su base (sin teñir, ×1000).

Levadura

Tubo germinativo

+ -

+ Crecimiento a 42 ° C -

Candida Candida Harina de maíz Carbohidrato

albicans Dubliensis asimilaciones

Blastoconidios Blastoconidios Blastoconidios Blastoconidios

solamente Pseudohifas Hifas verdaderas Pseudohifas
Hifas verdaderas
Artroconidias

Cryptococcus sp. Candida sp. Candida sp.

Candida sp.
Trichosporon sp.
HIGO. 27,58Diagrama esquemático que muestra cómo se puede utilizar la prueba del tubo germinativo para identificar levaduras
presuntamente.

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612 PARTE 2 Identificación de laboratorio de aislamientos significativos
HIGO. 27,60Candida tropicalis muestra constricción en la base del
tubo germinal, llamado pseudo-tubo germinal (Óptica Nomarski,×
1250).
Aunque muchos de estos kits están disponibles para la identificación de
levaduras, el sistema de identificación de levaduras API 20C (bioMérieux,
Durham, NC) es probablemente el más utilizado. En este ensayo, se colocan una
serie de azúcares liofilizados en pocillos en una tira de plástico. Los aislados de
levadura se suspenden en un medio basal de agar, se pipetean en los pocillos y
se incuban a 30 ° C durante 72 horas. A medida que se asimilan los azúcares, los
pozos se vuelven turbios con el crecimiento. Los pozos quedan limpios cuando el
azúcar no se asimila. Un código se deriva de los patrones de asimilación y se
compara con una base de datos computarizada. Las identificaciones van
acompañadas de un porcentaje, que indica la probabilidad de que la
identificación sea correcta. Aunque esta prueba es confiable, otras pruebas
auxiliares deben acompañar a los resultados de asimilación antes de realizar una
identificación final. También se encuentran disponibles sistemas automatizados
para la identificación de levaduras. Muchos de estos sistemas utilizan reacciones
enzimáticas y de asimilación para ayudar en la identificación de las levaduras.
Sustratos cromogénicos. Se encuentran disponibles varios medios
que contienen sustratos cromogénicos para la identificación presuntiva de
levaduras. CHROMagar Candida identifica presuntamenteC. albicans, C.
tropicalis, y alrededor de 10 otras especies. La identificación se basa en
diferentes colores de colonias, dependiendo de la descomposición de los
sustratos cromogénicos por las diferentes especies. Aproximadamente del
2% al 10% deC. albicans los aislamientos no se identifican en estos medios
porque forman colonias blancas.
Agar de harina de maíz. La morfología de la levadura en agar harina de maíz
ocupa el segundo lugar en importancia después de la asimilación del azúcar para
determinar la identificación de levaduras (ver Apéndice C). El reconocimiento de cuatro
tipos diferentes de morfología es un indicio importante para la identificación:
blastoconidios, clamidoconidios, pseudohifas y artroconidios.
Los blastoconidios son las formas características de las levaduras en gemación que
generalmente se observan en los montajes directos de levaduras. C. albicans produce
clamidoconidias junto con hifas, como se muestra en Figura 27.61. Pseudohifas (Figura
27.62) se producen cuando los blastoconidios germinan para formar una estera
filamentosa. Las paredes transversales ayudan a determinar si las estructuras son
verdaderas hifas o pseudohifas. Las paredes transversales de las pseudohifas están
estrechas y no son tabiques verdaderos, mientras que las hifas verdaderas permanecen
paralelas en las paredes transversales, sin hendiduras. Las artroconidias comienzan
como hifas verdaderas, pero se rompen en las paredes transversales con la madurez.
Los fragmentos rectangulares de hifas deben ser
ERRNVPHGLFRVRUJ
HIGO. 27,61Candida albicans en agar harina de maíz mostrando
clamidosporas típicas (sin teñir, ×200).
HIGO. 27,62Las pseudohifas ocurren cuando los blastoconidios
germinan y forman una estera filamentosa (sin teñir, ×200).
acompañado de blastoconidios para que un aislado se considere una
levadura.
Asimilación de nitrato de potasio. Nitrato de potasio (KNO3) La
asimilación proporciona información valiosa para separar las levaduras
clínicamente significativas. Uso del KNO modificado3 El agar es un método
bastante rápido, fácil y preciso para determinar la capacidad de las
levaduras para utilizar el nitrato como única fuente de nitrógeno. En un
KNO positivo3 resultado de asimilación, el medio se vuelve azul y, en un
resultado negativo, el medio se vuelve amarillo. Los organismos de control
que pueden usarse incluyenCryptococcus albidus (positivo) y C. albicans
(negativo).
Estudios de temperatura. Los estudios de temperatura ofrecen
información para la identificación de levaduras. Cryptococcus spp. tienen
un crecimiento débil a 35 ° C y ningún crecimiento a 42 ° C. La temperatura
óptima para el crecimiento es de unos 25 ° C.VariosCandida spp. tienen la
capacidad de crecer bien a temperaturas de hasta 45 ° C.C. albicans crece a
45 ° C, mientras que C. dubliniensis no.
Ureasa. Los aislados de levadura que producen la enzima ureasa pueden
detectarse fácilmente con agar urea Christensen. Las inclinaciones se inoculan y
se incuban a temperatura ambiente durante 48 horas. Casi todos se encuentran
clínicamenteCandida spp. son ureasa negativos, mientras que todos
Cryptococcus y Rhodotorula los organismos son ureasa positivos. La mayoría de
las cepas deTrichosporon spp. son ureasa positivos.

Diagnóstico mediante muestras clínicas y
marcadores sustitutos
(1,3) -β-D-Glucano. (1,3) -β-D-El glucano es un componente importante
de la pared celular de varios hongos, incluidas las levaduras patógenas y
los mohos. Las principales excepciones incluyenCryptococcus spp. y los
Mucorales. Hay varios ensayos disponibles, pero solo uno, la prueba
Fungitell (Associates of Cape Cod, Falmouth, MA), está disponible en los
Estados Unidos. Este ensayo es una prueba cromogénica basada en la
activación de la cascada de coagulación del cangrejo herradura por (1,3) -β-
D-glucano y utiliza enzimas amebocitos de Limulus polyphemus. Los
estudios clínicos han demostrado la utilidad de este ensayo para el
diagnóstico de infecciones fúngicas invasivas. Sin embargo, varias
sustancias, así como algunas bacterias, pueden dar lugar a resultados
falsos positivos. Los criptococos carecen de (1,3) -β-D-glucano, por lo que
son negativos. Además, se trata de un ensayo antifúngico, por lo que un
resultado positivo no proporciona información sobre las especies que
pueden estar causando la infección.
Galactomanano. La detección de galactomanano, un componente
de la Aspergilo pared celular, dentro del plasma o líquido BAL se
utiliza a menudo en el diagnóstico de infecciones invasivas causadas
porAspergilo especies. La detección de galactomanano es ahora parte
de los criterios de diagnóstico de probable aspergilosis invasiva. Un
método de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA),
PlateliaAspergilo El ensayo (Bio-Rad, Hercules, CA), que utiliza un
anticuerpo monoclonal de rata dirigido contra un epítopo en
galactomanano en formato ELISA, demostró ser sensible y específico
en pacientes con alto riesgo de aspergilosis invasiva.
Resonancia Magnética T2. Un ensayo relativamente nuevo para el
diagnóstico de candidiasis invasiva combina espectroscopia de resonancia
magnética nuclear con PCR para detectar Candida células directamente en
muestras de sangre. Un ensayo, el ensayo T2Candida (T2Biosystems,
Lexington, MA), está aprobado por la Administración de Drogas y
Alimentos de los EE. UU. (FDA) y puede detectar cincoCandida especies-C.
albicans, C. glabrata, C. krusei, C. parapsilosis, y C. tropicalis.Este ensayo
tiene una excelente sensibilidad analítica, pudiendo detectar de una a tres
unidades formadoras de colonias de Candida por mililitro de sangre. Una
de las principales ventajas es que los resultados están disponibles
rápidamente, generalmente dentro de las 4 horas en un estudio, en
comparación con más de 100 horas para los hemocultivos tradicionales.
Antígeno criptocócico. La detección de antígeno criptocócico, ya sea
en el LCR o en el suero, ha demostrado ser muy útil en el diagnóstico de
criptococosis. Varios ensayos disponibles detectan el componente
glucuronoxilomanano delCryptococcus antígeno. Estos incluyen ensayos
de aglutinación de látex, EIA y ensayos de flujo lateral. Recientemente, ha
estado disponible un ensayo de flujo lateral (ensayo de flujo lateral
criptocócico IMMY, Immuno-Mycologics, Norman, OK). Es una prueba
rápida con tira reactiva en el lugar de atención que utiliza un anticuerpo
monoclonal contra el antígeno criptocócico. Debido a que este ensayo es
sensible, fácil de realizar y no requiere equipo especializado o
refrigeración, la Organización Mundial de la Salud recomienda que se
utilice en entornos con recursos limitados para la detección de
criptococosis en personas con VIH.
Inmunodiagnóstico de la enfermedad fúngica
La reactividad de la prueba cutánea a los antígenos fúngicos se utiliza a
veces en el diagnóstico de alergias e infecciones fúngicas. Por ejemplo,
Aspergil lus spp. El extracto de antígeno se utiliza en caso de sospecha de
aspergilosis broncopulmonar alérgica, dermatitis atópica y asma alérgica.
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Capitulo 27 Hongos de importancia médica 613
Las pruebas cutáneas para diagnosticar una infección por hongos son valiosas solo si el
paciente tiene antecedentes de una prueba cutánea no reactiva.
Aunque hay pocos disponibles comercialmente, también se han
utilizado ensayos para detectar anticuerpos frente a hongos para ayudar a
diagnosticar infecciones. Los resultados dependen del antígeno elegido y
su calidad. Se ha informado de reactividad cruzada entre hongos
relacionados. La dobleinmunodifusión es probablemente el método más
utilizado; sin embargo, se han observado discrepancias entre laboratorios.
Un problema con los ensayos serológicos es la naturaleza ubicua de
muchos de los hongos oportunistas. Los individuos pueden tener
anticuerpos detectables pero no una infección activa. También se ha
demostrado que algunas personas conAspergilo spp. las infecciones no
tienen niveles detectables de anticuerpos.
Susceptibilidad antifúngica
Agentes antifúngicos
En los últimos 25 años, la incidencia de las infecciones por hongos ha
aumentado constantemente. Este aumento se puede atribuir a los avances en la
medicina que han prolongado la esperanza de vida, especialmente para quienes
padecen enfermedades crónicas. Los avances en el área de la medicina de
trasplantes y la quimioterapia, combinados con la inmunosupresión de la
infección por VIH, han creado más poblaciones de pacientes susceptibles a las
infecciones por hongos.
Los médicos tienen muchas menos opciones para tratar las infecciones por hongos
en comparación con las infecciones bacterianas. Las opciones actuales para tratar la
infección por hongos incluyen medicamentos principalmente de cuatro clases: polieno,
azol, equinocandina y alilamina. Durante muchos años, el principal agente antifúngico
fue la anfotericina B (AMB), un polieno. Este agente tiene un amplio espectro de
actividad además de actividad fungicida. Este agente no solo es letal para los hongos,
sino que también es tóxico para los pacientes. Los pacientes tratados con AMB pueden
experimentar muchos efectos secundarios adversos, incluidas reacciones relacionadas
con la perfusión (fiebre, rigidez, mialgia y artralgia) e insuficiencia renal. A pesar de
estos problemas, la AMB sigue siendo el fármaco de elección para la mayoría de las
enfermedades fúngicas potencialmente mortales. Desafortunadamente, la resistencia a
AMB se ha documentado conS. boydii y P. lilacinum, y en aproximadamente el 6% de
Candida lusitaniae aislamientos.
La clase que ha proporcionado el mayor número de agentes son los
azoles. Los compuestos más notables de esta clase incluyen fluconazol
(FLU), itraconazol (ITR), isavuconazol (ISA), posaconazol (POS) y voriconazol
(VOR). Los azoles son importantes porque exhiben una actividad razonable
contra los hongos y causan menos efectos secundarios. La gripe es el
agente principal para el tratamiento de las infecciones por hongos, pero
tiene una actividad limitada o nula contra el moho. Muchos médicos lo
utilizan ampliamente para tratar todo tipo de infecciones, incluidas la
vaginitis y la candidiasis. Desafortunadamente, su uso excesivo o indebido
ha resultado en el desarrollo de resistencias, sobre todo conC. glabrata.
Para los pacientes que han estado recibiendo terapia antifúngica a largo
plazo, es extremadamente importante determinar el patrón de
susceptibilidad para un aislado específico antes de prescribir FLU para
infecciones graves.
Los otros azoles, ITR, ISA, VORI y POS, se recetan con más
frecuencia para tratar las infecciones por moho. La ITR ha sido útil
para tratar infecciones por hongos feoides y aspergilli. ISA y POS son
los azoles más nuevos y quizás tengan la mejor actividad contra la
mayoría de las especies de hongos. El VOR ha mostrado una actividad
mejorada contra los aspergilli, además de varios patógenos
emergentes. Aunque la profilaxis con VOR es eficaz para disminuir las
infecciones alAspergilo spp., carece de actividad contra Mucorales.
614 PARTE 2 Identificación de laboratorio de aislamientos significativos
El primer agente que se liberó en el grupo de las equinocandinas fue la
caspofungina (CAS). Este agente es letal para las levaduras y, aunque es eficaz
contra los aspergilli, generalmente no es letal. Esta clase se dirige a la síntesis de
la pared celular, lo que la convierte en una opción atractiva para el tratamiento
de hongos que han desarrollado resistencia a otros agentes. Otras dos
equinocandinas son anidulafungina y micafungina. Estos dos antifúngicos
tienden a tener concentraciones inhibitorias mínimas (MIC) más bajas en
comparación con CAS. El CDC recomienda un fármaco equinocandina para el
tratamiento de invasivosC. auris infecciones.
Dos alilaminas aprobadas por la FDA son la terbinafina y la naftifina.
Estos compuestos interfieren con la síntesis de ergosterol, un esterol
principal en la membrana plasmática de muchos hongos. La terbinafina se
administra por vía oral y es activa contra varios grupos de hongos,
incluidos los dermatofitos y los hongos feoides. Naftifine se usa solo por
vía tópica.
Prueba de susceptibilidad antifúngica
Hasta los últimos años, muchos laboratorios utilizaban métodos que se habían
desarrollado internamente para determinar los patrones de susceptibilidad a los
hongos. El Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) de los Estados
Unidos ha publicado cuatro métodos para las pruebas de susceptibilidad a los
antifúngicos. Estos incluyen M27-A3 para pruebas de levadura, M38-A2 para
pruebas de moho, M44-A2 para pruebas de difusión de disco para levaduras y
M51-A para pruebas de difusión de disco para mohos. Los métodos más
recientes, M44-A2 y M51-A, se desarrollaron como procedimientos rentables que
podrían incorporarse fácilmente en laboratorios de microbiología ocupados que
rutinariamente realizan este tipo de pruebas antimicrobianas para bacterias. Al
igual que con las pruebas bacterianas, se usa agar Mueller-Hinton, lo que
elimina la necesidad de múltiples medios para realizar pruebas de
susceptibilidad antimicrobiana.
Aunque existe mucho debate con respecto a las pruebas de
susceptibilidad a los antifúngicos, está ganando popularidad entre más
laboratorios. La FDA ha aprobado un método de microtitulación de Trek
Diagnostic Systems (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) y un método
de difusión, Etest (bioMérieux, Durham, NC). Antes de que se desarrollaran
estos productos, solo los laboratorios que podían preparar sus propios
reactivos realizaban pruebas.
La barrera más grande para las pruebas antimicóticas generalizadas es
la falta de puntos de corte establecidos para la mayoría de los agentes. Los
puntos de corte son ahora específicos de la especie por fármaco, y los
resultados sitúan al organismo de forma categórica de la misma manera
que a las bacterias. Estas categorías son S (susceptible), I (intermedio) y R
(resistente) para las equinocandinas. Los azoles FLU y VOR se clasifican
como S, SDD (susceptible, dependiente de la dosis) y R. La categoría SDD
indica cepas que pueden considerarse susceptibles cuando se usa una
terapia de dosis alta, en contraposición a la terapia estándar.
Hasta que se estudien otros medicamentos y se establezcan los puntos de
corte, la utilidad de las pruebas de susceptibilidad a los antifúngicos
probablemente seguirá siendo limitada. Hasta que se establezcan los puntos de
corte, el CLSI ha proporcionado valores de corte epidemiológicos (VCE). La ECV
es un criterio de valoración que se puede utilizar para evaluar una CIM
determinada cuando no se dispone de puntos de corte clínicos. El ECV no indica
cepas susceptibles o resistentes, sino más bien cepas de tipo salvaje y no salvaje,
donde las cepas de tipo no salvaje pueden albergar mecanismos de resistencia a
los antifúngicos. El médico podrá revisar la actividad de un fármaco contra una
cepa específica para determinar si el resultado de la CMI es típico para esa
especie o alto. Aquellas cepas con una CIM por encima de la ECV tienen
potencialmente mecanismos de resistencia adquiridos.
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Puntos para recordar
- Las levaduras se reproducen típicamente por gemación, mientras que los mohos a menudo se reproducen
formando esporas.
- Una gran variedad de hongos producen infecciones humanas.
- Los hongos se pueden aislar de casi cualquier tipo de muestra clínica.
- La identificación de hongos se basa en una variedad de características, incluida
la apariencia macroscópica, la apariencia microscópica, la capacidad de crecer a
diversas temperaturas y las reacciones bioquímicas.
- Los hongos feoides producen pigmentos oscuros.
- Las dermatofitosis son causadas por Trichophyton, Microsporum, y
Epidermophyton especies.
- Los hongos térmicamente dimórficos Blastomyces dermatitidis,
Coccidioides immitis, Coccidioides posadasii, Histoplasma capsulatum,
Paracoccidioides brasiliensis, Sporothrix schenckii complejo de especies, y
Talaromyces (Penicillium) marneffei a menudo se asocian con micosis
sistémicas.
- Mucorales clínicamente importantes incluyen Rhizopus, Mucor,
Lichtheimia, Cunninghamella, y Syncephalastrum.
- Debido a su morfología microscópica, Geotrichum es un moho que a menudo se
confunde inicialmente con una levadura.
- Los hongos sapróbicos son más problemáticos en el huésped inmunodeprimido.
- Candida albicans es la levadura más comúnmente aislada.
- Pneumocystis jirovecii es un patógeno importante de pacientes con SIDA.
- Se debe tener mucho cuidado al trabajar con hongos dimórficos y en el
laboratorio. Los cultivos de todos los mohos deben procesarse en una
cabina de seguridad biológica.
- La terapia antimicótica suele ser ineficaz cuando se retrasa el diagnóstico.
Preguntas de evaluación del aprendizaje
1. Para cada uno de los siguientes hongos dimórficos, describa el aspecto
microscópico característico cuando se cultiva a 22 o 35 ° C:
una. Blastomyces dermatitidis
B. Coccidioides immitis y C. posadasii
C. Histoplasma capsulatum
D. Sporothrix schenckii complejo de especies
2. Describe la morfología microscópica de cada uno de los siguientes
organismos:
una. Microsporum gypseum
B. Microsporum canis
C. Trichophyton rubrum
D. Trichophyton mentagrophytes
3. Compare los resultados de la prueba de ureasa y la prueba de perforación del
cabello para T. rubrum y T. mentagrophytes.
4. Describir la importancia de aislar un saprobe de una infección
en un paciente inmunodeprimido.
5. Compare la morfología macroscópica y microscópica de los
siguientes saprobios: Penicillium spp., Aspergillus fumigatus,
Fusariumspp., y Curvularia spp.
6. Describe las diferencias entre la cromoblastomicosis y el
micetoma eumicótico.
7. Analice las diferencias entre bacterias y hongos.
8. Analice las diferencias entre los hongos hialinos y feoides.
9. Definir teleomorfo, anamorfo, y sinanamorfo.
10. Sospecha que una levadura aislada de la cavidad bucal de un paciente con
infección por VIH es C. albicans. Describe los resultados de la prueba del
tubo germinativo. ¿Qué morfología vería si inoculara la colonia en agar
de harina de maíz?

BIBLIOGRAFÍA
Ahmed, AOA y de Hoog, GS (2015). Hongos que causan eumicóticos
micetoma En JH Jorgensen, et al. (Eds.),Manual de microbiología clínica (
11ª ed., Pág. 2173). Washington, DC: Prensa de ASM. Albert, O. y col.
(2011). Reactividad del ensayo (1–> 3) -β-D-glucano en bacterias
infecciones del torrente sanguíneo. Revista europea de microbiología clínica
y enfermedades infecciosas: publicación oficial de la sociedad europea de
microbiología clínica30 de 1453.
Bormann, AM y Summerbell, RC (2015). Trichophyton, Microsporum,
Epidermophyton, y agentes de micosis superficiales. En JH Jorgensen,
et al. (Eds.),Manual de microbiología clínica (11ª ed., Pág. 2128).
Washington, DC: Prensa de ASM.
Brown, EM y col. (2013). El análisis filogenético revela una especie críptica
Blastomyces gilchristii, sp. nov. dentro del hongo patógeno humano
Blastomyces dermatitidis. Más uno, 8 (3), e59237. doi: 10.1371 /
journal.pone.0059237.
Centros de Control y Prevención de Enfermedades. CDC responde a multiestado
brote de meningitis fúngica y otras infecciones, 2012. Última actualización 18 de
febrero de 2016. Disponible en:http://www.cdc.gov/hai/outbreaks/ currentsituation
. Consultado el 14 de mayo de 2017.
Centros de Control y Prevención de Enfermedades. Candida auris interim recom
mendaciones para centros sanitarios y laboratorios. Última actualización el 4
de noviembre de 2016. Disponible en:https://www.cdc.gov/fungal/diseases/
candidiasis / recommended.html. Consultado el 11 de mayo de 2017. Chan,
JFW, et al. (2016).Talaromyces (Penicillium) marneffei infección
en pacientes no infectados por el VIH. Microbios e infecciones emergentes, 5, e19.
doi: 10.1038 / emi.2016.18.
Chen, SC-A. Y col. (2015).Aspergilo y Penicillium. En JH
Jorgensen y col. (Eds.),Manual de microbiología clínica (11ª ed., Pág.
2030). Washington, DC: Prensa de ASM.
Cojín, MT (2015). Pneumocystis. En JH Jorgensen, et al. (Eds.),
Manual de microbiología clínica (11ª ed., Pág. 2015). Washington, DC:
Prensa de ASM.
Dalcin, D. y col. (2016).Blastomyces gilchristii como causa de muerte aguda
síndrome de dificultad respiratoria. Enfermedades infecciosas emergentes.
Disponible en:http://dx.doi.org/10.3201/eid2202.151183.
D'Souza, CA y col. (2011). Variación del genoma enCryptococcus gattii, un
patógeno emergente de huéspedes inmunocompetentes. mBio, 2 (1), e00342–10.
doi: 10.1128 / mBio.00342-10.
García-Hermoso, D., et al. (2015). Agentes sistémicos y subcutáneos.
mucormicosis y entomoftoromicosis. En JH Jorgensen, et al. (Eds.),
Manual de microbiología clínica (11ª ed., Pág. 2087). Washington, DC:
Prensa de ASM.
Guarro, J. y de Hoog, GS (2015). Curvularia, Exophiala, Scedosporium,
Sporothrix, y otros hongos melanizados. En JH Jorgensen, et al. (Eds.),
Manual de microbiología clínica (11ª ed., Pág. 2153). Washington, DC:
Prensa de ASM.
Howell, SA y Hazen, KC (2015). Candida, Cryptococcus, y otra
levaduras de importancia médica. En JH Jorgensen, et al. (Eds.),Manual de
microbiología clínica (11ª ed., Pág. 1984). Washington, DC: Prensa de ASM. Jarvis, JN
y col. (2011). Evaluación de un criptocócico novedoso en el punto de atención
prueba de antígeno en suero, plasma y orina de pacientes con meningitis
criptocócica asociada al VIH. Enfermedades Infecciosas Clínicas: una publicación
oficial de la Sociedad Estadounidense de Enfermedades Infecciosas53, 1019.
Larone, DH (2016). Hongos de importancia médica: una guía para la identificación
(5ª ed.). Washington, DC: Prensa de ASM.
Lindsley, MD y col. (2011). Evaluación de un flujo lateral desarrollado recientemente
inmunoensayo para el diagnóstico de criptococosis. Infeccioso clínico
ERRNVPHGLFRVRUJ
Capitulo 27 Hongos de importancia médica 615
Enfermedades: una publicación oficial de la Sociedad de Enfermedades Infecciosas
de América53, 321.
Lockhart, SR y Warnock, DW (2015). Agentes antifúngicos. En JH
Jorgensen y col. (Eds.),Manual de microbiología clínica (11ª ed., Pág.
2223). Washington, DC: Prensa de ASM.
Lombard, L. y col. (2015). Conceptos genéricos enNectriáceas. Estudios en
Micología, 80, 189–245.
Luangsa-ard, J. y col. (2011).Purpureocillium, un nuevo género para el medio
cally importante Paecilomyces lilacinus. Cartas de microbiología FEMS,
321, 141-149. doi: 10.1111 / j.1574-6968.2011.02322.x.
Mylonakis, E. y col. (2015). Ensayo de resonancia magnética T2 para el rápido
diagnóstico de candidemia en sangre total: ensayo clínico. Enfermedades
Infecciosas Clínicas: una publicación oficial de la Sociedad Estadounidense de
Enfermedades Infecciosas, 60, 892.
Neely, LA y col. (2013). La resonancia magnética T2 permite nanopartículas
mediada por la detección rápida de candidemia en sangre total. Medicina
traslacional de la ciencia, 5, 182ra154.
Odabasi, Z. y col. (2004). β-D-Glucan como complemento de diagnóstico para invasivos
infecciones fúngicas: validación, desarrollo de puntos de corte y rendimiento
en pacientes con leucemia mielógena aguda y síndrome mielodisplásico.
Enfermedades Infecciosas Clínicas: una publicación oficial de la Sociedad
Estadounidense de Enfermedades Infecciosas, 39, 199. Ostrosky-Zeichner, L.,
et al. (2005). Evaluación clínica multicéntrica del
(1–> 3) ensayo de β-D-glucano como ayuda para el diagnóstico de infecciones fúngicas en
humanos. Enfermedades Infecciosas Clínicas: una publicación oficial de la Sociedad
Estadounidense de Enfermedades Infecciosas, 41, 654.
Pfeiffer, CD, Fine, JP y Safdar, N. (2006). Diagnóstico de invasivo
aspergilosis usando un ensayo de galactomanano: un metanálisis. Enfermedades
Infecciosas Clínicas: una publicación oficial de la Sociedad Estadounidense de
Enfermedades Infecciosas42, 1417.
Pickering, JW y col. (2005). Evaluación de un (1-> 3) -β-Densayo de glucano
para el diagnóstico de infecciones fúngicas invasivas. Revista de
microbiología clínica43, 5957.
Richardson, M. y Lass-Flörl, C. (2008). Cambiando la epidemiología de
infecciones fúngicas sistémicas. Microbiología clínica e infección,
14, 5.
Rizzato, C. y col. (2015). Superando los límites de la masa MALDI-TOF
espectrometría: más allá de la identificación de especies de hongos. Hongos J, 1,
367. doi: 10.3390 / jof1030367.
Scheel, C. y col. (2014). Desarrollo de una isoterma mediada por bucle
método de amplificación (LAMP) para detectar Histoplasma capsulatum
ADN en muestras clínicas. Revista de microbiología clínica, 52, 483.
Schwartz, IS, et al. (2015). 50 años deEmmonsia enfermedad en humanos:
La dramática aparición de un grupo de nuevos patógenos fúngicos. PLoS
Patógenos, 11, e1005198. doi: 10.1371 / journal.ppat.1005198. Suwantarat,
N. y col. (2015). Validación clínica a gran escala de un lateral
inmunoensayo de flujo para la detección de antígeno criptocócico en muestras de
suero y líquido cefalorraquídeo. Microbiología diagnóstica y enfermedades
infecciosas, 82, 54.
Thompson, GR y Gómez, BL (2015). Histoplasma, Blastomyces,
Coccidioides, y otros hongos dimórficos que causan micosis sistémicas.
En JH Jorgensen, et al. (Eds.),Manual de microbiología clínica (11ª ed.,
Pág. 2109). Washington, DC: Prensa de ASM.
Wright, W. y col. (2011). (1-3) -β-D-Ensayo de glucano: una revisión de su laboratorio
y aplicación clínica. Medicina de laboratorio42, 679.
Zhang, SX y col. (2015).Fusarium, y otros hialinos oportunistas
hongos En JH Jorgensen, et al. (Eds.),Manual de microbiología clínica
(11a ed., Pág.2057). Washington, DC: Prensa de ASM.
Traducido del inglés al español - www.onlinedoctranslator.com
CAPÍTULO
8 Uso de la morfología de colonias
para la identificación presuntiva
de microorganismos
Connie R. Mahona, George Manuselis
BOSQUEJO DEL CAPÍTULO
- IMPORTANCIA DE LA MORFOLOGÍA DE COLONIAS COMO
HERRAMIENTA DE DIAGNÓSTICO
- OBSERVACIÓN INICIAL E INTERPRETACIÓN DE
CULTURAS
- CARACTERÍSTICAS BRUTAS DE LA COLONIA UTILIZADAS
PARA DIFERENCIAR E IDENTIFICAR PRESUNTA
MICROORGANISMOS
Hemólisis
Tamaño
OBJETIVOS
Después de leer y estudiar este capítulo, debería poder:
1. Describir cómo se utiliza el crecimiento en agares sangre, chocolate y
MacConkey en la identificación preliminar de cepas bacterianas.
2. Diferenciar la α-hemólisis de la β-hemólisis en medio de agar sangre de
oveja.
3. Asocie las características de la colonia exhibidas en los agares sangre,
chocolate y MacConkey con los hallazgos microscópicos en el frotis directo, y
use la información en la identificación presuntiva de
microorganismos.
Caso en punto
Se cultivó un exudado de una úlcera decubital sacra en un paciente
hospitalizado de 65 años en agar sangre de oveja (SBA), chocolate (CHOC) y
agar MacConkey (MAC). El frotis directo mostró muchos glóbulos blancos,
un número moderado de cocos grampositivos en pares y grupos y algunos
bacilos gramnegativos. Después de la incubación durante la noche, fueron
visibles tres morfotipos de colonias en los medios SBA y CHOC. En SBA, el
primero fue un crecimiento moderado de una colonia β-hemolítica de
tamaño mediano que era de color blanquecino con una textura cremosa y
mantecosa. La segunda colonia también era β-hemolítica pero más
grande, mucoide y gris. El tercer tipo de colonia era grande, gris y
mucoide, similar al segundo
aMis comentarios son míos y no representan la opinión de la Administración de
Recursos y Servicios de Salud del Departamento de Salud y Servicios Humanos.
162
ERRNVPHGLFRVRUJ
Forma o margen
Elevación
Densidad
Color
Consistencia
Pigmento
Olor
- COLONIAS CON MÚLTIPLES CARACTERÍSTICAS
- CRECIMIENTO DE MICROORGANISMOS EN MEDIOS LÍQUIDOS
4. Utilizando la morfología de la colonia, diferenciar entre los siguientes
microorganismos:
• Estafilococos y estreptococos
• Streptococcus agalactiae y Streptococcus pyogenes
• Neisseria spp. y estafilococos
• Levaduras y estafilococos
• "Difteroides ”y estafilococos
• Fermentadores de lactosa y no fermentadores de lactosa
• "Enjambre " Proteo especies y otras enterobacterias
pero no fue hemolítico. El agar MAC mostró dos morfotipos de colonias: un
crecimiento claro de colonias de aspecto seco de color rosa oscuro con un
precipitado rosado circundante y algunas colonias claras. Con base en los
resultados de la tinción de Gram y las características de las colonias de los
aislados, se realizaron las pruebas bioquímicas apropiadas y las sensibilidades
antimicrobianas para identificar los agentes causantes de la úlcera.
Temas a considerar
Después de leer la historia clínica del paciente, considere:
- La morfología de las colonias de los aislados y cómo se utiliza para
identificar presuntamente microorganismos.
- Los resultados del examen de frotis directo y cómo se correlacionan con la
morfología de la colonia de los aislamientos en cada medio de cultivo.
- La morfología de la colonia de cada aislamiento para
diferenciar entre microorganismos patógenos y no patógenos.
 CAPÍTULO 8 Uso de la morfología de colonias para la identificación presuntiva de microorganismos 163

culturas como ejemplo. El tracto respiratorio superior contiene muchos

Términos clave
organismos autóctonos, y la identificación de todos los organismos en
α-hemólisis Fermentador de lactosa cultivo sería una tarea insuperable, con un costo prohibitivo y que
β-hemólisis No fermentador de lactosa consumiría mucho tiempo. Los microbiólogos deben ser capaces de
Frágil Margen diferenciar los patógenos potenciales de los habitantes
Butyrous Opaco "habituales" (microbiota) del tracto respiratorio superior y dirigir el trabajo
Morfología de la colonia Pigmento
de diagnóstico sólo hacia los patógenos potenciales. Los patógenos
Consistencia Rizoide
potenciales se identifican presuntamente por las características de la colonia,
Cremoso Liso
y el informe preliminar inicia la terapia inmediata.
Densidad Serpentinas
• Desempeñar un papel importante en el control de calidad,
Elevación Enjambre
especialmente de los procedimientos automatizados y otros
Escherichia / Citrobacter-igual que Transiluminación
sistemas de identificación disponibles comercialmente. Cuando se
organismos Translúcido
utilizan sistemas comerciales y automatizados, un inóculo mixto
Fastidioso Transparente
Filamentoso Turbiedad
(polimicrobiano, que contiene más de una especie) produce un

Hemólisis Umbilicato resultado de prueba bioquímica o una interpretación errónea de las

Klebsiella / Enterobacter-igual que Umbonate reacciones que altera significativamente la identificación (ver Capítulo 9
organismos ). La capacidad del microbiólogo para determinar si el inóculo está
mezclado y determinar si los resultados generados por un sistema
comercial o automatizado se correlacionan con la sospecha de

T
La importancia de la capacidad de reconocer y describir elmorfología
de la colonia (características de la colonia) de los aislamientos
recuperados en medios de cultivo y la interpretación de los frotis con
tinción Gram de muestras clínicas no se puede dejar de enfatizar. Aunque los
frotis teñidos con Gram permiten la identificación inicial de microorganismos
mediante caracterización microscópica, la descripción de las características de
crecimiento físico de los microorganismos en medios de laboratorio facilita los
procesos de identificación inicial.
Cierra los ojos e imagina las características físicas de una persona que
conoces bien. La altura, el peso, la forma, el color y el estilo de cabello, los
ojos, las pecas y el color de la piel de la persona, así como la voz o la risa,
pueden hacer que esa persona se distinga entre una multitud o cuando
está de espaldas a usted. De la misma manera, muchos microorganismos
tienen características específicas que los distinguen de una multitud de
otros géneros o especies.
Este capítulo analiza las características que se utilizan para
describir la morfología de la colonia de ciertos grupos de organismos
y cómo estas características se utilizan para diferenciar una especie
de una especie estrechamente relacionada y un género de otro.
También presenta cómo la caracterización de colonias en medios de
cultivo y los hallazgos en frotis directos teñidos facilitan la
identificación presuntiva de organismos comúnmente aislados.
Importancia de la morfología de las colonias como
herramienta de diagnóstico
La capacidad del microbiólogo para proporcionar una identificación presuntiva
mediante la morfología de la colonia amplía la utilidad de la caracterización de la
colonia más allá de una vía de identificación de organismos, pero en última
instancia puede incluir lo siguiente:
• Proporcione una identificación presuntiva al médico. Incluso en
esta era de sistemas de identificación rápida, los tiempos y
procedimientos de incubación pueden prolongarse. En una situación
crítica, el microbiólogo emite un juicio fundamentado sobre la presunta
identidad antes de realizar los procedimientos de identificación
diagnóstica.
• Mejorar la calidad de la atención al paciente mediante la notificación
rápida de los resultados y el aumento de la rentabilidad de las pruebas
de laboratorio. Esto se puede ilustrar mejor mediante el uso de esputo.
identificación del organismo es un componente importante del control
de calidad que se logra al reconocer los organismos por sus
características de colonia. .
Observación e interpretación inicial de
culturas
Revestimiento primario se refiere a la inoculación de la muestra clínica en
medios de laboratorio. Generalmente, los microbiólogos observan la morfología
de la colonia de organismos aislados en cultivo primario después de 18 a 24
horas de incubación. El tiempo de incubación puede variar según el momento en
que se reciba y procese la muestra en el laboratorio, y eso puede afectar la
morfología típica de un determinado aislado. Por ejemplo, las culturas jóvenes
deStaphylococcus aureus puede parecer más pequeño y no mostrar la β-
hemólisis distintiva que producen los cultivos más antiguos. Además, el
microbiólogo debe conocer los factores que pueden alterar significativamente la
morfología de la colonia de microorganismos en crecimiento. Estos factores
incluyen los ingredientes presentes en el medio, la naturaleza inhibitoria de
estos ingredientes y los agentes antimicrobianos que podrían estar presentes en
el medio.
La interpretación de culturas primarias, comúnmente conocida como
lectura de placa, es en realidad un examen comparativo de la morfología
de la colonia de microorganismos que crecen en varios medios de cultivo.
Las muestras como el esputo y las heridas que llegan al laboratorio clínico
se siembran en varios medios de cultivo como SBA, agar CHOC y agar MAC.
Cada tipo de placa de agar se examina en relación con el otro. Como
conjunto de medios de cultivo, se realiza un examen comparativo de
colonias del crecimiento de una muestra.Cuadro 8.1 enumera algunos de
los medios en placa utilizados comúnmente en un laboratorio de
microbiología clínica. VerApéndice A para obtener una lista más completa.
Algunos medios de laboratorio son selectivos, ya que se agregan agentes
para inhibir el crecimiento de ciertas especies. Esto permite una mejor
recuperación de las bacterias patógenas que son resistentes a los agentes
inhibidores. Algunos medios son diferenciales, lo que permite la diferenciación
de cepas bacterianas en función de la morfología de la colonia. Los medios
diferenciales se basan en la capacidad de algunas bacterias, y no de otras, de
utilizar un sustrato que a menudo produce un cambio en el pH que se detecta
mediante un cambio en el color de un indicador de pH. La capacidad de
determinar qué organismos crecen en medios selectivos y diferenciales ayuda al
microbiólogo a hacer una distinción inicial entre

ERRNVPHGLFRVRUJ
164 PARTE 1 Introducción a la microbiología clínica

MESA 8.1 Medios de uso común en el laboratorio de microbiología clínica

Medio Ingredientes principales Usos

Agar sangre anaeróbico, CDC Glóbulos rojos de oveja intactos, vitamina K, extracto de levadura
Agar chocolate Glóbulos rojos de oveja hemolizados suplementados con
hemoglobina y NAD
Agar entérico Hektoen Los carbohidratos lactosa, salicina y sacarosa; y bilis
sales para inhibir el crecimiento de bacterias grampositivas y
muchas bacterias entéricas no patógenas
Agar MacConkey Lactosa y sales biliares, la baja concentración de bilis.
Las sales inhiben las bacterias grampositivas pero permiten el
crecimiento de muchas bacterias gramnegativas.
Agar Thayer-Martin modificado Base de agar chocolate que contiene los agentes antimicrobianos
Medio nutritivo para el aislamiento y
subcultivo de bacterias anaerobias obligadas
Recubrimiento primario y subcultivo de quisquillosos
bacterias, por ejemplo, Haemophilus y patógeno
Neisseria spp.
Un medio selectivo y diferencial para el primario
placa de muestras de heces para ayudar en la recuperación
de patógenos intestinales, por ejemplo, SalmonelaUn
medio selectivo y diferencial para el
aislamiento de bacterias gramnegativas; utilizado para
el cultivo primario y el subcultivo
Un medio de recubrimiento primario selectivo para la recuperación de

vancomicina, colistina, trimetoprima y nistatina Neisseria gonorrhoeae y Neisseria meningitidis

Agar Sabouraud dextrosa Dextrosa (glucosa), se pueden agregar antimicrobianos a Plato primario y subcultivo de hongos.
inhibir bacterias
Agar sangre de oveja Glóbulos rojos de oveja intactos Placas primarias y subcultivo de la mayoría de bacterias
aisla

CENTROS PARA EL CONTROL Y LA PREVENCIÓN DE ENFERMEDADES, Centros de Control y Prevención de Enfermedades.

aislamientos grampositivos y gramnegativos. Agar SBA y CHOC apoyan el

crecimiento de variosfastidioso organismos (difíciles de cultivar, requieren
factores de crecimiento adicionales) así como organismos no fastidiosos,
tanto bacterias grampositivas como gramnegativas.

Verificación de caso 8.1

Como se ilustra en Case in Point al comienzo del capítulo, el frotis teñido con
Gram mostró cocos grampositivos y bacilos gramnegativos. Se observaron tres
morfotipos de colonias en SBA; uno fue identificado como cocos grampositivos y
el otro fueron dos especies gramnegativas diferentes. El frotis directo teñido con
Gram no permitirá distinciones entre las dos bacterias gramnegativas diferentes.
Se deben realizar observaciones morfológicas de colonias similares, excepto la
hemólisis, en agar CHOC.

Generalmente, los organismos que crecen en SBA también crecen

en agar CHOC, pero no todos los organismos que crecen en agar HIGO. 8.1En el sentido de las agujas del reloj desde la parte superior: agar
CHOC crecen en SBA. Aunque la SBA es compatible con organismos chocolate (CHOC), placa de agar sangre de oveja (SBA) y agar MacConkey
exigentes, las especies muy exigentes, comoHaemophilus spp. y (MAC). Las colonias grandes que crecen en las tres placas son bacilos
gramnegativos (entéricos). Estos bacilos gramnegativos crecen más
Neisseria gonorrhoeae,no crezcas en él. El agar CHOC proporciona
grandes, grises y mucosos en agar SBA y CHOC. Observe las fastidiosas
nutrientes adicionales para soportar organismos altamente exigentes
colonias más pequeñas, de color marrón grisáceo deHaemophilus sp.
comoHaemophilus spp. yN. gonorrhoeae. Por lo tanto, se sospecharía creciendo en agar CHOC(flecha), que no crecen en agar SBA o MAC.
que un bacilo gramnegativo que crece en agar CHOC pero no en agar
SBA o MAC es Haemophilus spp., mientras que se sospecharía que los
diplococos gramnegativos con el mismo patrón de crecimiento son Los bacilos gramnegativos se describen mejor en agar MAC porque
N. gonorrhoeae (Figura 8.1). El microbiólogo puede proporcionar una estos organismos producen colonias de aspecto similar en agar SBA y
identificación presuntiva y determinar cómo proceder para identificar CHOC. En agar SBA y CHOC, los bacilos gramnegativos producen colonias
los organismos aislados. Las bacterias seleccionadas para más grandes que parecen grises y a veces mucoides, y si son hemolíticos, se
pruebas se inocularán en otras placas, un proceso denominado observa hemólisis en SBA. El agar MAC se utiliza mejor para caracterizar los
subcultivo. bacilos gramnegativos porquefermentadores de lactosa pueden
Mientras que el agar MAC es compatible con la mayoría de los bacilos diferenciarse de los que no fermentan lactosa (no fermentadores de
gramnegativos, especialmente las Enterobacteriaceae, inhibe el lactosa). Los fermentadores de lactosa se detectan fácilmente por el
crecimiento de organismos grampositivos y algunos organismos cambio de color que producen en el medio; a medida que el pH disminuye
gramnegativos exigentes, comoHaemophilus y Neisseria spp. El debido a la fermentación de lactosa, los organismos producen colonias
crecimiento en agar SBA y CHOC pero no en agar MAC es indicativo de un rosadas, rosa oscuro o rojas (Figura 8.2A). Las colonias de no
aislado grampositivo o de un bacilo o coco gramnegativo exigente. fermentadores de lactosa permanecen claras e incoloras (Figura 8.2B).

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 CAPÍTULO 8 Uso de la morfología de colonias para la identificación presuntiva de microorganismos 165

A B
HIGO. 8.2A, Bacilos gramnegativos fermentadores de lactosa que producen colonias rosadas en agar MacConkey
(MAC). B, Bacilos gramnegativos no fermentadores de lactosa que producen colonias incoloras en agar MAC.

A B
HIGO. 8.3A, Fermentador de lactosa Escherichia / Citrobacter-como organismos que crecen en agar MacConkey
(MAC). Observe el aspecto seco de la colonia y el precipitado rosado de sales biliares que se extiende más allá de la
periferia de las colonias.B, Primer plano de seco, plano Escherichia / Citrobacterfermentadores similares a la lactosa
que crecen en agar MAC. Comparar conFigura 8.4B.

La diferenciación de la fermentación de lactosa y la no fermentación es Características brutas de las colonias utilizadas

particularmente importante en la detección de patógenos entéricos en cultivos
de heces. La mayoría de los patógenos entéricos no fermentan la lactosa. Los
microorganismos crecen en los medios de cultivo en la misma proporción o
concentración en la que están presentes en la muestra clínica. Debido a que
muchas muestras son polimicrobianas, esta característica puede ser beneficiosa
para identificar diferentes tipos de colonias.
Verificación de caso 8.2
para diferenciar e identificar
Presuntamente microorganismos
Al observar las características de la colonia de los organismos que se han
aislado, el microbiólogo puede hacer una suposición fundamentada con
respecto a la identificación del aislado. Las siguientes descripciones se
utilizan habitualmente para examinar las características de las colonias.
Muchas de las siguientes características de las colonias pueden diferir
entre especies y cepas del mismo género.

Ciertos patógenos entéricos, como Escherichia / Citrobacter-como organismos,

producen colonias rosadas secas con un "halo" circundante de sales biliares rosadas
precipitadas (Figura 8.3), mientras que Klebsiella / Enterobacter-como organismos
producen grandes colonias rosadas mucoides que ocasionalmente tienen centros de
color crema (Figura 8.4). Estas características en agar MAC son útiles en la identificación
presuntiva. En el caso en cuestión, se observaron colonias secas de color rosa oscuro
en agar MAC, lo que indica la presencia de una varilla gramnegativa fermentadora de
lactosa. Colonias de no fermentadores de lactosa que eran claras e incoloras (verFigura
8.2B) también se recuperaron de la muestra de este paciente.
Hemólisis
En SBA, hemólisis (griego hemo: perteneciente a los glóbulos rojos
[glóbulos rojos]; lisis: disolución o ruptura) observada en el medio que
rodea o debajo de la colonia es una reacción causada por la actividad
enzimática o toxínica de las bacterias. La hemólisis (p. Ej., Α, β o
ausencia de hemólisis con otras características de la colonia) en la SBA
es útil en la identificación presuntiva, en particular de estreptococos y
enterococos (véaseCapítulo 15). Es importante determinar si hay
hemólisis verdadera o si hay decoloración de

ERRNVPHGLFRVRUJ
166 PARTE 1 Introducción a la microbiología clínica

A B
HIGO. 8.4A, Klebsiella / Enterobacterfermentadores similares a la lactosa que crecen en agar MacConkey (MAC).
Observe la apariencia rosada, amontonada y mucoide.B, Primer plano de Klebsiella / Enterobactercolonias similares
en agar MAC. Observe la apariencia mucoide, amontonada y el centro ligeramente de color crema después de 48
horas de crecimiento.

Colonias

Placa de agar sangre HIGO. 8,6El agar chocolate (CHOC) no muestra hemólisis porque los
Fuente de luz
glóbulos rojos en el medio ya han sido lisados. Las bacterias que son
hemolíticas en agar sangre de oveja generalmente tienen una
decoloración verde alrededor de la colonia en agar CHOC.

HIGO. 8.5El uso de transiluminación para determinar si las colonias son

hemolíticas. La técnica se puede utilizar para agar MacConkey también
para ver ligeras diferencias de color en fermentadores sin lactosa.
el medio es el resultado del crecimiento del organismo en la placa. A
menudo, la colonia debe eliminarse con un asa para visualizar el
patrón hemolítico. La técnica adecuada requiere el paso de luz
brillante a través del fondo de la placa (transiluminación) para
determinar si el organismo es hemolítico (Figura 8.5). Muchos
organismos no tienen efecto lítico sobre los glóbulos rojos en SBA y se
denominanno hemolítico.
α-hemólisis
α-hemólisis es la lisis parcial de glóbulos rojos en una placa de SBA
alrededor y debajo de la colonia que da como resultado una decoloración
verde del medio. Ejemplos de organismos que producen α-hemólisis
organismos, como estreptococos β-hemolíticos del grupo A (Streptococcus
pyogenes), producen una zona amplia, profunda y clara de β-hemólisis, mientras
que otras, como los estreptococos β-hemolíticos del grupo B (Streptococcus
agalactiae) y Listeria monocytogenes (un bacilo grampositivo) producen una
zona estrecha y difusa de β-hemólisis cerca de la colonia. Estas características
son sugerencias útiles en la identificación de ciertas especies de bacterias. (Para
una comparación de las características de las colonias de estreptococos del
grupo A y del grupo B, consulteFigura 8.25.) El agar CHOC no muestra hemólisis
porque los glóbulos rojos en el medio se lisaron durante la preparación del
medio. Los organismos que son α-hemolíticos o β-hemolíticos en SBA
generalmente muestran una coloración verde alrededor de la colonia en agar
CHOC (Figura 8.6). Sin embargo, esta coloración no debe confundirse con una
característica hemolítica.
Tamaño

incluyensteotococos neumonia y ciertos estreptococos viridans. (Para una
comparación de la morfología de las colonias de estos dos organismos,
consulteFigura 8.24.)
β-hemólisis
β-hemólisis es la eliminación completa de eritrocitos en SBA alrededor o debajo
de las colonias debido a la lisis completa de los glóbulos rojos. Cierto
Las colonias se describen como grandes, medianas, pequeñas o puntiformes. Sin
embargo, un microbiólogo rara vez toma una regla y en realidad mide una
colonia. El tamaño es generalmente una comparación visual entre géneros o
especies. Por ejemplo, las bacterias grampositivas generalmente producen
colonias más pequeñas que las bacterias gramnegativas.EstafilococoLas
especies suelen ser más grandes que Estreptococo especies. Figura 8.7 muestra
colonias de bacilos gramnegativos en comparación con cocos grampositivos.

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 CAPÍTULO 8 Uso de la morfología de colonias para la identificación presuntiva de microorganismos
HIGO. 8.7Izquierda, Placa de agar sangre de oveja (SBA): las colonias blancas
pequeñas son cocos grampositivos. Derecha, SBA: las colonias grandes, grises y
mucoides son bacilos gramnegativos entéricos.
Filamentoso
Irregular
Liso
Áspero
HIGO. 8.8Ilustración de forma o margen para describir la morfología de la
colonia.
Forma o margen
Se debe observar el borde de las colonias y la forma, omargen, descrito
como liso, filamentoso, áspero o rizoide, o irregularFigura 8.8). Colonias
deBacillus Anthracis en el examen visual se describen como "cabezas de
medusa" debido a la apariencia filamentosa. Ciertos géneros comoProteo (
especialmenteProteus mirabilis) pueden pulularse en agar no selectivo
como agar sangre o agar CHOC. Enjambre es un manto brumoso de
crecimiento en la superficie que se extiende mucho más allá de las líneas
de la raya. Figura 8.9 muestra colonias enjambres de Proteo spp. Los
difteroides producen colonias
ERRNVPHGLFRVRUJ
167
HIGO. 8,9Enjambres de colonias de Proteo spp. El organismo se
inoculó en medio de la placa de agar sangre de carnero.(flecha).
HIGO. 8,10"Colonias de difteroides ”de apariencia seca y centro
umbonado que crecen en placa de agar sangre de carnero (SBA).
que tienen una apariencia secaFigura 8.10). Algunas levaduras producen
colonias cremosas, blancas con una superficie opaca y descritas como colonias
con patas o pedículos, mientras que los estafilococos producen colonias
húmedas, de color blanco cremoso a amarillento. (Para una comparación de la
morfología de las colonias de levaduras y estafilococos, consulteFigura 8.26.)
Elevación
los elevación debe determinarse inclinando la placa de cultivo y mirando
al lado de la colonia (Figura 8.11). La elevación puede ser elevada, convexa,
plana,umbilicato (centro deprimido, cóncavo), o umbonate (centro
elevado o abultado, convexo). S. pneumoniaetípicamente produce colonias
de umbilicatos, a menos que las colonias sean mucoides debido a la
presencia de una cápsula de polisacárido. S. aureus típicamente produce
colonias convexas. En comparación, los estreptococos β-hemolíticos
generalmente producen colonias planas.
Densidad
los densidad de la colonia puede ser transparente, translúcido, oopaco.
Para ver las diferencias en la densidad de las colonias, es útil mirar a través
de la colonia mientras se usa la transiluminación. Las colonias translúcidas
permiten que algo de luz pase a través de la colonia y las colonias opacas
no (Figura 8.12). Estreptococos β-hemolíticos
168 PARTE 1 Introducción a la microbiología clínica
excepto el grupo B (S. agalactiae) se describen como translúcidos. S.
agalactiae produce colonias que son semiopacas, con los organismos
concentrados en el centro de la colonia, a veces descrita como una colonia
de diana. Los estafilococos y otras bacterias grampositivas suelen ser
opacos. La mayoría de los bacilos gramnegativos también forman colonias
opacas.Bordetella pertussis se describe como brillante, similar a una media
perla, en medios que contienen sangre (ver Capítulo 18).
Color
A diferencia de la pigmentación, el color es un término que se utiliza para
describir un género en particular en general. Las colonias pueden ser blancas,
grises, amarillas o beige. Los estafilococos coagulasa negativos son blancos (
Figura 8.13), mientras que Enterococcus spp. puede aparecer gris. Cierto
Micrococosspp. yNeisseria spp. (no patógenos) son de color amarillo o
blanquecino (Figura 8.14). Los difteroides son pulidos. La mayoría de los bacilos
gramnegativos son grises en SBA.
Consistencia
Consistencia se determina tocando la colonia con un lazo estéril. La
consistencia de la colonia puede serfrágil (astillas), cremoso(butiroso),
seco o ceroso; ocasionalmente, toda la colonia se adhiere (se pega) al lazo.
S. aureus es cremoso, mientras que ciertos Neisseriaspp. son pegajosos.
Nocardia spp. producen colonias que son quebradizas, quebradizas y
arrugadas, parecidas a migas de pan en un plato. Las colonias de
difteroides suelen ser secas y cerosas. La mayoría de los estreptococos β-
hemolíticos están secos (excepto los tipos mucoides) y, cuando son
empujados por un asa, toda la colonia permanece intacta.
Plano
Elevado
Convexo o domo
Umbilicato
Umbonate
HIGO. 8.11Ilustración de elevaciones para describir la morfología de la colonia.
transparente transparente translucent translucent
colonia
HIGO. 8.12Densidad.
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Pigmento
Pigmento La producción es una característica inherente de un organismo
específico confinado generalmente a la colonia, aunque algunos pigmentos se
difundirán a través del medio de cultivo. La producción de pigmento
generalmente se mejora al cultivar bacterias a temperatura ambiente. Ejemplos
de organismos que producen pigmento incluyen los siguientes:
• P. aeruginosa—Verde, a veces un brillo metálico (Figura 8.15)
• Serratia rubidaea—Rojo ladrillo (Figura 8.16), especialmente a temperatura
ambiente
• Kluyvera spp. — azul
• Chromobacterium violaceum-púrpura
• Prevotella melaninogenica—Marrón-negro (anaeróbico) La
producción de pigmento de estos organismos es variable.
Olor
El olor debe determinarse cuando se retira la tapa de la placa de
cultivo y el olor se disipa en el entorno circundante. El
microbiólogo nunca debe inhalar directamente del plato. Algunos
ejemplos de microorganismos que producen olores distintivos
son los siguientes:
• S. aureus—Calcetín viejo (calcetín que se ha usado continuamente
durante algunos días sin lavarlo); este olor es evidente cuando las
bacterias crecen en agar sal de manitol
• P. aeruginosa—Fruta o en forma de uva
• P. mirabilis-podrido
• Haemophilus spp. — sótano mohoso, olor a "ratón" o "nido de
ratón"
• Nocardia spp. — campo recién arado
Verificación de caso 8.3
El caso en cuestión ilustra el razonamiento deductivo que se produce durante la
lectura de la placa (morfología de la colonia) del cultivo y el examen del frotis
directo de la muestra clínica. Ambas técnicas tienen un papel importante en la
presunta identificación requerida en la lectura de placas. El primer paso es
examinar el frotis directo de la muestra en busca de pistas importantes, por
ejemplo, la presencia de glóbulos blancos (un proceso inflamatorio) y la
morfología específica de la tinción de Gram. Los cocos grampositivos en pares y
agrupaciones en el frotis directo sugieren estafilococos (verCapítulo 7); es difícil
distinguir entre bacilos gramnegativos entéricos. Las colonias medianas β-
hemolíticas, blancas o blanquecinas, con apariencia de mantequilla cremosa en
SBA son muy sugestivas deS. aureus (ver Figura 8.26B). S. aureus sería inhibido
por el agar MAC y no crecería, dejando que los otros dos tipos de colonias se
identifiquen. El fermentador de lactosa (rosa) en agar MAC con un halo de
precipitado rosa que rodea las colonias es indicativo deEscherichia / Citrobacter
-como organismos. De estos dosEscherichia coli puede ser β-hemolítico en SBA
(ver Capítulo 19). El fermentador sin lactosa es el tercer tipo de colonia presente
en la muestra clínica. Tanto los fermentadores de lactosa como los
fermentadores sin lactosa crecen en SBA porque este medio no es inhibidor pero
se diferencia mejor en agar MAC.
opaco paque
colonia
 CAPÍTULO 8 Uso de la morfología de colonias para la identificación presuntiva de microorganismos 169

HIGO. 8.13Ejemplo de colonias blancas de estafilococos coagulasa A

negativos en placa de agar sangre.

B
HIGO. 8.14Ejemplo de las colonias amarillas características de ciertos no
patógenos Neisseria spp. en placa de agar sangre de oveja. HIGO. 8.15A, Pseudomonas aeruginosa que ilustra el brillo metálico
y la pigmentación verde de las colonias en una placa de agar sangre
de oveja (SBA). B, No todas las cepas del mismo organismo tienen la
misma apariencia de colonia. Esta es una cepa mucoide deP.
aeruginosa en SBA.
Colonias con múltiples características
Además de los organismos ya mencionados, otras bacterias encajan en
múltiples categorías descriptivas de morfología de colonias. Bacillus cereus
forma colonias hemolíticas grandes, rugosas, verdosas en SBA (Figura 8.17
). Eikenella corroe forma una pequeña colonia de "bordes difusos" con un
centro umbonato en agar SBA o CHOC (Figura 8.18). Aproximadamente la
mitad de las cepas se corroerán o formarán hoyos en el agar.

Crecimiento de microorganismos en
medios líquidos
También se pueden detectar pistas importantes para la identificación de un
organismo observando el crecimiento del organismo en medios líquidos como el
tioglicolato. Serpentinas o las enredaderas y los puffballs están asociados con
ciertas especies de estreptococos (Figura 8.19).Turbiedad, que se refiere a la HIGO. 8.16Pigmento rojo ladrillo de Serratia marcescens que es evidente
turbidez del medio resultante del crecimiento (y generalmente gas si el medio en agar MacConkey (Derecha). Este pigmento rojo ladrillo no debe
confundirse con la fermentación de lactosa. El pigmento es ligeramente
contiene glucosa), es producida por muchas Enterobacteriaceae (Figura 8.20).
visible en la placa de agar chocolate.(izquierda). La incubación a
Levaduras yPseudomonas las especies producen escoria en la parte superior y
temperatura ambiente mejora la pigmentación rojo ladrillo.
los lados del tubo (Higos. 8.21y 8.22). Además, las levaduras crecen
ocasionalmente debajo de la superficie en el área microaerofílica del medio (
Figura 8.23). S. agalactiae), y Figura 8.26 (estafilococos y una levadura) muestran las
Los microbiólogos pueden frustrarse cuando los microorganismos diferencias entre varios organismos según la morfología de la colonia. Los
que producen rasgos característicos muestran cambios en la organismos pueden presentar características muy diferentes de las
morfología de la colonia, tinción de Gram y reacciones bioquímicas. descritas anteriormente para ellos. La capacidad de reconocer estas
Fig. 8.24A y B (S. pneumoniae y estreptococos α-hemolíticos) Figura diferencias y cambios en las características hace que esta disciplina sea un
8.24C(Enterococcus spp .; verCapítulo 15), Figura 8.25 (S. pyogenes y desafío.

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170 PARTE 1 Introducción a la microbiología clínica

HIGO. 8.17Colonias grandes, rugosas y hemolíticas de Bacillus cereusen HIGO. 8.18Pequeña colonia central umbonada de "bordes
placa de agar sangre de oveja.
difusos" deEikenella corroe en agar chocolate. Este organismo
tiene la tendencia a "picar" el agar.

A B
HIGO. 8.19A, "Efecto vid ”o“ serpentina ”que presentan ciertas HIGO. 8,20Turbiedad producida por entéricos al crecer en
especies de estreptococos cuando crecen en tioglicolato. El efecto tioglicolato. Observe las burbujas de gas en la superficie y en el
es más frecuente hacia el fondo del tubo.B,Efecto de “bolas medio del medio.(flecha).
infladas” que presentan ciertas especies de estreptococos cuando
crecen en tioglicolato.

HIGO. 8.22Ilustración de Pseudomonas sp. produciendo "espuma" en

la superficie a los lados del tioglicolato. De vez en cuando,
HIGO. 8.21Producción de "escoria" por una levadura en la superficie del Pseudomonas aeruginosa produce un pigmento verde difusible y un
tioglicolato. brillo metálico en la superficie.

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 CAPÍTULO 8 Uso de la morfología de colonias para la identificación presuntiva de microorganismos 171

HIGO. 8.23Levadura que crece en el área microaerofílica del

tioglicolato.

Diferenciación de Steotococos neumonia, α-estreptococos viridans hemolíticos, y Enterococcus por morfología colonial

steotococos neumonia Estreptococos viridans α-hemolíticos

Translúcido, puede parecerse a una gota de agua; Translúcido, más gris, margen rugoso,
umbilicato, o plano con borde "penny"; margen centro umbonado
completo, zona amplia y fuerte de hemólisis α

Umbilicato
Centro Umbonate

Borde de "centavo"

B C
HIGO. 8.24A, Diferenciación de steotococos neumonia y α-estreptococos viridans hemolíticos por
morfología de la colonia. B, S. pneumoniae que crece en agar sangre de oveja (SBA). Note la zona fuerte deα
-hemólisis, centro de umbilicato y aspecto húmedo (mucoide) de las colonias. C, Enterococcuscreciendo en
SBA. No tiene un centro umbilicato o umbonato, pero está más amontonado y de apariencia gris queS.
pneumoniae. Los enterococos forman colonias más grandes y un margen liso y más oscuro, en contraste con
muchas cepas de α-estreptococos hemolíticos. El color verde en la placa no es hemólisis, pero es una
decoloración característica del crecimiento.

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172 PARTE 1 Introducción a la microbiología clínica

Streptococcus pyogenes Streptococcus agalactiae

Punta puntiaguda, quebradiza, translúcida, gris que puede
volverse marrón con la incubación continua, zona grande y
profunda de β-hemólisis en comparación con el tamaño de la
colonia
Colonia de tamaño mediano en comparación con
Streptococcus pyogenes, textura cremosa, zona gris, pequeña
y difusa de β-hemólisis en comparación con el tamaño de la
colonia; a menudo es necesario eliminar la colonia con un asa
para ver la hemólisis β; "ojo de buey": colonia que aparece
debido a los organismos concentrados en el centro

Colonia Colonia

Zona de β-hemólisis Zona de β-hemólisis

A

B C

D
HIGO. 8.25A, Diferenciación de Streptococcus pyogenes y Streptococcus agalactiae por morfología de la
colonia. B, Pequeña colonia de S. pyogenes exhibiendo una zona grande y profunda de β-hemólisis en agar
sangre de carnero (SBA). C, Colonias de S. agalactiae creciendo en SBA. Este organismo produce una colonia
más grande y una zona de hemólisis más pequeña y difusa queS. pyogenes. La hemólisis no es evidente en
esta fotografía. Comparar conB. D, Colonias de S. agalactiae creciendo en SBA. Mediante el uso de
transiluminación, el patrón hemolítico ahora es evidente; la hemólisis es difusa y permanece cerca de la
periferia de la colonia. La misma morfología de la colonia es producida porListeria monocytogenes, un bacilo
grampositivo. Comparar conB. S. pyogenes (flecha) produce dos hemolisinas; uno es estable al oxígeno y el
otro es lábil al oxígeno. Al apuñalar el medio con un asa de inoculación lleva al organismo a áreas donde las
condiciones anaeróbicas son más frecuentes, lo que permite ver el aumento de la hemólisis (debido a la
hemolisina lábil al oxígeno).

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 CAPÍTULO 8 Uso de la morfología de colonias para la identificación presuntiva de microorganismos 173

Estafilococo organismos Candida albicans (levadura)

Grande, plano o convexo o posee un centro umbonado Más pequeño que los estafilococos; convexo, crece más hacia arriba
después de 24 horas de incubación; brillante, húmedo, que hacia afuera; superficie cremosa, blanca y opaca; Por lo general,
cremoso, de blanco a blanquecino;S. aureus—Por lo general muestra pequeñas proyecciones en la base de la colonia después de
β-hemolítico 24 horas de incubación.

B C
HIGO. 8.26A, Diferenciación entre estafilococos y Candida albicans (una levadura) por morfología de la
colonia. B, Grande, blanco, convexo, brillante, húmedo, β-colonias hemolíticas de Staphylococcus aureus
creciendo en placa de agar sangre de oveja (SBA). C, "Colmado ”o convexo, blanco, de apariencia opaca y
textura butírica de C. albicans en SBA. Observe las pequeñas proyecciones o "pies" en el borde de las
colonias.

Puntos para recordar extendiéndose a lo largo del borde de su margen. Una presunta
identificación de este organismo sería:
- La morfología de la colonia descrita en este capítulo no es infalible. Las
una. Staphylococcus aureus
variaciones ocurren con bastante frecuencia. Las morfologías descritas son
B. Staphylococcus epidermidis
características generales de cualquier organismo dado.
C. Neisseria spp.
- El proceso de identificación inicial comienza con la tinción de Gram y la
D. Candida albicans
morfología de la colonia del aislado. Las reacciones bioquímicas o los ensayos
9. Un cultivo vaginal de una mujer embarazada de 25 años produjo colonias
de biología molecular confirman la identificación.
en agar SBA y CHOC, pero no hubo crecimiento en agar MAC. Las
- La tinción de Gram de la colonia de la placa de cultivo puede verse diferente del
colonias se describen como de tamaño mediano con zonas pequeñas y
frotis directo de la muestra. La competencia, el hacinamiento y los subproductos
difusas de β-hemólisis. Este tipo de hemólisis se nota cuando se extrae
metabólicos pueden alterar la morfología de la tinción de Gram.
una colonia con un asa. Una sospecha de identificación de este
Por ejemplo, en contraste con el frotis directo o los medios líquidos, los
organismo sería:
estreptococos pueden no aparecer como cocos positivos en las cadenas de la
una. Streptococcus pyogenes (Grupo A)
colonia.
B. Staphylococcus aureus
C. Streptococcus agalactiae (grupo B)
D. steotococos neumonia
Preguntas de evaluación del aprendizaje 10. Se observan colonias medianas, elevadas, de color blanquecino con proyecciones

1. ¿Qué indican las colonias de color rosa oscuro en agar MAC? filamentosas en agar SBA y CHOC. Es probable que el organismo:

2. En el caso en cuestión, ¿por qué hay tres tipos de colonias que una. steotococos neumonia
crecen en el SBA pero solo dos que crecen en agar MAC? B. Staphylococcus aureus
3. ¿Qué patógeno potencial sospecharía si encontrara colonias α- C. Bacillus cereus
hemolíticas en una muestra respiratoria? D. Una levadura

4. ¿Cómo describiría las colonias producidas en agar MAC por bacilos

gramnegativos no fermentadores?
BIBLIOGRAFÍA
5. ¿Cómo diferenciaría la β-hemólisis de la α-hemólisis?
De la Maza, L. y col. (2013).Atlas de color de bacteriología médica (2do
6. ¿Qué sospecharía si notara que crecen "bolas de pelaje" en el
ed.). Washington, DC: Prensa de ASM.
medio del caldo?
Leboffe, MJ y Pierce, BE (2011). Un atlas fotográfico de la
7. "¿Enjambrar ”colonias es una característica de qué género de bacterias?
laboratorio de microbiología (4a ed.). Englewood, CO: Morton Publishing.
8. Se aísla un crecimiento moderado de una colonia blanca apilada, de apariencia
Wistreich, G. (2007).Perspectivas de la microbiología: un estudio fotográfico
seca, de un paciente con aftas. La colonia tiene proyecciones diminutas
del mundo microbiano (2a ed.). Upper Saddle River, Nueva Jersey: Pearson.

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CAPÍTULO

9 Identificación bioquímica de
bacterias gramnegativas
Donald C. Lehman

BOSQUEJO DEL CAPÍTULO

- UTILIZACIÓN DE CARBOHIDRATOS Motilidad
Pruebas de oxidación-fermentación Nitrato de agar de motilidad-indol-
Agar hierro triple azúcar ornitina y oxidasa reductora de
Ortho-nitrofenil-β-D-Prueba de galactopiranósido nitrito
- EL METABOLISMO DE LA GLUCOSA Y SUS PRODUCTOS Agar ureasa de sulfuro-indol-
METABÓLICOS motilidad
Prueba de rojo de metilo - SISTEMAS DE PRUEBA MÚLTIPLE MANUAL
Prueba de Voges-Proskauer Principios del índice de perfil analítico de
- UTILIZACIÓN DE AMINOÁCIDOSPruebas de identificación
descarboxilasa y dihidrolasa Prueba de - SISTEMAS DE IDENTIFICACIÓN RÁPIDOS Y AUTOMATIZADOSEl
desaminasa término Rápido
- PRUEBAS VARIAS Pruebas bioquímicas rápidas realizadas en sistemas de identificación de
Utilización de citrato colonias aisladas que dependen de la utilización de carbohidratos
DNasa o sustratos cromogénicos Sistemas de
Producción de indol identificación automatizados Evaluación
Utilización de malonato de sistemas de identificación
inclinado de agar lisina hierro

OBJETIVOS
Después de leer y estudiar este capítulo, debería poder:
1. Explique la diferencia entre fenotipado y genotipado. • Test de motilidad

2. Analice la utilización de lactosa por las bacterias. • Ensayos de reducción de nitratos y nitritos

3. Compara las diferencias entre oxidación y fermentación. • Prueba de oxidasa

4. Explica las diferentes reacciones que se pueden observar en el agar hierro triple • Prueba de ureasa

azúcar (TSI). • Agar lisina-hierro (LIA)

5. Describa las reacciones involucradas y los productos del metabolismo • Agar de motilidad-indol-ornitina (MIO)
probados en cada uno de los siguientes: • Agar sulfuro-indol-motilidad (SIM)
• Orto-nitrofenil-β-D-prueba de galactopiranósido 6. Compare los fermentadores de lactosa retardados (dLF) con los fermentadores

• Prueba de rojo de metilo (MR) y Voges-Proskauer (VP) sin lactosa (NLF).

• Pruebas de descarboxilasa, dihidrolasa y desaminasa 7. Analice las ventajas de los sistemas de pruebas múltiples.

• Utilización de citrato 8. Describa la importancia de la notificación rápida de identificación

• Prueba de DNasa bacteriana.
• Prueba de licuefacción de gelatina 9. Describa cómo se han diseñado los métodos manuales establecidos para la
• Prueba de indol identificación rápida de aislamientos.
• Utilización de malonatos 10. Discutir la evaluación de los sistemas de identificación.

Afirmó haber comido una dieta estrictamente vegetariana y algunos

Caso en punto alimentos autóctonos bien cocinados, y que solo bebía agua embotellada.
Un hombre de 36 años acudió a un servicio de urgencias local quejándose Se enfermó gravemente el último día de su viaje cuando experimentó
de fiebre que había persistido durante aproximadamente una semana. El dolor de cabeza, fiebre y escalofríos, seguidos de seis a ocho episodios de
paciente informó que recientemente pasó unos 45 días en la India. diarrea por día. Unos días antes de la visita de hoy, el paciente

174
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 CAPÍTULO 9 Identificación bioquímica de bacterias gramnegativas 175

había sido diagnosticado en otro hospital con Giardia lamblia,
Endolimax nana, y Blastocystis hominis infección. Le habían
administrado ciprofloxacina pero no respondía al tratamiento. Se
solicitaron cultivos bacterianos de muestras de heces, orina y sangre.
No se observaron patógenos en los cultivos de sangre u orina; sin
embargo, se aisló un bacilo gramnegativo de los cultivos de heces. Se
observaron colonias claras, negativas a oxidasa en agar MacConkey y
colonias verdes con centros negros en Hektoen. Las pruebas
adicionales revelaron lo siguiente: TSI, alcalino sobre ácido con un
precipitado negro; caldo de glucosa, ácido sin gas; indol, negativo;
ureasa, negativo; y prueba de lisina descarboxilasa positiva.
Temas a considerar
Después de leer la historia clínica del paciente, considere:
- ¿Qué podría ser significativo sobre el viaje de este paciente a la
India?
- ¿Cuáles son los principios de las pruebas bioquímicas utilizadas para
Serotipado o el serogrupo, otro ejemplo de prueba fenotípica, a veces
se usa con pruebas bioquímicas para identificar diferentes cepas de
bacterias dentro de una especie. La serotipificación utiliza anticuerpos para
detectar antígenos específicos ubicados en la superficie bacteriana y se
menciona enCapítulo 10. Una tecnología más nueva que se encuentra en
los laboratorios de microbiología modernos es la desorción / ionización
láser asistida por matriz-espectrometría de masas de tiempo de vuelo
(MALD-TOF MS). Este método de identificación, discutido enCapítulo 11, se
basa en la caracterización de proteínas microbianas.
Los ensayos de biología molecular se basan en genotipo del
organismo y se cree que son más precisos que examinar el fenotipo. Los
ensayos de ácidos nucleicos, basados en secuencias de ácidos nucleicos,
disponibles desde hace varios años, son muy sensibles, específicos y
rápidos, y proporcionan resultados precisos en unas pocas horas o menos.
La genotipificación implica la caracterización de genes y se presenta en
Capítulo 11.
Este capítulo analiza los principios de las pruebas bioquímicas convencionales que

identificar el aislamiento? se utilizan comúnmente en la identificación de bacterias gramnegativas. Recuadro 9.1

enumera algunas de estas pruebas. El examen microscópico y la morfología de las
colonias se comentan en capítulos anteriores.

Términos clave

Asacarolítico Prueba de rojo de metilo (MR) Base Utilización de carbohidratos

permeasa de β-galactósido de descarboxilasa de Moeller
Entre las bacterias, existe una gran diversidad en la capacidad de utilizar
β-galactosidasa medio carbohidratos; sin embargo, la determinación de la utilización de lactosa es la
Sustrato cromogénico Motilidad-indol-ornitina
prueba de determinación de carbohidratos más importante. La degradación de
Prueba de citrato Agar (MIO)
la lactosa se puede utilizar para diferenciar especies bacterianas capaces de
Desaminasa Prueba de reducción de nitratos
fermentar lactosa (fermentadores de lactosa [LF]) de especies que son NLF. La
Descarboxilasa Códigos numéricos
lactosa es un disacárido que consta de glucosa y galactosa conectados por un
DNasa Medio basal O / F
enlace galactósido.
Fermentación Orto-nitrofenil-
Se necesitan dos enzimas para que una bacteria absorba lactosa y la
Sustrato fluorogénico β-D-galactopiranósido
divida en monosacáridos: β-permeasa de galactósido(lactosa permeasa),
Genotipo (ONPG)
Prueba de indol Prueba de oxidasa
que sirve como enzima de transporte que facilita la entrada de la molécula

Agar hierro Kligler (KIA)
Agar hierro lisina (LIA)
Prueba de malonato
Láser asistido por matriz
desorción / ionización—
espectrometría de masas de
tiempo de vuelo (MALDI-TOF MS)
Oxidación de lactosa a través de la membrana plasmática bacteriana, y β-
Fenotipo galactosidasa, la enzima que hidroliza la lactosa en glucosa y galactosa.
Serotipado Por definición, los LF poseen tanto β-galactósido permeasa como β-
Motilidad de indol-sulfuro (SIM) galactosidasa, y los NLF no poseen ninguna de las enzimas. Algunas
medio especies bacterianas carecen de β-galactósido permeasa pero poseen β-
Prueba de agar ureasa de hierro con galactosidasa. Estas especies bacterianas, denominadastarde o
triple azúcar (TSI) fermentadores de lactosa retardados (dLF), eventualmente son capaces de
Prueba de Voges-Proskauer (VP) escindir la molécula de lactosa.

H
Históricamente, la identificación de bacterias se ha basado
principalmente en la caracterización de la morfología de las colonias,
la morfología microscópica de organismos en frotis teñidos de Gram y
pruebas bioquímicas. Estos métodos se basan enfenotipo de microorganismos,
detectando características observables o medibles. Las pruebas bioquímicas se
realizaron originalmente en tubos de ensayo. Aunque este método fue preciso,
requirió mucho tiempo para inocular los múltiples tubos de medio y requirió
mucho espacio en la incubadora. Con el tiempo, las pruebas bioquímicas se
miniaturizaron y se desarrollaron sistemas multitest, lo que resultó en ahorros
de tiempo y espacio. Posteriormente se desarrollaron sistemas automatizados.
Después de la inoculación, un sistema computarizado registra los resultados de
la prueba, busca en una base de datos y proporciona una identificación del
organismo. Los sistemas automatizados pueden proporcionar una identificación
preliminar y patrones de susceptibilidad a los antimicrobianos en unas pocas
horas.
CAJA 9.1 Pruebas bioquímicas tradicionales para
Identificación de bacterias gramnegativas
• Agar hierro triple azúcar (TSI) o agar hierro Kligler (KIA) para determinar la
utilización de glucosa y lactosa, o sacarosa (sacarosa solo en TSI) y la
producción de sulfuro de hidrógeno
• Pruebas de rojo de metilo y Voges-Proskauer para determinar los productos finales de la
fermentación de glucosa.
• Prueba de indol para determinar si el indol se forma a partir del triptófano
por la triptofanasa
• Prueba de ureasa para determinar la hidrólisis de urea
• Citrato de Simmons para determinar si el citrato se puede utilizar como
única fuente de carbono
• Fermentación de carbohidratos
• Agar lisina-hierro (LIA) para determinar la actividad lisina descarboxilasa
• Medios de sulfuro-indol-motilidad (SIM) o motilidad-indol-ornitina (MIO)

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176 PARTE 1 Introducción a la microbiología clínica
Camino Embden-Meyerhof-Parnas Camino Entner-Doudoroff
Una molécula de glucosa Una molécula de glucosa
Glucosa 6-fosfato Glucosa 6-fosfato
Fructosa 6-fosfato Ácido 6-fosfoglucónico
Fructosa 1,6-difosfato 2-ceto-3-desoxi-6-
ácido fosfoglucónico
Dos moléculas de gliceraldehído
3-fosfato Gliceraldehído 3-fosfato
y ácido pirúvico
Ácido pirúvico de dos moléculas
HIGO. 9.1Dos vías para la degradación de la glucosa.
Una vez hidrolizada la lactosa, la glucosa está disponible para el
metabolismo principalmente a través de la vía Embden-Meyerhof-Parnas
(EMP), también conocida como glucólisis. Alternativamente, las bacterias
pueden utilizar la vía Entner-Doudoroff (Figura 9.1). VerFigura 1.10 en
Capítulo 1 para obtener una descripción adicional de estas vías.
Algunas especies bacterianas pueden usar carbohidratos solo en su
forma más simple, glucosa, y no pueden atacar al disacárido lactosa. De
manera similar, las especies bacterianas incapaces de fermentar glucosa
no pueden usar lactosa.
Las bacterias pueden utilizar muchos otros carbohidratos
(monosacáridos, disacáridos y polisacáridos). Con frecuencia, estos
carbohidratos se convierten finalmente en glucosa para su uso en la
glucólisis. Los ejemplos de azúcares distintos de la lactosa que se utilizan
para diferenciar bacterias incluyen maltosa, ramnosa, sacarosa, rafinosa y
arabinosa. Los alcoholes polihídricos (que terminan en "ol"), denominados
colectivamenteazúcares incluyen adonitol, dulcitol, manitol y sorbitol.
Algunas bacterias no pueden utilizar ningún carbohidrato; en su lugar,
utilizan otras moléculas orgánicas, como los aminoácidos, para obtener
energía y fuentes de carbono. Estos organismos se llamanasaccharolítico.
Pruebas de oxidación-fermentación
Las bacterias pueden utilizar los carbohidratos al oxidación (
aeróbicamente), fermentativamente (anaeróbicamente), o ambos,
determinando así el patrón de oxidación-fermentación (O / F), que es
importante en la identificación de bacterias. En particular, es útil para
diferenciar los miembros de la familia Enterobacteriaceae, aquellas
bacterias que son fermentadoras de glucosa de las pseudomonas
aeróbicas y bacterias gramnegativas similares que no fermentan.
Las pruebas de fermentación de carbohidratos determinan la capacidad de
un microorganismo para fermentar un carbohidrato específico incorporado en
un medio basal. Durantefermentación, la glucosa entra en la vía de la glucólisis,
lo que da como resultado la formación de ácido pirúvico que se puede
descomponer aún más en otros ácidos. El producto final de la fermentación de
carbohidratos es ácido o ácido con gas. Los indicadores de pH añadidos al medio
detectan la formación de ácido. Algunas bacterias producen principalmente un
solo ácido, como los estreptococos, que son fermentadores de ácido
homoláctico. Otras bacterias producen varios ácidos diferentes, como ácido
láctico, ácido propiónico y ácido succínico. Estos organismos se conocen como
fermentadores de ácidos mixtos.
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HIGO. 9.2Reacciones en medios fermentativos oxidativos. El par de
tubos de la izquierda es representativo de un fermentador: tubos
abiertos y superpuestos de aceite positivos para el ácido. El par de
tubos en el centro es representativo de un oxidante / no fermentador:
ácido producido solo en tubo abierto. El par de tubos de la derecha es
representativo de un no oxidante / no fermentador: el tubo recubierto
de aceite no cambia y el tubo abierto es alcalino por la utilización de
peptona.
La oxidación también comienza cuando la glucosa entra en la vía de la
glucólisis; sin embargo, el ácido pirúvico formado a partir de la glucólisis se
metaboliza más a dióxido de carbono (CO2). La oxidación requiere oxígeno
(respiración aeróbica) u otra molécula inorgánica (respiración anaeróbica),
como nitrato (NO3), como aceptor terminal de electrones. Se produce una
mayor acidez durante la fermentación que durante la oxidación pero se
genera menos energía.
De manera característica, los oxidantes y fermentadores exigentes
producen cantidades débiles o pequeñas de ácidos a partir de
carbohidratos. En medios que contienen grandes cantidades de peptonas
(1,0%), comoAgar triple azúcar-hierro (TSI), cualquier ácido que se
produzca es neutralizado o enmascarado por la reacción alcalina de la
utilización de peptona. Para detectar pequeñas cantidades de ácidos
producidos, ya sea fermentativa u oxidativamente, Hugh y Leifson
desarrollaron unMedio basal O / F(OFBM) que contiene la misma
concentración de carbohidratos (1%) que se encuentra en el medio TSI
pero una menor concentración de peptonas (0,2%). El indicador de pH es
azul de bromotimol. El medio sin inocular es verde; en un ambiente ácido,
el indicador es amarillo; y en un ambiente alcalino, es azul (Figura 9.2).
Cuadro 9.1 muestra las diferencias en las reacciones entre diferentes
grupos de organismos. El mismo medio se utiliza para las pruebas
oxidativas y fermentativas. Cuando se realizan las pruebas O / F, se
inoculan dos tubos de Hugh-Leifson OFBM: uno se recubre con aceite
mineral estéril para crear un ambiente anaeróbico (cerrado) y el otro tubo
se deja aeróbico (abierto), sin recubrimiento de aceite mineral. Cuando se
produce ácido en ambos tubos, es probable que el aislado sea un
fermentador. La fermentación puede ocurrir de forma aeróbica o
anaeróbica, si la bacteria no puede oxidar los carbohidratos. Esta situación
ocurre con muchos estreptococos, que obtienen toda la energía de la
fermentación incluso en presencia de oxígeno. La presencia de ácido en el
tubo cerrado solo indica que el organismo es un fermentador y posible
anaerobio obligado, mientras que la presencia de ácido en el tubo abierto
solo indica un oxidante. El tubo abierto puede o
 CAPÍTULO 9 Identificación bioquímica de bacterias gramnegativas
MESA 9.1 Reacciones bioquímicas características de bacilos gramnegativos en medios TSI, KIA y OFBM
Agar TSI
Carbohidratos (concentración) Glucosa (0,1%)
Lactosa (1%)
Sacarosa (1%)
Peptona 2%
Fermentador Tope ácido
Inclinación ácida o alcalina
No fermentador
Oxidante Trasero alcalino
Inclinación alcalina
No oxidante (asaccharolítico) Trasero alcalino
Inclinación alcalina
KIA, Agar hierro Kligler; OFBM, medio basal de oxidación-fermentación; TSI, hierro triple azúcar.
puede no mostrar acidez. La ausencia de producción de ácido en el tubo abierto
puede indicar que el organismo es un no oxidante; muchos no oxidantes
producen una reacción alcalina a partir de la utilización de peptonas.
Agar Hierro Triple Azúcar
Agar TSI y Agar hierro Kligler (KIA) son útiles en la identificación
presuntiva de bacterias entéricas gramnegativas, particularmente en la
detección de patógenos intestinales. Las fórmulas para el agar TSI y KIA
son idénticas excepto que el agar TSI contiene sacarosa además de glucosa
y lactosa. La lactosa está presente en una concentración 10 veces mayor
que la de la glucosa (1% de lactosa y 0,1% de glucosa). En el agar TSI, la
sacarosa también está presente en una concentración del 1%. Se agregan
sulfato ferroso y tiosulfato de sodio para detectar la producción de gas
sulfuro de hidrógeno (H2S). El rojo de fenol se utiliza como indicador de pH,
que es amarillo por debajo de un pH de 6,8. El medio sin inocular es rojo
porque el pH está tamponado a 7,4. Tanto el agar TSI como el KIA son
útiles para detectar la capacidad del microorganismo para fermentar
carbohidratos (glucosa y lactosa en KIA y glucosa, lactosa o sacarosa en
agar TSI); para producir gas a partir de la fermentación de azúcares; y para
detectar la producción de H2S.
Tanto el agar TSI como el KIA se vierten inclinados. La parte inclinada
es aeróbica; el trasero, o parte profunda, es anaeróbico. Para inocular agar
TSI o KIA, el científico del laboratorio debe elegir una colonia bien aislada
con una aguja de inoculación y apuñalar la culata casi hasta el fondo del
tubo. El científico del laboratorio quita la aguja, luego usa un movimiento
hacia adelante y hacia atrás, conocido comocola de pescado, a través de la
superficie de la inclinación. La tapa se vuelve a colocar sin apretar para
permitir que el oxígeno entre en el tubo y el medio se incuba en un
recipiente sin CO.2 incubadora de 18 a 24 horas. Los patrones de reacción
se escriben primero con los resultados oblicuos, seguidos de la reacción a
tope, separados por una barra (reacción oblicua / reacción a tope). Es
importante que las reacciones se lean dentro de un período de incubación
de 18 a 24 horas; de lo contrario, es posible que se obtengan resultados
erróneos.
Reacciones al agar TSI o KIA
1. Sin fermentación: inclinación alcalina / tope alcalino (K / K) o inclinación
alcalina / sin cambios (K / NC). Aunque no pueden fermentar ni lactosa ni la
glucosa, estos organismos pueden degradar las peptonas presentes en el
medio de forma aeróbica o anaeróbica, lo que da como resultado la
producción de subproductos alcalinos en la posición inclinada o profunda,
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177
KIA Hugh-Leifson OFBM
Glucosa (0,1%) Prueba de glucosa u otros carbohidratos (1%)
Lactosa (1%)
2% 0,2%
Tope ácido Tubo abierto: ácido
Inclinación ácida o alcalina Tubo sellado: ácido
Trasero alcalino Tubo abierto: ácido
Inclinación alcalina Tubo sellado: sin ácido
Trasero alcalino Tubo abierto: sin ácido
Inclinación alcalina Tubo sellado: sin ácido
respectivamente, cambiando el indicador a un color rojo intenso. Estas
reacciones son típicas de organismos que no son miembros de la
familia Enterobacteriaceae.
2. Fermentación de glucosa solamente, sin fermentación de lactosa (o
sacarosa en TSI): inclinación alcalina / tope ácido (K / A). El agar TSI y
KIA contienen glucosa en una concentración del 0,1%. El ácido
producido a partir de esta concentración de glucosa es suficiente para
cambiar el indicador a amarillo inicialmente en todo el medio. Sin
embargo, después de aproximadamente 12 horas, la glucosa se
consume y las bacterias en la inclinación utilizan las peptonas de
manera aeróbica, produciendo una reacción alcalina, que cambia el
indicador a un color rojo intenso. La fermentación de glucosa
(anaeróbica) en el trasero produce mayores cantidades de ácido,
superando los efectos alcalinos de la degradación de las peptonas; por
lo tanto, el trasero permanece ácido (amarillo). La lectura de los
resultados después de menos de 12 horas de incubación (ácido / ácido)
da la falsa apariencia de un organismo capaz de fermentar glucosa y
lactosa (o sacarosa en el caso del agar TSI). Por esta razón, el agar TSI o
KIA debe incubarse de 18 a 24 horas.
3. Fermentación de lactosa (o sacarosa o ambas): ácido / ácido (A / A).Los
fermentadores de glucosa atacan el azúcar simple glucosa primero y
luego lactosa o sacarosa. La producción de ácido a partir de la
fermentación del azúcar adicional es suficiente para mantener la
inclinación y el extremo ácido (amarillo) cuando se examinan al final de
las 18 a 24 horas de incubación. Sin embargo, si el medio se incuba
más allá de las 24 horas, es posible que la lactosa o la sacarosa se
consuman y se forme una inclinación alcalina. Es importante que las
pruebas de agar TSI y KIA no se lean después de 24 horas de
incubación.
4. H2Producción S: tope inclinado / ácido alcalino, H2S en el trasero (K / A, H2S) o
inclinado ácido / tope ácido, H2S en el trasero (A / AH2S). H2La producción de
S es un proceso de dos pasos. En el primer paso, H2S se forma a partir de
tiosulfato de sodio. Porque H2S es un gas incoloro, el indicador, sulfato
ferroso, es necesario para detectar visualmente su producción. En algunos
casos, la culata del tubo es completamente negra, oscureciendo el color
amarillo de la fermentación de carbohidratos. Porque H2La producción de S
requiere un ambiente ácido, incluso si no se puede ver el color amarillo, es
seguro asumir la fermentación de glucosa.
una. Bacteria (ambiente ácido) + Tiosulfato de sodio → H2S gas
B. H2Iones férricos S + → Sulfuro ferroso (precipitado negro)
178 PARTE 1 Introducción a la microbiología clínica
HIGO. 9.3Reacciones de agar hierro triple azúcar. De izquierda a derecha:
Tubo 1, gas A / A; tubo 2, A / AH2S; tubo 3, K / A; tubo 4, K / AH2S; tubo 5, K /
K.
5. Producción de gas (aerogénico) o no producción de gas (no
aerogénico). La producción de gas da como resultado la formación
de burbujas o la división del medio en la culata o el
desplazamiento completo del medio desde el fondo del tubo.
Figura 9.3 ilustra las reacciones en agar TSI.
Ortho-nitrofenil-β-D- Prueba
de galactopiranósido
Los organismos que son dLF aparecen como colonias no fermentadoras en
el medio de aislamiento primario. Cuando se colocan en agar TSI o
inclinaciones KIA, estas especies producen resultados similares después de
18 a 24 horas de incubación. losorto-nitrofenil-β-D-galactopiranósido
(ONPG) y el pag-nitrofenil-β-DLas pruebas de -galactopiranósido (PNPG)
determinan si el organismo es un dLF (uno que carece de la enzima β-
galactósido permeasa pero posee β-galactosidasa) o un verdadero NLF. El
ONPG es estructuralmente similar a la lactosa, pero el ONPG se transporta
más fácilmente a través de la membrana plasmática bacteriana y no
requiere permeasa de β-galactósido. La β-galactosidasa hidroliza ONPG, un
compuesto incoloro, en galactosa yo-nitrofenol, un compuesto amarillo.
ONPG permanece incoloro si el organismo es un NLF (Figura 9.4).
La prueba se puede realizar haciendo una suspensión pesada de
bacterias en solución salina estéril y agregando discos o tabletas de ONPG
preparados comercialmente. La suspensión se incuba a 35 ° C y, por lo
general, se pueden observar resultados positivos en 6 horas. La β-
galactosidasa es una enzima inducible. El gen se expresa solo si está
presente lactosa o un sustrato similar; por lo tanto, las bacterias deben
tomarse de los medios que contienen lactosa para su análisis. Las bacterias
que producen un pigmento amarillo no deben analizarse debido al riesgo
de un resultado falso positivo.
Metabolismo de la glucosa y sus
productos metabólicos
La glucosa metabolizada a través de la vía Embden-Meyerhof produce varios
subproductos intermedios, incluido el ácido pirúvico. Una mayor degradación
del ácido pirúvico puede producir ácidos mixtos como productos finales. Sin
embargo, las entéricas toman dos vías separadas: la mezcla
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ONPG
Sin inocular + -
HIGO. 9.4Orto-nitrofenil-β-DPrueba de -galactopiranósido (ONPG).
(Cortesía de la Sociedad Estadounidense de Ciencia, Educación e
Investigación de Laboratorios Clínicos, Inc, 1982.)
vía de fermentación ácida o vía del butilenglicol. losprueba de rojo de
metilo (MR) y el Prueba de Voges-Proskauer (VP) detectar los
productos finales de la fermentación de glucosa. Cada prueba detecta
productos de una vía diferente. Las pruebas de MR y VP son parte de
las reacciones IMViC: indol, MR, VP y citrato.
Prueba de rojo de metilo
Las bacterias se incuban en un medio de caldo que contiene glucosa. La mayoría
de los medios de RM comerciales son una modificación del medio de Clark y
Lubs. El caldo debe incubarse de 3 a 5 días a 35 ° C. Después de la incubación,
aproximadamente la mitad del caldo se transfiere a un tubo limpio y seco para la
prueba VP. Si la glucosa es metabolizada por la vía de fermentación ácida mixta,
se producen productos finales ácidos estables, lo que da como resultado un pH
bajo. Se desarrolla un color rojo después de la adición del indicador de pH MR (
Figura 9.5). Los cultivos MR-negativos permanecen amarillos después de la
adición del indicador de pH (pH 6,0).
Glucosa → Ácido pirúvico → Fermentación ácida mixta (pH 4,4)
↓
Color rojo con indicador rojo de metilo
Prueba de Voges-Proskauer
En algunas bacterias, los ácidos formados durante la fermentación pueden
metabolizarse más a 2,3-butanodiol a través de la acetoína intermedia.
Después de la incubación, primero se agrega α-naftol como catalizador o
intensificador de color. Luego, se agrega hidróxido de potasio (KOH) al 40%
o hidróxido de sodio (NaOH) y el tubo se agita suavemente para aumentar
la oxigenación. En estas condiciones, la acetoína se oxida a diacetilo. El
diacetilo en presencia de KOH y α-naftol forma un complejo rojo. El pH
permanece relativamente neutro.Figura 9.5ilustra la prueba MRVP. Las
bacterias tienden a ser positivas para MR o VP, pero no para ambas.
Algunas bacterias son negativas para ambas pruebas.
Glucosa → Ácido pirúvico → Acetoína → Diacetilo + KOH +
α-naftol → Complejo rojo → 2,3-butanodiol
 CAPÍTULO 9 Identificación bioquímica de bacterias gramnegativas 179

SEÑOR

MRVP

A B
Sin inocular W + -
Vicepresidente

C
Sin inocular + -
HIGO. 9.5A, La prueba de rojo de metilo-Voges-Proskauer (MRVP) se inocula y se incuba durante la noche. Luego se
divide igualmente en dos partes: una parte para la prueba de rojo de metilo (MR) y la otra para la prueba de Voges-
Proskauer (VP).B, Prueba de RM. C, Prueba de VP. (Cortesía de la Sociedad Estadounidense de Ciencia, Educación e
Investigación de Laboratorios Clínicos, Inc, 1982.)

Utilización de aminoácidos alcalinidad resultante. La degradación de los aminoácidos y sus

productos finales específicos se muestra en la siguiente reacción:
Pruebas de descarboxilasa y dihidrolasa
Muchas bacterias tienen la capacidad de utilizar aminoácidos como fuentes Degradación de aminoácidos y sus productos finales específicos
de energía y carbono. Descarboxilasa Las pruebas determinan si las
Lisina (aminoácido) → Lisina descarboxilasa →
especies bacterianas poseen enzimas capaces de descarboxilar (eliminar el
Cadaverina (amina) + CO2
grupo carboxilo, COOH) aminoácidos específicos en el medio de prueba. La
Ornitina → Descarboxilasa de ornitina → Putrescina
lisina y la ornitina son dos aminoácidos comúnmente usados para probar
la actividad descarboxilasa. Los productos de la descarboxilación son Arginina → Arginina dihidrolasa → Citrulina →Ornitina
moléculas de amina o diamina y CO2, con → Putrescina

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180 PARTE 1 Introducción a la microbiología clínica

La lisina es descarboxilada por la enzima lisina descarboxilasa a

cadaverina, una diamina y CO2. La ornitina descarboxilasa escinde la
ornitina en putrescina, una diamina y CO2. Tanto la cadaverina como
la putrescina son estables en condiciones anaeróbicas. La arginina se
puede descarboxilar en un proceso de dos pasos. En el primer paso, la
arginina se descarboxila por la arginina descarboxilasa para formar
agmatina y CO2. Luego, la agmatina se metaboliza más a putrescina y
urea. Si las bacterias también producen ureasa, la urea se degrada a
amoníaco (NH3) y compañía2. La arginina también puede ser
degradada por la arginina dihidrolasa formando citrulina, amoníaco y
fosfato inorgánico. En el siguiente paso, la citrulina se somete a una
escisión fosforolítica para producir ornitina. Si las bacterias también
poseen ornitina descarboxilasa, la ornitina se convierte en putrescina.

La prueba para detectar usos de descarboxilación Medio base

descarboxilasa Moeller. Este es un caldo que contiene glucosa;
peptonas; dos indicadores de pH, púrpura bromocresol y rojo cresol; y
el aminoácido específico a una concentración del 1%. El medio tiene
un pH inicial de 6,0. Tener glucosa en el medio es importante porque
las descarboxilasas son enzimas inducibles producidas en un pH
ácido. El medio no inoculado es violeta; El metabolismo de la pequeña
cantidad de glucosa reduce el pH a aproximadamente 5,5, volviendo
el medio de color amarillo. Para que tenga lugar la descarboxilación, HIGO. 9,6Reacciones de agar lisina hierro. De izquierda a derecha: K /
K (descarboxilación positiva sin H2S), K / AH2S (descarboxilación
se deben cumplir dos condiciones: un pH ácido y un ambiente
negativa con H2S), K / KH2S (descarboxilación positiva con H2S), R / Y
anaeróbico. Se inocula un tubo de control que contiene solo el medio
(descarboxilación negativa, desaminación positiva sin H2S).
base sin el aminoácido para determinar la viabilidad del organismo. El
tubo de control también determina si se produce suficiente ácido.
Ambos tubos se inoculan con el organismo de prueba; se recubren
con una capa de aceite mineral estéril, que crea condiciones
anaeróbicas; y luego se incuban a 35 ° C.
Durante las primeras horas de incubación, los organismos atacan
primero la glucosa, cambiando el pH a ácido. Si el organismo produce la
descarboxilasa específica y se ataca el aminoácido del medio, la liberación ALMOHADILLA

de los productos amínicos provoca un cambio de pH alcalino. Este cambio

da como resultado un color púrpura (resultado positivo) en el medio. Si el
organismo no posee la descarboxilasa específica, el medio permanece
amarillo (resultado negativo). El tubo de control permanece amarillo. Los
resultados generalmente se pueden registrar en 24 horas; sin embargo, las
bacterias con actividad descarboxilasa débil pueden tardar 4 días en ser
positivas. También se utilizan modificaciones de la prueba de
descarboxilasa para detectar otras reacciones bioquímicas. Ejemplos de
estos incluyen las pruebas MIO y LIA (Figura 9.6).

Prueba de desaminasa
Los aminoácidos pueden ser metabolizados por deaminasas que eliminan
una amina (NH2) grupo. La prueba de fenilalanina desaminasa (PAD)
determina si un organismo posee la enzima que desamina la fenilalanina
en ácido fenilpirúvico. El medio de prueba es un agar inclinado que
contiene una concentración de fenilalanina al 0,2%. La superficie de la
inclinación se inocula con una colonia bacteriana. Después de la
incubación, la adición de un 10% de cloruro férrico (FeCl3) El reactivo da
como resultado un color verde si está presente ácido fenilpirúvico. Esta
prueba es útil en la diferenciación inicial deProteo, Morganella, y
Providencia organismos, que son positivos, del resto de las
Enterobacteriaceae (Figura 9.7). Sin inocular + -
Desaminación de fenilalanina Fenilalanina →
HIGO. 9,7Prueba de fenilalanina desaminasa (PAD). (Cortesía de la
Fenilalanina desaminasa → Sociedad Estadounidense de Ciencia, Educación e Investigación de
Ácido fenil pirúvico + (FeCl3 ) verde Laboratorios Clínicos, Inc, 1982.)

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 CAPÍTULO 9 Identificación bioquímica de bacterias gramnegativas
HIGO. 9,8Prueba de utilización de citrato. Izquierda, Sin inocular. Medio,
Resultado positivo. Derecha, Resultado negativo.
Pruebas misceláneas
Utilización de citrato
los prueba de citrato determina si un organismo puede utilizar citrato de
sodio como única fuente de carbono. El medio de citrato de Simmons se
utiliza con frecuencia para determinar la utilización de citrato. Además del
citrato, el medio de prueba contiene sales de amonio como única fuente de
nitrógeno. Las bacterias capaces de usar citrato usarán las sales de
amonio, liberando amoníaco. El pH alcalino que resulta del uso de las sales
de amonio cambia el indicador de pH (azul de bromotimol) en el medio de
verde a azul. Es importante utilizar un inóculo ligero porque los
organismos muertos pueden ser una fuente de carbono y producir una
reacción de falso positivo (Figura 9.8). El medio de citrato de Christensen es
un medio de prueba alternativo. Este medio incorpora rojo de fenol (como
indicador de pH) y nitrógeno orgánico. A un pH alcalino, el indicador
cambia de amarillo a rosa.
DNasa
El ácido desoxirribonucleico (ADN) es un polinucleótido compuesto por
unidades monoméricas mononucleotídicas de purina y pirimidina que se
repiten. La mayoría bacterianaDNasas son endonucleasas que escinden
los enlaces fosfodiéster internos dando como resultado subunidades más
pequeñas. La ADNasa extracelular puede ser producida por numerosas
bacterias, comoStaphylococcus aureus y Serratia marcescens. El medio de
prueba de ADNasa generalmente contiene un 0,2% de ADN. Un inóculo
pesado de bacterias se esparce sobre la superficie del medio en línea recta;
se pueden analizar varios organismos a la vez. La placa se incuba a 35 ° C
durante 18 a 24 horas y luego se añade HCl 1 N a la superficie de la placa.
El ADN no hidrolizado es insoluble en HCl y forma un precipitado. Los
oligonucleótidos formados por la acción de la DNasa se disuelven en el
ácido, formando una zona clara (halo) alrededor del inóculo, un resultado
positivo. Una formulación alternativa incorpora verde de metilo en el
medio. Los complejos de verde de metilo con el ADN forman un color
verde. Si el ADN se descompone por
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181
Sin inocular + -
HIGO. 9,9Caldo de indol. (Cortesía de la Sociedad Estadounidense de
Ciencia, Educación e Investigación de Laboratorios Clínicos, Inc, 1982.)
ADNasas bacterianas, el ADN ya no puede unirse al verde de metilo y el color
verde se desvanece. Una zona clara alrededor de las bacterias indica un
resultado positivo.
Producción de indol
El indol es uno de los productos de degradación del aminoácido triptófano.
Los organismos que poseen la enzima triptófano son capaces de
desaminar el triptófano con la formación de productos de degradación
intermedios de indol, ácido pirúvico y amoníaco. Las bacterias se inoculan
en caldo de triptófano o peptona. La mayor parte del caldo de peptona
comercial contiene suficiente triptófano para una reacción positiva; se
puede añadir triptófano hasta una concentración final del 1%. Después de
la inoculación, el caldo debe incubarse a 35 ° C durante 48 horas. Después
de la incubación, se puede utilizar uno de dos métodos para detectar indol.
En el Ehrlichprueba de indol, el indol se extrae del caldo de cultivo
mediante la adición de 1 mL de xileno. Después de agregar el xileno, el
tubo se agita bien. Después de esperar unos minutos para que el xileno
suba a la parte superior, 0.5 mL de reactivo de Ehrlich, que contienepagSe
añade -dimetilaminobenzaldehído (PDAB). Si hay indol, se desarrolla un
color rojo después de la adición de PDAB (Figura 9.9). Alternativamente, se
puede utilizar el reactivo de Kovac, que también contiene PDAB. Este
método no utiliza una extracción con xileno. Aproximadamente cinco gotas
de reactivo de Kovac se agregan directamente al caldo de cultivo. El tubo
se agita y, si hay indol, aparece un color rojo. El método de Ehrlich es más
sensible que el reactivo de Kovac y se prefiere con bacterias no
fermentativas. Si se usa medio de indolenitrato (nitrato de tripticasa), la
prueba de indol se puede realizar a partir del mismo cultivo en caldo que
una prueba de nitrato. Antes de agregar cualquier reactivo, el caldo se
divide por la mitad, una alícuota para la prueba de indol y la otra para la
prueba de nitrato. Está disponible una prueba rápida de indol. Las colonias
bacterianas aisladas se extienden sobre papel de filtro humedecido conpag
-dimetilaminocinamaldehído.
182 PARTE 1 Introducción a la microbiología clínica

La formación de un color azul verdoso en 2 minutos es una

Caldo de malonato
reacción positiva que indica la presencia de indol en la colonia
bacteriana.

Agar lisina hierro inclinado

los agar lisina-hierro (LIA) La prueba es un agar inclinado en tubo que
contiene el aminoácido lisina, glucosa, citrato de amonio férrico y tiosulfato
de sodio. El indicador de pH es púrpura de bromocresol. El LIA se utiliza
principalmente para determinar si las bacterias descarboxilan o desaminan
la lisina (verFigura 9.6). H2La producción de S también se detecta en este
medio. LIA se inocula de la misma manera que un agar TSI inclinado. LIA es
más útil junto con TSI en la detección de muestras de heces para detectar
la presencia de patógenos entéricos, diferenciandoSalmonela spp. (lisina
positiva) deCitrobacter spp. (lisina negativa). La descarboxilación solo
ocurre anaeróbicamente; la presencia de una culata de color púrpura
oscuro es positiva para la descarboxilación de lisina. La producción de H2S
puede enmascarar el color púrpura en la culata del tubo. Porque H2La
producción de S en LIA ocurre solo en un ambiente alcalino, un precipitado
negro indica H2S también es un resultado positivo para la descarboxilación.
LIA también es útil para diferenciarProteo, Morganella, y Providencia spp.
de la mayoría de los demás miembros de Enterobacteriaceae. Este grupo
de entéricos desamina (ataca el NH2 grupo en lugar del grupo carboxilo)
Sin inocular + -
aminoácidos. En la inclinación LIA, la desaminación de la lisina convierte la
inclinación original del color púrpura claro a un color ciruela o púrpura HIGO. 9,10Prueba de malonatos. (Cortesía de la Sociedad Estadounidense de
rojizo; el trasero se vuelve amarillo debido a la fermentación de la glucosa. Ciencia, Educación e Investigación de Laboratorios Clínicos, Inc, 1982.)

Se inocularán dos tubos de motilidad, uno incubado a temperatura ambiente y el

Verificación de caso 9.1
En el Caso en cuestión al comienzo del capítulo, la historia del paciente y los resultados
preliminares del cultivo de laboratorio implicaron una infección bacteriana que
involucró a un miembro de las Enterobacteriaceae. Los resultados de los medios en
tubos indican que el agente causal esSalmonela Typhi. Las reacciones clave incluyen la
inclinación de TSI que muestra un fermentador sin lactosa ni sacarosa que produce H2
S; no se produce gas durante la fermentación de glucosa; y lisina descarboxilasa
positiva.
Utilización de malonatos
los prueba de malonato determina si el organismo es capaz de utilizar
malonato de sodio como única fuente de carbono. El caldo de malonato
normalmente contiene azul de bromotimol como indicador de pH. Las bacterias
que pueden utilizar malonato como única fuente de carbono también utilizan
sulfato de amonio como fuente de nitrógeno. Una prueba positiva da como
resultado un aumento de la alcalinidad por la utilización del sulfato de amonio,
cambiando el indicador de verde a azul (Figura 9.10).
Motilidad
La motilidad se puede determinar mediante el examen microscópico de
bacterias u observando el crecimiento en un medio semisólido. Los medios de
prueba de motilidad tienen concentraciones de agar de 0,4% o menos para
permitir la propagación libre de microorganismos. Se hace una sola puñalada en
el centro del medio entubado. Se obtienen mejores resultados si la puñalada se
hace lo más recta posible. Después de la incubación, el movimiento alejándose
de la línea de la puñalada o una apariencia nebulosa en todo el medio indica un
organismo móvil. La temperatura de incubación es importante. Algunas
bacterias son móviles solo a temperatura ambiente, pero esta temperatura
puede no ser óptima para el crecimiento. Se sugiere que
otro a 35ºC. La comparación de tubos inoculados con tubos sin inocular puede
ayudar a interpretar los resultados.
Agar de ornitina indol de motilidad
Agar motilidad indol ornitina (MIO) es un medio de agar semisólido que
se utiliza para detectar la motilidad y la producción de indol y ornitina
descarboxilasa. MIO es útil para diferenciarKlebsiella spp. deEnterobacter y
Serratia spp. El medio se inocula haciendo una puñalada recta en el centro
del medio con una aguja de inoculación. La motilidad se muestra por un
enturbiamiento del medio o un crecimiento que se extiende desde la línea
de inoculación. La descarboxilación de ornitina está indicada por un color
púrpura en todo el medio. Debido a que MIO es un medio semisólido, no
es necesario recubrirlo con aceite mineral para proporcionar condiciones
anaeróbicas. La producción de indol se detecta mediante la adición de
reactivo de Kovac; se forma un color de rosa a rojo en el área del reactivo si
el resultado de la prueba es positivo. La ornitina descarboxilasa y la
motilidad deben leerse primero antes de agregar el reactivo de Kovac.
Reducción de nitratos y nitritos
los prueba de reducción de nitratos determina si un organismo tiene la
capacidad de reducir el nitrato a nitrito y reducir aún más el nitrito a gas
nitrógeno (N2). El organismo se inocula en un caldo nutritivo que contiene
una fuente de nitrógeno. Después de 24 horas de incubación,
N, NSe añaden -dimetil-α-naftilamina y ácido sulfanílico. Un
color rojo indica la presencia de nitrito.
Reacción de prueba de reducción de nitrato
Caldo nutritivo con nitrato de potasio al 0,1% →
Nitrato reductasa → Nitrito → Ácido sulfanílico +norte,
norte-Dimetil-α-naftilamina → Tinte rojo diazo

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 CAPÍTULO 9 Identificación bioquímica de bacterias gramnegativas 183

Si no se desarrolla color, esto puede indicar que el nitrato no se ha

reducido o que el nitrato se ha reducido aún más a N2, óxido nítrico (NO) u
óxido nitroso (N2O), que los reactivos no detectarán. Agregar una pequeña
cantidad de polvo de zinc ayudará a determinar si la prueba ha producido
un resultado negativo verdadero o si la falta de producción de color se
debió a una reducción más allá del nitrito. El polvo de zinc reduce el nitrato
a nitrito. Por lo tanto, el desarrollo de un color rojo después de la adición
de zinc confirma un resultado de prueba negativo verdadero.
Alternativamente, un pequeño tubo de vidrio, llamadoTubo de Durham, se
puede insertar en el caldo al revés cuando el medio se divide en alícuotas
en tubos de ensayo. Durante la incubación, si se produce nitrógeno,
quedará atrapado en el tubo de Durham invertido.

Oxidasa
los prueba de oxidasa determina la presencia del sistema citocromo
oxidasa que oxida el citocromo reducido con oxígeno molecular. La prueba
de oxidasa es útil para diferenciar entre las Enterobacteriaceae, que son
oxidasa negativas (exceptoPlesiomonas) y las pseudomonas, que son
oxidasa positivas. La prueba de oxidasa también es útil para identificar
Neisseria spp., que son oxidasa positivas. Se utiliza una prueba de oxidasa
modificada para distinguirEstafilococo de Micrococcus. Se encuentran
disponibles varios métodos para realizar una prueba de oxidasa. La prueba
de oxidasa de Kovac utiliza una solución acuosa al 0,5% o al 1% de
diclorhidrato de tetrametil-ρ-fenilendiamina. Se agrega una gota del
reactivo al papel de filtro y se usa un aplicador de madera para frotar una
colonia sobre el papel de filtro humedecido. El desarrollo de un color
lavanda en 10 a 15 segundos es una reacción positiva. El oxalato de ρ-
aminodimetilanilina es menos sensible que el diclorhidrato de tetrametil-ρ-
fenilendiamina, pero es más barato y más estable. Las formas comerciales
de reactivo de oxidasa están disponibles en ampollas de vidrio y en discos
de papel de filtro.
Agar Sulfuro de Motilidad Indol
Motilidad de indol sulfuro (SIM) El medio es un agar semisólido útil para
diferenciar bacterias gramnegativas de la familia Enterobacteriaceae. Se
usa una aguja de inoculación para hacer una puñalada recta por el centro
del medio. La nubosidad que se extiende desde la línea de inoculación es
positiva para la motilidad. La producción de H2S se indica por un
precipitado negro, y un color de rosa a rojo después de la adición del
reactivo de Kovac es positivo para indol.
Ureasa
los prueba de ureasa determina si un microorganismo puede hidrolizar la urea,
liberando una cantidad suficiente de amoníaco para producir un cambio de color
mediante un indicador de pH. La ureasa hidroliza la urea para formar amoníaco,
agua y CO2. Se encuentran disponibles diferentes formulaciones de agar urea,
pero generalmente se prefiere el agar urea de Christensen. La superficie del
agar inclinado se inocula pero no se apuñala. El medio contiene rojo de fenol
como indicador de pH. El pH alcalino resultante de la hidrólisis de urea está
indicado por un color rosa brillante (Figura 9.11).
Verificación de caso 9.2
Los resultados de los medios en tubo para el Case in Point sugieren que la causa de la
enfermedad del paciente es Salmonela Typhi. Aislamientos bioquímicamente
identificados comoSalmonela posteriormente debe confirmarse mediante serogrupo.
Algunos laboratorios pueden preferir utilizar un sistema automatizado o de pruebas
múltiples en lugar de medios en tubos para identificar aislamientos de muestras
clínicas como sangre, orina o heces.
HIGO. 9.11Prueba de ureasa. Izquierda, Resultado negativo. Derecha, Resultado positivo.
Sistemas manuales de pruebas múltiples
Principios de identificación
Los sistemas de identificación comercial se clasifican en una de cinco categorías
o una combinación de las mismas: (1) reacciones basadas en el pH, (2) reacciones
basadas en enzimas, (3) utilización de fuentes de carbono, (4) detección visual
del crecimiento bacteriano o (5) ) detección de ácidos grasos volátiles o no
volátiles mediante cromatografía de gases. La identificación de bacterias y
levaduras puede facilitarse mediante el uso de sistemas de kits automatizados o
empaquetados mediante los cuales los organismos se identifican con bases de
datos asistidas por computadora o derivadas de computadora.códigos
numéricos. Estos códigos numéricos se generan en base a los perfiles
metabólicos de cada organismo. Cada reacción metabólica, o fenotipo, se
traduce en una de dos respuestas: más (+) para reacciones positivas y menos (-)
para reacciones negativas. Estas secuencias más-menos se catalogan como
números binarios y se almacenan en una base de datos de computadora. Los
códigos binarios son convertidos por computadora en números de perfil de
código que representan el fenotipo de identificación de organismos específicos.
Una vez que los perfiles metabólicos se han traducido a números, se asigna un
porcentaje de probabilidad de identificación correcta en función de la
comparación del perfil desconocido con perfiles conocidos dentro de la base de
datos. A medida que se incluyen más organismos en la base de datos, las
designaciones y probabilidades de género y especie se vuelven más precisas.
Con los frecuentes cambios de nombre que ocurren, A veces es difícil mantener
la taxonomía actual en una base de datos. Todos los proveedores comerciales de
sistemas de pruebas bioquímicas multicomponentes proporcionan a los
usuarios uno o más de los siguientes: una computadora con una base de datos
de números de perfil, un libro de códigos derivado de una computadora, acceso
a un sitio web o acceso a un centro de consultas telefónicas para facilitar la
coincidencia de números de perfil con especies.
Índice de perfil analítico
El índice de perfil analítico (API; bioMérieux, Durham, NC) se publicó
en 1970. El sistema para la identificación de gramnegativos

ERRNVPHGLFRVRUJ
184 PARTE 1 Introducción a la microbiología clínica
Las bacterias fermentativas (de la familia Enterobacteriaceae) se
denominan API 20E. Este sistema tiene una serie de 20 cúpulas unidas a
una tira de plástico. Dentro de las cúpulas hay sustratos liofilizados a base
de pH. Se utiliza una suspensión bacteriana preparada en solución salina
para rehidratar los reactivos en las cúpulas. Los principios de las pruebas
son iguales o similares a los principios de las pruebas realizadas en tubos
de ensayo. Algunas de las cúpulas, como las de los aminoácidos
desaminasas y la deshidrolasa, requieren una capa de aceite mineral. La
tira se incuba de 18 a 24 horas a 35 ° C y se añaden reactivos a algunas de
las cúpulas. La última prueba utilizada para determinar el número de perfil
es la prueba de oxidasa, que no forma parte de la tira API. Los resultados
se registran y se determina un número de perfil de código de 7 dígitos.
Después de determinar el número de perfil de código, se consulta una base
de datos proporcionada por el fabricante, que proporciona la identificación más
probable. Si la identificación está en duda, la reducción de nitratos y la motilidad
son pruebas complementarias que se pueden utilizar para obtener un dígito
adicional para el número de perfil. El sistema API ha sido un producto estándar
en muchos laboratorios de microbiología clínica y se ha mantenido sin cambios.
Precisión para Enterobacteriaceae comúnmente aisladas, comoEscherichia coli,
Klebsiella pneumoniae,y Proteus mirabilis, se ha informado que es del 87,7% a
las 24 horas de incubación. Para Enterobacteriaceae aisladas con menor
frecuencia, la precisión es del 78,7% a las 24 horas. bioMérieux comercializa
muchos sistemas API de pruebas múltiples, incluidos sistemas para cocos
grampositivos, bacilos gramnegativos no fermentadores (20NE) y un sistema
rápido para la identificación de enterobacterias en 4 horas (RapID 20E).
Otros sistemas de pruebas múltiples incluyen Crystal E / NF (BD
Diagnostic Systems, Sparks, MD), RapID NF Plus (ThermoFisher
Scientific, Waltham, MA), Microbact Biochemical Identification
(Thermo-Fisher Scientific), Enterotube II (BD Diagnostic Systems) y
Micro -ID (ThermoFisher Scientific). Biolog (Hayward, CA) comercializa
el sistema de lectura manual Gen III MicroLog M.
Rápido y Automatizado
Sistemas de identificacion
Hasta finales de la década de 1970, los microbiólogos confiaban en el
crecimiento y aislamiento de bacterias en caldos de cultivo y medios de
agar. Una vez que las bacterias se cultivan in vitro, sus características
bioquímicas o metabólicas se pueden utilizar para la identificación. El
aislamiento del agente infeccioso de las muestras clínicas normalmente
requiere de 24 a 48 horas. Los protocolos de identificación a menudo
requieren otras 24 horas de incubación en presencia de sustratos
bioquímicos específicos. El diagnóstico rápido de enfermedades infecciosas
sigue siendo un desafío importante para el laboratorio de microbiología
clínica. El resultado clínico de una notificación rápida y precisa de los
resultados debe afectar directamente la atención del paciente de dos
maneras: (1) diagnóstico temprano y (2) selección posterior de la terapia
antimicrobiana adecuada. Cuando se logren estos resultados, el
laboratorio de microbiología clínica tendrá un
Los informes rápidos también se vuelven cada vez más importantes a la luz de los
desafíos de diagnóstico actuales. Los nuevos patógenos emergentes, el reconocimiento
de patógenos antiguos en diferentes entornos clínicos, los viajes por el mundo, el
aumento de infecciones adquiridas en hospitales y la prevalencia de organismos
resistentes a múltiples fármacos contribuyen a la necesidad de diseñar y desarrollar
nuevas capacidades de identificación. En las siguientes secciones se enumeran algunos
de los principales conceptos y aplicaciones de los métodos rápidos y la automatización
actualmente disponibles para la identificación de microorganismos clínicamente
significativos.
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Aunque no es exhaustivo, se han incluido los principios de la mayoría de las
tecnologías de identificación rápida que se encuentran en el laboratorio de
microbiología clínica. Otros métodos de identificación rápida se analizan en
Capítulos 10 y 11. Los métodos de identificación específicos se discuten con
mayor detalle en los capítulos en asociación con descripciones de organismos
específicos.
El término Rápido
El examen microscópico directo de los fluidos corporales proporciona resultados
en 15 a 30 minutos; estos resultados suelen ser valiosos en el tratamiento de los
pacientes. Por ejemplo, los resultados de la tinción de Gram de una muestra de
líquido cefalorraquídeo junto con la química de la sangre y el líquido
cefalorraquídeo (glucosa y proteínas) y la hematología (hemograma completo y
diferencial) pueden ser fundamentales para establecer la causa de la meningitis
infecciosa.Capítulo 7 analiza el examen microscópico de muestras clínicas.
Durante décadas, los microbiólogos confiaron en la capacidad de un organismo
para fermentar azúcares, degradar aminoácidos y producir productos finales únicos
con fines de identificación. El diagnóstico de una enfermedad infecciosa ha sido un
proceso complejo, laborioso y con frecuencia lento. A finales de los años cincuenta y
sesenta, las pruebas bioquímicas tradicionales se miniaturizaron. Se introdujeron tubos
de ensayo más pequeños y recipientes de plástico moldeado. Estos cambios hicieron
que las pruebas fueran más convenientes, pero no mejoraron los tiempos de respuesta
en los informes de resultados. En la década de 1970, los microbiólogos comenzaron a
confiar en bases de datos computarizadas para poder considerar numerosos
resultados simultáneamente y el resultado estadísticamente más probable podría
considerarse como la identificación del organismo desconocido. Este desarrollo mejoró
la confiabilidad de los resultados, pero aún no mejoró los tiempos de respuesta de los
informes. A mediados y finales de la década de 1970, aparecieron gradualmente
instrumentos semiautomatizados para la identificación y las pruebas de susceptibilidad.
En muchos entornos de laboratorio, estos instrumentos acortaron los tiempos de
respuesta, produjeron una mayor precisión, mejoraron la productividad y
proporcionaron resultados de prueba precisos.
La frase método rápido abarca una amplia variedad de procedimientos y
técnicas y se ha aplicado libremente a cualquier procedimiento que proporcione
resultados más rápidos que el método convencional. Existen métodos rápidos
para microscopía, identificación bioquímica, detección de antígenos y detección
de anticuerpos.Rápido es un término relativo que se utiliza para describir el
tiempo y depende de los procedimientos que se comparan. Por ejemplo, un
método de inmunoensayo enzimático de 3 horas para detectarClostridium
difficile La toxina es rápida en comparación con un ensayo de citotoxicidad de
cultivo celular de 48 horas. La detección del sensor de oxígeno basada en
extinción de fluorescencia deTuberculosis micobacterianaen 2 semanas con
BACTEC 9000 MB (BD Diagnostic Systems) es rápido en comparación con las 6
semanas necesarias para hacer crecer el organismo en agar inclinados.
Los procedimientos microscópicos que utilizan tinciones comunes y anticuerpos
fluorescentes para detectar organismos específicos son métodos rápidos; también lo
son algunos procedimientos convencionales utilizados para la diferenciación inicial o la
identificación presuntiva de ciertos grupos de organismos. Estos procedimientos se
han modificado para proporcionar resultados inmediatos que pueden conducir a una
presunta identificación. La identificación rápida de aislados clínicos mediante
reacciones bioquímicas a menudo implica kits de identificación empaquetados
comercialmente o instrumentos totalmente automatizados. Estos kits fabricados suelen
ser sistemas de prueba miniaturizados que emplean cromogénicos osustratos
fluorogénicos para evaluar las enzimas preformadas. Sustratos cromogénicos son
incoloros cuando es escindido por una enzima microbiana, un compuesto coloreado es
 CAPÍTULO 9 Identificación bioquímica de bacterias gramnegativas 185

producido. Los sustratos fluorogénicos no son fluorescentes hasta que son escindidos
por enzimas microbianas. Los puntos finales de la reacción se pueden alcanzar después
de 2 a 6 horas de incubación, aunque algunos pueden requerir una incubación durante
la noche. Las capacidades de estos kits y sistemas varían ampliamente. Ciertos sistemas
aún pueden requerir lectura manual por parte del científico de laboratorio, mientras
que otros pueden usar lectura mecanizada a través de espectrofotometría, codificación
numérica y bases de datos computarizadas. Algunos de estos instrumentos también
incuban, leen e interpretan los resultados de las pruebas enzimáticas.
Pruebas bioquímicas rápidas realizadas en
colonias aisladas
Cuadro 9.2 resume los principios, modos de acción y aplicaciones de ciertos
procedimientos manuales establecidos para la diferenciación presuntiva rápida
entre grupos de organismos o la identificación presuntiva de especies
bacterianas. A menudo, se debe realizar más de una prueba para una
identificación presuntiva. Estas pruebas también pueden proporcionar
instrucciones sobre las pruebas adicionales necesarias para la identificación
definitiva. Discusión adicional de estos y otros similares rápidos
Los métodos bioquímicos se incluyen en los capítulos siguientes, ya que se
aplican a la identificación de organismos específicos.
Sistemas de identificación que se basan
en la utilización de carbohidratos o
sustratos cromogénicos
Las pruebas rápidas para la detección de productos finales resultantes del
metabolismo de carbohidratos o las pruebas enzimáticas que utilizan sustratos
cromogénicos producen puntos finales de reacción en minutos u horas. Las
cúpulas de plástico, las cámaras de reacción o las tiras de papel de filtro
contienen reactivos o sustratos desecados o deshidratados. En general, se
agrega al sistema una suspensión de células bacterianas o un bucle lleno de una
colonia aislada o se frota en un área de reacción. Una reacción positiva se mide
por la actividad enzimática y el cambio de color.
Los kits de pruebas múltiples que utilizan el metabolismo de carbohidratos
convencional aprovechan un inóculo de prueba distribuido en múltiples sitios de
reacción para producir más de un resultado. Para obtener resultados más
rápidos, se han modificado los métodos convencionales disminuyendo el
volumen del medio del sustrato de prueba y aumentando la concentración de

MESA 9.2 Pruebas bioquímicas rápidas realizadas en colonias aisladas

Prueba Enzima bacteriana Modo de acción Aplicaciones

Indol de manchas Triptofanasa Organismo de agar sangre o cualquier La reacción positiva identifica Escherichia
El medio que contiene triptófano se coloca coli, Proteus vulgaris; ayuda en la
en un hisopo y se agrega el reactivo; La identificación de anaerobios
hidrólisis de triptófano a indol está
indicada por la producción de color azul a
azul verdoso al agregar DMAC Ester enlace
ONPG β-galactosidasa de restos de ortonitrofenilo Determina la fermentación de lactosa (amarillo
a varios carbohidratos; la hidrólisis da como color) en fermentadores lentos de lactosa;
resultado la liberación de amarillo diferenciaNeisseria lactamicade patógeno
orto-nitrofenol Neisseria spp. Diferenciación de no
Oxidasa CitocromoC oxidasa El compuesto azul se produce cuando fermentadores; ayuda en
tetrametilpag-fenilendiamina reacciona identificacion de Neisseria,
con el citocromo C Aeromonas, Vibrio, y
Campylobacter spp.
Catalasa Catalasa Desglose del peróxido de hidrógeno en Diferenciación de estafilococos de
oxígeno y agua, lo que resulta en una rápida estreptococos y de Listeria spp. de
producción de burbujas estreptococos
Solubilidad en bilis Autocataliza colonia en presencia de Presunta identificación de
el desoxicolato de sodio tensioactivo (sal steotococos neumonia en cultivos de
biliar) esputo, sangre y LCR Identificación
PYR PYR Hidrólisis del sustrato amida con de estreptococos del grupo A;
formación de β-naftilamida libre, que se diferencia Enterococcus de
combina con DMAC para formar un color estreptococos del grupo D
rojo brillante
Ureasa rápida Ureasa Hidrólisis rápida de urea por liberación de ureasa. Prueba de cribado para Cryptococcus,
amoníaco; la alcalinidad hace que el Proteo, y Klebsiella spp. yYersinia
indicador rojo de fenol cambie de amarillo a enterocoliticaEspeciación de
Hidrólisis rápida de hipurato Hippuricase rojo Hidrólisis enzimática del hipurato Streptococcus agalactiae,
visualizado mediante la adición de ninhidrina Campylobacter jejuni, y Listeria
(triketohidrindeno) spp.
TAZA β-glucuronidasa Hidrólisis del sustrato a fluorescente Presunta identificación de E. coli y
MUG compuesto, que emite fluorescencia azul bajo Streptococcus anginosus grupo;
luz ultravioleta de onda larga enterohemorrágicoE. coli es negativa
REGAZO REGAZO LAP hidroliza el sustrato a leucina y Presunta identificación de catalasa-
α-naftilamina, que reacciona con DMAC cocos grampositivos negativos
para formar un color rojo.

LCR, Fluido cerebroespinal; DMAC, p-dimetilaminocinamaldehído; REGAZO, leucina aminopeptidasa; TAZA, 4-metilumbeliferil-β-D-glucurónido; ONPG,
ortonitrofenil-β-D-galactósido; PYR, L-pirrolidonil-β-naftilamida; UV, ultravioleta.

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186 PARTE 1 Introducción a la microbiología clínica
HIGO. 9.12Cartucho RapID que contiene varios sustratos. (Cortesía
de Remel, Lenexa, KS.)
bacterias en el inóculo. Los métodos basados en sustratos enzimáticos
tienen ciertas ventajas sobre los métodos convencionales. Debido a que los
métodos enzimáticos involucran enzimas preformadas, no requieren la
multiplicación del organismo (independiente del crecimiento). Los puntos
finales se alcanzan en minutos a unas pocas horas. Las pruebas son muy
sensibles a la presencia de la enzima, aunque no siempre son específicas
para la identificación de género y especie; sin embargo, la sensibilidad
depende de la concentración y estabilidad del sustrato, la enzima y la edad
del inóculo. Varias modificaciones rápidas de los métodos convencionales
para la identificación de bacterias y levaduras se enumeran enCuadro 9.3.
ThermoFisher Scientific comercializa una serie de paneles RapID que
pueden proporcionar identificación en aproximadamente 4 horas (Figura
9.12).
Sistemas de identificación automatizados
Actualmente se encuentran disponibles varios sistemas de identificación
automatizados; la mayoría de estos sistemas utilizan tecnología de turbidez,
colorimetría o fluorescencia. Estos sistemas tienen una variedad de capacidades
según el flujo de trabajo del laboratorio. Los sistemas totalmente automatizados
incuban y leen las reacciones, y el software de computadora interpreta los
resultados y proporciona la identificación. Una ventaja de los sistemas
automatizados incluye una interfaz para los sistemas de información de
laboratorio, lo que reduce los tiempos de respuesta para informar de los
resultados. Otras ventajas incluyen la predicción estadística de la identificación
correcta, una mayor adquisición de datos y análisis epidemiológico, y la
estandarización automatizada de los perfiles de identificación que pueden
reducir los errores analíticos. Si estos sistemas se utilizan junto con pruebas de
susceptibilidad automatizadas, estos datos pueden estar vinculados a la
farmacia para aplicaciones de gestión de pacientes. Una aplicación clave de los
sistemas automatizados es la prueba directa de hemocultivos positivos. En
teoría, la notificación temprana de los resultados puede acortar la duración de la
estancia hospitalaria, aumentar el manejo terapéutico de los agentes
antimicrobianos apropiados y, por lo tanto, disminuir los costos hospitalarios.
Ya sea que utilicen sistemas manuales de prueba múltiple (como se discutió
anteriormente) o sistemas automatizados, los laboratorios usan una placa de
“pureza” incubada del inóculo para acompañar el procedimiento de
identificación. Debido a que muchas muestras son polimicrobianas, una placa de
pureza asegura que el inóculo sea puro y no se mezcle con otro microorganismo
que produciría resultados erróneos. Con la amenaza del terrorismo biológico, los
sistemas automatizados abordan la identificación rápida y precisa de
organismos de nivel A de amenazas biológicas. Muchos de estos organismos,
comoBacillus anthracis, Francisella tularensis, y Yersinia pestis,rara vez se ven en
los laboratorios de microbiología clínica. Los fabricantes de sistemas de
identificación han respondido incluyendo datos actualizados sobre organismos
de nivel A de amenaza biológica en sus bases de datos de identificación. Sin
embargo, la identificación de algunas bacterias patógenas raramente aisladas
puede ser inexacta.
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HIGO. 9.13WalkAway 96 más Sistema con plataforma de prueba y
sistema automatizado de gestión de datos. (Cortesía de Siemens
Healthcare Diagnostics, Tarrytown, NY.)
Sistemas MicroScan
El sistema MicroScan (Beckman Coulter, Brea, CA) consta de
bandejas plásticas de microtitulación de 96 pocillos de tamaño
estándar en las que se incluyen 32 sustratos reactivos para la
identificación de bacterias y levaduras. Hay dos sistemas
disponibles: autoSCAN y WalkAway. Algunas bandejas, llamadas
bandejas combinadas, incluyen microdiluciones en caldo de
varios agentes antimicrobianos para realizar pruebas de
susceptibilidad junto con pruebas bioquímicas para su
identificación. Los paneles MicroScan contienen sustratos
deshidratados que permiten el almacenamiento a temperatura
ambiente y una vida útil más prolongada. Los pocillos se inoculan
con una suspensión pesada del organismo a ensayar y se incuban
a 35ºC. La mayoría de los paneles se incuban durante un mínimo
de 16 horas a aproximadamente 20 horas. El sistema autoSCAN
lee paneles estándar en un lector de bandeja automatizado que
detecta el crecimiento bacteriano o cambios de color por
diferencias en la transmisión de luz. Al igual que con otros
sistemas automatizados, la identificación del organismo se logra
digitalmente comparando las lecturas y comparándolas con la
base de datos del software del sistema para la identificación final.
Figura 9.13).
Además de los paneles MicroScan convencionales, se encuentran disponibles
paneles de fluorescencia rápida para su uso en el instrumento WalkAway. Los
paneles rápidos utilizan compuestos marcados con fluorescencia para probar
enzimas preformadas; estos paneles requieren solo alrededor de 2,5 horas para
la identificación bacteriana, y la susceptibilidad antimicrobiana se determina en
alrededor de 7 horas. Las reacciones fluorométricas detectan cambios en el pH
como resultado de la fermentación de carbohidratos. La producción de ácido
resultante provoca una disminución del pH y una disminución de la
fluorescencia. Un estudio encontró que Microscan WalkAway identificó
correctamente el 94,6% (405/428) de los estafilococos coagulasa negativos a
nivel de especie. Además, la correlación entre la resistencia a la meticilina y la
detección del genmeca fue del 97,6%.
Sistema de diagnóstico TREK
El sistema de diagnóstico TREK (ThermoFisher Scientific) ofrece dos
sistemas automatizados: el lector automático Sensititre y el sistema de
identificación totalmente automatizado Sensititre ARIS2X. El Sensititre
 CAPÍTULO 9 Identificación bioquímica de bacterias gramnegativas 187

MESA 9.3 Sistemas manuales y automatizados disponibles comercialmente para la identificación microbiana

Nombre Fabricante Principio Organismos identificados

Manual
API bioMérieux1 Utilización de carbohidratos / Enterobacteriaceae, otros bacilos GN,
sustrato cromogénico Estafilococo spp., Estreptococospp.,
Enterococcus spp., Neisseriaspp.,
bacilos GP, levaduras, anaerobios
Cristal E / NF Sistemas de diagnóstico BD2 Utilización de carbohidratos / Enterobacteriaceae, otros bacilos GN,
sustrato cromogénico Neisseria spp., Haemophilus spp.,
cocos GP, bacilos GP
Enterotubo II Sistemas de diagnóstico BD Utilización de carbohidratos / Enterobacteriaceae, otros bacilos GN
sustrato cromogénico
MicroLog Biolog3 Utilización de carbohidratos Organismos GP, organismos GN, levaduras,
anaerobios
Gonochek TCS Biociencia4 Sustrato cromogénico Neisseria / Moraxella spp.
Micro-ID (RapID) ThermoFisher Scientific5 Utilización de carbohidratos / Enterobacteriaceae, otros bacilos GN,
sustrato cromogénico Neisseria spp., Haemophilus spp.,
estreptococos, enterococos,
levaduras, anaerobios, UTI, bacilos GP
MicroScan (TouchScan) Beckman Coulter6 Utilización de carbohidratos / Organismos GP, organismos GN, ITU,
sustrato cromogénico Haemophilus spp., Neisseria spp.
Oxi-Ferm II Sistemas de diagnóstico BD Utilización de carbohidratos Bacterias GN no fermentadoras

Automatizado
BD Phoenix Sistemas de diagnóstico BD Utilización de carbohidratos / Enterobacteriaceae, otros bacilos GN,
sustrato cromogénico / GP
sustrato fluorogénico
MicroScan (escaneo automático, WalkAway) Beckman Coulter Utilización de carbohidratos / Enterobacteriaceae, otros bacilos GN,
sustrato cromogénico / Neisseria spp., Haemophilus spp.,
sustrato fluorogénico estreptococos, enterococos,
estafilococos, bacilos GP, levaduras,
anaerobios
OmniLog Biolog Utilización de carbohidratos / Organismos GN, organismos GP,
reducción de violeta de tetrazolio anaerobios
Sensititre ThermoFisher Utilización de carbohidratos / Organismos GN, organismos GP,
(EMIGRAR) Científico sustrato cromogénico anaerobios
Sistema de identificación microbiana Sherlock MIDI7 Análisis de ácidos grasos de Organismos GN, organismos GP,
células microbianas Mycobacterium spp., levaduras
Vitek 2 bioMérieux Utilización de carbohidratos / Enterobacteriaceae, otros bacilos GN,
sustrato cromogénico Neisseria spp., Haemophilus spp.,
estreptococos, enterococos,
estafilococos, bacilos GP, levaduras,
anaerobios

API, Índice de perfil analítico; GN, gramnegativo GP, Gram positivas; MIDI Sistema de identificación microbiana; UTI, infección del tracto urinario.
1 Hazelwood, MO.
2 Sparks, MD.
3 Hayward, CA.
4Buckingham, Reino Unido.
5Waltham, MA.
6Brea, CA.

7 Newark, DE.

El sistema utiliza tecnología de fluorescencia para detectar el crecimiento durante la noche si es necesario. Los resultados se transmiten a una computadora para su

bacteriano y la actividad enzimática. El sistema comprende 32 pruebas análisis e identificación. También se encuentran disponibles placas para pruebas de

bioquímicas, incluidos medios bioquímicos clásicos seleccionados reformulados susceptibilidad antimicrobiana únicamente.

para producir una señal fluorescente. El medio de prueba bioquímico, junto con
un indicador fluorescente apropiado, se seca en los pocillos individuales de la
placa Sensititre. Cada reacción bioquímica se repite tres veces en las placas de 96
pocillos; cada placa está diseñada para probar tres organismos separados. Todas
las pruebas se leen en Sensititre Autoreader para detectar la presencia o
ausencia de fluorescencia. Los resultados están disponibles tan pronto como 5
horas, aunque la incubación se puede extender a
Sistema Vitek 2
El Vitek 2 (bioMérieux Inc.) se introdujo por primera vez en la década de 1980. Se
prepara una suspensión del organismo en solución salina y se incorpora a una
tarjeta. Luego, la tarjeta se coloca en el módulo lector-incubadora del
instrumento, donde se escanea ópticamente y se lee periódicamente. El software
de la computadora recopila las lecturas y las coincidencias

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188 PARTE 1 Introducción a la microbiología clínica

a la base de datos automatizada para su identificación final. El lector /

incubadora tiene capacidad para 15, 30, 60 o 120 tarjetas, según el
sistema. Se encuentran disponibles numerosas tarjetas para cocos
grampositivos, corineformas, bacilos gramnegativos fermentativos, bacilos
gramnegativos no fermentativos,Haemophilus, Neisseria, y levaduras.
En comparación con la secuenciación del ARN ribosómico (ARNr) 16S, el
Vitek 2 identificó correctamente 43 de 50 (86%) bacterias anaeróbicas a
nivel de especie y 47 (94%) a nivel de género. En un estudio más amplio de
1020 cepas bacterianas y 5 hongos, 92.59% (949/1025) identificaciones de
cepas emparejadas por Vitek 2 y Vitekdesorción / ionización láser
asistida por matriz - espectrometría de masas de tiempo de vuelo
(MALDI-TOF MS). Los resultados discordantes se identificaron mediante
secuenciación del ARNr 16S. Los autores no informaron errores a nivel de
género para MALDI-TOF MS, mientras que VITEK 2 cometió 6 (0,58%)
errores. Las bacterias en el estudio incluyeron aislados clínicos típicos
comoPseudomonas spp., Acinetobacter spp., Enterobacteriaceae y algunas
bacterias de crecimiento lento (Eikenella corrodens, Listeria
monocytogenes, Haemophilus influenzae, y otros).

Sistema de microbiología automatizado BD Phoenix

El sistema de microbiología automatizado BD Phoenix (BD Diagnostic
Systems) se lanzó en los Estados Unidos en 2004. Una vez que se
inoculan los paneles de combinación de 136 pocillos, es un sistema
totalmente independiente que puede contener 100 paneles, 99
muestras y 1 control. Los paneles se leen cada 20 minutos durante un
máximo de 16 horas. Los resultados generalmente están disponibles
en 2 a 12 horas para las bacterias y de 4 a 15 horas para las levaduras.
Se utilizan varios indicadores colorimétricos y fluorométricos para la
identificación, y se utiliza un indicador colorimétrico redox para las
pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos. En un estudio en el
que se identificaron 618 aislamientos mediante el sistema Phoenix y
MALDI-TOF MS, la tasa de concordancia (acuerdo) fue del 95,9% a
nivel de género para los bacilos gramnegativos no fermentativos y del
81,6% a nivel de especie.
Sistema de identificación Biolog OmniLog
El Biolog OmniLog ID System totalmente automatizado se basa en la
capacidad del organismo para utilizar 95 fuentes de carbono. Se utiliza una
placa de 96 pocillos para cada organismo. La reducción de violeta de
tetrazolio se utiliza como sistema indicador. La base de datos Biolog es una
de las más grandes, con más de 2500 especies o taxones. Hay paneles
disponibles para levaduras y bacterias grampositivas y gramnegativas
aeróbicas y anaeróbicas. La MicroStation Gen III es un sistema
semiautomatizado. Los sistemas Biolog se utilizan con más frecuencia en
microbiología ambiental que clínica. Sin embargo, en un estudio de 100
aislamientos veterinarios, se identificaron correctamente 56 aislamientos a
nivel de especie y 29 adicionales a nivel de género. Los 15 restantes fueron
reportados como "sin identificación".
Sistema de identificación microbiana Sherlock
El sistema de identificación microbiana de Sherlock (MIDI, Newark, DE)
adopta un enfoque totalmente diferente; La identificación se basa en la
composición de ácidos grasos de 9 a 20 carbonos de los microorganismos (
Figura 9.14). El sistema Sherlock examina qué ácidos grasos están
presentes y su concentración relativa (porcentaje). Los ácidos grasos se
encuentran en la membrana plasmática de las bacterias y, según las
condiciones ambientales, son modificados por las bacterias. Por esta
razón, es importante que las condiciones de crecimiento estén bien
estandarizadas para una identificación precisa. La incubación estándar
HIGO. 9.14El sistema de identificación microbiana Sherlock incorpora un
cromatógrafo de gases de Agilent (modelo n. ° 6850). (Cortesía de Agilent
Technologies, Inc, Palo Alto, CA.)
Las condiciones para la mayoría de las bacterias aerobias son el agar de
soja tríptico incubado a 28 ° C durante 24 horas. Después de la incubación,
se suspende un bucle lleno de bacterias en una base metanólica y se
calienta durante 30 minutos en un baño de agua hirviendo. Durante este
paso, las células se lisan y los ácidos grasos se separan de los lípidos y se
convierten en la sal de sodio. Después de enfriar, la muestra se mezcla con
una solución de metanol y ácido clorhídrico para metilar los ácidos grasos
a ésteres metílicos de ácidos grasos. Los ésteres metílicos de ácidos grasos
se extraen, lavan e inyectan en un cromatógrafo de gases de alta
resolución. Los ésteres de ácidos grasos se separan mediante la columna
en el cromatógrafo de gases y se crea un cromatograma. El tamaño de la
molécula y el grado de saturación determinan el tiempo de retención en la
columna. Los ácidos grasos se identifican por su tiempo de retención en
comparación con los estándares, y la altura del pico determina la
concentración. La identificación típica requiere de 1,5 a 2 horas. El sistema
Sherlock compara el perfil de ácidos grasos de lo desconocido con la base
de datos de aproximadamente 1500 organismos. MIDI también
comercializa un sistema de cromatografía líquida de alto rendimiento para
la identificación deMycobacterium spp. En un estudio sobre la
identificación de bacterias ambientales en el aire que incluyóBacilospp.,
Estafilococo spp., Micrococos spp., y Acinetobacter,MIDI clasificó
correctamente el 75% (77/103) de los aislamientos.
Evaluación de sistemas de identificación
La mayoría de los procedimientos rápidos y automatizados están diseñados para
proporcionar resultados con mayor velocidad y precisión que los métodos
tradicionales. Muchos sistemas automatizados y de pruebas múltiples son muy
precisos y pueden proporcionar resultados en 2 a 4 horas, en particular con las
Enterobacteriaceae. Estos sistemas suelen mostrar menor precisión con
estafilococos coagulasa negativos; bacilos gramnegativos no fermentativos; y
bacterias de crecimiento más lento y más exigentes, como los anaerobios.
Que se logre una mayor eficiencia y productividad con los sistemas de
pruebas múltiples depende en gran medida del laboratorio y el

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 CAPÍTULO 9 Identificación bioquímica de bacterias gramnegativas 189

institución o instituciones que apoya. Los sistemas manuales y

3. ¿Cuál de los siguientes carbohidratos puede fermentar un bacilo
automatizados deben evaluarse in situ antes de cambiar o ampliar los gramnegativo y oxidasa negativo que produce una inclinación ácida y
protocolos actuales. Los mejores estudios son comparaciones una colilla ácida en agar hierro triple azúcar?
prospectivas, en paralelo, del procedimiento interno o de referencia una. Solo glucosa
actual con el nuevo sistema en cuanto a precisión, rentabilidad y B. Glucosa y lactosa o sacarosa o ambos
efecto en el flujo de trabajo. La mayoría de los microbiólogos C. Solo lactosa
D. Lactosa y sacarosa, pero no glucosa.
consideran la secuenciación del ARNr 16S como método de referencia
4. ¿Por qué se usa una capa de aceite cuando se prueba la utilización de carbohidratos?
en los estudios comparativos. Los sistemas automatizados a menudo
una. Minimiza el riesgo de contaminación en el aire.
proporcionan una menor sensibilidad y especificidad para la B. Proporciona una fuente de nutrientes.
identificación de bacterias bioquímicamente inertes y algunos C. Crea un ambiente anaeróbico
organismos exigentes en comparación con otras bacterias. Por lo D. Mejora la actividad del indicador de pH.
tanto, los medios suplementarios y diferenciales y los bioquímicos 5. El caldo de triptófano se inocula y se incuba durante 24 horas. Después de

convencionales aún deben mantenerse a mano para respaldar la la incubación, se agrega el reactivo de Kovac. Se desarrolla un color rojo
en la superficie del caldo. ¿Qué producto del metabolismo se formó?
identificación de estos organismos. Ya sea un método manual de
una. Ácidos mixtos
pruebas múltiples o un sistema automatizado,
B. Malonato
C. Fenilpiruvato
D. Indol

Puntos para recordar 6. En la prueba de utilización de citrato, un resultado positivo se determina mediante:
una. Aumento del pH debido al metabolismo de las peptonas.

- La fenotipificación, la serotipificación y la genotipificación tienen usos B. Aumento del pH debido a la actividad de la ureasa.

importantes en la identificación de bacterias. C. Disminución del pH debido a la utilización de citrato.

- Los ensayos de biología molecular, como las pruebas de amplificación de ácido nucleico D. Disminución del pH por reducción de nitratos
y la EM MALDI-TOF, proporcionan una identificación precisa más rápidamente que las 7. Lisina desaminasa:
pruebas bioquímicas convencionales. una. Escinde el grupo carboxi de la lisina
- Las bacterias pueden utilizar los carbohidratos de forma oxidativa, fermentativa o no utilizarlos en B. Escinde el grupo amino de la lisina
absoluto. C. Agrega un grupo amino a la lisina
- Los agares de hierro con triple azúcar y hierro Kligler son útiles para determinar D. Agrega un grupo carboxi a la lisina
la capacidad de las bacterias para utilizar ciertos carbohidratos y producir H2S. 8. Se inocula una capa inclinada de agar hierro triple azúcar con un bacilo
gramnegativo oxidasa negativo. Después de la incubación, la inclinación es
- Las pruebas de rojo de metilo y Voges-Proskauer se utilizan para determinar los roja y el trasero (profundo) es negro. Explique las reacciones bioquímicas que
productos finales de la fermentación de glucosa. han ocurrido.
- La descarboxilasa, las dihidrolasas y las desaminasas son enzimas que utilizan las 9. ¿En qué se diferencian las bacterias que pueden fermentar la lactosa
bacterias para metabolizar los aminoácidos. rápidamente de las bacterias que fermentan la lactosa con retraso?
- Numerosas pruebas, como citrato, DNasa, indol, reducción de 10. Después de 24 horas de incubación de un caldo de nitrato con crecimiento visible,

nitrato, oxidasa y ureasa, son importantes en la identificación de N, NSe añaden -dimetil-α-naftilamina y ácido sulfanílico. No se nota
bacterias gramnegativas. ningún cambio de color. ¿Cuáles son dos posibles explicaciones sobre la
- Los sistemas manuales de pruebas múltiples han mejorado la identificación de reducción de nitrato? ¿Qué debe hacer a continuación para determinar
bacterias al simplificar la inoculación de muchas pruebas bioquímicas diferentes qué explicación es correcta?
y producir códigos numéricos que se pueden comparar con números en una
base de datos.
- Las pruebas rápidas a menudo utilizan sustratos cromogénicos o fluorogénicos para
analizar las enzimas bacterianas preformadas.
- Los sistemas de identificación microbiana automatizados ofrecen identificaciones BIBLIOGRAFÍA
precisas y rápidas con menos tiempo de manos de los científicos de laboratorio. Blairon, L. y col. (2010). Tarjeta Vitek 2 ANC versus BBL Crystal Anaerobe
y RapID ANA II para la identificación de bacterias anaerobias clínicas.
Anaerobio16, 355.
Carroll, KC, Patel, R. y col. (2015). Sistemas de identificación de bacterias
y hongos. En JH Jorgensen (Ed.),Manual de microbiología clínica(11a
Preguntas de evaluación del aprendizaje ed., Pág.29). Washington, DC: Prensa de ASM.
El-Bouri, K. y col. (2012). Comparación de la identificación bacteriana por
1. ¿Cuál de las siguientes pruebas detecta la producción de ácidos mixtos
Espectrometría de masas MALDI-TOF y métodos convencionales de microbiología
como resultado del metabolismo posterior del piruvato?
diagnóstica: concordancia, velocidad e implicaciones de costa. Revista Británica de
una. Prueba de rojo de metilo
Ciencias Biomédicas, 69, 47.
B. Prueba de Voges-Proskauer
Fykse, EM y col. (2015). Identificación de bacterias en el aire por 16S rDNA
C. Prueba de citrato
secuenciación, MALDI-TOF MS y el sistema de identificación microbiana
D. Prueba de indol
MIDI. Aerobiologia (Bolonia)31, 271.
2. El metabolismo de la glucosa a piruvato por miembros de la familia
Guo, L. y col. (2014). Estudio comparativo de MALDI-TOF MS y VITEK
Enterobacteriaceae se realiza a través de la vía Embden-Meyerhof
2 en identificación de bacterias. Revista de enfermedad torácica, 6, 534.
“Parnas” (EMP). El metabolismo posterior del piruvato muestra esta
Li, Y., et al. (2014). Tarjeta MALDI-TOF MS versus VITEK 2 ANC para
reacción: Glucosa→ Piruvato → Acetilmetilcarbinol (acetoína)
→ 2,3-butanodiol. Esta reacción es la base de: identificación de bacterias anaeróbicas. Revista de enfermedad torácica, 6, 517.
MacFaddin, JF (2000). Pruebas bioquímicas para la identificación de medicamentos
una. Reacción oxidasa
bacterias (3a ed.). Filadelfia: Lippincott Williams y Williams. O'Hara,
B. Prueba de rojo de metilo
CM (2005). Instrumentación manual y automatizada para
C. Prueba de indol
identificación de enterobacterias y otros bacilos gramnegativos
D. Prueba de Voges-Proskauer
aerobios. Reseñas de microbiología clínica, 18, 147.

ERRNVPHGLFRVRUJ
190 PARTE 1 Introducción a la microbiología clínica

Patteet, L. (2012). Validación del MicroScan-96 para la identificación de especies
tificación y pruebas de susceptibilidad a la meticilina de estafilococos
coagulasa negativos significativos desde el punto de vista clínico. Revista
europea de microbiología clínica y enfermedades infecciosas: publicación
oficial de la sociedad europea de microbiología clínica, 31, 747.
Wragg, P. y col. (2014). Comparación de Biolog GEN III MicroStation
sistema de identificación bacteriana semiautomatizado con desorción láser asistida
por matriz, ionización-tiempo de espectrometría de masas de vuelo y secuenciación
de genes de ARN ribosómico 16S para la identificación de bacterias de interés
veterinario. Revista de métodos microbiológicos, 105, 16.

ERRNVPHGLFRVRUJ
Traducido del inglés al español - www.onlinedoctranslator.com

CAPÍTULO

10 Inmunodiagnóstico de
Enfermedades infecciosas
Donald C. Lehman

BOSQUEJO DEL CAPÍTULO

- ANTICUERPOS EN PRUEBAS SEROLÓGICAS Ensayos de neutralización
Antígenos Inmunoensayos etiquetados
Títulos de anticuerpos agudos y convalecientes - USO DE PRUEBAS SEROLÓGICAS EN ENFERMEDADES ESPECÍFICAS
Anticuerpos monoclonales Pruebas serológicas de la sífilis
Estudios de población con resultados serológicos de resultados falsos Pruebas serológicas para infecciones estreptocócicas
negativos y falsos positivos de especificidad de anticuerpos y reactividad Diagnóstico serológico de enfermedades virales
cruzada Diagnóstico serológico de infecciones fúngicas
Prueba del estado inmunológico - ENSAYOS DE DETECCIÓN DIRECTA DE
Infecciones congénitas ANTÍGENOFaringitis estreptocócica Meningitis
- DETECCIÓN DE ANTÍGENO bacteriana
- PRINCIPIOS DE LOS ENSAYOS INMUNOLÓGICOS Infecciones por giardiasis y criptosporidiosis por el
Ensayos de precipitación virus de la inmunodeficiencia humana en pacientes
Ensayos de aglutinación inmunodeprimidos

OBJETIVOS
Después de leer y estudiar este capítulo, debería poder:
1. Definir antígeno. • Western blot
2. Compare la estructura y función de la inmunoglobulina G y la • Mancha de puntos

inmunoglobulina M. 9. Compare la aglutinación directa, la aglutinación pasiva y la aglutinación

3. Discuta la importancia de los títulos de anticuerpos agudos y convalecientes. pasiva inversa.
4. Interprete los resultados de títulos de anticuerpos significativos. 10. Describa las aplicaciones clínicas de la detección de anticuerpos para las siguientes

5. Compara anticuerpos policlonales y monoclonales. enfermedades:

6. Analice las causas de los resultados de las pruebas inmunológicas falsas negativas y • Sífilis
falsas positivas. • Streptococcus pyogenes infección
7. Reconozca la importancia de las pruebas serológicas en las siguientes • Rubéola
situaciones: • Mononucleosis infecciosa
• Estudios de población • Hepatitis
• Prueba del estado inmunológico • Infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)
• Infecciones congénitas • Infecciones por hongos
• Infecciones más allá del período neonatal. 11. Describir las aplicaciones clínicas actuales de los métodos de detección directa de

8. Describa los principios y aplicaciones de cada uno de los siguientes antígenos en cada una de las siguientes enfermedades infecciosas:

métodos inmunológicos: • Streptococcus pyogenes infección

• Ensayos de precipitación • Infecciones virales del tracto respiratorio
• Ensayos de aglutinación • Meningitis bacteriana y sepsis.
• Ensayos de neutralización • Giardiasis y criptosporidiosis
• Ensayos inmunofluorescentes • Infección por VIH
• Inmunoensayos enzimáticos • Infecciones en pacientes inmunodeprimidos
• Fijación del complemento (CF)

191
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192 PARTE 1 Introducción a la microbiología clínica

aglutinación, llamada anticuerpos, forma como resultado de la infección

Caso en punto
Un hombre de 33 años previamente sano acude a su médico con una
pérdida de peso involuntaria de 10 libras durante un período de 3 meses,
diarrea intermitente durante varios meses y fiebre de causa desconocida.
El hemograma completo reveló un recuento de glóbulos blancos (WBC)
ligeramente elevado. El diferencial de leucocitos fue 72% de neutrófilos,
15% de monocitos, 10% de linfocitos y 3% de eosinófilos. Con base en estos
hallazgos y la presentación clínica, el médico ordenó un análisis de sangre
para detectar anticuerpos dirigidos contra el virus de la inmunodeficiencia
humana (VIH). El resultado de la prueba de detección fue reactivo.
Temas a considerar
por microorganismos y virus.
Serología (literalmente el estudio del suero) es el estudio de anticuerpos y
su reacción con antígenos, moléculas que se unen específicamente a
anticuerpos o receptores de células T, en el diagnóstico de enfermedades
infecciosas. Estas pruebas originalmente se referían al uso de suero o plasma,
pero ahora se utilizan varias muestras corporales, incluido el líquido
cefalorraquídeo (LCR) y la orina. Los ensayos inmunológicos basados en los
principios de las reacciones anticuerpo-antígeno también se utilizan para
detectar y cuantificar analitos, como proteínas séricas, hormonas y fármacos, en
química clínica y ciencia forense. Los inmunoensayos se utilizan en el desarrollo
de pruebas en el lugar de atención.
Quizás la mayor ventaja de las pruebas serológicas es que es un medio
excelente para detectar agentes infecciosos que son difíciles o imposibles

Después de leer la historia clínica del paciente, considere:
- La importancia de la historia clínica del paciente y los resultados de
laboratorio.
- La importancia del análisis de sangre para el VIH
- ¿Qué prueba adicional se debe realizar a continuación?
- El papel de los cultivos y la detección directa de antígenos en el
diagnóstico de enfermedades infecciosas.
de cultivar. Ciertos agentes infecciosos, como los virus o algunas bacterias
de transmisión sexual, son difíciles de cultivar, generalmente debido a sus
requisitos de crecimiento específicos o a la terapia antimicrobiana previa
que disminuye el número de organismos viables. Muchos hongos y
micobacterias también tardan mucho en crecer. Además, muchos
organismos no se cultivan debido a un riesgo significativo para los
trabajadores de laboratorio. Las pruebas serológicas se pueden usar no
solo en estas condiciones, sino también para obtener información de
pronóstico y en el seguimiento de la terapia, como en el caso de la
hepatitis crónica.

Términos clave Por muy poderosas que sean las pruebas inmunológicas, el uso de
procedimientos serológicos en el diagnóstico tiene desventajas. El problema más
Fase aguda Inmunodifusión
importante es que para medir la respuesta inmune del huésped a un organismo,
Respuesta inmune anamnésica Título Inmunógeno
deben pasar de 10 a 14 días después del inicio de una infección. En algunos
de anticuerpos Aglutinación indirecta
casos (p. Ej., VIH, virus de la hepatitis B [VHB] y virus de la hepatitis C [VHC]),
Antígenos Anticuerpo fluorescente indirecto
deben pasar semanas o meses antes de que los niveles de anticuerpos sean
Avidez (IFA)
detectables. Los pacientes inmunodeprimidos pueden tener una respuesta de
Quimioluminiscente Inmunoensayo indirecto en sándwich
anticuerpos disminuida o inexistente, lo que afecta la capacidad de utilizar
inmunoensayo (CLIA) Anticuerpo monoclonal
cualquier procedimiento serológico. Además, el anticuerpo que se detecta puede
Coaglutinación Anticuerpo policlonal
Conjugado de fijación del Postzone haber sido producido contra otro organismo, y unfalso positivose observa la

complemento (CF) Precipitación prueba.

Fase de convalecencia Prozona Las reacciones y reacciones cruzadas de antisueros preparados contra
Efecto citopático Inmunodifusión radial proteínas animales y vegetales han demostrado que las respuestas
Anticuerpo fluorescente directo Radioinmunoensayo (RIA) inmunes se pueden aplicar al estudio de las relaciones taxonómicas. Sin
(DFA) Anticuerpos reagina embargo, se cree que la secuenciación de ácidos nucleicos es el ensayo
Epítopos Factor reumatoide (RF) de más importante para los estudios taxonómicos. El descubrimiento de que
Falso negativo aglutinación pasiva inversa la hemólisis inmune podría estar mediada por anticuerpos antieritrocitos
Falso positivo Seroconversión en presencia de complemento y podría titularse añadió un nuevo enfoque
Fluorocromo Serología al diagnóstico de enfermedades infecciosas. La sangre de los pacientes
Anticuerpos heterófilos Especificidad podría examinarse para detectar la presencia de anticuerpos que no
Hibridoma potencial zeta aglutinan ni precipitan sus respectivos antígenos, sino que activan o fijan el
Complejo inmunológico Zona de equivalencia complemento. Este método serológico, conocido comofijación del
complemento(CF), es un método muy sensible para detectar anticuerpos
contra sus correspondientes antígenos.
Las primeras pruebas de laboratorio prácticas para detectar agentes

T
El fenómeno de la aglutinación bacteriana en sueros humanos fue
descubierto en 1896 y rápidamente fue reconocido como una
herramienta poderosa por los bacteriólogos. No solo se podrían
usar sueros para identificar y diferenciar bacterias (serotipificación), sino
que también se podría analizar la capacidad de los sueros de pacientes
infectados para aglutinar un microorganismo conocido. La reacción de los
sueros de los pacientes con las bacterias fue indicativa de una exposición
previa al organismo y del nivel de respuesta inmune y protección frente al
agente infeccioso. Las proteínas en el suero humano que causan bacterias
infecciosos recién descubiertos todavía se basan generalmente en la serología.
Los tipos de pruebas disponibles continúan aumentando drásticamente, lo que
permite el diagnóstico de muchas infecciones nuevas. Por ejemplo, el síndrome
de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), la hepatitis y la enfermedad de Lyme se
diagnostican con mayor frecuencia en el laboratorio con pruebas serológicas.
Todas estas tres enfermedades son causadas por agentes infecciosos que son
difíciles de cultivar en los laboratorios clínicos de rutina. Aunque las pruebas
serológicas disponibles actualmente para estos y otros agentes no son perfectas,
se han producido mejoras como resultado de los avances en la preparación de
anticuerpos y antígenos de alta pureza. Una amplia variedad de

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 CAPÍTULO 10 Inmunodiagnóstico de enfermedades infecciosas 193

Hay disponibles kits comerciales de alta calidad. Las pruebas inmunológicas también se
utilizan para detectar antígenos que son detectables antes que los anticuerpos; sin
embargo, no están disponibles para tantos organismos como las pruebas clásicas de
detección de anticuerpos. Este capítulo analiza los aspectos del uso de ensayos
inmunológicos para diagnosticar enfermedades infecciosas mediante la detección de
anticuerpos o antígenos en muestras de pacientes.
de antígeno de un agente infeccioso se mezcla con cada dilución de
anticuerpo, y las reacciones anticuerpo-antígeno se detectan de alguna
manera. Un resultado positivo se informa comotítulo de anticuerpos, que
es el recíproco de la mayor dilución de suero que muestra reactividad. Sin
embargo, este tipo de método de dilución en serie no es muy preciso y la
diferencia de una sola dilución de tubo no se considera significativa para
determinar la presencia de una infección reciente. Las pruebas de

Anticuerpos en pruebas serológicas anticuerpos para una amplia variedad de agentes infecciosos están
disponibles comercialmente (Cuadro 10.1). Antígeno-anticuerpo (complejo
Antígenos inmunológico) Los métodos de detección, junto con las aplicaciones de
Los antígenos son sustancias de peso molecular relativamente alto, diagnóstico específicas, se analizan más adelante en este capítulo.
generalmente proteínas o polisacáridos (con menos frecuencia, lípidos o ácidos La primera exposición de un individuo a un agente infeccioso resulta
nucleicos solos o complejados con proteínas o polisacáridos), que pueden principalmente en la producción de inmunoglobulina M (IgM). Una exposición
combinarse específicamente con moléculas de anticuerpos. Se dice que los posterior al mismo antígeno provoca una reacción secundaria orespuesta
antígenos que son reconocidos como sustancias extrañas por un huésped son inmune anamnésica, que se caracteriza por un rápido aumento en el
inmunogénico capaz de provocar una respuesta inmune. A menudo, los anticuerpo inmunoglobulina G (IgG) asociado con niveles más altos, una
términosantígeno y inmunógeno se usan indistintamente, el primer término se elevación prolongada y una disminución más gradual (Figura 10.1). La síntesis de
refiere a las propiedades de la molécula de unión al anticuerpo, mientras que el anticuerpos IgM juega un papel menor en una respuesta inmune secundaria.
último se refiere a la propiedad de la molécula para inducir el anticuerpo. Las pruebas serológicas diseñadas para detectar anticuerpos IgG e IgM por
separado aprovechan las diferencias en la producción de IgM entre una
La respuesta inmune típica a un antígeno complejo grande, como una respuesta inmune primaria y una secundaria. Un resultado positivo de la prueba
bacteria o un virus, da como resultado la estimulación de muchos linfocitos de anticuerpos IgM se considera sugestivo de una infección primaria, actual o
diferentes con diferentes especificidad a los determinantes antigénicos muy reciente, mientras que la presencia de anticuerpos IgG por sí sola sugiere
disponibles (epítopos). Capitulo 2 proporciona una explicación detallada de la una infección o exposición previa. La interpretación de títulos altos de
formación de anticuerpos. La mayoría de los antígenos naturales son anticuerpos IgM debe realizarse con cautela. En algunas enfermedades
extremadamente grandes. Por tanto, la respuesta generada a estas moléculas es infecciosas, los niveles altos de IgM pueden persistir más allá del estado agudo.
policlonal, lo que da como resultado una mezcla de anticuerpos que reconocen Alternativamente, un título de IgM negativo no excluye
diferentes epítopos con diferentes afinidades de unión.Anticuerpo policlonal es
una mezcla de múltiples moléculas de anticuerpos derivadas de múltiples células
contra múltiples epítopos que se encuentran en un antígeno o que se dirigen
contra diferentes antígenos en conjunto. Por ejemplo, cuando un animal o una
persona se exponen a cualquier bacteria, se producen diferentes moléculas de MESA 10.1 Ejemplos de disponibles comercialmente
anticuerpos para cada uno de los numerosos epítopos que se encuentran en la Pruebas serológicas para el diagnóstico de
bacteria.
enfermedades infecciosas
Los microorganismos contienen una amplia gama de moléculas capaces de
provocar una respuesta inmune en el huésped. Las sustancias inmunogénicas Organismos Métodos de prueba serológica disponibles
pueden ser componentes estructurales o no estructurales del microorganismo.
Por ejemplo, muchas bacterias tienen cápsulas de polisacáridos que recubren el Blastomyces dermatitidis CF, ID, EIA
Bordetella pertussis EIA
organismo. Debido a que estas cápsulas se encuentran en la superficie celular, a
Borrelia burgdorferi IFA, EIA, WB
menudo son los primeros determinantes antigénicos reconocidos por el
Citomegalovirus EIA, LA, IFA
huésped. Los componentes antigénicos estructurales adicionales son la pared Virus de Epstein Barr HA, ICT, LA
celular bacteriana, las proteínas de la membrana y las proteínas pili. Los Helicobacter pylori EIA
antígenos no estructurales incluyen enzimas bacterianas y toxinas que se Virus de la hepatitis A, B EIA, TIC
pueden encontrar dentro de la célula o se liberan en los tejidos del huésped. Virus de la hepatitis C EIA
Debido a que muchos componentes bacterianos están "ocultos" en lo profundo Virus herpes simplex EIA, ICT, LA, IFA
Tipos de VIH 1, 2 EIA, IFA, ICT, WB
de la célula, es posible que las respuestas de anticuerpos a algunos de ellos no
Histoplasma capsulatum CF, ICT, ID, EIA
se desarrollen hasta que la célula haya sido parcialmente degradada por la
Virus de la influenza A, B EIA, ICT
inmunidad natural del huésped (p. Ej., Células fagocíticas, complemento). Una Legionella pneumophila TIC, IFA, EIA
sola especie bacteriana infectante normalmente estimula la producción de Mycoplasma pneumoniae EIA, TIC, IFA
numerosos anticuerpos con diferentes especificidades. RSV EIA, TIC
Virus de la rubéola EIA, TIC, IFA, HAI
Agudo y convaleciente Streptococcus pyogenes IHA, NT
Títulos de anticuerpos Toxoplasma gondii EIA, IFA, LA
Treponema pallidum IFA, EIA, floculación
En los ensayos serológicos, el suero de un paciente se analiza para detectar
anticuerpos reactivos a antígenos específicos extraídos de un agente infeccioso. CF, Fijación del complemento; EIA, inmunoensayo enzimático; DECIR AH,
Si los anticuerpos están presentes, esto indica una infección. Es posible hemaglutinación; HAI, inhibición de la hemaglutinación; VIH, virus de
inmunodeficiencia humana; TIC, prueba inmunocromatográfica; IDENTIFICACIÓN,
semicuantificar la cantidad de anticuerpo haciendo diluciones seriadas dobles
inmunodifusión; IFA, anticuerpo fluorescente indirecto; IHA, hemaglutinación
(duplicadas) del suero, produciendo concentraciones progresivamente más bajas indirecta; LA, aglutinación de látex; NUEVO TESTAMENTO, neutralización; RSV,virus
de anticuerpo (1: 2, 1: 4, etc.). Una cantidad estándar sincitial respiratorio; WB, Western blot.

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194 PARTE 1 Introducción a la microbiología clínica
Primario Secundario
IgG
Respuesta de anticuerpos
IgM
Tiempo
Primero Segundo
exposición exposición
al antígeno al antígeno
HIGO. 10.1Respuestas de anticuerpos primarias y secundarias.
una infección porque a veces pueden pasar varias semanas después del
inicio de una infección antes de que la IgM sea detectable.
De manera similar, la presencia de niveles significativos de anticuerpos
IgM (con o sin IgG) en un recién nacido sugiere una infección en el útero. El
feto puede sintetizar IgM y no puede atravesar la placenta de la madre al
feto, mientras que la presencia de anticuerpos IgG solo en el recién nacido
es indicativa de una transferencia materna pasiva de IgG a través de la
placenta, no de una infección en el útero.
Hay varios métodos disponibles para la eliminación o inactivación de
IgG sérica, lo que permite la detección preferencial de IgM. Uno de los
métodos más populares para la eliminación física de IgG utiliza columnas
de cromatografía de intercambio iónico en miniatura disponibles en el
mercado para atrapar la IgM, al tiempo que permite que la IgG se lave con
una solución tampón. El anticuerpo IgM se recoge por elución de la
columna con un tampón de pH más bajo. Otro método para eliminar la IgG
del suero completo utiliza la adsorción a la proteína A que se encuentra en
la pared celular de los estafilococos. La proteína A se une a la mayoría de
las subclases de IgG humana, lo que facilita su eliminación. Además, la IgG
antihumana inactiva o elimina (requiere precipitación y centrifugación) la
IgG para los ensayos específicos de IgM. Este método tiene la ventaja
adicional de eliminarfactor reumatoide (RF) que se uniría a los complejos
IgG-anti-IgG.
A veces es una práctica analizar una sola muestra de suero en busca de
anticuerpos IgG para intentar diagnosticar una infección reciente o pasada. En
muchos casos, la presencia de anticuerpos IgG es difícil o imposible de
interpretar; puede representar una infección pasada, ya sea clínicamente
aparente o subclínica (sin síntomas evidentes). Un título relativamente alto de
IgG no indica una infección reciente. Los niveles de anticuerpos varían según la
genética del huésped, la edad, las comorbilidades y la inmunogenicidad del
agente infeccioso. Un título alto de anticuerpos simplemente significa que el
huésped responde mucho a ese antígeno específico y tiene antecedentes de
infección. Sin embargo, en algunos otros casos, como infecciones que son raras
(p. Ej., Rabia) o que han estado presentes durante un tiempo relativamente largo
cuando aparecen los primeros síntomas (p. Ej., SIDA), la presencia de anticuerpos
IgG en una sola muestra de suero podría ser diagnóstica. Las pruebas de IgG e
IgM deben realizarse al mismo tiempo.
A menos que una prueba serológica esté diseñada para medir anticuerpos
específicos de IgM e IgG específicos en una sola muestra de suero, el
diagnóstico serológico de una enfermedad infecciosa requiere la medición de la
concentración total de anticuerpos en ambos Fase aguda y fase de
convalecencia muestras de suero. El anticuerpo IgG específico no suele ser
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detectado en el suero recolectado durante la fase aguda de la enfermedad
(dentro de 1 semana de la manifestación de los síntomas). Un aumento
significativo de IgG detectado durante la fase de convalecencia (recuperación),
generalmente 2 semanas después, es diagnóstico de infección y es el resultado
del cambio de clase de IgM a IgG.
Debido a que algunos anticuerpos IgG ya pueden estar presentes en la muestra de
suero de fase aguda de un paciente, generalmente es necesario cuantificar la
concentración de anticuerpo tanto en las muestras de fase aguda como en las de fase
convaleciente. En las pruebas de títulos de anticuerpos en casos agudos y
convalecientes, los sueros generalmente se analizan como diluciones dobles en una
serie de tubos. Un aumento de cuatro veces (dos diluciones al doble) en el título de
anticuerpos entre sueros de fase aguda (título de anticuerpos agudos) y de fase
convaleciente (título de anticuerpos convalecientes) se considera diagnóstico de una
infección actual. Es importante que ambos sueros se analicen al mismo tiempo porque
la mayoría de las pruebas serológicas tienen una variabilidad inherente que puede
alterar el título por lo menos al doble. Analizar los sueros al mismo tiempo reduce esta
variabilidad.
Las desventajas de las pruebas de suero para pacientes agudos y convalecientes
incluyen múltiples visitas para que el paciente se extraiga sangre y el tiempo necesario
para detectar un aumento en el título de anticuerpos. Además, es posible que se
obtengan falsos negativos si los sueros se recolectan demasiado pronto en el curso de
la enfermedad. En este caso, una muestra de fase aguda sería negativa y la muestra de
fase de convalecencia sería positiva. Este escenario se conoce comoseroconversión.
Aunque la seroconversión generalmente ocurre dentro de las 2 a 3 semanas
posteriores al inicio de la enfermedad, puede demorarse en ciertos pacientes o tipos de
infección.
Algunas pruebas de diagnóstico comerciales están diseñadas
sin la necesidad de realizar diluciones seriadas y establecimiento
de títulos. En su lugar, se analiza suero sin diluir o una sola
dilución de suero. En estas situaciones, la determinación de un
único resultado positivo sugiere, pero no siempre prueba, una
infección actual. Generalmente, si se va a intentar el diagnóstico
serológico de la infección actual en una sola muestra de suero, se
debe realizar un ensayo de IgM así como un ensayo de IgG
específico. Si ambos análisis son negativos, es probable que el
paciente no esté infectado. Si ambos resultados del ensayo son
positivos o solo se detecta un anticuerpo IgM, es probable que el
paciente haya sido infectado recientemente. Si solo hay
anticuerpos IgG, es probable que el paciente haya sido infectado
en el pasado y no tenga una infección actual.
Anticuerpos monoclonicos
Cuando un animal se expone a un solo antígeno, se pueden producir
anticuerpos contra diferentes epítopos del antígeno. Estos anticuerpos se llaman
anticuerpos policlonales porque cada anticuerpo se derivó de un clon diferente
de células plasmáticas. En las pruebas serológicas, los anticuerpos se pueden
utilizar para detectar antígenos en muestras de pacientes. Los problemas con los
anticuerpos policlonales son de baja especificidad, porque la solución de
anticuerpos contiene múltiples anticuerpos con diferentes especificidades, lo
que puede resultar en un alto nivel de reactividad cruzada.
Los problemas con el anticuerpo policlonal se pueden minimizar con el uso
de anticuerpo monoclonal. Este anticuerpo se deriva inicialmente de una célula
que ha sido expuesta a un epítopo. Esta célula se divide, produciendo un clon de
células idénticas y produce un anticuerpo específico para este epítopo. Los
anticuerpos monoclonales rara vez se producen de forma natural y, por lo
general, se asocian con algún tipo de proceso de enfermedad inmunitaria
anormal. La producción de anticuerpos monoclonales en el laboratorio se ha
convertido en algo común. Se usa ampliamente en pruebas serológicas, donde la
identificación
 CAPÍTULO 10 Inmunodiagnóstico de enfermedades infecciosas 195

o la cuantificación de un antígeno es el objetivo principal. Estos anticuerpos tienen una

fuerte cinética de unión a epítopos específicos de antígenos (avidez) y puede
discriminar entre determinantes antigénicos estrechamente relacionados
(especificidad). Sin embargo, los anticuerpos monoclonales pueden ser demasiado
específicos, lo que da como resultado una baja sensibilidad. Si una población
bacteriana contiene una forma alterada o mutada de un antígeno, es posible que no
reaccione al anticuerpo monoclonal, lo quefalso negativo resultado de la prueba.
Los anticuerpos monoclonales se purifican a partir de un solo clon de células.
En 1975 George Köhler desarrolló la técnica para producir anticuerpos
monoclonales en el laboratorio. Esta técnica permite a un científico inyectar una
mezcla de antígenos crudos en un ratón y seleccionar un clon que produzca un
anticuerpo específico contra un antígeno. Este proceso de producción de un
anticuerpo monoclonal puede llevar de 3 a 6 meses. Un solo linfocito productor
de anticuerpos se fusiona con una célula de mieloma para formar un híbrido.
Este híbrido prolifera para formar una línea celular llamadahibridoma (Figura
10.2).
Especificidad de anticuerpos y
reactividad cruzada
La mayoría de las reacciones antígeno-anticuerpo muestran una alta especificidad; es
decir, los sitios de unión al antígeno en la molécula de anticuerpo reaccionan con
epítopos específicos y no con otros antígenos que contienen diferentes epítopos. Sin
embargo, algunos antígenos de diferentes microorganismos son similares, y un
huésped puede responder produciendo anticuerpos, no solo contra el organismo
invasor sino también contra organismos antigénicamente similares. Se dice que estos
anticuerposreacción cruzada, lo que puede dar lugar a una mala interpretación de las
pruebas serológicas. Los anticuerpos producidos en respuesta a una molécula que
también reaccionan contra un antígeno de una fuente no relacionada se denominan
anticuerpos heterófilos. Debido a la reactividad cruzada de los anticuerpos, a menudo
es mejor realizar una serie de pruebas serológicas utilizando los organismos que se
sabe que muestran reactividad cruzada y hacerlo con sueros pareados. Un ejemplo de
esto

1. INOCULACIÓN

Parcial
2 a 4 semanas Coágulo purificación

Antígeno
Entero Suero Inmunoglobulina
sangre fracción que contiene
anticuerpos policlonales
2. PRODUCCIÓN al antígeno

Fusión celular
Policlonal

Mieloma Productor de anticuerpos Hibridoma

células (inmortales células plasmáticas de células

en cultura) bazo de conejo (limitado (inmortalizado)

vida en la cultura)

Clonar para
celdas individuales

Monoclonal

Monoclonal
anticuerpos
secretado en
Prueba de anticuerpos monoclonales de
fluido de cultivo
interés y expansión de la línea celular

HIGO. 10,2Preparación de anticuerpos policlonales y monoclonales.

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196 PARTE 1 Introducción a la microbiología clínica

El tipo de prueba sería una batería de hongos que consta de pruebas
para histoplasmosis, blastomicosis y coccidioidomicosis.
Resultados serológicos falsos negativos
y falsos positivos
Una prueba serológica ideal debe tener una precisión diagnóstica del
100%; es decir, debe ser positivo en todas las muestras de pacientes con la
infección y negativo en todas las muestras de pacientes sin la infección por
el agente específico (Figura 10.3A). En la práctica, las pruebas serológicas,
similares a otras pruebas de laboratorio, no alcanzan este ideal. La
precisión de las pruebas de diagnóstico se mide en términos de
sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo y valor predictivo
negativo. VerCapítulo 5 para una discusión de estos términos.
A prueba serológica falsa negativa se define como un resultado negativo para un
paciente que realmente está infectado. Puede ocurrir por muchas razones. Un paciente
puede estar inmunodeprimido e incapaz de responder a un estímulo inmunogénico.
Este podría ser el caso de un individuo con una enfermedad de inmunodeficiencia
congénita o adquirida o de un paciente que recibe terapia inmunosupresora después
de un trasplante de órganos o quimioterapia contra el cáncer. Además, es posible que
los recién nacidos no siempre respondan a un agente infeccioso debido a un sistema
inmunológico inmaduro. Para algunas infecciones, como la enfermedad de Lyme y la
enfermedad del legionario, es posible que los títulos de anticuerpos no aumenten
hasta meses después de la infección aguda, lo que lleva a resultados de pruebas
serológicas falsas negativas en muestras de suero recolectadas demasiado temprano
en el curso de la infección.
Anti-IgM etiquetado
No todos los individuos reaccionan de la misma manera a los estímulos
inmunogénicos, debido a las diferencias genéticas inherentes en el sistema
inmunológico entre los individuos.
Puede producirse un tipo diferente de resultado falso negativo en ensayos
diseñados específicamente para detectar anticuerpos IgM. Podría ser el
resultado de la competencia por los sitios de unión al antígeno entre los
anticuerpos IgG e IgM en una muestra de suero de un paciente con niveles altos
de IgG y niveles relativamente bajos de IgM (Figura 10.3B). Las pruebas de
anticuerpos IgM a veces se realizan en el suero de un recién nacido para
diagnosticar una infección en el útero. La muestra de suero de un recién nacido
puede contener IgG materna contra un agente infeccioso específico, así como
niveles bajos de IgM fetal. Las moléculas de anticuerpo IgG se unen al antígeno
en el ensayo y bloquean la unión de IgM, produciendo un resultado de IgM falso
negativo. La mayoría de los ensayos diseñados para detectar anticuerpos IgM
incluyen algún procedimiento inicial para separar físicamente IgG de IgM o para
"capturar" IgM en el ensayo y luego eliminar IgG.
Un resultado de prueba serológica falso positivo es un resultado
positivo para un paciente que no está infectado por el agente específico
para el que está diseñada la prueba. Puede ocurrir por la producción de
anticuerpos de reacción cruzada, como se discutió anteriormente, o por la
reactivación de un organismo latente como resultado de una infección por
un organismo diferente. La infección por el virus de la influenza A puede
provocar la reactivación del citomegalovirus latente (CMV) con un aumento
concomitante de anticuerpos contra el CMV. También pueden producirse
ensayos de anticuerpos IgM falsos positivos. Estos se deben a la presencia
de actividad de RF en el suero. El RF es generalmente un anticuerpo IgM,
producido en algunos individuos, que se une a la región Fc de la propia IgG
del individuo. La RF de IgM no se puede diferenciar fácilmente de la IgM
específica de organismo en algunas pruebas serológicas.Figura 10.3C).

F Finalmente, los individuos que reciben inmunoglobulina intravenosa, un

A producto preparado mediante la combinación de grandes cantidades de
F
plasma de múltiples donantes voluntarios, pueden mostrar anticuerpos
Del paciente específicos contra varios agentes infecciosos debido a la transferencia
antígeno- Antígeno del paciente
IgM específico pasiva, no a la infección activa. El personal de laboratorio debe conocer
IgG específica A
esta posibilidad y cualquier terapia que pueda ser importante para
interpretar los resultados de las pruebas serológicas para una muestra de
Verdadero positivo
paciente específica.
Del paciente
específico de antígeno
IgM (limitante)
Estudios de población
Del paciente
F F B Se pueden realizar pruebas serológicas para un agente infeccioso específico o
antígeno-
IgG específica
F una batería de agentes para determinar el porcentaje de personas previamente
(exceso) A expuestas o infectadas con los agentes en un área geográfica. Esta información
Anti-IgM etiquetado
proporciona a los epidemiólogos y a los funcionarios de salud pública
Falso negativo información sobre qué tan extendido está un agente infeccioso en un área
determinada. Tales estudios han demostrado que el hongoHistoplasma
F
Anti-IgM etiquetado capsulatum, que causa histoplasmosis, se distribuye ampliamente en el valle del
F río Ohio y que la bacteria Borrelia burgdorferi, que causa la enfermedad de
Lyme, es común en los estados del Medio Oeste Superior, Nueva Inglaterra y el
Del paciente
antígeno-
C Atlántico Medio. De manera similar, los estudios serológicos realizados en
IgG específica animales que son reservorios de enfermedades humanas pueden alertar a los
A
Factor reumatoide funcionarios de salud pública de que una enfermedad (por ejemplo, el virus del
(IgM anti-IgG)
Nilo Occidental) puede estar activa en el área y puede representar una amenaza
Falso positivo
para los humanos.
HIGO. 10,3Causas de los ensayos de inmunoglobulina M (IgM) falsos
positivos y falsos negativos. A, Ensayo de IgM positivo verdadero. B, Prueba del estado inmunológico
Ensayo de IgM falso negativo. El exceso de inmunoglobulina G (IgG)
específica de antígeno inhibe la unión de IgM específica de antígeno.C, En varias situaciones, puede ser importante determinar si un individuo es
Ensayo de IgM falso positivo. El factor reumatoide (RF) se une a la IgG inmune (ya sea a través de una infección previa o inmunización) a una
específica de antígeno y se detecta con un anticuerpo anti-IgM marcado. enfermedad infecciosa específica. Por ejemplo, salud

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 CAPÍTULO 10 Inmunodiagnóstico de enfermedades infecciosas
Los centros de atención pueden requerir que los empleados potenciales muestren
evidencia de inmunidad al virus varicela-zóster, que causa la varicela. Este requisito
existe porque si los empleados están infectados, pueden transmitir el virus durante el
período de incubación (antes de que se desarrollen los síntomas) a los pacientes
susceptibles. La infección por el virus de la varicela-zóster en un recién nacido o en un
paciente inmunodeprimido puede poner en peligro la vida. De manera similar, las
mujeres que estén considerando quedarse embarazadas deben someterse a pruebas
de detección de anticuerpos contra la rubéola y el CMV; ambas infecciones pueden
causar morbilidad o mortalidad al feto en desarrollo. En general, se recomienda que
todas las mujeres en edad fértil se sometan a pruebas de inmunidad contra la rubéola;
si es negativo, deben vacunarse antes de considerar el embarazo.
Una situación adicional en la que se pueden considerar las pruebas del
estado inmunológico es el trasplante de órganos o de médula ósea. El CMV
puede residir de forma latente en los leucocitos del tejido del donante y puede
causar una enfermedad importante en un receptor no inmunitario. Se
recomienda que un receptor de trasplante CMV negativo reciba tejido y
hemoderivados de un donante CMV negativo.
Infecciones congénitas
Las pruebas serológicas se utilizan a menudo para ayudar a diagnosticar
infecciones congénitas (adquiridas en el útero) en un recién nacido; algunos
agentes infecciosos tienen la capacidad de atravesar la placenta y causar
infección al feto. Tales infecciones pueden causar solo síntomas mínimos en la
madre durante el embarazo y pueden no ser diagnosticadas en ese momento.
Sin embargo, si la madre no es inmune, la infección puede ser importante para
el feto. Los agentes que se encuentran con más frecuencia en las pruebas son
los agentes TORCH:Toxoplasma gondii (que causa toxoplasmosis), virus de la
rubéola, CMV, virus del herpes simple y Treponema pallidumsubsp. pallidum (
que causa la sífilis).
Analizar el suero de la madre para detectar anticuerpos IgG es inútil a menos
que se haya realizado un examen prenatal o temprano en el embarazo y los
resultados de la prueba de anticuerpos sean negativos. Debido a que los
agentes TORCH son agentes infecciosos comunes, muchos individuos tienen
anticuerpos IgG remanentes de infecciones previas. De manera similar, la
prueba de anticuerpos IgG en el recién nacido no tiene valor porque la IgG
materna atraviesa la placenta y está presente en el suero neonatal. Las pruebas
de anticuerpos IgM maternos también tienen poco valor (a menos que la
infección haya ocurrido cerca del momento del parto), porque pueden ser
indetectables 1 o 2 meses después de la infección. Por lo tanto, la detección de
anticuerpos IgM en suero neonatal es el método de elección para el diagnóstico
serológico de infección congénita por uno de los agentes TORCH.
Detección de antígenos
La detección de anticuerpos puede requerir un período de tiempo significativo
para volverse positiva. Las pruebas directas basadas en antígenos generalmente
se consideran menos sensibles que el cultivo; sin embargo, pueden proporcionar
información de diagnóstico mucho antes, muchos en 30 minutos. Este tiempo
más corto es extremadamente importante en tratamientos que requieren la
documentación de la presencia de un agente específico.
Numerosos agentes infecciosos producen antígenos que pueden identificarse en
casi cualquier líquido corporal (suero, orina, esputo, LCR o exudados) o material celular.
La era moderna de la detección directa de antígenos comenzó a mediados de la década
de 1970. La capacidad de producir grandes cantidades de anticuerpos monoclonales
altamente específicos condujo a un fuerte aumento en la producción de productos de
diagnóstico rápido. La detección directa de antígenos microbianos es el proceso
mediante el cual los antígenos microbianos como
ERRNVPHGLFRVRUJ
197
Fragmento fabuloso
Cadena de luz
Enlaces disulfuro s
s
Antígeno-
Pesado
s s
s s
vinculante
cadenas
regiones
Fragmento de Fc
s
s
Cadena de luz
Fragmento fabuloso
HIGO. 10,4Estructura de un monómero de anticuerpo.
como polisacárido capsular o componentes de la pared celular se identifican en
muestras obtenidas de un huésped infectado. Estos antígenos pueden ser
reconocidos y combinarse específicamente con moléculas de anticuerpos para
formar complejos estables.
El proceso básico de detección de antígenos implica mezclar una
muestra clínica con una preparación de anticuerpos específica para el
antígeno de interés. Si el antígeno microbiano está presente en la muestra,
se produce una interacción antígeno-anticuerpo, formando un complejo
inmune. Este complejo puede detectarse mediante muchas técnicas.
Algunos métodos aprovechan el hecho de que las moléculas de
anticuerpos son polivalentes, tienen dos o más sitios de unión al antígeno
y pueden combinarse con dos o más antígenos (Figura 10.4). Muchas
técnicas utilizan moléculas indicadoras como enzimas y sustrato,
fluorocromoexcitación o quimioluminiscencia. Las pruebas que se utilizan
para detectar estas proteínas (antígenos) son similares a las que se utilizan
en la detección de anticuerpos.
Principios de los ensayos inmunológicos
Ensayos de precipitación
los precipitación La reacción se encuentra en ensayos que involucran la
difusión de antígeno y anticuerpo solubles. En un punto crítico, cuando las
concentraciones son óptimas, se forma un precipitado visible, que está
compuesto por un complejo insoluble de antígenos y anticuerpos. Las
reacciones de precipitación son más estables cuando se realizan en un gel
de agarosa. Los métodos de precipitación con importancia diagnóstica
para las enfermedades infecciosas son el dobleinmunodifusión,
inmunodifusión radialy pruebas de floculación.
Inmunodifusión doble
En el inmunodifusión doble o Difusión de gel de Ouchterlony (Figura 10.5), se
cortan orificios cilíndricos o pocillos de un gel de agarosa, espaciados
adecuadamente, en una pequeña placa de Petri. Para la detección de
anticuerpos, se coloca un extracto de antígeno en bruto o purificado conocido de
un microorganismo en un pocillo de la placa de agar y se agrega una muestra de
suero del paciente a un pocillo adyacente. Las moléculas de antígeno y
anticuerpo en solución se difunden fuera de los pocillos y a través de la agarosa
porosa. Si hay un anticuerpo específico para el antígeno, los dos componentes se
combinan en un punto de concentración óptima.
198 PARTE 1 Introducción a la microbiología clínica

Bueno 7;
conocido
hongos
anticuerpo Pozo 1

Pozo 6 Pozo 2

Bien 3;
conocido
Bien 5 hongos
antígeno
(+ control)

Bien 4; Línea de identidad

del paciente entre los pozos 3, 4 y
desconocido 7, lo que indica que
suero el pozo 4 contiene
anticuerpo antifúngico
idéntico al pozo 7
HIGO. 10,5Plato Ouchterlony. Una muestra de suero que contiene un anticuerpo desconocido se coloca en
un pocillo (p. Ej., Pocillo 4), un antígeno conocido de interés se coloca en un pocillo adyacente (pocillo 3:
control positivo) y un antisuero conocido contra el antígeno (pocillo 7: positivo control) se coloca en otro pozo
adyacente. Las moléculas de antígeno y anticuerpo de la solución se difunden desde los pocillos y a través de
la agarosa porosa. Si el suero desconocido contiene anticuerpos contra el antígeno conocido, se forma una
banda de precipitina en un punto de concentración óptima de cada componente. Esta banda de precipitina
se llamalínea de identidad.

llamó al zona de equivalencia y producir una banda de precipitina visible, o
línea de precipitación. Debido a que la prueba se basa en la difusión pasiva de
moléculas, la difusión es lenta y generalmente no es susceptible de un
diagnóstico rápido. Las reacciones pueden tardar de 48 a 72 horas en
desarrollarse. Se utiliza con mayor frecuencia para detectar exoantígenos
fúngicos o anticuerpos séricos. La doble inmunodifusión se limita principalmente
a la detección de anticuerpos frente a patógenos fúngicos, incluidosH.
capsulatum, Blastomyces dermatitidis, y Coccidioides immitis.
Inmunodifusión radial única
Con inmunodifusión radial simple, el anticuerpo conocido se distribuye
uniformemente en agar colocado en una placa de plástico. Los pocillos se cortan
en el agar y se agrega una muestra a los pocillos que puede contener antígeno
reconocido por el anticuerpo. El antígeno se difunde pasivamente a través del
agar y, en la zona de equivalencia con el anticuerpo, forma un precipitado. El
diámetro de la zona de precipitación es directamente
proporcional a la concentración del antígeno. Esta técnica se usa para
cuantificar la concentración de antígeno, pero hoy en día no se usa mucho.
Ha sido reemplazado por métodos más rápidos.
Floculación
Las pruebas de floculación son una variación de las pruebas de precipitación que
también tienen algunas propiedades de los ensayos de aglutinación. En estas pruebas,
debido a la naturaleza química del antígeno (no es un antígeno verdaderamente
soluble), la reacción antígeno-anticuerpo forma un grupo o precipitado
microscópicamente visible de partículas finas que permanecen en suspensión. Las
aplicaciones más importantes de las pruebas de floculación en la detección de
anticuerpos se relacionan con la serología de la sífilis. Después de la infección conT.
pallidum,el cuerpo reacciona desarrollando dos clases diferentes de anticuerpos: (1)
anticuerpos específicos o treponémicos, dirigidos contra T. pallidumantígenos y (2)
anticuerpos inespecíficos o no treponémicos, dirigidos contra el tejido normal del
huésped. Estos anticuerpos no treponémicos, también

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 CAPÍTULO 10 Inmunodiagnóstico de enfermedades infecciosas
denominado anticuerpos reagina, se detectan por reacciones de floculación. La
serología de la sífilis se analiza más adelante en este capítulo.
Ensayos de aglutinación
Los anticuerpos aglutinantes reaccionan con antígenos en la superficie de
partículas microscópicas para formar grumos visibles. Las pruebas de
aglutinación se pueden realizar en tubos de ensayo, pero generalmente se
realizan en la superficie de portaobjetos de vidrio, plástico o cartón. Las pruebas
de aglutinación para la detección de anticuerpos se pueden clasificar como
aglutinación directa (partícula portadora natural) o indirecta (partícula portadora
artificial).Aglutinación indirecta también se conoce como aglutinación pasiva.
Aglutinación pasiva inversa utiliza un anticuerpo adherido a una partícula para
detectar el antígeno. A diferencia de las reacciones de precipitación, en las
reacciones de aglutinación, el antígeno o el anticuerpo se unen a un vehículo
particulado, lo que lo hace insoluble, antes de formar un complejo inmune.
Las pruebas serológicas basadas en la aglutinación directa de partículas
aprovechan los antígenos que se encuentran naturalmente en las células
biológicas. Más comúnmente, estas células son bacterias completas o eritrocitos.
En la aglutinación de células bacterianas completas, los antígenos de superficie
que forman la pared celular bacteriana o la cápsula permiten la reticulación y la
aglutinación macroscópica de las células en presencia de un anticuerpo
específico. Serotipificación de patógenos entéricos comoSalmonela se basa en la
detección de antígenos de superficie bacterianos utilizando sueros preparados
comercialmente.
Aglutinación de látex
Se pueden acoplar pasiva o químicamente varios antígenos a partículas de
origen natural tales como eritrocitos o partículas sintéticas tales como perlas de
látex (poliestireno). Estas cuentas, generalmente alrededor de 1µm de diámetro
Figura 10.6), mejoran la visibilidad de las reacciones de aglutinación. En esta
disposición, la partícula puede aglutinarse mediante un anticuerpo específico
que se encuentra en la muestra de suero de un paciente. Las perlas de látex
recubiertas de antígeno forman una suspensión lechosa homogénea que,
cuando se mezcla con una muestra que contiene un anticuerpo específico, da
como resultado la unión antígeno-anticuerpo. Sin embargo, esta unión primaria
entre las moléculas de antígeno y anticuerpo no produce una reacción de
aglutinación (aglutinación) visible. El anticuerpo debe interactuar con
HIGO. 10,6Micrografía electrónica de transmisión de una suspensión de látex.
Cada cuenta de látex es de aproximadamente 1µm de diámetro. (Cortesía de
Molecular Probes, Invitrogen Detection Technologies, Eugene, OR).
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199
antígeno en dos perlas de látex diferentes (unión secundaria) para
producir aglutinación.
En la aglutinación pasiva inversa, cada perla de látex puede contener miles
de moléculas de anticuerpos. Pueden unirse moléculas de anticuerpos
monoclonales o policlonales a las perlas de látex. Cuando se mezcla con una
muestra que contiene antígeno específico para el anticuerpo en las perlas de
látex, se produce la unión antígeno-anticuerpo. Sin embargo, las moléculas de
antígeno se entrecruzan mediante las perlas de látex recubiertas de anticuerpo
solo si las moléculas de antígeno contienen múltiples epítopos, como es común
para los polisacáridos, proteínas o microorganismos de alto peso molecular. Esta
reticulación secundaria de antígeno y anticuerpo, que da como resultado una
red macromolecular, produce una reacción de aglutinación visible (Figura 10.7).
Los ensayos de aglutinación de látex (LA) se realizan generalmente en
un portaobjetos de vidrio o cartón tratado utilizando una muestra líquida y
volúmenes de látex de aproximadamente 50 µL cada uno (Figura 10.8). Los
reactivos se mezclan a fondo y el portaobjetos se balancea o gira con la
mano o con un dispositivo mecánico durante 2 a 3 minutos antes de leerlo
con la iluminación adecuada y a simple vista. La reacción depende de
muchas variables; por lo tanto, la estandarización es imperativa. Las
variables incluyen tamaño de partícula de látex, avidez de anticuerpo,
isotipo de anticuerpo (IgM o IgG), temperatura de reacción, pH, fuerza
iónica de la solución y concentración de antígeno en la muestra. La IgM es
un pentámero y es una aglutinina más eficaz que la IgG. Se pueden
detectar polisacáridos o proteínas microbianos a niveles de 0,1 ng / ml.
La fuerza y la rapidez de la reacción varían según las condiciones de la
prueba y, lo que es más importante, la concentración de antígeno en la
muestra. Con una alta concentración de antígeno en la muestra de prueba,
puede ocurrir una reacción de aglutinación máxima (4+ en una escala de
1+ a 4+) en solo unos segundos. En ausencia de un antígeno específico, la
suspensión de látex permanece homogénea y lechosa; es decir, no se
observa aglutinación. Aunque la mayoría de las aplicaciones de LA utilizan
perlas de látex blancas, también hay látex de colores disponibles para
mejorar la detección visual.
Perlas de látex Anticuerpo específico
Antígeno
Aglutinación de partículas
HIGO. 10,7Alineación de moléculas de anticuerpos unidas a la superficie
de una partícula de látex y reacción de aglutinación de látex (LA).
200 PARTE 1 Introducción a la microbiología clínica

HIGO. 10,8Portaobjetos de prueba de aglutinación de látex comercial (LA) que muestra la reacción de los controles y
el líquido cefalorraquídeo de un paciente con reactivos de látex específicos para Haemophilus influenzae serotipo b
(Hib). Streptococcus pneumoniae (Sp),estreptococo del grupo B (GBS), y cinco serogrupos diferentes (grupos C y
W135, grupos A e Y, y grupo B) de Neisseria meningitidis (Nm). Tenga en cuenta las reacciones positivas con cada
reactivo de látex de prueba y control positivo (PAG) así como la reacción positiva con la muestra del paciente y el
látex de prueba de Hib. (Cortesía y BD Diagnostic Systems, Sparks, MD.)

MESA 10,2 Interpretación de los controles de la prueba de aglutinación de látex y las muestras de pacientes

Reacción de aglutinación

Número de reacción Espécimen de prueba Prueba de látex Látex de control Interpretación

1 Control de antígeno positivo + 0 Control OK

2 Control de antígeno negativo 0 0 Control OK
3 Paciente A + 0 Prueba positiva
4 Paciente B 0 0 Prueba negativa
5 Paciente C + + Aglutinación inespecífica

+, Aglutinación; 0, sin aglutinación.

Los controles deben acompañar la prueba de muestras de pacientes (Cuadro
10.2). Estos controles incluyen: (1) un control de antígeno positivo (una solución
que contiene el antígeno conocido de interés), (2) un control de antígeno
negativo (una solución que no contiene el antígeno) y (3) una suspensión de
látex de control para detectar la presencia de reacciones de aglutinación
inespecíficas. El látex de control implica analizar la muestra del paciente con
perlas de látex recubiertas con una inmunoglobulina cuya especificidad no está
dirigida al antígeno de prueba. Este suero no inmune se obtiene generalmente
de la misma especie animal en la que se preparó el anticuerpo específico. Se
produce una reacción de aglutinación inespecífica cuando la muestra del
paciente reacciona tanto con la prueba como con el látex de control. Cuando
ocurren tales reacciones, la prueba no es interpretable. Un resultado positivo de
la prueba requiere que el látex de prueba, pero no el látex de control, aglutine la
muestra del paciente.
Los análisis de LA para antígenos microbianos, al igual que otras pruebas de
laboratorio, están sujetos a reacciones falsas negativas y falsas positivas en
comparación con el cultivo. Las reacciones falsas negativas (resultado negativo de la
prueba de antígeno, cultivo positivo) pueden deberse a la presencia de antígeno
en la muestra a concentraciones por debajo del límite de detección de la prueba.
Prozona ocurre cuando la concentración relativa de anticuerpo excede la
concentración de antígeno. En esta situación, cada antígeno se combina con una
o dos moléculas de anticuerpo y no se produce la reticulación entre el antígeno y
el anticuerpo. Además, pueden producirse reacciones falsas negativas con
exceso de antígeno:postzona. Cuando la concentración de antígeno excede la
concentración relativa de anticuerpo, no se produce la reticulación entre el
antígeno y el anticuerpo y no se desarrolla una red adecuada. Algunos kits de
análisis de antígeno requieren que todos los resultados negativos se vuelvan a
analizar con una muestra diluida para descartar la zona posterior.
Las reacciones falsas positivas (resultado positivo de la prueba de antígeno,
cultivo negativo) son más difíciles de explicar; pueden deberse a la presencia de
antígenos de reacción cruzada u organismos no viables en la muestra original.
Las pruebas de detección de antígenos no requieren microbios viables. Las
suspensiones de látex recubiertas de anticuerpos pueden aglutinar organismos
viables o no viables, componentes microbianos como la pared celular o
fragmentos de membrana, o antígenos solubles como bacterias

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 CAPÍTULO 10 Inmunodiagnóstico de enfermedades infecciosas
polisacárido capsular. Por lo tanto, un resultado aparente de prueba de látex falso
positivo en realidad puede representar un resultado positivo verdadero para la
enfermedad en un paciente con un cultivo negativo.
Se pueden utilizar numerosos procedimientos de pretratamiento de
muestras para eliminar o minimizar las aglutinaciones inespecíficas,
presumiblemente eliminando o inactivando los factores de la muestra
responsables de estas reacciones. Estos procedimientos incluyen la
centrifugación de la muestra para eliminar el material particulado, la ebullición
para inactivar los constituyentes de la proteína (aceptable cuando el antígeno de
prueba es un polisacárido termoestable) y el paso de la muestra a través de un
filtro de membrana. Algunas muestras, como la orina, pueden concentrarse
mediante centrifugación o filtración por membrana antes de la prueba. Los
filtros normalmente atrapan o excluyen los materiales antigénicos de alto peso
molecular, al tiempo que permiten el paso de agua y pequeños compuestos.
Estos métodos de concentración aumentan la sensibilidad de la prueba. Los
pretratamientos se requieren con menos frecuencia a medida que los kits
comerciales de látex se vuelven más específicos y sensibles.
Las ventajas de las pruebas de LA son la disponibilidad de reactivos de buena
calidad en forma de kit completo, buena sensibilidad, rapidez relativa y facilidad
de ejecución. Las desventajas incluyen subjetividad en la lectura de criterios de
valoración y reacciones inespecíficas resultantes de sustancias que interfieren en
muestras clínicas. La prueba LA es uno de los métodos de detección de
antígenos más utilizados en el laboratorio clínico. En muchos laboratorios
clínicos, la identificación de serogrupos del β-hemolíticoEstreptococo spp. de las
placas de cultivo se realiza de forma rutinaria utilizando kits de prueba de LA. La
sensibilidad paraStreptococcus pyogenes en frotis de garganta es del 70% al
96%. Las pruebas serológicas comerciales basadas en LA están disponibles para
muchas infecciones virales, que incluyen CMV, rubéola y mononucleosis
infecciosa (anticuerpo heterófilo), y algunas infecciones bacterianas
(estreptococos, anticuerpos micoplásmicos), fúngicas (anticuerpos candidiásicos)
y parasitarias (anticuerpos toxoplasmas). . Debido a la baja sensibilidad, el uso
rutinario de las pruebas de LA para la detección deStreptococcus agalactiae en
muestras de LCR y del tracto urogenital ya no se recomienda.
Bacterias
Antígenos
A
A
A
A
A
A
Células estafilocócicas
HIGO. 10,9Diagrama de la reacción de coaglutinación con antígeno de células bacterianas completas. A, Antígeno.
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201
Coaglutinación estafilocócica
Similar a LA, coaglutinación estafilocócica o simplemente coaglutinación, utiliza
anticuerpos unidos a partículas para mejorar la visibilidad de las reacciones
antígeno-anticuerpo. En lugar de una perla de látex, muerta con formalina
intactaStaphylococcus aureus se utilizan células (típicamente la cepa Cowan 1).
La pared celular de esta cepa deS. aureus contiene una gran cantidad de
proteína A, que puede unirse a la porción Fc (base de la cadena pesada de
inmunoglobulina) de la molécula de anticuerpo IgG. Esto deja los sitios de unión
al antígeno de la molécula (porción Fab) disponibles para reaccionar con
antígenos específicos (Higos. 10,9y 10.10). Se ha estimado que cada célula
estafilocócica tiene alrededor de 80.000 sitios de unión a anticuerpos. El número
real de moléculas de anticuerpo unidas a la célula estafilocócica está limitado
por el impedimento esteárico. Sin embargo, el recubrimiento es suficiente para
hacer que el producto sea de utilidad clínica en las pruebas de antígenos
directos.
Las reacciones de coaglutinación se preparan mezclando células
estafilocócicas sensibilizadas con anticuerpos con una solución que contiene el
antígeno de interés en un portaobjetos o cartulina (ver Figura 10.10). Los
procedimientos de coaglutinación parecen más susceptibles a reacciones de
aglutinación inespecíficas y la preparación de la muestra es importante. Esto es
particularmente cierto para las pruebas de muestras de suero, probablemente
porque las células estafilocócicas pueden unirse a IgG humana en las muestras
de suero de prueba y, posteriormente, aglutinarse por la presencia de RF (IgM
anti-IgG) en el suero. La coaglutinación es muy específica pero puede ser menos
sensible que la LA para detectar pequeñas cantidades de antígeno. Por lo tanto,
estos reactivos se utilizan a menudo para confirmar la identificación de colonias
bacterianas en placas de cultivo, pero no para la detección rápida de antígenos a
partir de muestras clínicas.
Hemaglutinación
En la hemaglutinación pasiva o indirecta (IHA), los antígenos microbianos
se unen a los eritrocitos después del tratamiento químico de las células
con ácido tánico, cloruro crómico, glutaraldehído u otra sustancia que
promueva la reticulación de los antígenos. El sensibilizado
Anticuerpos
Moléculas de proteína A
A
A
A
A
202 PARTE 1 Introducción a la microbiología clínica

HIGO. 10.10Tarjeta de prueba de coaglutinación comercial que muestra positivo (1) y negativo (2 y 3)
reacciones. El color azul es un colorante indicador agregado para facilitar la lectura de la reacción de
aglutinación sobre un fondo blanco.

las células pueden reaccionar con el suero de un paciente para detectar

anticuerpos aglutinantes. Este método de ensayo se utiliza raramente en la
actualidad. Las células, como los eritrocitos, tienen una carga superficial
conocida comopotencial zeta. Si las células tienen la misma carga, se repelerán.
Para que se produzca la aglutinación, los anticuerpos que se unen a las células
deben ser lo suficientemente grandes para atravesar las células y superar las
cargas. La IgM, debido a que es un pentámero, es mejor aglutinando eritrocitos
que la IgG. La repulsión de las células por el potencial zeta puede verse afectada
por el pH, la solución salina de iones bajos y la viscosidad del fluido.
Un ejemplo de prueba de hemaglutinación directa es la detección de
anticuerpos heterófilos en la etapa aguda de la mononucleosis infecciosa,
como resultado de la infección por el virus de Epstein-Barr (VEB). En el caso
de la mononucleosis infecciosa, el anticuerpo heterófilo humano reacciona
con eritrocitos de caballo, buey y oveja. En el entorno apropiado, las
pruebas de anticuerpos heterófilos son útiles para el diagnóstico y todavía
se utilizan en los laboratorios clínicos. Los eritrocitos de caballo
especialmente tratados proporcionan el antígeno y la prueba de
aglutinación se lee en un portaobjetos o tarjeta (BBL MonoSlide; Beckton-
Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Otra empresa comercializa eritrocitos de
caballo teñidos con color realzado para un mejor contraste (ColorCard HIGO. 10.11Kit de prueba Sure-Vue Mono (Biokit USA, Lexington, MA)
Mono-Test; Alere, Waltham, MA). Los ensayos más nuevos se basan en para la detección de anticuerpos heterófilos producidos durante la
antígenos heterófilos unidos a partículas de látex (Sure-Vue; Biokit USA, mononucleosis infecciosa.
Lexington, MA) (Figura 10.11).

Inhibición de la hemaglutinación condiciones apropiadas con un rango de tamaño de 1 µma 20 µm de

Una prueba de laboratorio que tiene una gran importancia histórica para la
serología diagnóstica, en particular para las infecciones virales, es la prueba de
inhibición de la hemaglutinación (HI). Esta prueba aprovecha el hecho de que
muchos agentes virales, incluidos los virus de la rubéola y la influenza, tienen
antígenos de superficie que pueden aglutinar los eritrocitos de ciertas especies
de mamíferos. Los anticuerpos presentes en el suero pueden unirse al virus e
inhibir la reacción de aglutinación. El título de anticuerpos HI es la dilución más
alta del suero del paciente que inhibe completamente la aglutinación de los
eritrocitos por el virus. Los inmunoensayos enzimáticos (EIA) también se utilizan
con frecuencia para diagnosticar la infección por el virus de la influenza. Estos
ensayos tienen la ventaja de poder diferenciar IgG de IgM.
Aglutinación mediada por liposomas
La aglutinación mediada por liposomas implica el uso de liposomas,
membranas bicapa de un solo lípido que forman vesículas cerradas debajo
diámetro. En su fabricación, las moléculas de antígeno o anticuerpo
pueden incorporarse a la superficie de la membrana y estar disponibles
para la interacción con la molécula correspondiente (Figura 10.12).
Además, la vesícula de liposoma se puede construir con un colorante
químico o una molécula bioactiva atrapada en el interior. El tinte de color
permite una fácil detección visual de la formación de la red y la
aglutinación entre el anticuerpo y el antígeno unidos a liposomas.
Alternativamente, la combinación de liposomas que contienen colorante y
perlas de látex, los cuales contienen el anticuerpo reactivo en la superficie,
puede aumentar la sensibilidad de LA. Quizás la mayor ventaja potencial de
la tecnología de los liposomas está en su aplicación a inmunoensayos
distintos de la aglutinación de partículas que hacen uso de la capacidad del
liposoma para transportar sustancias químicas reactivas. Los liposomas
aún tienen que alcanzar su máximo potencial como reactivos de
diagnóstico en el laboratorio clínico. Los métodos de aglutinación de
partículas se comparan enCuadro 10.3.

ERRNVPHGLFRVRUJ
 CAPÍTULO 10 Inmunodiagnóstico de enfermedades infecciosas 203

Antígenos
Anticuerpos
A
A
Teñir
moléculas Y Y

A
mi

A
mi mi

Y
mi mi
D

A
D mi mi
YY D

A
D

A
Y
D D A
Y

Y
D B
Moléculas enzimáticas
Y

"Cabezas" polares de moléculas lipídicas

Y

A
Y "Colas" no polares de moléculas de lípidos

HIGO. 10.12Diagrama de partículas de liposomas que muestran la estructura de la capa de bilípidos. Cualquiera de los
anticuerpos(A) o antígeno (B) se puede unir a la superficie del liposoma. El interior del liposoma puede transportar moléculas
informadoras (p. Ej., Tintes, enzimas).

MESA 10,3 Comparación de métodos de aglutinación de partículas

Naturaleza de la unión del anticuerpo a la

Método de aglutinación Tipo de partícula partícula Utilidad de diagnóstico

LA Perlas de látex Absorción inespecífica o Aglutinación más utilizada

Coaglutinación estafilocócica
Aglutinación mediada por liposomas
Estafilococos fijados con formalina
Liposomas
acoplamiento químico método de detección directa Se
La porción Fc de la molécula de IgG se une utiliza para la identificación antigénica
a la proteína A en la pared celular de bacterias en cultivo
estafilocócica
Acoplamiento químico Método más nuevo; limitado
aplicaciones de pruebas comerciales

IgG, Inmunoglobulina G; LA, prueba de aglutinación de látex.

efecto citopático de las células. El efecto citopático es el cambio visual que se

Ensayos de neutralización
Los ensayos de neutralización para la detección de anticuerpos se basan en la
interacción de un antígeno biológicamente activo con anticuerpos que pueden
bloquear o inactivar la actividad biológica del antígeno. No solo participan en las
pruebas serológicas, los anticuerpos neutralizantes juegan un papel importante
en su funcionamiento como anticuerpos protectores in vivo. Por ejemplo, la
inmunidad a numerosos virus depende de los anticuerpos circulantes que
pueden neutralizar o bloquear la infectividad de los virus que llegan al torrente
sanguíneo. La neutralización probablemente se produce porque el anticuerpo se
une a la partícula viral y bloquea la unión posterior del virus a los sitios
receptores en las células diana. Los anticuerpos neutralizantes frente a virus
pueden medirse in vitro mediante el uso de cultivos celulares.
En la neutralización viral, la muestra de suero de un paciente se diluye
en serie y cada dilución se mezcla con una cantidad estándar de un virus
conocido que se sospecha que causa la enfermedad en el paciente. Las
mezclas de virus y suero se inoculan en una serie de tubos o matraces de
cultivo celular. Si el suero del paciente contiene anticuerpos neutralizantes
del virus, el anticuerpo bloquea la infección viral y previene la
produce en las monocapas celulares provocado por virus o toxinas. El título de
anticuerpos neutralizantes es la dilución más alta del suero del paciente para
bloquear completamente el efecto citopático. Para el diagnóstico de la
enfermedad actual, deben analizarse sueros de fase aguda y de fase de
convalecencia.
Los ensayos de neutralización viral son muy sensibles y específicos, pero
también son técnicamente exigentes y requieren el uso de virus activos y cultivos
celulares. En la actualidad, no se utilizan comúnmente pruebas serológicas, pero
las pruebas de neutralización son valiosas para identificar un virus desconocido
con un anticuerpo conocido. Otros ejemplos de ensayos de neutralización son el
ensayo HI (discutido anteriormente) y la prueba de neutralización de
antiestreptolisina O (ASO) para detectar anticuerpos antiestreptocócicos.
Inmunoensayos etiquetados
Ensayos inmunofluorescentes
Los ensayos inmunofluorescentes son un método para la detección rápida de
antígenos y anticuerpos en el laboratorio clínico. Los resultados son generalmente

ERRNVPHGLFRVRUJ
204 PARTE 1 Introducción a la microbiología clínica
Luz emocionante
Luz fluorescente
Ocular
Incorporado
filtro de supresión
Haz dicroico
espejo dividido
Excitante
filtrar
Objetivo
Muestra
HIGO. 10.13Camino de luz del microscopio de luz incidente.
HIGO. 10.14Células teñidas con anticuerpos fluorescentes directos de Giardia
duodenalis (tres celdas ovaladas de color verde manzana más grandes) y
Cryptosporidium spp. (células más pequeñas) en las heces. (Cortesía de Meridian
Bioscience, Cincinnati, OH.)
disponible dentro de 15 minutos a 60 minutos. Cuando se conjugan
anticuerpos monoclonales o policlonales específicos con tintes
fluorescentes (fluorocromos), se pueden visualizar con un microscopio de
fluorescencia. Los anticuerpos marcados se denominanconjuga porque el
anticuerpo está conjugado (enlazado) a una etiqueta. Los fluorocromos son
sustancias químicas que absorben luz de una longitud de onda y emiten
luz de diferente longitud de onda. El microscopio de fluorescencia utiliza
un sistema de luz epiluminiscente (incidente) de iluminación vertical, filtros
de longitud de onda y un espejo dicroico (Figura 10.13). El espejo dicroico
permite el paso de luz a una longitud de onda de excitación desde la
fuente de luz hasta la muestra. El espejo también permite el paso de la luz
de longitud de onda de emisión (más larga) desde la fuente etiquetada
hasta la lente del objetivo. Esta luz de longitud de onda emitida o excitada
aparece como un color brillante dependiendo del tinte. Un fluorocromo de
uso común es el isotiocianato de fluoresceína (FITC), que, cuando se excita,
emite una fluorescencia verde manzana brillante (Figura 10.14).
Las técnicas de detección pueden ser directas o indirectas. En el
anticuerpo fluorescente directo (DFA), la muestra clínica que contiene el
antígeno de interés se fija en un portaobjetos de vidrio con formalina,
metanol, etanol o acetona. La fijación hace que las membranas de las
células de los mamíferos sean permeables a las manchas. El anticuerpo
marcado con antígeno específico se aplica a la muestra fijada, se incuba, se
lava y se examina con un microscopio de fluorescencia. Si el antígeno fue
ERRNVPHGLFRVRUJ
PRUEBAS DE ANTICUERPOS FLUORESCENTES
Sin etiqueta Etiquetado Etiquetado
anticuerpo anticuerpo antiinmuno
globulina
Prueba directa Prueba indirecta
A B
Antígeno
Sección de tejido
HIGO. 10.15Prueba de anticuerpos fluorescentes para la identificación de
antígenos tisulares o sus anticuerpos. A, Anticuerpo fluorescente directo
(DFA). El anticuerpo marcado con antígeno específico se aplica a la muestra
fijada, se incuba, se lava y se visualiza con un microscopio de fluorescencia.
B, Anticuerpo fluorescente indirecto (IFA). Se aplica un segundo anticuerpo
marcado con fluorocromo específico para el primer anticuerpo no
marcado. (De Goering R et al:Microbiología médica de Mims, ed 4, Londres,
2008, Mosby.)
presente en la muestra clínica, el anticuerpo marcado (conjugado) se
une al antígeno y se observa fluorescencia (Figura 10.15A). La tinción
inmunofluorescente permite una visualización rápida de tejido
infectado, cultivo celular, fluidos corporales y muestras de hisopos.
Cuando el agente infeccioso no produce suficiente antígeno para la
detección en los fluidos corporales, se debe considerar la realización de
pruebas directas de las células. El uso de anticuerpos específicos para el
agente infeccioso permite la detección del agente dentro de las células
infectadas. Las técnicas de inmunofluorescencia directa son el ensayo de
elección en estas condiciones. La prueba DFA se utiliza para detectar
Bordetella pertussis; Legionella pneumophila; Giardia duodenalis (G.
lamblia, G. intestinalis); Cryptosporidiumspp .; Pneumocystis jirovecii; virus
herpes simplex; CMV; virus de la varicela zoster; y los virus respiratorios
más comúnmente aislados, como el virus de la parainfluenza, el virus de la
influenza, el adenovirus y el virus sincitial respiratorio (VSR), en muestras
clínicas. Pueden usarse ensayos inmunofluorescentes para la confirmación
de virus aislados en cultivos celulares.
En el anticuerpo fluorescente indirecto (IFA) para anticuerpos, células
microbianas completas (bacterias, hongos, parásitos protozoarios) o células de
mamíferos infectadas por virus se lavan y se fijan a una densidad específica en
portaobjetos de vidrio. Con frecuencia, con los ensayos preparados
comercialmente, las células se colocan en pequeños pocillos en el portaobjetos
de vidrio y se agregan diferentes muestras de pacientes a los pocillos
individuales. La fijación generalmente se logra con metanol, etanol o acetona.
El suero del paciente se puede diluir en serie, aplicar a las preparaciones de
células fijas e incubar entre 22 ° C y 37 ° C en un ambiente húmedo.
 CAPÍTULO 10 Inmunodiagnóstico de enfermedades infecciosas 205

ambiente para evitar el secado, permitiendo que se produzca la unión antígeno- F F Marcado con fluoresceína
anticuerpo. Los portaobjetos se lavan primero con una solución tamponada para F F anticuerpo terciario
F F
eliminar el anticuerpo no unido, antes de la aplicación de anticuerpos IgG o IgM
antihumanos que están marcados con fluorescencia y son reactivos con
inmunoglobulina humana. Los portaobjetos se incuban nuevamente y se lavan,
Anticuerpo secundario
se secan al aire y se observan con un microscopio equipado con una fuente de
luz y filtros para excitar el fluorocromo (Figura 10.15B). Si el anticuerpo
Anticuerpo del paciente
específico contra el antígeno del agente infeccioso está presente en el suero del
que contiene suero
paciente, el anticuerpo se une y se produce una unión secundaria por parte del
conjugado. Las células emiten fluorescencia y se puntúan en una escala A Antígeno conocido
semicuantitativa como positivas (1+ a 4+) o negativas. El título es el recíproco de
la dilución más alta del suero del paciente que da un nivel mínimo de
HIGO. 10.16Pruebas de anticuerpos de fluorescencia indirecta doble (IFA) para la
fluorescencia (a menudo 2+ o más).
detección de anticuerpos.
El ensayo IFA sigue siendo el método de elección para el diagnóstico
serológico de muchas enfermedades infecciosas, como las causadas por los
agentes TORCH, L. pneumophila, B. burgdorferi, Rickettsia rickettsii, y M.
pneumoniae. La detección de T. pallidumLos anticuerpos que utilizan la prueba El método utiliza un segundo anticuerpo IgG o IgM antihumano no marcado
de absorción de anticuerpos treponémicos fluorescentes (FTA-ABS) (que se para unirse al anticuerpo específico microbiano en el suero de un paciente. El
analiza más adelante en este capítulo) fue la aplicación más utilizada de las anticuerpo marcado con FITC se dirige al segundo anticuerpo. El paso adicional
pruebas de IFA. Sin embargo, la prueba FTA-ABS está siendo reemplazada por amplifica la reacción porque múltiples moléculas del segundo anticuerpo
ensayos que son más fáciles de realizar. El principio de IFA también se aplica a la pueden unirse al anticuerpo del paciente, proporcionando sitios de unión
detección de autoanticuerpos (anticuerpos antinucleares) en el diagnóstico de adicionales para el anticuerpo marcado con FITC.
lupus eritematoso sistémico.
La prueba IFA también es útil para detectar anticuerpos específicos de IgM o Inmunoensayos enzimáticos
específicos de IgG, mediante el uso de un segundo anticuerpo marcado con FITC El EIA es una alternativa a los ensayos inmunofluorescentes para detectar
altamente específico para IgM o IgG humanas. Al igual que con cualquier prueba de antígenos y anticuerpos en muestras clínicas. En lugar de marcar un
IgM, IFA para IgM está sujeta a resultados falsos negativos debido al exceso de IgG y a anticuerpo con un fluorocromo, el EIA usa moléculas de enzima
resultados falsos positivos debido a RF. Para evitar estos problemas, la IgG debe conjugadas con anticuerpos de tal manera que se conservan las
eliminarse físicamente o desactivarse funcionalmente para los ensayos específicos de actividades enzimáticas y de unión a antígenos. Las enzimas utilizadas son
IgM. a menudo fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano picante. Cuando se
La utilidad de las pruebas DFA e IFA está limitada por muchos factores, incluida la naturaleza laboriosa de los agrega el sustrato apropiado al complejo de anticuerpo conjugado con
procedimientos, el requisito de un microscopio de fluorescencia, la necesidad de un cuarto oscuro y la interpretación subjetiva antígeno, la enzima cataliza la producción de un producto final visible
involucrada en la lectura de las diapositivas. Los procedimientos no son fáciles de automatizar. Finalmente, la fluorescencia se (coloreado) que puede cuantificarse espectrofotométricamente. Los
desvanece con el tiempo. Por tanto, los anticuerpos se han conjugado con otros marcadores además de los fluorocromos. Las procedimientos de EIA pueden detectar antígenos o anticuerpos y son muy
etiquetas colorimétricas utilizan enzimas, como la peroxidasa de rábano picante, la fosfatasa alcalina y los sistemas estreptavidina- fáciles de automatizar y analizar un gran número de muestras.
biotina, para detectar la presencia de complejos inmunes convirtiendo un sustrato incoloro en un producto final coloreado. Se

prefiere la estreptavidina a la avidina debido a una mayor sensibilidad y una menor incidencia de unión inespecífica. La molécula
de estreptavidina se puede unir a fluorocromos como la fluoresceína o la rodamina. La interacción estreptavidina-biotina ocupa el
lugar de la interacción anticuerpo primario-anticuerpo secundario. Este método tiende a aumentar la cantidad de señal detectada
(mayor sensibilidad) por las siguientes razones: (1) múltiples moléculas de biotina pueden unirse al anticuerpo primario y (2) cada
molécula de estreptavidina tiene cuatro sitios reactivos para la biotina. Estos productos no se desvanecen con el almacenamiento y
pueden detectarse mediante un simple microscopio óptico. La capacidad de visualizar y evaluar reacciones le da un alto nivel de
certeza al procedimiento. Los ensayos serológicos más nuevos a menudo se evalúan con procedimientos de IFA. La prueba IFA
también se adapta rápidamente para estudiar la respuesta serológica a agentes infecciosos recién descubiertos. La interacción
estreptavidina-biotina ocupa el lugar de la interacción anticuerpo primario-anticuerpo secundario. Este método tiende a aumentar
la cantidad de señal detectada (mayor sensibilidad) por las siguientes razones: (1) múltiples moléculas de biotina pueden unirse al
anticuerpo primario y (2) cada molécula de estreptavidina tiene cuatro sitios reactivos para la biotina. Estos productos no se
desvanecen con el almacenamiento y pueden detectarse mediante un simple microscopio óptico. La capacidad de visualizar y
evaluar reacciones le da un alto nivel de certeza al procedimiento. Los ensayos serológicos más nuevos a menudo se evalúan con
procedimientos de IFA. La prueba IFA también se adapta rápidamente para estudiar la respuesta serológica a agentes infecciosos
recién descubiertos. La interacción estreptavidina-biotina ocupa el lugar de la interacción anticuerpo primario-anticuerpo
secundario. Este método tiende a aumentar la cantidad de señal detectada (mayor sensibilidad) por las siguientes razones: (1)
múltiples moléculas de biotina pueden unirse al anticuerpo primario y (2) cada molécula de estreptavidina tiene cuatro sitios
reactivos para la biotina. Estos productos no se desvanecen con el almacenamiento y pueden detectarse mediante un simple
microscopio óptico. La capacidad de visualizar y evaluar reacciones le da un alto nivel de certeza al procedimiento. Los ensayos serológicos más nuevos a menudo se evalúan con procedimientos de IFA. La prueba IFA también se adapta rápidamente para estudiar la respuesta serológica a agentes inf
Los EIA se utilizan ampliamente para el diagnóstico serológico de
enfermedades infecciosas. Son populares por muchas razones, que incluyen: (1)
la disponibilidad de kits comerciales de EIA para una gran cantidad de agentes
infecciosos; (2) la adaptabilidad de las pruebas de EIA a la automatización, lo que
permite realizar más pruebas en tiempos más cortos; y (3) la interpretación
objetiva de los resultados de las pruebas con productos finales coloreados que
se pueden leer espectrofotométricamente. Muchos productos comerciales están
diseñados para adaptarse a laboratorios de gran volumen; otros están
diseñados para aplicaciones de un solo uso en muestras de pacientes
individuales. Dependiendo del diseño, estas pruebas pueden proporcionar
resultados cualitativos (positivos o negativos) o cuantitativos.
Los EIA desarrollados comercialmente para el diagnóstico de agentes
infecciosos normalmente requieren una fase sólida para la unión de un antígeno
o anticuerpo. Se encuentran disponibles varias plataformas de matriz sólida que
incluyen pocillos individuales de bandejas de microtitulación de poliestireno (
Figura 10.17A), perlas de plástico esféricas o perlas magnéticas (Figura 10.17B).
La matriz sólida permite el lavado de la muestra y el reactivo para disminuir la
unión no específica o la actividad de fondo.
Al realizar un EIA para detectar un antígeno, la fase sólida contiene

Se han desarrollado numerosas variaciones de la prueba IFA. El un anticuerpo de captura unido a la matriz. Se agrega una muestra
objetivo básico en la mayoría de estos procedimientos ha sido aumentar la clínica y, si el antígeno de interés está presente en la muestra, forma
sensibilidad, mientras se mantiene la especificidad del ensayo. Un ejemplo un complejo estable con el anticuerpo unido a la matriz. La muestra
de tal procedimiento es la prueba doble IFA (Figura 10.16). Esta no unida se elimina mediante lavado y un segundo anticuerpo

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206 PARTE 1 Introducción a la microbiología clínica
Anticuerpo específico Antígeno
Pozo de plástico
Conjugado con enzimas
anticuerpo
Sustrato enzimático
De colores
Producto final
A B
HIGO. 10.17Principio del ensayo inmunoabsorbente directo en fase sólida. A, La superficie en fase sólida es un pozo de microtitulación.
B, La superficie de la fase sólida es una perla.
se añade específico para el antígeno. En el método directo de
detección de antígenos, este segundo anticuerpo se conjuga con una
enzima. En el método indirecto, se agrega y se lava un segundo
anticuerpo no conjugado, y luego se agrega un tercer anticuerpo
específico para el segundo anticuerpo. El tercer anticuerpo se conjuga
con la enzima y se dirige contra la porción Fc del segundo anticuerpo
no marcado.
En cualquier método, después de agregar y lavar el conjugado, se agrega el
sustrato específico de la enzima. Después de un tiempo especificado, se agrega
un reactivo de parada para bloquear la actividad enzimática. La cantidad de
producto final coloreado es directamente proporcional a la cantidad de
conjugado unido a enzima y antígeno presente en la muestra clínica original.
Ambos métodos de detección se describen paso a paso enFigura 10.18. Los
métodos descritos a menudo se denominaninmunoensayo sándwich directo y
inmunoensayo sándwich indirecto. La ventaja del inmunoensayo indirecto en
sándwich es la necesidad de un solo anticuerpo antiinmunoglobulina conjugado
con enzima (tercer anticuerpo) que pueda usarse en diferentes ensayos para
detectar varios antígenos. Una desventaja es que los anticuerpos heterófilos
pueden
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Talón Antígeno
Conjugado con enzimas
anticuerpo
Sustrato enzimático
De colores
Producto final
producir resultados falsos positivos o falsamente aumentados. El anticuerpo heterófilo
puede comportarse de manera similar al antígeno, uniéndose tanto a los anticuerpos
de captura como a los de señal.
Las empresas comerciales han producido kits de EIA de buena calidad para
la detección de varios antígenos microbianos. Los conjugados se pueden
preparar de forma económica, son estables durante 6 meses y tienen una
sensibilidad razonablemente buena en la mayoría de las aplicaciones. El uso de
placas de microtitulación e instrumentación para dispensar reactivos,
procedimientos de lavado y lectura óptica automatizada de reacciones ha
facilitado enormemente los métodos de EIA para permitir la prueba de lotes de
grandes volúmenes (Figura 10.19). Sin embargo, algunos métodos requieren
mucho tiempo y pueden no ser prácticos para laboratorios de bajo volumen o
ejecuciones “estadísticas”. No siempre pueden considerarse pruebas rápidas en
comparación con otros procedimientos como LA. Los EIA se utilizan para la
detección rápida deL. pneumophila, Clostridium difficile toxinas, G. duodenalis, y
Cryptosporidium spp. Debido a la baja sensibilidad, los EIA paraChlamydia
trachomatis se consideran deficientes y ya no se recomiendan. Las pruebas de
amplificación de ácidos nucleicos se consideran las pruebas de elección en
muestras clínicas.
 CAPÍTULO 10 Inmunodiagnóstico de enfermedades infecciosas 207

Directo Indirecto

HIGO. 10.19Prueba de inmunoensayo enzimático (EIA) en placa de

microtitulación(cima) y desnudarse (fondo) mostrando pozos con producto
de reacción enzimática antes (azul) y después (amarillo) adición de una
solución de parada ácida. (Cortesía de Meridian Bioscience, Cincinnati, OH.)
mi

El antígeno se adsorbe bien en la placa.

mi
mi

El suero que contiene anticuerpos del paciente se

une al antígeno.

mi

HIGO. 10.18Principio de varios inmunoensayos enzimáticos para antígeno.

Ambos métodos (inmunoensayos sándwich directos e indirectos) mi mi mi
comienzan con un anticuerpo específico unido a la fase sólida.Flechas El segundo anticuerpo marcado con enzima (E) se
une al anticuerpo del paciente.
pasos separados en los procedimientos donde tiene lugar el lavado de la
fase sólida. Y, Anticuerpo; AUTOMÓVIL CLUB BRITÁNICO, antígeno; MI,
enzima, sustrato enzimático, producto enzimático.

Los inmunoensayos para la detección de anticuerpos séricos se realizan de manera

similar a los inmunoensayos para la detección de antígenos microbianos, excepto que
las funciones del antígeno y del anticuerpo se invierten (Figura 10.20). La mayoría de los
ensayos de anticuerpos séricos se realizan en una matriz sólida utilizando tubos o
pocillos recubiertos con antígeno. Debido a la gran cantidad de pruebas que se pueden
realizar y al pequeño volumen de suero requerido, las placas de microtitulación de 96
pocillos se utilizan comúnmente para este propósito. Los casetes de dilución de suero
único y prueba única también están disponibles en fuentes comerciales para entornos
con pruebas de bajo volumen o poco frecuentes. En cualquier caso, el anticuerpo del
paciente se une a la superficie recubierta de antígeno microbiano y el anticuerpo se
detecta utilizando una inmunoglobulina antihumana marcada con enzima o un
conjugado. Los EIA o, más específicamente, los EIA en fase sólida (ensayo
inmunoabsorbente ligado a enzimas [ELISA]) son los tipos de inmunoensayos más
populares que se utilizan en la actualidad.
mi mi mi
Sustrato enzimático ( ) se convierte en
producto ().
HIGO. 10,20Principio del inmunoensayo enzimático indirecto en fase sólida (EIA)
para la detección de anticuerpos.
Muchos laboratorios utilizan alguna forma de prueba ELISA para la detección de
anticuerpos. En esta prueba, los resultados no se informan como título de anticuerpos,
sino como los resultados se relacionan con la cantidad relativa de señal generada por el
suero del paciente en comparación con la de una muestra conocida débilmente
positiva. Los resultados generalmente se informan como unidades relativas con un
rango de referencia numérico (U / mL) o como una proporción de

ERRNVPHGLFRVRUJ
208 PARTE 1 Introducción a la microbiología clínica
resultados en la muestra al control positivo bajo (p. ej., paciente 15 U / mL,
control 10 U / mL, relación 1,5). Si el resultado de la prueba está por
encima de un umbral establecido, el resultado se considera positivo o
reactivo. Es imposible comparar los resultados de los métodos de dilución
en serie con los resultados de ELISA debido a la variación de una prueba a
otra. Sin embargo, existe una relación lineal en cada ensayo individual
entre las cantidades de anticuerpo presentes, lo que significa que duplicar
el resultado produce un aumento doble en la cantidad de anticuerpo.
los ELISA de captura de anticuerpos IgM detecta específicamente el
anticuerpo IgM (Figura 10.21). En este procedimiento, la fase sólida se
recubre primero con un anticuerpo animal específico para IgM humana. Se
agrega e incuba el suero del paciente y se lava el tubo o la placa. En este
punto, las moléculas de anticuerpo IgM, independientemente de la
especificidad del antígeno, deben unirse a la fase sólida y los anticuerpos
de otras clases de inmunoglobulinas deben eliminarse por lavado. El
siguiente paso del ensayo implica la adición del antígeno de interés y se
puede realizar de dos formas. El antígeno se puede marcar directamente
con una enzima o se puede añadir sin marcar. En cualquier caso, el
antígeno se unirá a la fase sólida si está presente el anticuerpo IgM
específico. Con el antígeno marcado, el ensayo se completa con
EE
Etiquetado específico (izquierda)
o sin etiqueta (Derecha)
antígeno añadido.
El antígeno se une a
IgM específica solamente.
EE
Sustrato enzimático
se convierte en producto.
HIGO. 10.21El anticuerpo de inmunoglobulina M (IgM) captura el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA)
utilizando antígeno marcado (izquierda) o antígeno sin marcar; un anticuerpo secundario marcado con enzima se agrega más
tarde(Derecha).
ERRNVPHGLFRVRUJ
añadiendo sustrato enzimático y midiendo el producto coloreado.
Alternativamente, el antígeno no marcado unido a IgM se detecta
agregando un anticuerpo secundario marcado con enzima dirigido contra
el antígeno específico, seguido de la adición de sustrato enzimático. La
cantidad de producto coloreado es directamente proporcional a la
cantidad de IgM específica capturada en la fase sólida.
El ensayo de captura de anticuerpos IgM tiene la ventaja de eliminar la
necesidad de separación de IgG que podría competir con IgM y producir
resultados falsos negativos. El ensayo de captura puede ser susceptible a
resultados falsos positivos debido a que IgM RF se une a la fase sólida.
Pueden emplearse modificaciones del ensayo para reducir la posibilidad de
este problema. Otra forma de distinguir entre IgG e IgM es usar
conjugados específicos de IgG y específicos de IgM.
Una variación del marcaje enzimático implica marcar un anticuerpo con una
molécula reactiva como la biotina. La unión del anticuerpo a un antígeno
específico se detecta agregando estreptavidina marcada con enzima, que, como
se mencionó anteriormente, se une muy estrecha y específicamente a la biotina
por uno de los cuatro sitios reactivos en cada molécula de estreptavidina. La
estreptavidina a menudo está relacionada con la peroxidasa de rábano picante.
En combinación, las interacciones estreptavidina-biotina permiten que múltiples
complejos con enzima se unan y rompan el sustrato.
IgM antihumano unido a placa.
Se agregó suero del paciente.
IgM capturada en el suero del paciente.
EE EE
Etiquetado con enzimas Sustrato enzimático
específico de antígeno se convierte en producto.
segundo anticuerpo
adicional.
 CAPÍTULO 10 Inmunodiagnóstico de enfermedades infecciosas
Inmunoensayos unidos a membranas
Las características de flujo continuo y gran área de superficie de la nitrocelulosa,
el nailon y otras membranas mejoran la velocidad y la sensibilidad de las
reacciones de EIA. Las mejoras asociadas con los EIA unidos a la membrana son
en gran parte el resultado de la inmovilización del anticuerpo sobre la superficie
de las membranas porosas. Esta modificación utiliza un casete de plástico
desechable que consta de la membrana unida al anticuerpo y una pequeña
cámara a la que se puede agregar la muestra clínica que contiene el antígeno (
Figura 10.22). Se coloca un material absorbente debajo de la membrana para
tirar, o absorber, los reactivos líquidos a través de la membrana; esto ayuda a
separar los componentes que no han reaccionado de los complejos antígeno-
anticuerpo de interés que están unidos a la membrana y simplifica los pasos de
lavado. Los tiempos de incubación también disminuyen porque la tasa de unión
del antígeno es proporcional a su concentración en la solución cerca de la
HIGO. 10.22TestPack Strep A componentes del kit de la prueba de
inmunoensayo enzimático unido a membrana (EIA) para el antígeno
polisacárido estreptocócico del grupo A. (Cortesía de Inverness Medical
Professional Diagnostics – BioStar, Louisville, CO.)
A B
HIGO. 10.23Dispositivos PAC en color que muestran negativo (A) y positivo (B) reacciones de inmunoensayo
enzimático unido a membrana (EIA) potenciado con liposomas para el antígeno polisacárido estreptocócico del
grupo A. (Cortesía y Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD.)
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209
superficie de la membrana; esta acción aumenta la velocidad y el alcance
de la unión. Las pruebas de EIA unidas a membrana se utilizan
comúnmente para la detección rápida de rotavirus, RSV, virus de influenza
A y B,C. difficile toxinas y estreptococos del grupo A (GAS) (Figura 10.23).
Inmunoensayos de flujo lateral, también llamados pruebas
inmunocromatográficas (TIC), se basan en un principio similar. Este ensayo
se puede utilizar para detectar anticuerpos o antígenos. Para detectar
antígeno en una muestra clínica, se aplica en una línea un anticuerpo de
captura con especificidad para el antígeno en cuestión (llamadomuestra o
línea de prueba) sobre la membrana. Más allá de la línea de prueba, se
adjunta una línea de anticuerpo anti-conejo (línea de control). Debajo de la
línea de prueba en la membrana hay un anticuerpo de conejo con
especificidad para el antígeno en cuestión marcado con un tinte u oro
coloidal. La muestra clínica se coloca en un diluyente tampón y la muestra
procesada se agrega a la membrana. El tampón se transporta lateralmente
a lo largo de la membrana por acción capilar. El anticuerpo de conejo
marcado se suspende en el tampón y, si el antígeno está presente en la
muestra clínica, forma un complejo con el anticuerpo marcado.
A medida que el tampón continúa migrando, el complejo antígeno-
anticuerpo se une al anticuerpo de captura fijado a la membrana. Suficiente
complejo se une para formar un color visible en la línea de prueba. La línea de
control es un control interno que debe ser positivo para que los resultados sean
válidos. La línea de control captura cualquier anticuerpo de conejo marcado y es
positiva en muestras con o sin el antígeno. La línea de control asegura que el
búfer haya migrado más allá de la línea de prueba y confirma un resultado de
prueba negativo.
En un ensayo de ICT para detectar anticuerpos, como anti-VIH (Ora-
Quick; OraSure Technologies, Bethlehem, PA), la proteína A estafilocócica,
marcada con oro coloidal, en el kit se une a la porción Fc de IgG con
cualquier especificidad en el espécimen clínico. El complejo se lleva a la
línea de prueba, que contiene antígenos del VIH. Si el anticuerpo anti-VIH
está presente en la muestra clínica, se une a los antígenos y aparece una
línea roja. La línea de control contiene un anticuerpo antihumano que se
une a moléculas de IgG no específicas para el antígeno del VIH presente en
la muestra, produciendo una línea roja (Figura 10.24). Debido a su facilidad
de uso y control integrado, los ensayos de TIC se han vuelto populares en
los consultorios médicos. Hay kits disponibles para detectar numerosas
sustancias, como drogas, y se utilizan como pruebas de campo en la
ciencia forense.
210 PARTE 1 Introducción a la microbiología clínica

Inmunoensayos ópticos
El inmunoensayo óptico (OIA) se basa en la interacción de complejos de
antigeanticuerpos en superficies inertes. La interacción específica antígeno-
anticuerpo altera el grosor de los reactivos en la superficie de prueba. La luz que
se refleja en la película de la superficie que contiene anticuerpos solo se
considera de un color. Sin embargo, cuando el antígeno específico se une al
anticuerpo, aumenta el grosor de la película. Esto aumentó
El grosor hace que la superficie tenga un color diferente a simple vista. Hay
un OIA disponible para detectar GAS en poblaciones pediátricas (Figura
10.25). La Administración de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos
(FDA) también ha aprobado una OIA para la detección del virus de la
influenza A. Una prueba en el punto de atención paraNeisseria
gonorrhoeae(BioStar; Alere) reaccionó positivamente con el 99,4% de N.
gonorrhoeaeaislamientos y fue negativo con 88,7% de no gonocócicas
Neisseriaaislamientos.

Prueba de fijación del complemento

HIGO. 10,24 Prueba inmunocromatográfica. La prueba OraQuick
es un ensayo rápido para la detección de anticuerpos contra el virus de
inmunodeficiencia humana (VIH) tipos 1 y 2. La formación de una línea roja en el
área de prueba es una reacción positiva.
Las pruebas de FQ son ensayos versátiles que se pueden utilizar para la
detección de anticuerpos y antígenos. Son ampliamente aplicables para varios
agentes infecciosos y se han utilizado durante muchos años, particularmente
para la detección de anticuerpos. Las pruebas de FQ han sido reemplazadas
gradualmente por pruebas más rápidas y sensibles; sin embargo, todavía se
utilizan en laboratorios de referencia y de salud pública para ciertos agentes.
Aunque una discusión sobre el sistema de proteínas del complemento sérico
está más allá del alcance de este capítulo (ver Capitulo 2), el sistema juega un
papel vital en muchas funciones inmunológicas. Las proteínas implicadas en el
sistema del complemento suelen encontrarse en forma inactiva; sin embargo,
una vez activadas, las proteínas se involucran en una cascada enzimática que
involucra la producción de proteínas con diversas actividades biológicas. La
activación del complemento se produce por la vía clásica cuando el anticuerpo
IgG o IgM específico se combina con el antígeno y expone un sitio de unión al
complemento en la molécula de anticuerpo. Es la capacidad de lisis celular de los
componentes activados del complemento lo que es importante en las pruebas
de FQ.
La prueba de CF requiere tanto un sistema de indicadores como un sistema
de prueba (Figura 10.26). El sistema indicador consiste típicamente en una
combinación de eritrocitos de oveja, anticuerpo de conejo contra eritrocitos de
oveja y complemento de cobaya. Cuando estos tres componentes están
presentes y activos, el anticuerpo de conejo se combina primero con los
eritrocitos de oveja y, posteriormente, el complemento se une (fija) al complejo
anticuerpo-antígeno, lo que da como resultado la activación del complemento
por la vía clásica; esto da como resultado la lisis de los eritrocitos de oveja. El
sistema de prueba consiste en una mezcla de antígeno conocido y suero
inactivado por calor de un paciente que puede

A B
HIGO. 10.25Inmunoensayo óptico (OIA) para estreptococos del grupo A (GAS). A, Principio de Biostar OIA Strep Una
prueba que muestra un cambio de color de dorado a púrpura después de la unión del complejo inmune que
contiene el antígeno estreptocócico del grupo A. B, Cassettes de prueba que muestran una reacción positiva a la
izquierda y una reacción negativa a la derecha. (Cortesía de Inverness Medical Professional Diagnostics – BioStar,
Louisville, CO.)

ERRNVPHGLFRVRUJ
 CAPÍTULO 10 Inmunodiagnóstico de enfermedades infecciosas
Prueba del sistema 1 Prueba del sistema 2
Suero de paciente no inmune Suero de paciente inmune
(anticuerpo específico no regalo) (anticuerpo específico presente)
Prueba de antígeno + complemento Prueba de antígeno + complemento
Complemento no reparado Complemento fijo
Sistema indicador
RBC de oveja
Complemento de conejillo de indias (del sistema de prueba)
Hemolisina de conejo (anticuerpo contra los glóbulos rojos)
Hemólisis Sin hemólisis
Prueba de anticuerpos de FQ negativa Prueba de anticuerpos de FQ positiva
HIGO. 10.26Principios de la prueba de fijación del complemento (FC). Glóbulos rojos,Las
células rojas de la sangre.
o puede que no contenga un anticuerpo específico contra el antígeno. Es necesario
calentar la muestra del paciente para inactivar el complemento presente en el suero
humano.
La prueba de CF se realiza como un procedimiento de dos pasos. El suero del
paciente se diluye en serie en tubos de ensayo y cada dilución se mezcla con una
cantidad conocida de antígeno (sistema de prueba). Se agrega una cantidad fija
de complemento a cada tubo y se incuba la mezcla. A continuación, se añaden
los eritrocitos de oveja y el anticuerpo de conejo (sistema indicador) a cada tubo,
y los tubos se incuban nuevamente. Si el suero del paciente tuviera anticuerpos
específicos contra el antígeno de prueba, el sistema de prueba fijaría el
complemento y no estaría disponible para lisar los eritrocitos. Si el suero del
paciente no tuviera un anticuerpo específico contra el antígeno de prueba, el
sistema indicador fijaría el complemento, lo que provocaría la lisis de los
eritrocitos. El título de anticuerpos de la FQ se considera la dilución más alta del
suero del paciente que da como resultado una hemólisis del 100%. Suele leerse
espectrofotométricamente.
Western Blot
Aunque los métodos de prueba serológica para detectar
anticuerpos, como los ensayos de IFA y los EIA, proporcionan
una sensibilidad y especificidad excelentes en la mayoría de
las aplicaciones clínicas, tienen una capacidad limitada para
resolver la respuesta de anticuerpos compleja que se produce
durante la infección por la mayoría de los agentes infecciosos.
Debido a que la mayoría de los antígenos usados en estos
ensayos son extractos microbianos y virales en bruto, un
resultado positivo puede representar una respuesta de
anticuerpos a uno o muchos antígenos. La prueba de EIA
puede diseñarse para detectar anticuerpos contra numerosos
antígenos individuales, pero esto requiere el proceso costoso
y laborioso de purificar antígenos y ejecutar múltiples EIA.
Como alternativa, se utiliza la técnica de Western blot.
La inmunotransferencia se ha utilizado para confirmar los anticuerpos contra el
virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) en pacientes cuyos sueros han
reaccionado repetidamente en las pruebas de EIA. Sin embargo, se ha demostrado que
el uso de Western blot para la confirmación de la reacción inicial
ERRNVPHGLFRVRUJ
211
HIGO. 10.27Western blot para la detección de anticuerpos frente al VIH-1.
Las tiras 1 y 4 son tiras positivas altas; las tiras 2 y 5 son positivas bajas; las
tiras 3 y 6 son controles negativos. Las tiras 7 a 13 y la tira 16 son
reacciones positivas de los sueros de los pacientes. Las tiras 14 y 15 son
reacciones negativas de los sueros de pacientes. Gp160 representa una
glicoproteína viral con un peso molecular de 160.000 Da; gp41 y p24
representan otras proteínas virales. (Cortesía de bioMérieux, Durham, NC.)
Los resultados de los inmunoensayos pueden producir resultados falsos negativos o
indeterminados en las primeras etapas del curso de la infección por VIH. El Western blot
todavía se considera una prueba de confirmación que se realiza solo después de una prueba de
detección positiva para el diagnóstico de la enfermedad de Lyme.
En el procedimiento de transferencia Western, se calienta primero una
preparación de antígeno en bruto (por ejemplo, una preparación de virus
parcialmente purificada) con un detergente como dodecilsulfato de sodio
(SDS). El SDS libera polipéptidos individuales de proteínas complejas. Los
polipéptidos se separan según su peso molecular mediante electroforesis
en gel de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE). Los polipéptidos separados
forman "bandas" de proteínas invisibles en el gel. Las bandas de proteína
se transfieren a un soporte de membrana de filtro inerte, generalmente de
nitrocelulosa. La membrana de nitrocelulosa se convierte en una matriz
sólida a la que se adhieren firmemente los antígenos proteicos separados
y sobre la cual puede ocurrir y visualizarse una reacción anticuerpo-
antígeno, similar a una placa de microvaloración con un ELISA.
Muchos kits comerciales para transferencia Western contienen tiras de
membranas de nitrocelulosa en las que los antígenos proteicos de interés
ya se han separado electroforéticamente. Para el análisis, la membrana de
nitrocelulosa se sumerge en la muestra de suero de un paciente
(generalmente diluida) y se deja incubar. Los anticuerpos específicos en la
muestra, si están presentes, se unen a epítopos únicos en las bandas de
proteínas. Después de la incubación, la membrana de nitrocelulosa se lava
a fondo para eliminar el anticuerpo no unido y se deja que una
inmunoglobulina antihumana marcada (anticuerpo secundario) reaccione
con la membrana. El anticuerpo secundario comúnmente se marca con
una enzima o biotina. La visualización de una reacción antígeno-anticuerpo
en cualquier banda de proteína se logra mediante la adición de sustrato
enzimático (o estreptavidina marcada con enzima seguida de sustrato
enzimático) y un lavado final (Figura 10.27).
La inmunotransferencia ha añadido una dimensión de versatilidad y
especificidad a los inmunoensayos. Ha ayudado a resolver falsos positivos
212 PARTE 1 Introducción a la microbiología clínica
Resultados de EIA debido a la reacción cruzada de anticuerpos con otros agentes
infecciosos, trastornos autoinmunes y errores técnicos. También ha ayudado a
diseccionar y analizar la respuesta de anticuerpos a proteínas individuales en
mezclas complejas. La inmunotransferencia es un procedimiento que debe ser
bien controlado e interpretado con criterios estrictos. Es posible que los
anticuerpos detectados por otros métodos no se detecten mediante técnicas de
transferencia Western porque los antígenos polipeptídicos utilizados no son
proteínas nativas intactas (el tratamiento con SDS desnaturaliza las proteínas) y
es posible que algunos antígenos no se transfieran a las membranas. La
inmunotransferencia es un ensayo cualitativo; no se pueden determinar los
títulos de anticuerpos. A pesar de estos inconvenientes, se espera que la
transferencia Western siga desempeñando un papel importante en la
inmunoserología de agentes infecciosos seleccionados.
Dot Blot
Los dot blots son como los Western blots, excepto que los antígenos proteicos
no se separan electroforéticamente ni se transfieren a una superficie sólida. En
cambio, las proteínas se purifican y se aplican directamente (se transfieren) a
lugares específicos de la superficie sólida. Un ejemplo es Immuno-DOT Borrelia
para la enfermedad de Lyme (GenBio, San Diego, CA). El antígeno borrelial
completo, utilizado para detectar anticuerpos, y cuatro proteínas purificadas o
recombinantes (para especificidad) se aplican a una tira de filtro de nitrocelulosa
junto con un control positivo. Se agrega suero del paciente a la tira y, si hay
anticuerpos contra alguna de las proteínas, se unen. Se agrega un anticuerpo
antihumano marcado con enzima, seguido del sustrato de la enzima para
detectar la unión del anticuerpo del paciente. Las tiras se leen manualmente.
Otros inmunoensayos etiquetados
Además de las enzimas y los fluorocromos, se pueden utilizar otros
marcadores para detectar reacciones antígeno-anticuerpo in vitro, que
incluyen radioinmunoensayo (RIA) y inmunoensayo quimioluminiscente
(CLIA). Los principios son similares a los de EIA, excepto que se usa una
etiqueta que no es una enzima. Los radionucleótidos (generalmente yodo
125 o carbono 14) se sustituyen por enzimas en RIA. Aunque RIA fue una
vez el método clave para la detección de antígenos de numerosos agentes
infecciosos, especialmente el VHB, ha sido reemplazado en gran medida
por EIA, que no requiere el uso de sustancias radiactivas. La CLIA utiliza
sustancias químicas, como luminol, ésteres de acridio y derivados de
rutenio, que emiten luz. Se requiere un luminómetro para leer CLIA.
Uso de pruebas serológicas en
enfermedades específicas
A medida que mejoraron la sensibilidad, la especificidad y la facilidad de uso, las
pruebas serológicas se convirtieron en un pilar de los laboratorios clínicos. Los
fabricantes producen kits para analizar un gran número de muestras y kits para
confirmar resultados positivos o negativos. Las pruebas de detección están diseñadas
para detectar una gran cantidad de personas que padecen una enfermedad en
particular. Sin embargo, debido a la alta sensibilidad, estas pruebas son propensas a
resultados falsos positivos. Las pruebas de detección positivas deben confirmarse con
una prueba de confirmación más específica. Además, algunos kits son de un solo uso,
diseñados para un volumen de prueba bajo, mientras que otros kits se prestan para
pruebas de gran volumen y pueden automatizarse. VerCuadro 10.1 para obtener listas
de pruebas serológicas de uso común y disponibles comercialmente para detectar
anticuerpos y los organismos identificados. Esta sección analiza las enfermedades
importantes diagnosticadas mediante la detección de anticuerpos. La siguiente sección
examina la detección directa de antígenos en el diagnóstico de enfermedades
infecciosas.
ERRNVPHGLFRVRUJ
Pruebas serológicas de la sífilis
Las enfermedades de transmisión sexual (ETS) se encuentran entre las
enfermedades infecciosas más comunes en los Estados Unidos. Las más
comunes de estas enfermedades son las verrugas genitales, la clamidia y el
herpes genital; sin embargo, la sífilis es una de las más peligrosas si no se trata.
T. pallidum subsp. pallidum, la espiroqueta que causa la sífilis, se puede
identificar a partir de una lesión o chancro. Sin embargo, las pruebas serológicas
para la sífilis son el método de diagnóstico más común. Existen dos formas de
prueba para la sífilis: pruebas de detección y pruebas confirmatorias. Las
pruebas de confirmación utilizan antígenos treponémicos y son muy sensibles y
específicas, pero no son adecuadas para realizar pruebas a un gran número de
individuos (detección) porque son técnicamente exigentes y requieren mucho
tiempo, y al igual que otras pruebas de diagnóstico, darían lugar a una
disminución del diagnóstico. precisión si se aplica a una gran población con una
enfermedad de baja prevalencia. Aproximadamente el 1% de la población daría
un resultado falso positivo. Las pruebas de confirmación tampoco se pueden
utilizar para controlar la terapia. Ejemplos de ensayos de confirmación son la
prueba FTA-ABS, el Serodia TP-PA (T. pallidum aglutinación de partículas)
(Fujirebio America, Fairfield, NJ) y el ensayo de microhemaglutinación para T.
pallidumprueba. En esta prueba, los anticuerpos treponémicos específicos se
detectan utilizando eritrocitos recubiertos con antígeno treponémico. Debido a
la facilidad de uso, menos tiempo técnico y la falta de un paso de absorción y
microscopio fluorescente, elT. pallidum La prueba de aglutinación de partículas
es probablemente el ensayo de confirmación más utilizado.
Las pruebas de antígenos no treponémicos son técnicamente más
fáciles y rápidas de realizar, y son las pruebas de elección para el
cribado de la sífilis. Las pruebas no treponémicas más utilizadas en la
actualidad son el Laboratorio de Investigación de Enfermedades
Venéreas (VDRL) y las pruebas de reagina plasmática rápida (RPR). La
prueba VDRL, que lleva el nombre del laboratorio que la desarrolló, es
una prueba de floculación microscópica que utiliza suero inactivado
por calor y se realiza en portaobjetos de vidrio. La prueba detecta
anticuerpos reagínicos (reagina) que se unen a una solución
alcohólica de partículas de cardiolipina-lecitina-colesterol. Durante la
infección, estos compuestos se liberan de las células huésped
dañadas, lo que hace que los anticuerpos se dirijan contra ellos.
Debido a que se utilizan antígenos no treponémicos, la prueba es
menos específica que los ensayos que utilizan antígenos
treponémicos. Los falsos positivos se han asociado con el embarazo.
La prueba RPR usa el mismo antígeno que la prueba VDRL; sin embargo, se
han añadido partículas de carbono para que la reacción de floculación se pueda
ver más claramente. El ensayo RPR se puede realizar en suero o plasma sin
calentar y se lee macroscópicamente (Figura 10.28). Las pruebas VDRL y RPR
detectan tanto IgM como IgG y pueden realizarse tanto como pruebas
cualitativas como cuantitativas. Debido a la extrema atención a la preparación de
los reactivos y al control de calidad requerido y la dificultad para leer los
resultados, la prueba VDRL ha sido reemplazada por la prueba RPR en la mayoría
de los laboratorios clínicos. Sin embargo, el ensayo VDRL se puede utilizar para
analizar el LCR para el diagnóstico de neurosífilis y para seguir los títulos de
anticuerpos en un recién nacido para diagnosticar la sífilis congénita.
Pruebas serológicas para
Infecciones estreptocócicas
Streptococcus pyogenes, o GAS, causa muchas infecciones piógenas
comunes (asociadas con pus o respuesta de neutrófilos) agudas,
incluyendo faringitis e infecciones de la piel. Además, el organismo
 CAPÍTULO 10 Inmunodiagnóstico de enfermedades infecciosas
HIGO. 10.28Prueba rápida de tarjeta de reagina plasmática (RPR) para la detección de anticuerpos no treponémicos.
(Cortesía de Baxter US Distribution, División de Baxter Healthcare, Deerfield, IL.)
es responsable de ciertas enfermedades no supurativas (no piogénicas), como la
fiebre reumática aguda y la glomerulonefritis posestreptocócica, que ocurren
semanas después del proceso infeccioso agudo y se cree que son enfermedades
autoinmunes; es decir, el daño se debe a la respuesta inmunitaria del huésped.
Aunque las infecciones piógenas se diagnostican mejor mediante el aislamiento
del organismo en cultivo, las enfermedades no supurativas se producen en un
momento en que el organismo ya no puede estar presente; por lo tanto,
generalmente se realiza el diagnóstico serológico. Además, puede ser necesario
diagnosticar infecciones mediante serología después de que se haya iniciado la
terapia antimicrobiana.
La prueba de anticuerpos ASO se utiliza para demostrar la respuesta
serológica a S. pyogenes. Un método para detectar ASO es medir la
capacidad del suero del paciente para neutralizar la capacidad de lisis de
eritrocitos (hemolítica) de la enzima estreptocócica (estreptolisina O). El
suero del paciente se mezcla con una concentración estándar de
estreptolisina O. Si el anticuerpo contra la estreptolisina O está presente,
se une a la hemolisina neutralizándolo. Cuando se agregan glóbulos rojos
(glóbulos rojos), los glóbulos rojos no se lisan. Si el anticuerpo contra la
estreptolisina O no está presente en la muestra de suero, la hemolisina no
se neutraliza y los glóbulos rojos se lisan.
Los títulos de anticuerpos se basan en la comparación de la muestra del paciente
con estándares conocidos. Los títulos de anticuerpos se informan como unidades de
Todd, que recibieron el nombre de EW Todd, quien descubrió las estreptolisinas. Un
aumento de cuatro veces en el título se considera diagnóstico de unaS. pyogenes
infección. Se desarrollan títulos altos de anticuerpos ASO en aproximadamente 85% de
los casos de fiebre reumática, pero los títulos y porcentajes de pacientes con
infecciones de heridas estreptocócicas y glomerulonefritis posestreptocócica que
desarrollan anticuerpos ASO son significativamente más bajos. Las pruebas serológicas
para detectar anticuerpos contra otros antígenos estreptocócicos también están
disponibles y se analizan enCapítulo 15.
Diagnóstico serológico de enfermedades virales
Rubéola
La rubéola normalmente es insignificante, excepto en mujeres embarazadas. Esta
enfermedad puede causar un aborto espontáneo o puede causar cardiopatía
congénita, cataratas, sordera o daño cerebral en el feto. Es extremadamente
importante determinar si las mujeres que pueden quedar embarazadas tienen
inmunidad a la rubéola. Las pruebas serológicas generalmente se realizan mediante
EIA para detectar anticuerpos antirrubella IgM o IgG. Mujeres qué
ERRNVPHGLFRVRUJ
213
no son inmunes o tienen un título bajo de anticuerpos deben vacunarse antes de
quedar embarazada. La vacuna contra la rubéola es parte de la vacuna trivalente
contra el sarampión, las paperas y la rubéola que reciben la mayoría de los niños
en los países desarrollados.
Mononucleosis infecciosa
El título de anticuerpos heterófilos es una de las pruebas que se utilizan para
diagnosticar la mononucleosis infecciosa causada por el VEB. El término
anticuerpo heterófilo se refiere a un anticuerpo con afinidad por un antígeno de
más de un grupo o especie. Los seres humanos rara vez tienen anticuerpos
contra los glóbulos rojos de las ovejas. Sin embargo, se ha demostrado que
muchos pacientes con mononucleosis infecciosa desarrollan anticuerpos que
aglutinan glóbulos rojos de ovejas, bovinos y equinos. Hay disponibles kits de
diagnóstico comerciales para ayudar a diagnosticar la mononucleosis infecciosa.
Estos kits se conocen generalmente comopruebas puntuales y algunos usan una
suspensión salina de antígeno derivado de los glóbulos rojos de los caballos, por
ejemplo, BBL MonoSlide mencionado anteriormente en este capítulo. Si el
paciente tiene mononucleosis infecciosa, la mezcla del reactivo de prueba con
una gota del suero del paciente provoca hemaglutinación. Algunos kits de
diagnóstico colocan antígenos del VEB en partículas portadoras: glóbulos rojos o
perlas de látex. Mediante estos métodos se pueden identificar los anticuerpos
IgM o IgG. Estas pruebas son rápidas y sensibles para la detección; sin embargo,
no identifican positivamente la infección por VEB. Dado que no se utilizan
antígenos del VEB, otros factores pueden aumentar los títulos de anticuerpos
heterófilos; por lo tanto, la prueba no es específica. A menudo se necesitan otras
pruebas, como los anticuerpos contra el antígeno de la cápside viral y el
antígeno nuclear de Epstein-Barr, para confirmar la mononucleosis infecciosa
activa.
Hepatitis
La hepatitis se refiere a la inflamación del hígado. Muchos productos químicos y
agentes infecciosos pueden causar hepatitis; sin embargo, la mayoría de los
casos de hepatitis tienen una etiología viral. Mientras que varios virus diferentes
se han relacionado con la hepatitis, el virus de la hepatitis A (VHA), el VHB y el
VHC son las causas más comunes. Debido a la extrema dificultad de aislar los
virus que causan hepatitis, los ensayos serológicos son muy importantes para el
diagnóstico de hepatitis viral.
Numerosos marcadores serológicos del VHB, tanto anticuerpos como antígenos,
están presentes en el suero de los pacientes. Los ensayos serológicos a menudo son
214 PARTE 1 Introducción a la microbiología clínica
realizado como perfil o batería de pruebas. Uno de los primeros
marcadores detectados en las infecciones es el antígeno de superficie de la
hepatitis B (HBsAg). Aunque el virus tiene numerosos antígenos, el HBsAg
es muy antigénico y fácil de detectar. Los ensayos de antígenos adicionales
incluyen la detección del antígeno central de la hepatitis B (HBcAg) y el
antígeno e de la hepatitis B (HBeAg). La detección de HBsAg en el suero de
un paciente significa que el paciente está enfermo con la enfermedad o es
portador y es potencialmente infeccioso. El laboratorio también puede
realizar pruebas de anticuerpos contra varios antígenos: anticuerpo anti-
HBsAg, anticuerpo anti-HBcAg y anticuerpo anti-HBeAg. La presencia de
anti-HBsAg indica inmunidad. Una discusión más detallada de la serología
del VHB se encuentra enCapítulo 29. El VHB se transmite en la sangre
humana y las unidades de sangre se analizan para detectar este virus para
reducir el riesgo de hepatitis postransfusional.
Las pruebas más utilizadas para el diagnóstico de la infección por VHA son
anti-VHA-IgM y anti-VHA-IgG. Una prueba de IgM anti-VHA positiva sugiere una
infección aguda, mientras que una prueba de IgG anti-VHA positiva es indicativa
de exposición pasada. En la década de 1980, se clonó un gen asociado con una
proteína del VHC. Esta proteína se utilizó para desarrollar una prueba para
detectar anticuerpos contra el VHC en la sangre. Esta fue la primera vez que se
utilizó un genoma viral para desarrollar una prueba serológica sin aislar primero
el agente causante. La investigación determinó que el agente principal en la
hepatitis por transfusión no A y no B es el VHC. En 1990, la FDA aprobó los
primeros kits de prueba para la detección del VHC. Debido a que el VHC también
se encuentra en la sangre humana, las unidades de sangre se examinan para
detectar el VHC con ensayos multiantígenos que detectan anticuerpos y con
pruebas de amplificación de ácidos nucleicos (verCapítulo 11).
Verificación de caso 10.1
Sobre la base de la presentación clínica de la patente y las pruebas de laboratorio
preliminares en el caso en cuestión al comienzo del capítulo, el médico sospechaba de
infección por VIH. Los laboratorios generalmente detectan anticuerpos anti-VIH con un
EIA. Sin embargo, todos los resultados reactivos (positivos) deben confirmarse
mediante una prueba serológica adicional.
Virus de inmunodeficiencia humana
Actualmente, los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades
recomiendan que los laboratorios realicen pruebas iniciales para el VIH con un
inmunoensayo de combinación de antígeno / anticuerpo que detecta los
anticuerpos del VIH-1 y VIH-2 y el antígeno p24 del VIH-1. No se requieren
pruebas adicionales para muestras no reactivas. Los métodos disponibles
comercialmente se basan en EIA e inmunoensayo quimioluminiscente. Debido a
que el desarrollo de anticuerpos en la infección por VIH tiene una amplia
variación según el paciente, la dosis infecciosa y el fenotipo del virus, la
seroconversión se produce en un promedio de 45 días después de la infección.
Por esta razón, es necesario analizar las proteínas específicas del VIH
(antígenos), como p24, una proteína central, o gp41, una glicoproteína en la
envoltura del virus. Kits de cribado que detectan tanto anticuerpos como
antígenos, denominadospruebas de cuarta generación, son algunas de las
pruebas de detección más sensibles.
Las muestras con un resultado de inmunoensayo de combinación de
antígeno / anticuerpo reactivo o con reactividad repetida deben analizarse con
un inmunoensayo complementario que diferencie los anticuerpos del VIH-1 de
los anticuerpos del VIH-2 para su confirmación. Los métodos de ensayo
complementarios incluyen Western blot, ensayo de inmunofluorescencia
indirecta, ensayo de ARN de VIH-1 cualitativo y ensayo de diferenciación de
anticuerpos de VIH-1 / VIH-2. El Western blot y el inmunofluorescente indirecto
ERRNVPHGLFRVRUJ
Los ensayos detectan las infecciones por VIH-1 más tarde que otros métodos de
ensayo y, por lo tanto, pueden producir resultados falsos negativos o
indeterminados. El Western blot del VIH-1 también ha demostrado reactividad
cruzada con el VIH-2. Por estas razones, el Western blot como prueba de
confirmación de la infección por VIH está cayendo en desuso. Las muestras
reactivas en el inmunoensayo de combinación inicial de antígeno / anticuerpo y
no reactivas o indeterminadas en los inmunoensayos de anticuerpos
individuales del VIH-1 / VIH-2 deben analizarse con una prueba de amplificación
de ácido nucleico del VIH-1. Los ensayos varían en su sensibilidad, especificidad y
utilidad diagnóstica y deben probarse individualmente antes de su uso en un
laboratorio clínico.
Verificación de caso 10,2
En el caso en cuestión, la prueba de detección del paciente para anticuerpos anti-VIH
fue reactiva. Antes de que se pueda suponer un diagnóstico de infección por VIH, se
debe realizar una segunda prueba de confirmación. Anteriormente, el ensayo de
Western blot era la prueba de confirmación más utilizada. Actualmente, se
recomiendan el ensayo de inmunofluorescencia indirecta, el ensayo cualitativo de ARN
del VIH-1 o el ensayo de diferenciación de anticuerpos del VIH-1 / VIH-2.
Diagnóstico serológico de
Infecciones por hongos
Los laboratorios clínicos han utilizado varios métodos para identificar
anticuerpos en pacientes inmunocompetentes en respuesta a enfermedades
fúngicas. Los métodos de ensayo más comúnmente utilizados en la actualidad
incluyen EIA, CF, inmunodifusión e inmunoensayo de enzimas fluorescentes. Las
principales enfermedades fúngicas diagnosticadas por estos medios son la
histoplasmosis y la coccidioidomicosis. La histoplasmosis se encuentra
principalmente en el valle de Ohio y la coccidioidomicosis o fiebre del valle se
observa principalmente en el valle de San Joaquín de California. Un título de
hongos no es suficiente para ser diagnóstico porque las personas que viven en
un área endémica pueden tener pruebas serológicas positivas por exposiciones
pasadas. Un aumento de cuatro veces en el título es evidencia de una infección
actual. Un historial de viaje es obligatorio cuando se sospecha una enfermedad
fúngica.
El ensayo de inmunodifusión para el diagnóstico de coccidioidomicosis detecta
principalmente IgM, mientras que la prueba de CF detecta IgG frente a un antígeno
diferente. Ahora hay disponible un ELISA que detecta tanto IgM como IgG. El
anticuerpo IgM se detecta alrededor de la tercera semana después de la infección,
luego el título disminuye rápidamente. El anticuerpo IgG se detecta en
aproximadamente el 50% de los pacientes infectados en aproximadamente 1 mes. Se
ha demostrado que la prueba tiene una mayor sensibilidad, pero existe preocupación
sobre la especificidad de la prueba. Se ha sugerido que la EIA se utilice como prueba de
detección y que cualquier resultado positivo se confirme mediante un método
diferente.
Las pruebas de inmunodifusión y FQ también se han utilizado ampliamente
para detectar anticuerpos durante la histoplasmosis. Aproximadamente el 80%
de los pacientes tendrán una prueba de inmunodifusión positiva y hasta el 95%
serán positivos por FQ. Sin embargo, la prueba de FQ es menos específica
debido a la reactividad cruzada con aspergilosis, blastomicosis, tuberculosis y
otras infecciones.
Ensayos de detección directa de antígenos
Los ensayos de detección de antígenos pueden proporcionar un diagnóstico rápido de agentes
infecciosos, especialmente para aquellos que son difíciles o imposibles de cultivar.Cuadro 10.4
enumera algunas enfermedades infecciosas que se pueden diagnosticar
 CAPÍTULO 10 Inmunodiagnóstico de enfermedades infecciosas 215

pared celular del organismo. Esta extracción se logra más comúnmente

MESA 10,4 Enfermedades infecciosas representativas y exponiendo la muestra a ácido nitroso, pero se puede lograr mediante
Métodos de detección directa de antígenos digestión enzimática (pronasa). Cuando se ha ajustado el pH de la
disponibles comercialmente para detectarlos preparación de antígeno solubilizado en una solución tampón, la muestra
se analiza de acuerdo con el procedimiento específico del fabricante. Las
Tipo de infeccion Métodos de prueba pruebas de EIA se han vuelto populares, particularmente aquellas que
usan anticuerpos unidos a la membrana para acelerar la reacción y facilitar
Bacteriano
el procedimiento de lavado. Debido al producto de color, generalmente
Faringitis estreptocócica del grupo A LA, EIA, ICT, mejorado con liposomas
inmunoensayo, OIA son más fáciles de leer que las pruebas de LA. Una variación del EIA unido
Clostridium difficile colitis LA, EIA a la membrana para GAS utiliza liposomas coloreados llenos de colorante
tos ferina FA unidos al anticuerpo como reactivo de detección. Como se mencionó
Legionelosis FA, TIC anteriormente, una OIA altamente sensible y específica está disponible
Hongos comercialmente. Estas pruebas rápidas no son tan sensibles como la
Meningitis criptocócica ICT, LA, EIA cultura, que sigue siendo el método de referencia. Las pruebas rápidas

Parásito negativas en niños y adolescentes deben confirmarse mediante cultivo.

Giardiasis FA, EIA, TIC
Criptosporidiosis FA, EIA, TIC
Neumonía por Pneumocystis FA
Trichomonas vaginitis FA
Viral
Gastroenteritis por rotavirus LA, EIA
Infección por hepatitis B EIA
Infección por virus respiratorioa EIA, FA
Infección por virus del herpes simple EIA, FA
Infección por citomegalovirus Infección FA
por VIH EIA
aIncluye virus de influenza, parainfluenza y sincitial respiratorio.EIA,
Inmunoensayo enzimático; FA, prueba de anticuerpos fluorescentes; VIH, virus
de inmunodeficiencia humana; TIC, prueba inmunocromatográfica; LA, prueba
de aglutinación de látex; OIA, inmunoensayo óptico.
mediante la detección de antígenos en muestras clínicas. Otras técnicas
desarrolladas por razones similares, como la amplificación de ácidos nucleicos,
se analizan enCapítulo 11. Como con cualquier procedimiento de prueba, todos
los laboratorios deben evaluar las pruebas para sus situaciones.
Faringitis estreptocócica
Una de las aplicaciones más utilizadas de las pruebas de antígenos directos,
popularizada en la década de 1980, es la detección de GAS en muestras de frotis
de garganta para el diagnóstico de faringitis estreptocócica. La principal ventaja
de la prueba rápida de antígenos directos para GAS sobre un cultivo de garganta
estándar es que los resultados están disponibles mientras el paciente está en el
consultorio del médico, lo que permite administrar la terapia antimicrobiana de
inmediato en lugar de esperar de 24 a 48 horas para obtener los resultados del
cultivo. Esta prueba es más conveniente tanto para el médico como para el
paciente. Aunque el tratamiento antimicrobiano es fundamental para la
prevención de síndromes de faringitis posestreptocócica como fiebre reumática
y glomerulonefritis, la administración temprana de antimicrobianos también
puede acortar la enfermedad. Además, el tratamiento temprano puede reducir
las infecciones secundarias a los contactos cercanos, permitir que el paciente
regrese antes al trabajo o la escuela. La razón más importante para diagnosticar
y tratar la faringitis por EGA es prevenir las secuelas no supurativas. La demora
en el inicio de la terapia durante unos días (mientras se esperan los resultados
del cultivo) no aumenta el riesgo del paciente de desarrollar tales
complicaciones.
Más de 20 fabricantes producen kits de pruebas de diagnóstico para la
detección directa de antígenos GAS. La mayoría de estos kits utilizan LA o
EIA. Generalmente, ambos tipos de pruebas contienen reactivos para
realizar una extracción inicial del antígeno de carbohidrato del grupo A del
Infecciones respiratorias virales
Muchos virus respiratorios se pueden detectar directamente tanto en
muestras de las vías respiratorias superiores como inferiores. El uso
de hisopos agrupados para recolectar muestras de las vías
respiratorias superiores aumenta la sensibilidad de estos ensayos. Los
hisopos flocados tienen fibras de nailon cortas y rígidas que se
extienden desde el eje y actúan como un minibrush. El uso de hisopos
flocados mejora la calidad de la muestra recolectada. Técnicas rápidas
para detectar RSV; virus de la influenza A y B; virus de la parainfluenza
1, 2 y 3; y los adenovirus incluyen ensayo inmunofluorescente, ensayo
inmunocromatográfico, EIA e inmunoensayo con tira reactiva. Estos
ensayos pueden usarse para la detección directa o para confirmar el
aislamiento viral en tubos de cultivo celular convencionales o viales de
cubierta. Sin embargo, existe una gran variabilidad en la sensibilidad
y especificidad de las pruebas.
Es de particular importancia la detección directa de RSV por anticuerpo
fluorescente o EIA unido a membrana en muestras nasofaríngeas. Las
pruebas de DFA tienen una sensibilidad informada del 84% al 100% y una
especificidad del 86% al 100%. La detección directa rápida es importante
porque el VSR causa enfermedades graves de las vías respiratorias
inferiores (bronquiolitis y neumonía) en los niños pequeños, que a menudo
requieren hospitalización. Los resultados rápidos pueden ayudar a tomar
decisiones de cohortes sobre el ingreso hospitalario. Además, es difícil
mantener la viabilidad viral durante el transporte y, por lo tanto, puede ser
difícil recuperar el VSR en cultivo.
La influenza es otra infección del tracto respiratorio en la que un
diagnóstico rápido es importante para el tratamiento. Se encuentran
disponibles muchas pruebas directas de antígenos con varios formatos
para detectar los virus de la influenza A o de la influenza A y de la influenza
B. Generalmente, estas pruebas tienen muy buenas sensibilidades y
especificidades, aunque la sensibilidad es menor en adultos. Dos pruebas
de punto de atención exentas de CLIA son la prueba QuickVue Influenza
(Quidel, San Diego, CA) y la FLU OIA (ThermoBioStar, Waltham, MA). Estas
pruebas se pueden realizar en numerosas muestras clínicas, como hisopos
nasales, nasofaríngeos y faríngeos. Las sensibilidades y la especificidad
difieren según la muestra clínica. La prueba QuickVue tiene una
sensibilidad reportada ligeramente menor que la de FLU OIA, aunque tiene
una mayor especificidad.
Meningitis bacterial
Durante muchos años, los laboratorios clínicos han utilizado regularmente pruebas de
detección de antígenos de LCR y otros fluidos corporales para detectar organismos que
causan meningitis bacteriana. Las técnicas han incluido EIA,

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216 PARTE 1 Introducción a la microbiología clínica
coaglutinación y ensayos de LA. Los agentes bacterianos detectados en los
kits disponibles comercialmente incluyenH. influenzae tipo b, Neisseria
meningitidis, Streptococcus pneumoniae, y S. agalactiae (estreptococo del
grupo B). Las sensibilidades de estos ensayos son muy bajas, por lo que ya
no se recomienda su uso rutinario. Una excepción es el Binax NOW
steotococos neumonia Tarjeta de antígeno (Alere). Un estudio encontró
que el ICT fue positivo para 68 (99%) de los 69 casos de meningitis
neumocócica confirmados por cultivo y negativo para 124 (99%) de 125
casos de meningitis confirmados por cultivo causados por otras bacterias.
Los organismos que causan la meningitis a menudo causan
bacteriemia antes de invadir el sistema nervioso central. El organismo y los
antígenos pueden detectarse en el suero antes o al mismo tiempo que se
encuentran en el LCR en los casos de meningitis. Los organismos
circulantes y los antígenos solubles quedan atrapados, degradados y
liberados por las células fagocíticas del hígado y el bazo. Estos productos
se eliminan del cuerpo por filtración en el riñón y se excretan en la orina;
por tanto, la orina puede examinarse para detectar la presencia de
antígeno además del LCR en casos sospechosos de meningitis. La orina
también es útil como muestra de prueba, ya sea sola o además del suero
en casos de bacteriemia e infecciones focales distintas de la meningitis,
como la neumonía causada porLegionella pneumophila.La orina se puede
concentrar mediante ultrafiltración para aumentar la sensibilidad de la
prueba.
La utilidad clínica de las pruebas de antígenos para diagnosticar la
meningitis varía con varios factores, incluido el fabricante del kit, el organismo
específico y el tipo de muestra analizada. En muchos laboratorios clínicos, el uso
de estas pruebas se reserva para requisitos de pruebas de diagnóstico muy
específicos. En la mayoría de las situaciones, la tinción de Gram es lo
suficientemente sensible para detectar meningitis bacteriana. Las tinciones de
Gram o las pruebas de detección de antígenos siempre deben realizarse junto
con el cultivo. Lo más importante es que nunca se debe suspender el
tratamiento antimicrobiano apropiado en espera de los resultados del cultivo en
pacientes con resultados negativos en la prueba de antígenos, en contraste con
la situación con las pruebas de antígenos para GAS. La mayor utilidad clínica de
estas pruebas de antígenos es probablemente analizar muestras de pacientes
que recibieron terapia antimicrobiana antes de la recolección de cultivos y en
quienes la tinción de Gram fue negativa. En esta situación, la probabilidad de
recuperar el organismo en cultivo se reduce drásticamente.
Giardiasis y criptosporidiosis
El método de diagnóstico clásico de óvulos y parásitos (O & P) requiere
extracción química, concentración y examen microscópico de muestras de
heces. Aunque generalmente se considera el método de referencia, estos
métodos son técnicamente exigentes y requieren mucho tiempo y
requieren personal capacitado. En entornos que no incluyen áreas de
endemicidad de parásitos intestinales (p. Ej., Estados Unidos), numerosos
estudios han sugerido que el 95% de todos los parásitos clínicamente
importantes detectados en Estados Unidos son:G. duodenalis o
Cryptosporidium parvum. Se encuentran disponibles varios kits de DFA, EIA
y ICT para detectar antígenos de esos parásitos, así como Entamoeba
histolytica / Entamoeba dispar directamente de las heces. Los ensayos de
DFA se realizan en muestras concentradas, mientras que EIA y ICT no
requieren concentración. Generalmente, los ensayos se pueden realizar en
heces frescas o heces conservadas en formalina del 5% al 10% u otros
conservantes. Estos kits generalmente tienen sensibilidades y
especificidades superiores al 90%. Algunos formatos incluyen un
anticuerpo monoclonal para detectar un organismo; otro
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Los formatos utilizan anticuerpos monoclonales separados para ambos
organismos. Al realizar pruebas mediante ensayos de DFA (consulteFigura 10.14
), la diferencia de tamaño entre estos dos parásitos permite al científico del
laboratorio distinguir visualmente los dos organismos cuando se utilizan ambos
anticuerpos en un procedimiento. Muchos laboratorios ofrecen estas pruebas
para evaluar a la población ambulatoria inmunocompetente.
Un problema con los ensayos de detección de antígenos es que sólo se pueden
detectar dos o tres organismos; otros parásitos intestinales clínicamente significativos
podrían pasarse por alto que podrían haberse detectado con un examen microscópico.
Los algoritmos de prueba generalmente se establecen de modo que solo los pacientes
con antecedentes de viajes o inmunosupresión requieran un examen completo de O &
P cuando la prueba de detección sea negativa. Los ensayos de DFA también se pueden
utilizar para verificar los suministros de agua municipales en busca deG. duodenalis
quistes sin embargo, los ensayos de reacción en cadena de la polimerasa son más
sensibles y, en cambio, se utilizan con mayor frecuencia.
El ImmunoCard STAT!®CGE (Meridian Bioscience, Cincinnati, OH) es
una prueba de TIC para la detección de G. duodenalis,
Cryptosporidium, y E. histolytica. E. histolyticacausa algunas de las
infecciones parasitarias gastrointestinales más graves. E. histolytica
debe diferenciarse de los morfológicamente idénticos pero no
patógenos E. dispar. Se demostró que este ensayo tiene una
sensibilidad y especificidad del 100% para Cryptosporidium. Una
sensibilidad del 83% y el 100% con una especificidad del 100% y el
80% para G. duodenalis, y E. histolytica, respectivamente, se informó.
TechLab (Blacksburg, VA) ofrece una EIAE. histolytica–Kit específico,
Quick Check, que utiliza anticuerpo monoclonal contra la lectina
específica de Gal / GalNAc. Los estudios han encontrado que este
ensayo tiene sensibilidades y especificidades paraG. duodenalis y C.
parvum del 87% al 100%. No detectaE. histolytica.
Verificación de caso 10,3
Aunque la infección por VIH generalmente se diagnostica mediante detección de anticuerpos,
la EIA para el antígeno p24 viral se usa para detectar la replicación viral activa en sangre. Su
mayor valor se encuentra en el diagnóstico de infecciones tempranas, antes de que los
anticuerpos sean detectables, y en neonatos en los que el diagnóstico serológico tiene poco
valor debido a la IgG materna anti-VIH de una madre seropositiva.
Virus de inmunodeficiencia humana
Las pruebas serológicas de cuarta generación para el VIH detectan anticuerpos anti-VIH
y p24, la proteína más abundante de los viriones del VIH. La combinación de la
detección de antígenos con la detección de anticuerpos aumenta la sensibilidad de
diagnosticar a un paciente con infección por VIH. La detección del antígeno p24 se
realiza generalmente mediante captura EIA utilizando un anticuerpo monoclonal. Un
problema con este ensayo ocurre durante la seroconversión. A medida que el paciente
comienza a producir anticuerpos contra el antígeno p24, se pueden formar complejos
inmunes que evitan que el antígeno y el anticuerpo reaccionen con los ensayos in vitro;
esto puede resultar en resultados falsos negativos para los ensayos de detección de
antígenos y anticuerpos.
Otro problema con la detección del antígeno p24 ha sido la baja sensibilidad.
La modificación del procedimiento, como hervir el suero antes de la prueba para
liberar complejos inmunes, ha disminuido el problema. Sin embargo, su
sensibilidad sigue siendo menor que la de las pruebas de amplificación de ácidos
nucleicos. Las unidades de sangre para transfusión generalmente se examinan
para detectar anticuerpos contra el VIH y se realiza una prueba de amplificación
de ácido nucleico para detectar ARN viral.
 CAPÍTULO 10 Inmunodiagnóstico de enfermedades infecciosas 217

muestra. P. jirovecii El cultivo no está ampliamente disponible, lo que hace que los
Infecciones en pacientes ensayos de anticuerpos fluorescentes sean el único método confiable para su detección
inmunodeprimidos en el laboratorio de microbiología clínica.
La detección de anticuerpos en pacientes inmunodeprimidos puede ser
problemática debido a la escasa respuesta inmunitaria en estos pacientes.
Las pruebas de detección directa de antígenos a veces son más valiosas.
Cryptococcus neoformans, CMV y P. jirovecii son patógenos pulmonares
importantes en pacientes con trasplantes, cáncer y SIDA. La criptococosis
es una infección sistémica devastadora que generalmente se limita a
pacientes inmunodeprimidos. La infección ocurre inicialmente en los
pulmones y se disemina rápidamente al cerebro y las meninges. Antes del
advenimiento del SIDA, la infección criptocócica diseminada era rara.
Tradicionalmente, el diagnóstico de meningitis por criptococosis se ha
basado en el cultivo de LCR o la presencia de células de levadura
encapsuladas en preparaciones de LCR con tinta china. La prueba de
antígeno del LCR, realizada por LA, EIA o ICT, es considerablemente más
sensible que el examen directo del LCR con tinta china. Los métodos de
detección de antígenos utilizan anticuerpos policlonales o monoclonales HIGO. 10.29Demostración de lavado broncoalveolar Pneumocystis jirovecii
contra el antígeno capsular (polisacárido) y son fáciles de realizar. utilizando la prueba de anticuerpos fluorescentes.
Detección cuantitativa de antígenos, que consiste en titular el antígeno del
LCR mediante diluciones seriadas, es un indicador pronóstico importante
de la respuesta clínica a la terapia antifúngica. Muchos de estos ensayos se Puntos para recordar
pueden utilizar en LCR y suero. - Aunque las palabras antígeno y inmunógeno a veces se usan
El sistema de aglutinación de látex de antígeno criptocócico (CALAS; indistintamente, un inmunógeno es una molécula que estimula una
Meridian Diagnostics, Cincinnati, OH) utiliza IgG policlonal de conejo. Este respuesta inmune, mientras que un antígeno es una molécula capaz de
ensayo es más sensible que los ensayos que utilizan anticuerpos unirse a un anticuerpo específico o receptor de células T.
- El uso de anticuerpos para diagnosticar enfermedades infecciosas
monoclonales. La radiofrecuencia puede producir resultados falsos
requiere demostrar un aumento de cuatro veces en el título o distinguir
positivos, por lo que el fabricante recomienda un tratamiento previo con
entre IgG e IgM.
pronasa para eliminar la radiofrecuencia y otras interferencias
- Aunque los anticuerpos monoclonales tienen la ventaja de ser más específicos
inespecíficas. La prueba de antígeno de Cryptococcus de Remel que los anticuerpos policlonales en la detección de antígenos, los anticuerpos
(ThermoFisher Scientific) utiliza IgM monoclonal de ratón; este ensayo policlonales pueden ser más sensibles.
incorpora un tratamiento con proteasa para el suero para prevenir - Pueden ocurrir pruebas falsas negativas de anticuerpos contra antígenos
resultados falsos positivos por RF. La prueba de antígeno criptocócico específicos si la muestra de suero se recolecta demasiado pronto en el curso de

Premier (Meridian Diagnostics) es un EIA que utiliza anticuerpos
policlonales adheridos a micropocillos. Tiene la ventaja de tener menos
resultados positivos falsos, no reacciona con la RF y se puede analizar en
una gran cantidad de muestras a la vez. Un método de TIC, IMMY CrAg LFA
(Ensayo de flujo lateral de antígeno criptocócico), fabricado por Immuno-
Mycologics (Norman, OK) se puede utilizar en suero, orina o LCR. Utiliza un
la infección, el paciente está inmunodeprimido o la concentración de
anticuerpos es extremadamente alta (fenómeno de prozona).
- Las pruebas de falsos positivos para anticuerpos pueden deberse a muchas
situaciones, incluida la presencia de anticuerpos heterófilos o factor reumatoide.
- Las reacciones de precipitación se basan en la insolubilidad de los complejos
inmunes formados después de la unión del antígeno soluble al anticuerpo

anticuerpo monoclonal dirigido contra el material capsular que detecta los
cuatro serotipos deC. neoformans complejo que incluye Cryptococcus gatii.
Un metanálisis de los datos publicados encontró una sensibilidad y
especificidad de más del 95% para el suero y el LCR.
Las proteínas estructurales de CMV tempranas se pueden controlar
mediante el ensayo de antigenemia de CMV. En este procedimiento, las capas
soluble.
- Los ensayos de aglutinación utilizan sustancias particuladas, como el látex, para
formar grumos visibles para detectar inmunocomplejos.
- Los antígenos o anticuerpos pueden marcarse con numerosos
marcadores, como fluorocromos o enzimas, para detectar la unión
antígeno-anticuerpo in vitro.
- En la serología de la sífilis, las pruebas de detección utilizan antígenos no treponémicos,

leucocíticas de muestras de sangre total se tiñen con anticuerpo fluorescente y
se informa el número de células polimorfonucleares positivas por célula contada.
Un mayor número de núcleos polimorfonucleares teñidos con fluorescencia es
indicativo de un mayor riesgo de desarrollar neumonía por CMV u otra
enfermedad orgánica en etapa terminal. Las pruebas de antigenemia son
importantes para determinar la infección por CMV en pacientes con trasplante
de órganos sólidos y células hematopoyéticas.
Procedimiento de anticuerpos fluorescentes para P. jirovecii está aprobado
para su uso en muestras de esputo inducido y broncoscopia (Figura 10.29). Los
kits más sensibles son aquellos con anticuerpos monoclonales dirigidos contra
antígenos que se encuentran en todas las formas del hongo. En pacientes con
alta probabilidad de neumonía por Pneumocystis, un anticuerpo fluorescente
negativo en el esputo inducido debe ir seguido de un anticuerpo fluorescente en
una prueba obtenida broncoscópicamente.
mientras que las pruebas de confirmación utilizan antígenos de espiroquetas.
- Los métodos de detección directa de antígenos ofrecen alternativas rápidas y precisas
al cultivo de agentes infecciosos.
- A excepción de la criptococosis, la detección directa de antígenos en el LCR es
insensible y no se recomienda.
Preguntas de evaluación del aprendizaje
1. ¿Cuál es la importancia de un título alto de IgM para el citomegalovirus en un
recién nacido?
2. Muchos kits de diagnóstico para detectar antígenos en muestras clínicas
utilizan anticuerpos monoclonales. ¿Cuáles son las ventajas y
desventajas de usar anticuerpos monoclonales en lugar de anticuerpos
policlonales?

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218 PARTE 1 Introducción a la microbiología clínica
3. Enumere algunas causas de resultados de pruebas serológicas falsas negativas.
4. ¿En qué se diferencia la inmunodifusión doble de la inmunodifusión
radial simple?
5. ¿En qué se diferencia la aglutinación pasiva de la aglutinación pasiva
inversa?
6. Se preparan diluciones en serie al doble de la muestra de suero de un paciente.
Las diluciones se analizan para detectar la presencia de anticuerpo
antiestreptolisina-O en un ensayo de neutralización. Las diluciones 1: 1 a 1:16
no muestran hemólisis, mientras que las diluciones 1:32 a 1: 128 presentan
hemólisis. ¿Cómo se deben informar los resultados?
7. En el ensayo de inmunofluorescencia indirecta para detectar anticuerpos,
¿qué es el conjugado?
8. ¿Qué ventaja tiene la prueba de Western blot sobre otras pruebas
serológicas?
9. La muestra de suero de un paciente se informó como reactiva en una prueba rápida de
reagina plasmática. ¿Qué se debe hacer a continuación? ¿Por qué?
10. ¿Qué enfermedad sugiere la presencia de anticuerpos que aglutinan los
glóbulos rojos de las ovejas y los caballos?
BIBLIOGRAFÍA
Alexander, CL y col. (2013). La rápida detección deCryptosporidium y
Giardia especies en heces clínicas utilizando el inmunoensayo Quik
Chek.Parasitology International62, 552.
Ashbee, HR (2015). Enfoques generales para la detección directa y
identificación de hongos. En JH Jorgensen, et al. (Eds.),Manual de
microbiología clínica (11ª ed., Pág. 1965). Washington, DC: Prensa de
ASM. Babady, NE y Tang, Y.-W. (2015). Virus respiratorio sincitial y
metaneumonvirus humano. En JH Jorgensen, et al. (Eds.),Manual
de microbiología clínica (11ª ed., Pág. 1498). Washington, DC:
Prensa de ASM.
Branson, BM y Owen, SM (2015). Virus de inmunodeficiencia humana.
En JH Jorgensen, et al. (Eds.),Manual de microbiología clínica (11ª ed.,
Pág. 1436). Washington, DC: Prensa de ASM.
Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (2008). Algoritmo de prueba de sífilis
ritmos que utilizan pruebas treponémicas para la detección inicial: cuatro laboratorios,
ERRNVPHGLFRVRUJ
Ciudad de Nueva York, 2005-2006. MMWR. Informe semanal de morbilidad y
mortalidad, 57, 872.
Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (2014). Pruebas de laboratorio para
el diagnóstico de la infección por el VIH: recomendaciones actualizadas. Disponible
en:https://stacks.cdc.gov/view/cdc/23447. (Consultado el 24 de julio de 2017).
Gieseker, KE y col. (2005). Evaluación de la Academia Estadounidense de
Estándar de diagnóstico pediátrico para Streptococcus pyogenes faringitis: cultivo
de respaldo versus repetición de la prueba rápida de antígenos. Pediatría, 111,
e666. Ginocchio, CC y col. (2015). Reactivos, tinciones, medios y cultivos celulares:
virología. En JH Jorgensen, et al. (Eds.),Manual de microbiología clínica (
11ª ed., Pág. 1422). Washington, DC: Prensa de ASM.
Huang, H.-R. y col. (2015). Evaluación de un nuevo antígeno criptocócico
Inmunoensayo de flujo lateral en suero, líquido cefalorraquídeo y orina para
el diagnóstico de criptococosis: metaanálisis y revisión sistemática.Más uno,
10 (5), e0127117. doi: 10.1371 / journal.pone.0127117. Moisi, JC y col. (2009).
Diagnóstico mejorado de meningitis neumocócica
con el uso de Binax NOW, prueba inmunocromatográfica de steotococos
neumonia antígeno: un estudio multisitio. Enfermedades Infecciosas
Clínicas: una publicación oficial de la Sociedad Estadounidense de
Enfermedades Infecciosas, 48 (Suplemento 2), S49.
Samarawickrama, A. y col. (2011). Una evaluación de laboratorio de
la prueba de punto de atención BioStar Optical ImmunoAssay para
diagnosticarNeisseria gonorrhoeae infección. Revista de microbiología
médica, 60, 1779.
Sena, AC y col. (2015).Treponema y Brachyspira, anfitrión humano
espiroquetas asociadas. En JH Jorgensen, et al. (Eds.),Manual de
microbiología clínica (11ª ed., Pág. 1055). Washington, DC: Prensa de ASM.
Theel, ES y col. (2015). Inmunoensayos para el diagnóstico de infecciones
enfermedades. En JH Jorgensen, et al. (Eds.),Manual de microbiología clínica (
11ª ed., Pág. 91). Washington, DC: Prensa de ASM.
Uslu, H. y col. (2016). Comparación de varios métodos en el diagnóstico.
de Entamoeba histolytica en muestras de heces y suero. La revista
euroasiática de medicina, 48, 124.
Van den Bossche, D. y col. (2015). Comparación de cuatro diagnósticos rápidos
pruebas, ELISA, microscopía y PCR para la detección de Giardia lamblia,
Cryptosporidium spp. yEntamoeba histolytica en las heces. Revista de
métodos microbiológicos110, 78.
CAPÍTULO
11 Aplicaciones del
diagnóstico molecular
Steven D. Mahlen y Arun Kumar
BOSQUEJO DEL CAPÍTULO
- TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN DE ÁCIDO NUCLEICO
Variables de reacción de hibridación Selección de sonda
Formatos de hibridación
Aplicaciones de las técnicas de hibridación de ácidos nucleicos
- PROCEDIMIENTOS DE AMPLIFICACIÓN DE ÁCIDO NUCLEICO
Reacción en cadena de la polimerasa
Otras reacciones de amplificación de ácidos nucleicos
- CLASIFICACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE LAS CEPAS
Métodos de tipificación no amplificados Métodos de
tipificación amplificados
OBJETIVOS
Después de leer y estudiar este capítulo, debería poder:
1. Describir el concepto de hibridación de ácidos nucleicos y cómo se utilizan los
diferentes formatos en el laboratorio de microbiología clínica.
2. Analice qué son las sondas de ácido nucleico y cómo se utilizan en
técnicas de diagnóstico molecular.
3. Explicar el concepto de reacciones de amplificación de ácidos nucleicos y cómo se
pueden utilizar estas técnicas en el laboratorio de microbiología clínica.
4. Describa las ventajas y desventajas de utilizar procedimientos de amplificación
de ácidos nucleicos.
5. Analice la teoría y los componentes de la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR).
6. Enumere y describa los métodos de detección de productos de PCR.
Caso en punto
Un hombre de 26 años notó un pequeño "grano" en su flanco derecho. A
los pocos días, la espinilla se convirtió en un forúnculo (una infección de
uno de sus folículos pilosos). El área alrededor del furúnculo se inflama: la
piel estaba enrojecida, el área alrededor del furúnculo comenzó a
hincharse y toda el área estaba dolorida. Posteriormente, sintió náuseas,
comenzó a vomitar y tenía fiebre baja cuando se presentó al departamento
de emergencias. Estaba lo suficientemente enfermo como para ser
ingresado en el hospital.
Se drenó el forúnculo y se envió el pus al laboratorio de microbiología.
Se observaron cocos grampositivos agrupados en una tinción de Gram del
material purulento. Al día siguiente, se observaron colonias β-hemolíticas
de color blanco cremoso en agar sangre de oveja.
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- FUTURO DE LAS PRUEBAS DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR EN EL
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA CLÍNICA
Secuenciación
Pirosecuenciación
Proteómica de microarrays y
nanoarrays de ADN
- NANOMEDICINA
7. Proporcione una descripción general de la PCR en tiempo real y los diversos métodos de detección
de PCR en tiempo real.
8. Discutir los tipos alternativos de ensayos de PCR y sus usos en el
laboratorio de microbiología clínica.
9. Describa los diferentes procedimientos de amplificación no basados en PCR y
cómo se utilizan.
10. Compare las diversas metodologías de tipificación de cepas y analice
sus ventajas y desventajas.
11. Analice las técnicas de secuenciación, la genómica a gran escala, la
nanotecnología, los ensayos de proteómica y la espectrometría de masas de
tiempo de vuelo con desorción-ionización por láser asistida por matriz.
Las colonias fueron catalasa positivas y positivas por aglutinación de látex
para coagulasa. Un informe preliminar de “Staphylococcus aureuspresente,
susceptibilidades a seguir ”se ingresó en el sistema de información de
laboratorio del hospital.
Se realizó un ensayo de reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
en tiempo real para determinar si S. aureus aislar llevó el mecUn gen,
el determinante de la resistencia a la meticilina en muchos
estafilococos. El ensayo de PCR en tiempo real tomó menos de 2
horas para determinar que el aislado del paciente era positivo para el
mecUn gen. Un control interno para unS. aureus–También se utilizó
un gen específico en el ensayo, lo que confirma la identificación del
aislado. El paciente fue tratado con agentes antimicrobianos
apropiados y se recuperó.
219
220 PARTE 1 Introducción a la microbiología clínica

Temas a considerar
Después de leer la historia clínica del paciente, considere:
- Los síntomas y la presentación del paciente que pueden indicar la
identidad del agente.
- El uso de técnicas de diagnóstico molecular rápido que pueden ayudar
en la identificación de un agente causal y el tratamiento de una
opciones de prueba ampliamente utilizadas por los médicos. Esto se debe en parte a la
mayor sensibilidad y especificidad que proporcionan ahora los ensayos de base
molecular. Las pruebas de diagnóstico molecular proporcionan una detección rápida
de ciertos agentes infecciosos y son particularmente útiles para agentes que son
difíciles de cultivar o que necesitan mucho tiempo para crecer en medios de cultivo. Los
ensayos de diagnóstico molecular brindan a los médicos respuestas rápidas para las

enfermedad. opciones de tratamiento, lo que ahorra un tiempo valioso en el caso de una infección

- Los posibles beneficios para la atención del paciente que pueden resultar del potencialmente mortal.

uso de técnicas de diagnóstico molecular
- El tiempo que tardan los métodos microbiológicos estándar en
comparación con los ensayos de diagnóstico molecular
Términos clave
Los tipos de ensayos utilizados en el diagnóstico molecular para las
pruebas de enfermedades infecciosas incluyen técnicas de hibridación de
ácidos nucleicos, técnicas de amplificación de señales y ácidos nucleicos, y
ensayos que ayudan en las investigaciones epidemiológicas. Este capítulo
analiza estas técnicas de base molecular y sus aplicaciones en un
laboratorio moderno de microbiología clínica.

Amplicón de electroforesis en gel Oligonucleótido

de agarosa Análisis de perfil de plásmidos Técnicas de hibridación de ácidos nucleicos
Recocer Plásmidos
Temperatura de recocido (Ta) Ensayo Reacción en cadena de la polimerasa Hibridación de ácidos nucleicos es una técnica descrita por primera vez
de ADN ramificado (ADNb) (PCR) en 1961 por Marmur y Doty. La mayoría de los procedimientos de pruebas
Tecnología de sonda cíclica Recocido de imprimación de diagnóstico molecular utilizan el concepto de hibridación de ácidos
Desnaturalización Extensión de imprimación nucleicos. Conceptualmente, la hibridación de ácidos nucleicos se refiere a
Dendrograma Primer-dímeros la formación de enlaces de hidrógeno entre nucleótidos de moléculas de
Desoxinucleótido Imprimaciones ácido desoxirribonucleico (ADN) y / o ácido ribonucleico (ARN)
trifosfatos (dNTP) Investigacion monocatenarias que son complementarias entre sí. En las condiciones
Microarrays de ADN Proteómica adecuadas, esto forma una molécula de ácido nucleico bicatenario estable.
ADN polimerasa Gel de campo pulsado Los híbridos de doble hebra resultantes pueden ser ADN: ADN, ADN: ARN o
FRET de doble sonda electroforesis (PFGE) ARN: ARN, como se muestra enFigura 11.1. Este proceso de hibridación
5′ ensayo de nucleasa Pirosecuenciación también se llamaformación de dúplex. Este acoplamiento de moléculas
Resonancia de fluorescencia Amplificado aleatorio
complementarias monocatenarias es un componente clave para muchas
transferencia de energía (FRET) ADN polimórfico (RAPD) de las pruebas analizadas en este capítulo, incluidos los métodos de
Fluoróforo PCR en tiempo real
transferencia, lareacción en cadena de la polimerasa (PCR) y otras
Genes de limpieza Palindrómico repetitivo
técnicas de base molecular.
Captura híbrida PCR de elementos extragénicos
Las dos moléculas de ácido nucleico monocatenario utilizadas en las
Amplificación in situ (ISA) (Rep-PCR)
técnicas de hibridación se denominan con términos diferentes. Una de las
Hibridación in situ (ISH) Enzima restrictiva
hebras se conoce comoobjetivo. La hebra diana es la secuencia de ADN o
Análisis de la curva de fusión PCR de transcripción inversa
ARN que se identificará mediante el método de diagnóstico molecular que
Temperatura de fusión (Tmetro) (RT-PCR)
Ribonucleasa H (RNasa H) se utilice. La molécula de ácido nucleico diana típicamente se inmoviliza en
Metagenómica
Baliza molecular Ribotipado un medio de soporte sólido o se suspende en solución. El objetivo también

Enzima multilocus Imprimaciones Scorpion se conoce como elplantilla. La otra hebra involucrada en los métodos de
electroforesis (MLEE) Secuenciación hibridación se llamaInvestigacion. La sonda suele ser un ADN o ARN
Escritura de secuencia multilocus Mancha sureña monocatenario.oligonucleótido etiquetado
(MLST) SYBR Verde
Número variable de multilocus de Objetivo

análisis de repetición en tándem Plantilla A

(MLVA) Termociclador
PCR multiplex Transcripción (ARN mensajero)
Nanobiotecnología Mediada por transcripción
PCR anidado amplificación (TMA)
Mancha del norte Uracilnorte-glicosilasa (UNG)
Hibridación de ácidos nucleicos Basado B
en secuencias de ácidos nucleicos
amplificación (NASBA)

El diagnóstico olecular representa un avance significativo en el C

METRO
laboratorio de microbiología clínica durante los últimos años y
es probablemente la sección de más rápido crecimiento.
en muchos laboratorios clínicos. Las técnicas de biología molecular se utilizan
ahora para ayudar en el diagnóstico de enfermedades infecciosas y son
HIGO. 11,1Tres híbridos de oligonucleótidos diferentes. A, ADN: ADN
híbrido. B, ADN: ARN híbrido. La cadena superior es ADN y la cadena
inferior es ARN; tenga en cuenta los Nosotros en lugar de los Yoes.C, ARN:
ARN híbrido.

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 CAPÍTULO 11 Aplicaciones del diagnóstico molecular
con una molécula informadora adjunta que puede detectarse visualmente o
mediante un instrumento. En esencia, la sonda se usa para detectar la molécula
de ácido nucleico diana. En la mayoría de los métodos de base molecular usados
actualmente, la sonda se produce sintéticamente para detectar una secuencia de
ácido nucleico diana específica de un microorganismo o virus dado. A menudo,
las sondas están disponibles para su compra a los fabricantes en kits diseñados
para detectar una secuencia diana específica. Las sondas se utilizan en la
detección de patógenos microbianos en muchos tipos diferentes de muestras,
análisis de expresión génica, identificación de reordenamientos genéticos y
translocaciones cromosómicas, detección de mutaciones puntuales y otras
aplicaciones clínicas.
Variables de reacción de hibridación
Varias variables afectan el resultado de una determinada reacción de
hibridación. Estas variables incluyen la temperatura, la composición de la base
de nucleótidos de la sonda, la longitud de la sonda, la concentración de la sonda,
el grado de complementariedad entre la diana y la sonda, la fuerza iónica
(concentración de sal) y el pH. Cuando una o más de estas variables no se
optimizan para un ensayo de hibridación, es posible que los híbridos no se
formen de manera eficiente.
Temperatura
La temperatura es una variable que probablemente sea la más fácil de
controlar durante la hibridación. La estabilidad de un híbrido dado se
puede calcular determinando laTemperatura de fusión (Tmetro) de una
sonda. La tmetro es la temperatura a la que se ha formado el 50% de los
híbridos y el 50% de las moléculas de ácido nucleico monocatenario
todavía están disociadas. La tmetro puede calcularse mediante varios
métodos; Las empresas que fabrican sondas sintéticamente normalmente
calculan la Tmetro para el cliente. En su mayor parte, la Tmetro depende de la
composición de nucleótidos de la sonda, particularmente del porcentaje de
nucleótidos de guanina (G) y citosina (C) en la sonda. Esto a menudo se
conoce como la composición G + C, o G
+ Relación C, de la sonda. La tmetro depende de la relación G + C porque se
forman tres enlaces de hidrógeno entre G y C, en lugar de los dos enlaces
de hidrógeno que se forman entre la adenina (A) y la timina (T); el par de
enlaces GC es termodinámicamente más estable que el par de enlaces AT.
Longitud de la sonda
Otro aspecto que afecta a la Tmetro es la longitud de la sonda; en general, la Tmetro
es menor para una sonda más corta. Las reacciones de hibridación tienden a
ocurrir más rápidamente para sondas más cortas que para sondas más largas.
Además, todos los demás factores que afectan las reacciones de hibridación se
vuelven más influyentes para sondas más cortas que para sondas más largas.
Concentración de sonda
La concentración de la sonda también afecta a las reacciones de hibridación. Las
concentraciones de sonda más altas normalmente reducen el tiempo de
reacción saturando todas las secuencias diana de sonda disponibles. Sin
embargo, las concentraciones de sonda excesivas promueven la unión
inespecífica de la sonda a secuencias no objetivo. La concentración de sonda
óptima se puede determinar probando varias reacciones diferentes con
diferentes concentraciones de sonda, si esto no se ha determinado ya.
Grado de complementariedad del objetivo y la sonda
Muchas condiciones del ensayo de hibridación se basan en la expectativa de que
una sonda tenga una secuencia de complementariedad exacta o casi exacta.
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221
al ácido nucleico diana. Este no siempre será el caso en el que diferentes cepas
de microorganismos puedan poseer secuencias diana ligeramente diferentes a
través de mutaciones puntuales. Cuando las condiciones son estrictas, las
coincidencias exactas entre la sonda y el objetivo se hibridarán primero,
mientras que las fallas de coincidencia forman dúplex más lentamente. Las altas
temperaturas (por ejemplo, la Tmetro temperatura) puede incluso inhibir la
formación de híbridos. Los oligonucleótidos cortos que se utilizan con mayor
frecuencia como sondas pueden verse muy afectados por desajustes; las sondas
muy largas no se ven tan afectadas. Una temperatura más baja que la Tmetro
ayudará a aliviar el rigor y permitirá que los desajustes formen dúplex más
fácilmente.
Concentración de sal
La concentración de sal (la fuerza iónica) puede afectar la rigurosidad de una
determinada reacción de hibridación. La velocidad de una reacción de
hibridación aumentará a medida que aumente la concentración de sal, hasta un
umbral; después de una concentración de NaCl 1,2 M, la velocidad de la reacción
se vuelve constante.
pH
El pH afecta la estabilidad de las moléculas de ácido nucleico bicatenario en
solución. Un pH alcalino promueve la disociación de moléculas de doble
hebra, mientras que las soluciones de pH ácido pueden depurinar sondas y
moléculas de ácido nucleico diana. Por tanto, es preferible un pH neutro
para la mayoría de las reacciones de hibridación. Por lo general, no es
necesario ajustar el pH de la mayoría de las reacciones de hibridación
realizadas en el laboratorio de microbiología clínica porque los reactivos
suministrados por el fabricante contienen tampones con el pH adecuado.
Selección de sonda
La selección de la sonda adecuada para las reacciones de hibridación de ácidos nucleicos es tan
importante como el propio método de reacción de hibridación. Esencialmente, la función de la
sonda es formar un dúplex con cada secuencia complementaria disponible en la reacción, y la
sonda debe ser adecuada para la reacción de hibridación particular que se utilizará. Las sondas
pueden estar basadas en ADN o ARN y están marcadas. En un momento, las sondas de ácido
nucleico llevaban típicamente un marcador de radionucleótidos. La sonda radiomarcada a
menudo tenía que ser preparada por el usuario, y el éxito de una reacción de hibridación
dependía de la incorporación eficaz del marcador radionucleotídico en la sonda. Actualmente,
las sondas radiomarcadas rara vez, si es que alguna vez, se utilizan en el laboratorio de
microbiología clínica. La mayoría de los radioisótopos tenían semividas breves y, por tanto,
tenían poca utilidad clínica. Además, Se generaron desechos radiactivos indeseables y, debido a
su toxicidad, los radioisótopos deben manipularse con cuidado. Las sondas radiomarcadas se
han reemplazado en su mayor parte por marcadores no isotópicos, que incluyen biotina,
digoxigenina (DIG) y fluoresceína. Generalmente, los marcadores no isotópicos tienen una
resolución y sensibilidad que se acercan, coinciden o incluso superan a los de los marcadores
de radionucleótidos, según el fabricante y el proceso utilizado. Además, las etiquetas no
isotópicas no requieren un manejo especial ni una eliminación de desechos especializada. o
incluso superar los de los marcadores de radionucleótidos, según el fabricante y el proceso
utilizado. Además, las etiquetas no isotópicas no requieren un manejo especial ni una
eliminación de desechos especializada. o incluso superar los de los marcadores de
radionucleótidos, según el fabricante y el proceso utilizado. Además, las etiquetas no isotópicas
no requieren un manejo especial ni una eliminación de desechos especializada.
Una sonda puede marcarse en los extremos o marcarse de forma continua. Una
sonda con etiqueta en el extremo tiene la etiqueta adherida al 5′ o 3′ final de la
secuencia de ácido nucleico. A 5′ La sonda marcada en el extremo se puede sintetizar
mediante la transferencia de la sonda a través de una reacción de quinasa, mientras
que un 3′ La sonda marcada en el extremo se puede sintetizar utilizando una enzima
transferasa terminal. Una sonda marcada continuamente tiene la marca incorporada a
intervalos a lo largo de la secuencia de ácido nucleico.
222 PARTE 1 Introducción a la microbiología clínica

con un enzima restrictiva. El ADN se digiere primero porque el ADN

Formatos de hibridación
Hibridación de soporte sólido
Las reacciones de hibridación pueden ocurrir en un mecanismo de soporte
sólido, in situ o en solución. Las reacciones de hibridación de soporte sólido han
estado disponibles durante muchos años, aunque los formatos de hibridación en
solución se utilizan ahora con más frecuencia en los laboratorios de
microbiología clínica. En la hibridación de soporte sólido, una técnica a menudo
llamadasecante el ácido nucleico diana se transfiere y se inmoviliza en una
membrana compuesta de nitrocelulosa o nailon. La membrana sólida a menudo
se trata previamente para reducir la unión inespecífica de la sonda a la propia
membrana. A continuación, la sonda marcada se hibrida con el ácido nucleico
inmovilizado y se utilizan las etapas de lavado para eliminar el exceso de sonda y
aclarar la señal. La detección se basa en el tipo de sonda utilizada; Las sondas
colorimétricas permiten la determinación visual de reacciones positivas y
negativas y las sondas quimioluminiscentes (emisoras de luz) y radiomarcadas
requieren una película y / o un sistema de detección. Dos ejemplos de técnicas
de hibridación con soporte sólido son la transferencia Southern y la
transferencia Northern.
Southern Blot
los Mancha sureña fue descrita por primera vez en 1975 por Southern, quien
describió una técnica mediante la cual el ADN cromosómico podía separarse
mediante electroforesis en gel de agarosa y luego se transfirió e inmovilizó
sobre una membrana de nitrocelulosa. Por lo general, este método se usa
después de que el ADN cromosómico ha sido digerido, creando cortes de doble
hebra en el ADN en secuencias de nucleótidos específicas.
cromosómico es demasiado grande para separarlo en un gel de agarosa.
Una vez que el ADN se ha separado e inmovilizado en una membrana
sólida, la sonda marcada se hibrida con la secuencia de ADN diana
específica y se detecta, como se muestra enFigura 11.2. La transferencia
Southern es algo laboriosa, a menudo tarda más de 1 día en realizarse y no
se utiliza con frecuencia en la actualidad en los laboratorios de
microbiología clínica. La transferencia Southern se puede utilizar para
identificar microorganismos, detectar mutaciones y tipificar cepas para
investigaciones epidemiológicas y para otros fines.
Northern blot
A Mancha del norte se utiliza para detectar moléculas de ARN, que
casi siempre son transcripción (ARN mensajero, ARNm). El
procedimiento para transferir ARN a un mecanismo de soporte sólido
fue descrito por primera vez por Alwine y sus colegas en 1977 (esta
técnica no recibió el nombre de una persona llamada "Northern").
Pueden usarse transferencias Northern para determinar el tamaño de
moléculas de ARN particulares y semicuantificar la cantidad de una
transcripción de ARN particular. El procedimiento real de la
transferencia Northern es similar al de la transferencia Southern: el
ARN se separa en un gel de agarosa, se transfiere a una membrana,
se inmoviliza y se detecta con una sonda que se hibrida con la especie
de ARN de interés. La detección también se realiza según el tipo de
etiqueta de la sonda. Una diferencia entre la transferencia Southern y
la transferencia Northern es que no se usa una enzima de restricción
para digerir el ARN antes de la separación;

A B

HIGO. 11,2Southern blot. A, Los fragmentos de ADN cromosómico separados en un gel de agarosa se
transfieren a una membrana sólida. B, La sonda marcada específica para un ácido nucleico diana se incuba
con el ADN separado en la membrana. C, El exceso de sonda se elimina de la membrana, dejando la sonda
unida solo al ADN diana apropiado. D, Se detecta el híbrido de ADN sonda-diana.

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 CAPÍTULO 11 Aplicaciones del diagnóstico molecular
Al igual que la transferencia Southern, la transferencia Northern no se utiliza a menudo
en los laboratorios de microbiología clínica.
Hibridación in situ
Hibridación in situ (ISH) fue descrita por primera vez en 1969 por Pardue y
Gall. En este método de hibridación, el transcrito de ADN o ARN se puede
detectar directamente en el tejido con sondas marcadas. La técnica a
menudo se realiza directamente en tejido que se ha incrustado en
parafina. ISH también puede detectar ácidos nucleicos en células intactas y
material genético cromosómico. En microbiología, la ISH se puede utilizar
para detectar niveles bajos de virus en muestras de tejido, como el virus
del papiloma humano (VPH). Algunos laboratorios acoplarán un
procedimiento de amplificación como PCR con ISH para aumentar la
sensibilidad y la especificidad. Esta técnica se llamaamplificación in situ (
ES UN). Al igual que ISH, ISA no se usa a menudo en laboratorios de
microbiología clínica, pero puede usarse para detectar virus en muestras
de tejido.
Hibridación en solución
La hibridación en solución es la reacción de hibridación más utilizada por los
laboratorios de microbiología clínica. Varios fabricantes han desarrollado
ensayos útiles que promueven la hibridación entre una sonda marcada y ácidos
nucleicos diana en una solución líquida en tubos o en pocillos de
microvaloración. Generalmente, los métodos de detección para estos sistemas
comerciales se basan en quimioluminiscencia. Las sondas marcadas se utilizan
durante la hibridación en solución para confirmar las identificaciones de
bacterias y hongos basadas en cultivos y para identificar rápidamente
organismos de enfermedades infecciosas.
Aplicaciones de las técnicas de
hibridación de ácidos nucleicos
Aplicaciones de sonda de confirmación de cultivo
El sistema AccuProbe de Hologic (Marlborough, MA) utiliza la hibridación
de ácidos nucleicos para confirmar cultivos sospechosos de varios
organismos diferentes, incluidas varias micobacterias, hongos y bacterias.
Independientemente de la aplicación en particular, todas las pruebas de
AccuProbe utilizan el mismo principio tecnológico. Se diseña una sonda de
ADN monocatenaria, marcada con quimioluminiscencia, para hibridar con
el ARN ribosómico (ARNr) del organismo objetivo, formando un dúplex
ADN: ARN. Un detector llamadoluminómetro se utiliza para detectar estos
dúplex etiquetados. El luminómetro da una lectura en unidades de luz
relativas (RLU) y el resultado de RLU para un cultivo sospechoso se
compara con un valor de RLU de corte positivo; cualquier lectura por
encima del valor de corte es positiva y las lecturas por debajo son
negativas. El valor de corte de RLU puede cambiar de un ensayo a otro.
Estos ensayos se pueden realizar en cultivos obtenidos en medios sólidos o
líquidos. La sensibilidad y la especificidad de la mayoría de estos ensayos
se acercan al 100% y la mayoría de estas pruebas tardan
aproximadamente 1 hora en realizarse.
Ensayos basados en sondas que identifican
microorganismos directamente a partir de muestras
Muchos ensayos utilizan sondas marcadas para la detección directa de ácido
nucleico microbiano a partir de muestras. Enzo Life Sciences (Farmingdale, NY),
por ejemplo, tiene varias sondas marcadas con quimioluminiscencia en su línea
de productos de sondas marcadas con Bio-Probe, que pueden usarse para
detectar ácido nucleico de varios agentes de enfermedades infecciosas, como
adenovirus, virus BK, y virus JC, mediante transferencia Southern, transferencia
Northern o ISH. Enzo Life Sciences también ha etiquetado
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223
sondas que detectan el VPH mediante ISH como parte de sus sistemas
PathoGene y Bio-Pap.
Además, Hologic también ofrece algunos sistemas diferentes para
la detección de Chlamydia trachomatis y Neisseria gonorrhoeae a
partir de muestras clínicas. Un sistema, el PACE 2C (y su predecesor,
PACE), se ha utilizado durante varios años en muchos laboratorios de
microbiología clínica. El sistema PACE 2C prueba
C. trachomatis y N. gonorrhoeae a partir de una única muestra de torunda
endocervical o uretral masculina. PACE 2C utiliza sondas de ADN marcadas con
quimioluminiscencia que se dirigen a secuencias de ARNr específicas de estos
microbios y forman híbridos de ADN: ARN (como en los ensayos AccuProbe). Se
utiliza un luminómetro para detectar los híbridos. Una prueba inicial le dice al
científico del laboratorio si el ácido nucleico de cualquiera de los
microorganismos está presente en la muestra; Luego se realiza una prueba de
confirmación para determinar la identidad real. Aunque es popular y económico,
el sistema PACE 2C es principalmente un procedimiento manual, y muchos
laboratorios de microbiología clínica con alta
C. trachomatis y N. gonorrhoeae Los volúmenes de prueba ahora utilizan
los ensayos Hologic Aptima Combo 2 en la plataforma Tigris o en la
plataforma Panther (descrita más adelante).
Procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos
Aunque las sondas marcadas pueden usarse en ensayos de hibridación de
ácidos nucleicos para detectar microorganismos en el laboratorio de
microbiología clínica, los ensayos de amplificación probablemente tengan más
utilidad clínica. La amplificación puede usarse para aumentar la cantidad de
ácido nucleico del microorganismo diana en una muestra en poco tiempo. Este
aumento de la cantidad de ácido nucleico puede detectarse mediante varios
métodos. La amplificación también se usa en algunos ensayos para aumentar la
cantidad de señal después de hibridar una sonda con el ácido nucleico de un
organismo.
Los procedimientos de amplificación tienen muchas ventajas sobre los
métodos microbiológicos estándar y sobre los procedimientos directos de
hibridación de ácidos nucleicos. Muchos ensayos de amplificación combinan
tiempos de detección rápidos con alta sensibilidad y especificidad. En general,
los ensayos de amplificación son más sensibles que sus homólogos de
hibridación de ácido nucleico porque las secuencias de ácido nucleico diana
pueden no estar presentes en cantidades suficientemente altas para ser
detectadas por ensayos de hibridación directa. En algunos casos, las pruebas de
amplificación también se pueden utilizar para detectar el ácido nucleico diana en
muestras clínicas, y presentan la ventaja de la velocidad sobre los métodos de
identificación de cultivos. Algunas técnicas de amplificación también
proporcionan datos cuantitativos y son útiles para seguir el progreso de una
enfermedad o proporcionar el número de copias de ácido nucleico microbiano
presentes en una muestra.
Las desventajas de los procedimientos de amplificación incluyen el costo, la
necesidad de equipos de detección y prueba especializados, espacio dedicado
para reducir la contaminación y científicos especialmente capacitados. Además,
un procedimiento de amplificación dado puede proporcionar una respuesta
rápida y proporcionar una identificación precisa de un microorganismo dado
presente en un estado patológico, pero eso no significa que no estén presentes
otros microorganismos. Algunas técnicas de amplificación son tan sensibles que
el ácido nucleico de un agente infeccioso puede detectarse a niveles bajos,
incluso si ese agente no es responsable de una infección actual o no es viable. El
procedimiento de amplificación utilizado por la mayoría de los laboratorios es la
PCR o una derivación de la misma; otros procedimientos de amplificación
incluyenamplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos (NASBA),
amplificación mediada por transcripción
224 PARTE 1 Introducción a la microbiología clínica
MESA 11,1 Tres pasos básicos en una cadena de polimerasa
Reacción
Paso Objetivo
Desnaturalización Separa el ADN de doble hebra Recorta
Recocido de imprimación los cebadores para apuntar al ADN
Extensión de imprimación Sintetiza nuevas hebras de ADN
ADN Ácido desoxirribonucleico.
(TMA), ensayo de ADN ramificado (bADN), captura híbrida, y
tecnología de sonda de ciclismo.
Reacción en cadena de la polimerasa
La introducción de la PCR fue uno de los mayores avances en las ciencias
químicas y biológicas, si no uno de los mayores avances jamás realizados
en estos campos. La técnica de síntesis de ADN fue descrita por primera
vez en 1971 por Kleppe y asociados, aunque Mullis y otros en Cetus
Corporation en California desarrollaron la PCR en su aplicación actual a
principios de la década de 1980. Mullis finalmente recibió el Premio Nobel
de Química por PCR, y el advenimiento de la PCR inició una revolución en la
biología molecular y varios otros campos, incluida la microbiología. La PCR
es valiosa porque es simple, sensible y poderosa. La PCR puede amplificar
una sola copia del ADN diana en una cantidad exponencial de producto de
ácido nucleico en el transcurso de 25 a 40 ciclos de reacción. Como se
muestra enCuadro 11.1, cada ciclo consta de tres pasos: (1)
desnaturalizaciónde ADN diana; (2)recocido de imprimación a la
secuencia objetivo; y (3)extensión del cebador. La PCR requiere varios
componentes, incluida una enzima comúnmente llamadaADN polimerasa
(correctamente llamadoADN polimerasa dependiente de ADN), un tampón
para la polimerasa,imprimaciones (oligonucleótidos que recocer
específicamente para apuntar al ADN y cebar, o iniciar, la síntesis de
nuevas cadenas de ADN), los cuatrotrifosfatos de desoxinucleótidos (
dNTP: dA, dC, dG y dT) y una fuente de ADN molde (el objetivo). Un
instrumento llamadotermociclador también es obligatorio.
El método de PCR original descrito fue laborioso y utilizó dos bloques
de calor separados y el fragmento de Klenow deEscherichia coli como la
ADN polimerasa. El ADN objetivo se desnaturaliza a temperaturas
superiores a 90 ° C, por lo que un bloque de calor se estableció en 95 ° C. El
otro bloque de calor se estableció en 30 ° C, la temperatura a la que el
fragmento de Klenow deE. coli funcionó mejor, para recocer
imprimaciones. A continuación, la reacción de amplificación procedió
mediante la transferencia manual del tubo de reacción del bloque de calor
al bloque de calor durante varios ciclos; Además, se tuvo que agregar un
nuevo fragmento de Klenow después de cada ciclo porque se desnaturaliza
a 95 ° C.En 1986, un instrumento llamado eltermociclador fue desarrollado;
Básicamente era un bloque de calor que alternaba rápidamente entre
temperaturas, de modo que no se necesitaban bloques de calor
individuales. En 1988, una ADN polimerasa termoestable (termoestable) de
la bacteria termófilaThermus aquaticus se utilizó en PCR. Este fue un gran
avance en el sentido de que la polimerasa tenía que incluirse solo al
comienzo de la reacción y no tenía que añadirse después de cada ciclo. Se
han descrito varias variaciones de la PCR estándar, incluidas aplicaciones
útiles comoPCR de transcripción inversa(RT-PCR), PCR multiplex, y PCR
anidado.
ERRNVPHGLFRVRUJ
Verificación de caso 11,1
El caso en cuestión ilustra una situación bastante común Staphylococcus aureus tipo de
infección, un forúnculo. Aunque la identificación rápida de agentes infecciosos por
parte del laboratorio de microbiología clínica es siempre importante, es aún más
importante conS. aureus para determinar si un aislado en particular es resistente a la
meticilina o no. Resistente a la meticilinaS. aureus los aislados son más difíciles de
tratar que las cepas sensibles a la meticilina. Una de las principales ventajas de utilizar
un método molecular rápido como la PCR para determinar la resistencia a la meticilina
es la velocidad que ofrece la PCR; se puede obtener una respuesta con PCR en solo
unas pocas horas en comparación con aproximadamente 24 horas para las pruebas de
sensibilidad estándar.
Mecanismo de la reacción en cadena de la polimerasa
Como se describió anteriormente, la PCR amplifica el ADN en tres pasos:
desnaturalización, hibridación de cebadores y extensión de cebadores. El ADN
diana se amplifica exponencialmente durante muchos ciclos (25 a 40) de estos
tres pasos de reacción.Figura 11.3 muestra un ciclo de PCR.
Desnaturalización. Los objetivos de ADN monocatenario son
necesarios para los ensayos de PCR. El ADN de doble hebra diana (dsDNA)
se separa en hebras simples durante el paso de desnaturalización. Una vez
que se ha separado el dsDNA objetivo, los cebadores se aparean con las
hebras simples. Los enlaces en el dsDNA se separan a temperaturas
superiores a 90 ° C, por lo que la mayoría de los protocolos de PCR se
desnaturalizan a 94 ° C o 95 ° C. El tiempo requerido para la
desnaturalización es variable, generalmente dependiendo del tipo de
ensayo de PCR realizado. Durante los ensayos de PCR estándar, a menudo
se utilizan de 15 a 30 segundos para la desnaturalización. La mayoría de
los ensayos de PCR también desnaturalizarán el ADN diana durante unos
minutos antes de que comiencen los ciclos reales para garantizar una
separación adecuada. Es muy importante que todo el ADN esté
desnaturalizado; El producto de PCR no se obtendrá en grandes cantidades
si la desnaturalización no es completa.
Recocido de imprimación. El objetivo de este paso es hibridar, o aparear,
cebadores de oligonucleótidos con las hebras de ADN diana monocatenarias
desnaturalizadas. En la PCR estándar se utiliza un par de cebadores, uno para cada
hebra de dsDNA. El 5′ Los extremos de estos cebadores enmarcan la región de
amplificación del ADN diana. Por lo tanto, el 5′ los extremos del par de cebadores
definen el tamaño final del producto de PCR. El recocido del cebador ocurre mejor
dentro de un rango de temperatura que generalmente está definido por la Tmetro. La
temperatura en el tubo de reacción no debe elevarse por encima de la Tmetro; de lo
contrario, no se producirá la hibridación adecuada de los cebadores con el ADN diana.
La temperatura a la que el ADN monocatenario complementario comienza a hibridar se
denominatemperatura de recocido (Ta). En la mayoría de las PCR, la temperatura de
apareamiento del cebador utilizada es unos pocos grados por debajo de la temperatura
de fusión; algunos laboratorios usan la fórmula Ta = Tmetro - 5ºC. Las temperaturas de
recocido de la imprimación oscilan normalmente entre aproximadamente 45ºC y 65ºC
durante aproximadamente 30 segundos a 2 minutos. Las temperaturas de hibridación
más altas pueden aumentar la especificidad de hibridación, por lo que los cebadores a
menudo se diseñan para tener temperaturas de hibridación en el extremo superior del
rango.
Extensión de imprimación. El propósito de la extensión del cebador es
producir el producto de PCR, llamado amplicón. La adición del
termoestableTaq La ADN polimerasa apoyó la extensión del cebador a
temperaturas elevadas, por lo que este paso se puede lograr entre 68 ° y
72 ° C, el rango de temperatura en el que esta polimerasa funciona mejor.
Es más,Taq La ADN polimerasa, así como otras ADN polimerasas
termoestables, sobrevive al alto calor de la etapa de desnaturalización.
Durante este paso, la ADN polimerasa toma el
 CAPÍTULO 11 Aplicaciones del diagnóstico molecular 225

5′ 3′

3′ 5′

5′ 3′

3′ 5′

5′ 3′

Pol
Primer 1 Primer 2
Pol

3′ 5′

5′ 3′

3′ 5′
HIGO. 11,3Un ciclo de reacción en cadena de la polimerasa. A, El ADN molde se desnaturaliza por calor para
producir dos hebras de ADN monocatenarias. B, La temperatura de la reacción se reduce y los dos cebadores
monocatenarios (cebadores 1 y 2, en azul) hibridación con las hebras de ADN de la plantilla, ADN polimerasa (
esferas azules, Pol). C, La temperatura del ensayo se eleva a 72 ° C y la ADN polimerasa agrega nucleótidos a
los cebadores para sintetizar nuevas moléculas de ADN de doble hebra (ADN nuevo en rojo) en el paso de
extensión del cebador. El nuevo ADN se usa luego para el siguiente ciclo.

dNTP individuales y los agrega a los 3′ final de cada cebador que se hibrida con
las cadenas de ADN diana. Las cadenas de ADN diana actúan como referencia o
molde para la polimerasa. Normalmente se deja que esta reacción prosiga
durante 1 a 2 minutos. Una vez que se completa este paso, los ciclos comienzan
de nuevo. El rendimiento del producto de PCR es inicialmente bajo durante los
primeros ciclos; sin embargo, después de aproximadamente 20 ciclos, el
rendimiento es alto y genera la mayor parte del producto de PCR. Una vez que se
completan todos los ciclos de PCR, muchos protocolos de PCR incluyen una
extensión final de 2 a 10 minutos para garantizar que se hayan completado
todas las reacciones de extensión del cebador y que todo el ADN en el tubo de
reacción sea de doble hebra. Una vez completada la extensión final, los
amplicones de PCR pueden almacenarse a -20 ° C o analizarse inmediatamente.
Componentes de la reacción en cadena de la polimerasa
A pesar de su sensibilidad y especificidad extremadamente altas, un inconveniente de
la PCR es que las condiciones de reacción deben configurarse correctamente;
de lo contrario, puede producirse una amplificación inespecífica o ninguna
amplificación. Varios componentes son necesarios para un ensayo de PCR
exitoso, incluido el ADN molde, los cebadores de oligonucleótidos, la ADN
polimerasa termoestable, el magnesio, el tampón para la polimerasa y los
desoxinucleótidos. Además, se requiere un termociclador.Cuadro 11.2
enumera estos componentes y sus usos.
Plantilla de ADN. La cantidad y calidad del ADN molde es importante para
un ensayo de PCR exitoso. El ADN diana generalmente se obtiene aislando el
ácido nucleico de las muestras. En un momento, el aislamiento de ácido nucleico
era una técnica laboriosa que podía llevar varias horas o incluso más de un día.
Ahora, se encuentran disponibles numerosos kits comerciales para aislar ácido
nucleico de muchas fuentes diferentes, como muestras clínicas y muestras
ambientales. Los kits de aislamiento de ácidos nucleicos también están
disponibles comercialmente para tipos específicos de microorganismos, como
los kits para ácidos nucleicos virales. Además, los sistemas automatizados de
aislamiento de ácidos nucleicos, como el

ERRNVPHGLFRVRUJ
226 PARTE 1 Introducción a la microbiología clínica
MESA 11,2 Componentes de la reacción en cadena de la polimerasa
Componente Objetivo
Plantilla de ADN Sirve como diana para PCR
Oligonucleótido Se utiliza para iniciar la síntesis de nuevo ADN.
imprimaciones hebras
ADN termoestable Sintetiza nuevas hebras de ADN
polimerasa
Magnesio Requerido por la ADN polimerasa Garantiza las
Buffer condiciones y el pH adecuados para
ADN polimerasa
Desoxinucleótidos Utilizado por la ADN polimerasa para sintetizar
nuevas hebras de ADN
Termociclador Instrumento que calienta y enfría rápidamente
Pasos del ciclo de PCR
ADN Ácido desoxirribonucleico; PCR, reacción en cadena de la polimerasa.
MagNA Pure Compact o el sistema LC (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN),
están disponibles para laboratorios de gran volumen. Se recomienda
encarecidamente el uso de kits y / o sistemas de extracción automatizados para
que se pueda obtener un ácido nucleico molde puro de alta calidad en una
concentración lo más alta posible. ADN total en una cantidad de 0,1 a 1µg se usa
a menudo para muchos protocolos de PCR, aunque generalmente se usa un
volumen estándar de ADN después de la extracción con un kit. Grandes
cantidades de ADN molde pueden aumentar las posibilidades de formar
productos de PCR inespecíficos.
Cebadores de oligonucleótidos. Se usa un par de cebadores en
ensayos de PCR estándar, en los que un cebador es homólogo a la región
flanqueante izquierda de la diana y el otro es homólogo a la región
flanqueante derecha. Hay instrumentos automatizados disponibles para
sintetizar cebadores; sin embargo, en la mayoría de los casos, los
laboratorios tendrán cebadores sintetizados para ellos. Las secuencias de
cebadores publicadas están disponibles para muchas dianas microbianas,
incluidos los genes resistentes a los antibióticos. Algunos laboratorios
diseñan sus propias secuencias de cebadores y, cuando se hace esto, se
deben seguir varios parámetros. Los cebadores no deben ser
complementarios entre sí para queprimerdimers (cebadores que se
aparean entre sí durante la PCR) no se forman, y los cebadores deben ser
tan específicos para la diana de interés como sea posible. El contenido de G
+ C de los cebadores debe ser del 40% al 60%, y los dos cebadores deben
tener contenidos de G + C similares. Además, evite un grupo de tres o más
G o C en el 3′ extremos de los cebadores porque esto podría aumentar las
posibilidades de productos de PCR inespecíficos.
Los cebadores utilizados en la PCR suelen tener una longitud de 15 a 30
nucleótidos. Los cebadores más pequeños que este tienen mayores posibilidades de
hibridación con otras secuencias de ADN de forma inespecífica, mientras que el tiempo
de hibridación puede incrementarse para cebadores más largos. Como se señaló, los
fabricantes que sintetizan sondas y cebadores generalmente calcularán la Tmetro para el
consumidor. Para los cebadores que tienen menos de 25 nucleótidos de longitud, la
fórmula Tmetro = 4 (G + C) + 2 (A + T) puede usarse para derivar un T aproximadometro
cálculo. Por ejemplo, una imprimación de 20 bases con un contenido de G + C del 50%
tendría una Tmetro de 4 (10) + 2 (10), o 60 ° C.Este cálculo no es válido si el Tmetro
determinado es superior a 68 ° C.Para cebadores y sondas de más de 25 nucleótidos, se
deben usar computadoras para calcular Tmetro. La mayoría de los ensayos de PCR están
diseñados para formar amplicones de PCR relativamente pequeños, a menudo de
menos de 1000 pares de bases (pb). De hecho, muchos ensayos de PCR producen
ERRNVPHGLFRVRUJ
amplicones de aproximadamente 100 pb. Los ensayos de PCR pueden ser más rápidos
para amplicones pequeños y la ADN polimerasa tiene una menor probabilidad de
cometer un error.
ADN polimerasa termoestable. Se han aislado y caracterizado varias
ADN polimerasas termoestables a partir de bacterias termófilas. De estos,
Taq La ADN polimerasa se describió por primera vez para su uso en PCR y
todavía se usa con mayor frecuencia. Hay muchos disponiblesTaq ADN
polimerasas en el mercado. En la actualidad, muchas son enzimas
recombinantes producidas en bacterias (p. Ej.,E. coli) y están altamente
purificados. Taq La ADN polimerasa comete errores ocasionales durante la
extensión del cebador, aunque muchas ADN polimerasas disponibles
comercialmente son ahora mezclas de enzimas que tienen tasas de error
reducidas. Además, los disponibles comercialmenteTaq Las ADN
polimerasas pueden tener diferentes velocidades a las que agregan dNTP
para sintetizar nuevas hebras de ADN; Se ha informado una tasa de
aproximadamente 100 dNTP por segundo en las condiciones correctas
para muchosTaq ADN polimerasas.
Magnesio. Un catión divalente, generalmente Mg2+ en forma de MgCl2, es
necesario para el correcto funcionamiento de Taq ADN polimerasa. Un MgCl
típico2 el rango de concentración es de 1 a 2 mM; muchos tampones de ADN
polimerasa se suministran con MgCl 1,5 mM2. Se producirá un bajo rendimiento
de productos de PCR si la concentración de magnesio es demasiado baja. Si la
concentración es demasiado alta, pueden producirse productos inespecíficos y
una incorporación incorrecta de nucleótidos. Además, Mg2+ se unirá a algunos de
los componentes de la PCR, incluidos los dNTP libres, la plantilla de ADN y los
cebadores, por lo que debería haber un ligero exceso de MgCl2
en la mezcla de reacción final. Altas concentraciones de Mg2+ incluso
puede inhibir la ADN polimerasa. La concentración de MgCl2
podría tener que optimizarse para un ensayo de PCR en particular.
Buffer. Se necesita un tampón optimizado para generar las condiciones
de reacción adecuadas para Taq ADN polimerasa. EstándarTaq Los
tampones de ADN polimerasa utilizados en la PCR se componen de Tris-HCl
y una sal, como KCl, a un pH de 8,3. El tampón a menudo se suministra con
la ADN polimerasa del fabricante, generalmente como×10 solución
concentrada. El tampón se diluye en un factor de 10 en la mezcla de PCR
final. Algunos tampones están disponibles con MgCl2. Esto es aceptable si
el ensayo de PCR funciona correctamente con la concentración
suministrada de MgCl.2, pero muchos laboratorios prefieren usar tampón
sin MgCl2 y agregue MgCl2 como un componente separado para optimizar
el ensayo de PCR.
Desoxinucleótidos. Se agregan desoxinucleótidos individuales a los 3′ final
de los cebadores hibridados por la ADN polimerasa durante la extensión del
cebador. Casi todos los ensayos de PCR utilizan una concentración final de 200µ
M para cada uno de los dNTP. Es importante que se utilice la misma
concentración de cada dNTP para que no se produzca una incorporación
incorrecta de dNTP incorrectos. Si la concentración de cada dNTP es demasiado
alta, la tasa de error deTaq Puede aumentar la ADN polimerasa.
Ciclador térmico. Un termociclador es un bloque de calor programable que se
utiliza para realizar ciclos de ensayos de PCR. La mayoría de los termocicladores
calientan y enfrían de manera eficiente y alternan entre temperaturas rápidamente, de
modo que las reacciones ocurren rápidamente. Hay muchos tipos diferentes de
termocicladores y muchos aceptan diferentes tamaños de tubos de PCR.
Prevención de la contaminación
Debido a que la PCR es tan sensible, pequeñas cantidades de ácido nucleico
extraído o amplicones remanentes de ensayos de PCR anteriores pueden
contaminar los ensayos de PCR futuros. Esto puede resultar en resultados falsos
positivos. Cuando se produce contaminación, todos los equipos y superficies de
trabajo deben limpiarse a fondo y, por lo general, reactivos nuevos.
 CAPÍTULO 11 Aplicaciones del diagnóstico molecular
(incluidas las imprimaciones). Además, la atención del paciente puede verse
comprometida si se generan resultados de PCR falsos positivos en un laboratorio
de microbiología clínica. Esto también puede conducir a una reducción de la
confianza en los resultados futuros de los miembros del personal del hospital.
Por eso es muy importante prevenir la contaminación en un laboratorio que
realiza PCR.
Los laboratorios que realizan PCR y otros métodos de amplificación
deben, si es posible, utilizar salas separadas para la extracción de
plantillas, la preparación de reactivos de PCR y la amplificación. Si esto no
es posible, utilice diferentes mesas de trabajo y espacios de trabajo del
laboratorio para cada función. En cualquier caso, nunca se deben colocar
muestras de ácido nucleico y amplicones de PCR en la habitación o espacio
de trabajo reservado para la preparación de reactivos. El trabajo debe fluir
siempre de la habitación más limpia a la más sucia. Por ejemplo, los tubos
con reactivos de PCR deben trasladarse al área reservada para la
extracción de ácido nucleico diana y, finalmente, al área en la que tiene
lugar el ciclo de PCR. El equipo de laboratorio, incluidas pipetas, batas de
laboratorio y suministros, no debe salir de las áreas designadas; cada área
debe tener equipo dedicado. Si es posible, La preparación del reactivo
debe realizarse en una campana de flujo laminar y la extracción de ácido
nucleico debe realizarse en una cabina de bioseguridad. Exponer los
espacios de trabajo a la luz ultravioleta (UV) reduce en gran medida las
posibilidades de contaminación. No exponga los reactivos de PCR y los
ácidos nucleicos extraídos a la luz ultravioleta porque la luz podría
dañarlos.Figura 11.4 ilustra un diagrama de flujo de trabajo.
D C
A B
FH BSC
HIGO. 11,4Diagrama de flujo de trabajo para un laboratorio de reacción
en cadena de la polimerasa (PCR). Sala A, Sala de preparación de reactivos
para componentes de PCR. Esta es una sala limpia con una campana de
flujo laminar(FH) donde no se permite ácido nucleico molde. Sala B, Sala de
extracción de ácidos nucleicos con cabina de seguridad biológica (BSC)
para muestras clínicas y control de contaminación. Sala C, Sala de ciclos
térmicos donde se amplifican las muestras. Sala D, Sala de detección de
electroforesis en gel de agarosa, si es necesario.
ERRNVPHGLFRVRUJ
227
Además, siempre se deben utilizar puntas de pipeta resistentes a aerosoles
para todos los procedimientos de amplificación. Utilice siempre guantes y
cámbielos con frecuencia, según sea necesario. También se deben usar batas de
laboratorio específicas en cada área de trabajo. Todos los tubos de muestras y
reactivos deben taparse cuando no se manipulen. Todo el equipo de laboratorio
y las superficies de trabajo deben limpiarse después de cada uso con una
solución fresca de lejía al 10% o con productos disponibles de varios fabricantes
diseñados para eliminar los ácidos nucleicos contaminantes. Otra forma de
reducir la contaminación es limitar el número de controles positivos utilizados en
cada ensayo de PCR. Los controles positivos pueden contaminar fácilmente
soluciones y muestras desconocidas si no se utilizan con cuidado. Es prudente
configurar controles positivos después de que se hayan configurado todas las
muestras desconocidas. Los controles negativos deben usarse ampliamente
para garantizar que el proceso de PCR no esté contaminado. Muchos
laboratorios utilizan una "muestra, sin control de plantilla" que tiene todos los
reactivos, excepto la plantilla de ADN añadida. Si se produce una amplificación
desde este tubo, es probable que haya contaminación.
Algunos laboratorios toman muestras de rutina de los espacios y
equipos de trabajo para determinar la contaminación. Estos exámenes de
contaminación deben incorporarse al programa de control de calidad del
laboratorio. Las muestras se utilizan como molde en ensayos de PCR; el
cribado puede ocurrir a un ritmo determinado por el laboratorio (p. ej.,
trimestralmente).
Finalmente, uracilonorte-glicosilasa (UNG) se ha utilizado con éxito
para reducir el arrastre de los ensayos de PCR. Algunos laboratorios
utilizan trifosfato de desoxiuridina (dUTP) en lugar de trifosfato de
desoxitimidina (dTTP) en los ensayos de PCR estándar; polimerasas no
corregidas comoTaq La ADN polimerasa colocará los nucleótidos de dUTP
donde deben colocarse los nucleótidos de dTTP, sin un efecto aparente
sobre la especificidad o sensibilidad. Por tanto, el amplicón de PCR se
produce normalmente, pero sustituyendo timina por uracilo. La enzima
UNG evita la replicación del ADN que contiene uracilo. Los reactivos de PCR
se pueden preincubar con UNG para garantizar que el arrastre de
amplicones no contamine los reactivos.
Análisis de productos de reacción en cadena de la polimerasa
El análisis de amplicones de PCR se puede realizar mediante diferentes
procedimientos. En el pasado, el análisis por electroforesis en gel de agarosa era
popular y utilizado por muchos laboratorios. La electroforesis en gel de agarosa
tarda de 1 a 2 horas en separar los productos de PCR, genera desechos
peligrosos y requiere un sistema de imágenes. Hoy en día, muchos laboratorios
clínicos están cambiando aPCR en tiempo real analizar los productos de PCR.
Electroforesis en gel de agarosa. La electroforesis es una técnica utilizada
para separar macromoléculas biológicas, como ácidos nucleicos y proteínas. La
electroforesis separa estas moléculas según el tamaño, la carga y la forma. La
agarosa es un compuesto elaborado a partir de algas. Los ácidos nucleicos se
mueven a través de una matriz de agarosa, básicamente un tamiz molecular,
mediante una corriente eléctrica. El ARN y el ADN poseen una carga neta
negativa en solución debido a sus cadenas principales de fosfato, por lo que un
campo eléctrico forzará a estas moléculas de un polo eléctrico negativo (cátodo)
a uno positivo (ánodo). Las moléculas grandes de ácido nucleico se mueven más
lentamente a través de la matriz de agarosa que las moléculas más pequeñas.
Para realizar la electroforesis en gel de agarosa, se mezcla agarosa en
polvo con un tampón y se calienta a ebullición para poner la agarosa en
solución. Muchos laboratorios derriten agarosa en un microondas; Se debe
tener cuidado para evitar el sobrecalentamiento, que puede hacer que la
agarosa hierva y cause quemaduras. Se deja que la agarosa derretida
228 PARTE 1 Introducción a la microbiología clínica
enfriar brevemente y la mezcla se vierte en una bandeja de fundición con
un peine de plástico colocado en una caja de gel. La bandeja de colada se
sella en los extremos con cinta o juntas de goma, y la agarosa se solidifica
cuando se deja enfriar durante 20 a 30 minutos. El peine de plástico se
retira de la agarosa solidificada, lo que deja varios pocillos en el gel de
agarosa.
El tampón de ejecución se vierte sobre el gel de agarosa solidificado
para que el gel quede completamente sumergido. Las muestras de ácido
nucleico se mezclan luego con un tampón de carga que sirve para dos
propósitos: (1) contiene un reactivo denso (por ejemplo, sacarosa o
glicerol) que aumenta la densidad de la muestra de ácido nucleico; y (2)
contiene un tinte de color, como azul de bromofenol y / o xileno cianol, que
puede usarse para observar el progreso de las muestras a través del gel de
agarosa. El búfer de carga, a veces denominadotampón de muestra,se
pueden comprar prefabricados de varios fabricantes. A continuación, se
pipetean las muestras de ácido nucleico en los pocillos del gel, se coloca la
tapa sobre la caja del gel y se ajusta y enciende la fuente de voltaje. El
reactivo denso en el tampón de carga evita que las muestras floten fuera
de los pocillos y entren en el tampón de ejecución del gel. El tiempo y el
voltaje usados para separar los fragmentos de ácido nucleico dependen
de la concentración del gel de agarosa y del tamaño anticipado de las
moléculas de ARN o ADN.
Los fragmentos grandes de ácido nucleico (generalmente> 1000 pb para
ADN o 1000 bases para ARN) generalmente se separan mejor en geles de
agarosa de bajo porcentaje, como 0,8% a 1%. Los fragmentos de ácido nucleico
más pequeños (<1000 pb o bases) se separan mejor en geles de agarosa al 1,5%
al 2%. El movimiento de los ácidos nucleicos de la muestra se puede rastrear
controlando el flujo del tampón de carga a través del gel. El azul de bromofenol
normalmente funcionará a aproximadamente 100 pb de ADN, dependiendo de la
concentración del gel de agarosa. Muchos laboratorios procesan geles de 70 a
100 V durante 1 a 2 horas. El voltaje puede aumentarse para acelerar la
separación, aunque los voltajes superiores a 100 V pueden calentar la agarosa y
provocar una separación desigual de los ácidos nucleicos. Cuando el gel termina
de correr, las muestras se pueden visualizar mediante tinción.Figura 11.5
describe la instrumentación utilizada en la migración de muestras de ADN en un
gel de agarosa.
HIGO. 11,5Electroforesis en gel de agarosa. Se muestra un gel de agarosa sumergido
en tampón de funcionamiento en una caja de gel; junto a la caja de gel hay una fuente
de voltaje que suministra la corriente eléctrica para separar los ácidos nucleicos. El
colorante de carga azul es visible en muestras individuales después de migrar
parcialmente a través de la matriz de gel de agarosa.Izquierda,Los pocillos son visibles
en la parte superior del gel para cargar muestras.
ERRNVPHGLFRVRUJ
La tinción de ácido nucleico más común utilizada después de la separación
por electroforesis en gel de agarosa es el bromuro de etidio. Este compuesto se
unirá a los ácidos nucleicos intercalando entre las bases. Cuando el bromuro de
etidio se irradia con luz ultravioleta, presenta una fluorescencia de color naranja
brillante. Esta fluorescencia se puede visualizar a simple vista sosteniendo una
lámpara ultravioleta sobre el gel o con un instrumento de formación de
imágenes que ilumine la parte inferior del gel con luz ultravioleta. La mayoría de
los laboratorios utilizan sistemas de imágenes para geles de agarosa porque las
imágenes de ácidos nucleicos fluorescentes pueden capturarse y analizarse
posteriormente con computadoras. Muchos laboratorios pipetean bromuro de
etidio a una concentración de 0,5 a 1µg / mL en agarosa fundida para que los
ácidos nucleicos se tiñen a medida que viajan a través de la matriz del gel. De lo
contrario, el gel debe bañarse en una solución de bromuro de etidio para teñir
antes de que pueda visualizarse. Los ácidos nucleicos aparecen como bandas en
geles.
Se debe tener cuidado con el bromuro de etidio porque es un
poderoso mutágeno. Siempre debe manipularse con guantes y los
geles manchados nunca deben tocarse con las manos desnudas.
Todos los desechos de bromuro de etidio deben tratarse como
desechos tóxicos y eliminarse adecuadamente. Por esta razón,
muchos laboratorios están cambiando a tintes alternativos, como
SYBR Verde, que es menos mutágeno que el bromuro de etidio,
aunque todavía tiene propiedades mutagénicas y también debe
manipularse y desecharse con cuidado, y se considera más sensible
que el bromuro de etidio.
Hay dos tipos de SYBR Green. SYBR Green I se utiliza para teñir el ADN; SYBR
Green II se utiliza para teñir ARN. Ambos se vuelven verdes después de la
exposición a la luz ultravioleta. La adición de SYBR Green a los geles de agarosa
fundidos tiende a producir bandas onduladas de ácido nucleico. Por esta razón,
la mayoría de los geles se tiñen en una solución de SYBR Green después de que
se completa la electroforesis.
Un estándar de tamaño molecular, a menudo llamado escalera, se utiliza
cuando se separan ácidos nucleicos mediante electroforesis en gel de agarosa.
Hay muchos estándares de tamaño de ácido nucleico disponibles
comercialmente. Se utiliza una escalera para determinar el tamaño aproximado
de las bandas de ácido nucleico en un gel de agarosa. Normalmente, uno de los
carriles del gel se reserva para el estándar de tamaño y se somete a
electroforesis con las muestras. Debido a que muchos amplicones de PCR tienen
menos de 1000 pb de longitud, muchos laboratorios utilizan un estándar de
1000 pb para buscar el tamaño esperado del producto de PCR. Debe conocerse
el tamaño del amplicón de PCR porque los cebadores se pueden usar para
calcular el tamaño esperado.Figura 11.6 muestra una imagen de amplicones de
PCR teñidos con bromuro de etidio en un gel de agarosa visualizados con una
lámpara UV. Figura 11.7muestra una imagen de amplicones de PCR teñidos con
bromuro de etidio separados por electroforesis en gel de agarosa visualizados
con un sistema de imágenes.
Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real. La PCR en tiempo
real fue un gran avance para la detección de productos de PCR. El método fue
desarrollado a principios de la década de 1990 por Higuchi y sus colaboradores.
Otros nombres para la PCR en tiempo real incluyen PCR cinética y PCR
homogénea. Los amplicones se detectan a medida que se acumulan durante la
PCR en tiempo real después de cada ciclo, a diferencia de la PCR estándar, en la
que los amplicones se detectan al final de todo el procedimiento. De este modo,
se puede observar rápidamente un resultado positivo, a menudo mientras el
ensayo aún está en marcha. Esta técnica no utiliza un gel de agarosa,
generalmente no acumula desechos peligrosos y el sistema de imágenes es
parte de la instrumentación en tiempo real. Otro beneficio importante de la PCR
en tiempo real es que las reacciones ocurren en tubos cerrados que no tienen
que abrirse para la detección.
 CAPÍTULO 11 Aplicaciones del diagnóstico molecular
M12 34 56
Wells
VPH
400 pb
100 pb
Frente de tinte
HIGO. 11,6Amplicones de reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
teñidos con bromuro de etidio separados en un gel de agarosa. La imagen
se obtuvo con una lámpara ultravioleta (UV). Se utilizó PCR para amplificar
un gen del virus del papiloma humano.(VPH) a partir de muestras clínicas.
Carril M es una escalera de 100 pb; las bandas de 100 y 400 pb se indican
medianteflechas a la izquierda de la imagen. Los pocillos en los que se
cargaron las muestras están indicados porflecha en la parte superior
derecha de la imagen, y el frente del tinte del búfer de carga se indica en la
parte inferior derecha. Carril 1, Control negativo (destilado H2O en lugar de
plantilla de ADN). Carril 2, Control VPH positivo. Carriles 3 a 6, Muestras
desconocidas. La muestra desconocida en el carril 6 fue positiva para VPH.
Se pueden observar amplicones inespecíficos en los carriles 3 y 5.
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
400 pb
100 pb
HIGO. 11,7Amplicones de reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
teñidos con bromuro de etidio separados en un gel de agarosa. La imagen
se obtuvo con un sistema de imagen. Se utilizó PCR para amplificar un gen
del virus del papiloma humano (VPH) a partir de muestras clínicas.Carril M,
Escalera de 100 pb; las bandas de 100 y 400 pb se indican medianteflechas
a la izquierda de la imagen. Los carriles 1 a 6 se analizaron para detectar el
VPH; Los carriles 8 a 13 se analizaron paraβ-actina, un control interno que
debe estar presente en todas las muestras humanas. Carriles 1 y 8, Control
negativo (destilado H2O en lugar de plantilla de ADN). Carriles 2 y 9, Control
positivo de VPH (también un control positivo para β-actina). Carriles 3 a 6 y
10 a 13, Muestras desconocidas. Carril 7, Carril vacío. La muestra
desconocida en el carril 4 fue positiva para el VPH.β-La actina estuvo
presente en todas las muestras desconocidas.
ERRNVPHGLFRVRUJ
229
Por lo tanto, existe una posibilidad mucho menor de que un amplicón de un
ensayo de PCR en tiempo real contamine el equipo, los reactivos y los espacios
de trabajo.
La PCR en tiempo real también se usa para cuantificar ácidos nucleicos, lo
que es útil para monitorear el progreso de ciertas enfermedades, como las
causadas por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), el virus de la
hepatitis B y el citomegalovirus. La PCR en tiempo real utiliza un tinte indicador
fluorescente, a menudo en forma de sondas o balizas etiquetadas, a veces
llamadasfluoróforo, un termociclador que utiliza una fuente de luz ultravioleta
para excitar al reportero y una cámara controlada por un sistema informático.
Los instrumentos de PCR en tiempo real pueden medir los aumentos en la
fluorescencia del indicador a medida que se acumulan los amplicones de PCR, lo
que conduce a resultados rápidos y precisos. El sistema informático registra los
picos fluorescentes como intensidad de fluorescencia frente al número de ciclos
de PCR.Figura 11.8 muestra una curva de fluorescencia de PCR en tiempo real.
La fluorescencia se mide controlando directamente un aumento de la
fluorescencia o indirectamente mediante un proceso llamado
transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (
PREOCUPARSE). FRET es la transferencia de energía de una molécula de
colorante donante a una molécula de colorante aceptora; FRET también
ocurre entre un tinte fluorescente y una molécula de extinción que
mantiene baja la luz emitida hasta que el tinte fluorescente se libera del
extintor. Para que se produzca FRET, las dos moléculas deben estar muy
próximas, entre uno y cinco nucleótidos entre sí.
Algunas plataformas de PCR en tiempo real pueden proporcionar
análisis de la curva de fusión para determinar los resultados del ensayo o
verificar la pureza del producto de PCR y determinar si hay dímeros de
cebadores presentes. Todas las moléculas de dsDNA tienen una Tmetro. Esto
está determinado por la longitud y el contenido de GC del híbrido de
dsDNA. Cuando un tinte fluorescente se une al producto de PCR o se une a
una sonda unida al producto de PCR, la plataforma de PCR en tiempo real
detecta una señal fluorescente. Sin embargo, cuando la temperatura
aumenta y alcanza la Tmetro, la cantidad de fluorescencia disminuye
repentinamente a medida que las sondas y / o el tinte fluorescente se
disocia del producto de PCR. Esta repentina disminución de la
fluorescencia se puede medir como un pico.
Hay muchas plataformas de PCR en tiempo real disponibles comercialmente.
Algunos ejemplos incluyen LightCycler / LightCycler 2.0 (Roche Diagnostics,
Figura 11.9), Ciclador integrado de 3M (Focus Diagnostics, Figura 11.10),
GeneXpert (Cepheid) y GeneAmp 5700 y Prism 7700 (Applied Biosystems). Estas
plataformas utilizan un intercambio de aire rápido o una conductividad térmica
rápida alrededor del recipiente de reacción para obtener un termociclado
rápido; también tienen una alta relación superficie / volumen de la mezcla de
reactivos de PCR. Por tanto, además de las ventajas de la PCR en tiempo real en
comparación con la PCR estándar, la PCR en tiempo real es extremadamente
rápida. Muchos ensayos de PCR en tiempo real dan resultados positivos en 30 a
40 minutos, en comparación con aproximadamente 4 a 5 horas para la PCR
estándar. Por ejemplo, el tiempo de desnaturalización para la PCR en tiempo real
suele ser de unos pocos segundos, en comparación con los 15 a 30 segundos de
la PCR estándar. Además, muchos procedimientos de PCR en tiempo real utilizan
cebadores con una Ta de aproximadamente 72 ° C, de modo que el recocido y la
extensión del cebador se produzcan a la misma temperatura. Esto ahorra un
tiempo considerable. Las plataformas de PCR en tiempo real utilizan diferentes
variaciones de detección, incluida la5′ ensayo de nucleasa(a veces llamado el
Ensayo TaqMan), FRET de doble sonda, losbaliza molecular método,
Imprimaciones Scorpiony colorantes intercalados como SYBR Green para la
detección de productos acumulados.
230 PARTE 1 Introducción a la microbiología clínica

19

18

17

dieciséis

15
PC del VHS
14

13

12
PC de β-actina

11

10
Fluorescencia (F1)

5
β-actina SNTC
4

-1

-2
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Número de ciclo

HIGO. 11,8Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (PCR) análisis de datos para el virus del herpes
simple (HSV)de un espécimen humano. Los picos fluorescentes se representan como intensidad de fluorescencia (y
eje) versus el número de ciclo de PCR (X eje). Un control positivo para HSV(PC del VHS) fue analizado junto con un
control interno, β-actina, que debe estar presente en todas las muestras humanas. El HSV PC yβ-actina-control
positivo (β-actina PC) tienen picos fluorescentes, al igual que los βensayo de -actina de la muestra desconocida. La
muestra desconocida no tuvo un pico de HSV. Además, una muestra, sin control de plantilla(SNTC) fue analizado
tanto para HSV como para β-actina, y no hay picos fluorescentes para ninguno.

oligonucleótidos de alrededor de 18 a 22 bases de largo que generalmente están

Verificación de caso 11,2
Aunque la PCR se usa para amplificar rápidamente la secuencia diana, se debe tomar
una decisión sobre qué método se usará para determinar cómo se visualizan los
amplicones generados. La electroforesis en gel de agarosa permite al científico del
laboratorio ver los amplicones teñidos, pero este método agrega otra hora o más al
proceso de PCR. Por tanto, suele ser más ventajoso utilizar la PCR en tiempo real para
que las curvas generadas por amplicones se muestren en tiempo real. Los resultados
se generan más rápidamente con este método y pueden permitir que los pacientes
sean tratados más rápidamente.
5′ Ensayo de nucleasa (TaqMan). El 5′ ensayo de nucleasa utiliza el 5′
actividad exonucleasa de algunos Taq polimerasas (por ejemplo, ADN
polimerasa de oro, Applied Biosystems.) y sondas TaqMan (Roche
Molecular Diagnostics, Pleasanton, CA). Las sondas TaqMan son
etiquetados en los 5′ termine con un tinte reportero fluorescente y en el 3′ Termine con
un quencher de tinte.
Figura 11.11 ilustra el principio de un 5′ ensayo de nucleasa. La
fluorescencia del colorante indicador se mantiene a un nivel de fondo bajo
como resultado de la proximidad del desactivador por FRET (debido a la
conformación de la sonda), en el que el fluoróforo dona energía al
desactivador. La sonda TaqMan para un ensayo de PCR específico está
diseñada para complementar parte de la región interna del amplicón de
PCR durante el paso de hibridación del cebador. Durante la extensión del
cebador, elTaq La ADN polimerasa extiende una hebra de ADN
complementaria a partir de los cebadores utilizando la hebra molde con la
que se hibrida la sonda TaqMan. El tinte reportero es liberado por el 5′
actividad nucleasa de la polimerasa primero, y luego se libera toda la
sonda. La fluorescencia aumenta a medida que el fluoróforo se

ERRNVPHGLFRVRUJ
 CAPÍTULO 11 Aplicaciones del diagnóstico molecular
HIGO. 11,9LightCycler (Roche Diagnostics), un sistema de reacción en cadena de la
polimerasa en tiempo real.
HIGO. 11.10Ciclador integrado de 3M (Focus Diagnostics), otra plataforma de
reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real. (Imagen cortesía de Steve
D. Mahler.)
retirado de las inmediaciones del extintor. La fluorescencia aumenta en
una escala lineal a medida que se sintetiza más producto de PCR durante
los ciclos de PCR posteriores.
Ventajas del 5′ El método de nucleasa incluye lo siguiente:
(1) solo se detectan productos de PCR específicos, (2) se pueden usar
protocolos de PCR estándar y (3) las reacciones de hibridación y
escisión no interfieren con la producción del producto de PCR. Una
desventaja es que deben diseñarse y / o comprarse sondas específicas
para dianas específicas, y las sondas marcadas con fluorescencia son
caras en comparación con los oligonucleótidos no marcados. Otra
desventaja es que el análisis de la curva de fusión no se puede realizar
cuando se utilizan sondas TaqMan porque estas sondas se hidrolizan
durante el proceso de amplificación.
Transferencia de energía de resonancia de fluorescencia de doble sonda. Esta
El método a veces se llama método FRET de doble oligonucleótidoo simplemente
el Técnica FRET. FRET de doble sonda utiliza dos sondas etiquetadas, como se
muestra enFigura 11.12. Una sonda está etiquetada en el 3′terminar con un tinte
fluorescente de donante, y la otra sonda está etiquetada en el 5′ terminar con un
colorante fluorescente aceptor. Las sondas son
ERRNVPHGLFRVRUJ
231
Cebador Investigacion
F
Q
PAG F Q
B
PAG Q
F
Q
PAG
HIGO. 11.115′ ensayo de nucleasa (TaqMan). A, El cebador y la sonda
se hibridan con el ADN molde. ADN polimerasa(PAG) comienza a
extenderse desde la imprimación. B, La ADN polimerasa escinde el
tinte fluorescente (F) de la sonda y del extintor (Q).Se observa
fluorescencia. C, A medida que la ADN polimerasa continúa
extendiéndose y sintetizando una nueva hebra de ADN, la sonda se
fragmenta y el tinte fluorescente y el extintor se liberan
completamente entre sí. La fluorescencia se acumula a medida que se
liberan moléculas de tinte fluorescente.
diseñado para recocer de la cabeza a la cola con amplicones de PCR.
Cuando esto ocurre, los dos tintes fluorescentes se acercan entre sí y se
produce FRET. La fuente de luz emitida por la plataforma de PCR en tiempo
real excita el tinte en la primera sonda, y este tinte luego emite luz
fluorescente a una longitud de onda más larga. La energía que desprenden
los 3′ El tinte luego excita el tinte fluorescente en la segunda sonda porque
los dos tintes están muy juntos. Este tinte luego emite luz fluorescente a
una longitud de onda más larga que antes y esto es medido por el
instrumento. La intensidad de la luz fluorescente emitida es proporcional a
la cantidad de producto de PCR amplificado durante la reacción. La emisión
se detecta solo cuando las dos sondas se aparean con sus respectivas
secuencias complementarias en los amplicones de PCR. Es importante
señalar que la detección de fluorescencia ocurre solo después de que las
dos sondas hayan
232 PARTE 1 Introducción a la microbiología clínica
5′ 3′ 5′ 3′
D A
A Baliza molecular
5′ 3′
D A
5′ 3′
D A
HIGO. 11.12Transferencia de energía de resonancia de fluorescencia de doble sonda.
A, Dos sondas marcadas se hibridan con el producto de la reacción en cadena de
la polimerasa (PCR) a medida que se acumula. Una sonda está marcada con un
tinte fluorescente de donante(D) en el 3′ fin; la otra sonda está etiquetada en el 5
′ terminar con un tinte aceptor (A). Las dos sondas se hibridan con el producto
de PCR de la cabeza a la cola. En este diagrama se muestra una hebra única de
producto de PCR después de que se haya producido la desnaturalización.
B, La fuente de luz de la plataforma de PCR en tiempo real excita el
tinte fluorescente del donante. El donante luego transfiere esta
energía al tinte aceptor. El tinte aceptor se excita y emite luz
fluorescente, que es leída por el instrumento. La fluorescencia
aumenta a medida que se acumula el producto de la PCR.
hibridado, por lo que la medición se produce durante el paso de
hibridación del cebador. Cuando se eleva la temperatura para el paso de
extensión del cebador, las dos sondas son desplazadas porTaq La ADN
polimerasa y FRET se detiene porque las sondas ya no están muy próximas.
La siguiente medición se realiza después del paso de recocido del
cebador en el siguiente ciclo. Esta es una técnica específica que también
permite el análisis de la curva de fusión de los amplicones de PCR
resultantes. Sin embargo, la técnica es cara y requiere habilidad en el
diseño de sondas. El sistema LightCycler utiliza FRET de doble sonda para
varios ensayos. La primera sonda está etiquetada en el 3′ termina con la
fluoresceína del donante y la segunda sonda se marca con el tinte aceptor
LightCycler Red 640 en el 5′ fin. LightCycler Red 640 emite luz fluorescente
roja que mide el instrumento a medida que aumenta el producto de PCR.
Balizas moleculares. La técnica de la baliza molecular utiliza segmentos
cortos de ADN con colorantes adheridos a los 5′ y 3′ termina. Se adjunta un
tinte indicador marcado con fluorescencia al 5′ extremo del segmento de
ADN y un extintor se adjunta a los 3′ final de la balizaFigura 11.13). La
baliza molecular está diseñada para tener bases de ADN complementarias
en cada extremo para que puedan emparejarse entre sí y formar una
estructura de horquilla con un bucle; esta es la forma natural de la baliza
molecular. La porción de bucle de la molécula de horquilla es
complementaria a una de las hebras de amplicón de PCR. FRET apaga la
fluorescencia del tinte indicador mientras la baliza está en la estructura de
horquilla porque los dos tintes se mantienen juntos en estrecha
proximidad. A medida que avanza la PCR, el paso de desnaturalización
separa el ADN molde, el ADN del producto de PCR (si está presente) y la
baliza molecular. Cuando se baja la temperatura para el paso de
hibridación del cebador, una cadena de ADN de baliza se hibrida
ERRNVPHGLFRVRUJ
Complementario
al producto de PCR
F Q
F Q
HIGO. 11.13Balizas moleculares. La sonda de baliza molecular es una
estructura de bucle de horquilla complementaria. Un tinte fluorescente
está unido al 5′ final de la horquilla y un extintor (Q) se adjunta a los 3′ fin.
Una estructura de bucle en la parte superior de la molécula es
complementaria a la reacción en cadena de la polimerasa formada(PCR)
producto formado. Cuando se produce la etapa de desnaturalización de la
PCR, el producto de la PCR y las sondas de baliza molecular se disocian;
Aquí se muestra una hebra única de un amplicón de PCR. La baliza se
hibrida con el producto de PCR formado y luego se elimina el tinte
fluorescente de la molécula extintora. La fluorescencia aumenta a medida
que se acumula el producto de la PCR.
a un amplicón de PCR, si está presente, y los colorantes desactivador e indicador
ya no están muy próximos. La fluorescencia se observa de forma lineal a medida
que se acumulan los amplicones de PCR. Las moléculas de baliza molecular que
no se hibridan con los amplicones de PCR reforman las estructuras en horquilla y
no se observa fluorescencia.
Imprimación Scorpion. Un cebador Scorpion utiliza un único
oligonucleótido para cebar una secuencia específica y detectar la
acumulación de producto de PCR. Figura 11.14 ilustra los cebadores
Scorpion y su mecanismo. Estructuralmente, los cebadores Scorpion se
parecen a las balizas moleculares en que la forma no hibridada del
cebador Scorpion es un bucle de horquilla complementario. Los cebadores
Scorpion tienen una sonda de fluoróforo con un bloqueador de PCR
vinculado a los 5′ final y un extintor adjunto a los 3′ final de la estructura de
bucle de horquilla; FRET reduce la fluorescencia. Además, un tallo en el 3′ El
extremo del bucle de horquilla es complementario a una secuencia
específica del ADN diana. La ADN polimerasa se extiende desde este tallo,
de modo que al final de la primera ronda de PCR, el cebador Scorpion se
une al producto sintetizado. Al comienzo del segundo ciclo, la estructura
en horquilla del cebador Scorpion se desnaturaliza, junto con la plantilla de
ADN en el ensayo. La secuencia de la sonda de horquilla luego se hibrida
con el producto que se acaba de sintetizar. Cuando esto ocurre, el
fluoróforo y la molécula inhibidora se separan; la acumulación de
fluorescencia indica la acumulación de amplicones de PCR.
SYBR Green Detección de cadena de polimerasa en tiempo real
Productos de reacción. Como se describió anteriormente, SYBR Green es un tinte
fluorescente que se une a los ácidos nucleicos. SYBR Green I se une
 CAPÍTULO 11 Aplicaciones del diagnóstico molecular
Imprimación de escorpión
5′ 3′
F Q
A
5′ 3′
F Q
B producto en la Administración de Drogas y Alimentos de los EE. UU. (FDA) y los
5′
F Q
C
Q F
HIGO. 11.14Mecanismo de cebador Scorpion. A, Un cebador Scorpion es
una sonda y un cebador en una molécula. Es una molécula de horquilla
etiquetada en el 5′ terminar con un fluoróforo (F) y el 3′ terminar con un
extintor (Q). También se adjunta una breve secuencia de cebado a los 3′
fin. La secuencia de cebado se hibrida con el ADN diana.
B, La ADN polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN a partir de la
secuencia de cebado corta. C, Se produce la desnaturalización y el
ADN recién formado y el cebador Scorpion se disocian. Una porción
interna de la imprimación Scorpion es complementaria al producto
recién formado. Esta porción se hibrida con el producto de reacción
en cadena de la polimerasa y separa el fluoróforo del extintor; luego
se acumula la fluorescencia.
inespecíficamente al dsDNA. El resultado final de la mayoría de las aplicaciones de PCR
en tiempo real es un amplicón de ADN, por lo que SYBR Green I se utiliza con mayor
frecuencia. La fluorescencia aumenta a medida que se acumula el producto de la PCR.
Durante el paso de desnaturalización, SYBR Green I no se une al ADN porque las
moléculas de ADN son monocatenarias a alta temperatura. Algunas moléculas de
colorante comienzan a unirse al ADN durante la fase de primer borrado, lo que da
como resultado una fluorescencia de fondo de bajo nivel. El tinte luego se une
rápidamente al dsDNA durante el paso de extensión del cebador. A medida que los
ciclos comienzan de nuevo, la fluorescencia vuelve a caer a niveles de fondo bajos
cuando la temperatura aumenta y la desnaturalización ocurre nuevamente. Por tanto,
la detección mediante la plataforma de PCR en tiempo real se produce después de cada
ciclo de PCR.
Usar SYBR Green es más económico que usar sondas etiquetadas y puede
usarse para análisis de curvas de fusión. Sin embargo, el tinte se une
ERRNVPHGLFRVRUJ
233
a cualquier producto de PCR inespecífico que pueda formarse durante los
ensayos y también se une a los dímeros de cebadores. Tenga en cuenta que el
análisis de la curva de fusión debe realizarse después de utilizar la detección
SYBR Green para determinar si se han formado dímeros de cebadores o
productos de PCR no específicos; la temperatura de la curva de fusión para los
dímeros de los cebadores y los productos no específicos será diferente a la de
los productos de PCR amplificados.
Aplicaciones de la reacción en cadena de la polimerasa
en el laboratorio de microbiología clínica
Con la disponibilidad comercial de plataformas y ensayos de PCR en tiempo real,
muchos laboratorios clínicos utilizan este método para diagnosticar infecciones
bacterianas, virales, fúngicas o parasitarias. También se han descrito muchos
ensayos para los mecanismos de resistencia a los fármacos antimicrobianos. Se
han descrito ensayos de PCR para casi todos los organismos clínicamente
significativos. Varias empresas producen ensayos basados en kits llamados
reactivos específicos de analito (ASR). Los ASR son el ingrediente activo de una
prueba interna y los laboratorios los utilizan para establecer y realizar pruebas
de PCR internas (o las llamadas pruebas caseras). El fabricante registra el
laboratorios utilizan los ASR en los ensayos. Los laboratorios que utilizan ASR
deben establecer y mantener el rendimiento de la prueba de PCR y los reactivos.
Los resultados de los pacientes con ensayos de PCR obtenidos con el uso de ASR
se pueden informar en un entorno de diagnóstico; Los ASR pertenecen a una
clase de reactivos que no requiere la aprobación de la FDA. Los laboratorios que
reportan resultados con ASR deben incluir una declaración con los resultados,
como la siguiente:
Este ensayo y las características de rendimiento de la prueba fueron
desarrollados por [insertar el nombre del laboratorio]. Esta prueba no ha
sido autorizada ni aprobada por la Administración de Drogas y Alimentos
de los EE. UU. (FDA). La FDA ha determinado que dicha autorización o
aprobación no es necesaria. Esta prueba se utiliza con fines clínicos. No
debe considerarse como de investigación o para investigación. Este
laboratorio está regulado por las Enmiendas de mejora de laboratorio
clínico de 1988 (CLIA-88) como calificado para realizar pruebas de
laboratorio clínico de alta complejidad.
Varias empresas suministran ASR y / o kits aprobados por la FDA para sus
respectivos sistemas de instrumentos para varios organismos o genes de
resistencia a los antibióticos. Por ejemplo, Cepheid (Sunnyvale, CA) comercializa
los sistemas GeneXpert y SmartCycler y ofrece ensayos de PCR para varios
organismos que se pueden usar directamente en muestras clínicas. Los tiempos
de respuesta son muy rápidos para estos ensayos y pueden mejorar
enormemente la atención al paciente. Roche Diagnostics (Indianapolis, IN)
también ofrece varios ensayos de PCR en sistemas de instrumentos. Por
ejemplo, el COBAS Amplicor es un ensayo basado en PCR automatizado paraC.
trachomatis y N. gonorrhoeae. El ensayo cuenta con la aprobación de la FDA
para analizar muestras de hisopos endocervicales, orina de hombres y muestras
de hisopos uretrales de hombres sintomáticos.
Otros procedimientos de reacción en cadena de la polimerasa
Se han publicado muchas variantes diferentes de PCR en la bibliografía o se han
desarrollado por diversas empresas. Muchas de estas variaciones de la PCR se
utilizan para fines específicos. Aquí se analizan algunos de los procedimientos de
PCR variantes más comunes, incluida la PCR de transcripción inversa (RT-PCR), la
PCR multiplex y la PCR anidada.
Reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa. La
técnica más sensible disponible para detectar y cuantificar el ARNm o la
transcripción es la RT-PCR, también llamada la transcriptasa inversa
234 PARTE 1 Introducción a la microbiología clínica
PCR y PCR de ARN. La técnica es tan sensible que es posible la evaluación
de la transcripción de una sola celda. El método utiliza una enzima llamada
la transcriptasa inversa (nombre propio es ADN polimerasa dependiente
de ARN) para sintetizar una hebra complementaria de ADN (ADN
complementario o ADNc) a partir de una plantilla de ARN. El ADNc
resultante se usa luego como molde en un ensayo de PCR usando ADN
polimerasa (ver anteriormente).
El ARN molde de alta calidad es importante para la RT-PCR. Se encuentran
disponibles numerosos kits comerciales para la extracción de ARN de muestras
clínicas, incluidos kits específicos para virus y microorganismos. Por lo general,
los laboratorios clínicos aíslan el ARN total de las muestras, aunque en realidad
el ARNm se usa como molde por la transcriptasa inversa. Los kits están
disponibles solo para extracción de ARNm. Sin embargo, el ARNm constituye solo
alrededor del 1% al 4% del ARN total de una célula, por lo que generalmente es
más fácil aislar el ARN total y usarlo para RT-PCR. Se pueden usar sistemas de
extracción de ácido nucleico automatizados para aislar ARN. La integridad de la
plantilla de ARN se puede evaluar mediante electroforesis en gel de agarosa,
espectrofotometría UV o el uso de controles durante el ensayo de RT-PCR.
Generalmente, el ARN extraído con el uso de kits comerciales es de alta calidad,
por lo que la mayoría de los laboratorios clínicos utilizan controles para evaluar
la calidad e integridad de las muestras de ARN. El ADN genómico de una muestra
puede contaminar la plantilla de ARN, por lo que los laboratorios deben tratar el
ARN con una desoxirribonucleasa (DNasa), una enzima que hidroliza el ADN,
antes de que el ARN se utilice en RT-PCR. Muchos kits de extracción de ARN
incluyen un paso de DNasa.
Los controles internos se utilizan comúnmente durante la RT-PCR.
Cuando los laboratorios clínicos analizan virus de ARN a partir de muestras
clínicas humanas, generalmente se utiliza un control interno para una
especie de ARN humano para evaluar la integridad y la calidad de una
muestra. Los controles internos para estos ensayos incluyen
transcripciones de genes humanos tales como β-actina, gliceraldehído
fosfato deshidrogenasa y rARN 18S. Cada muestra clínica debe ser positiva
durante un ensayo de RT-PCR para uno de estos controles internos o el
ensayo no será válido.
Los productos de PCR que resultan de los ensayos de RT-PCR pueden analizarse en
laboratorios de microbiología clínica mediante electroforesis en gel de agarosa o
mediante PCR en tiempo real. En cuanto a la PCR estándar, la mayoría de los
laboratorios utilizan ahora la PCR en tiempo real para analizar los amplicones de RT-
PCR. Algunos kits disponibles comercialmente incluyen todos los componentes
utilizados para los ensayos de RT-PCR, y la mayoría de ellos están diseñados para PCR
en tiempo real o son fácilmente aptos para PCR en tiempo real. Además, se encuentran
disponibles algunos kits y ASR para la detección de organismos particulares mediante
RT-PCR.
Los laboratorios clínicos y de investigación utilizan dos tipos generales
de ensayos de RT-PCR, RT-PCR de un paso y de dos pasos. La RT-PCR de un
solo paso utiliza un solo tubo para realizar el paso de transcriptasa inversa
y el posterior ciclo de PCR del ADNc. La RT-PCR de dos pasos utiliza un solo
tubo para el paso de la transcriptasa inversa, seguido de la transferencia
de ADNc a un segundo tubo (o serie de tubos) para los siguientes pasos de
la PCR. Una de las ventajas clave del uso de la RT-PCR en un solo paso es
que minimiza el posible arrastre de amplicones al entorno de trabajo, el
equipo y otros reactivos del ensayo. La variación de tubo a tubo se reduce
porque no se inducen errores potenciales al retirar el amplicón del primer
tubo y pipetear en otros tubos. Una ventaja de la RT-PCR de dos pasos es
que el ADNc resultante se puede utilizar en muchos tipos diferentes de
reacciones posteriores, especialmente si un laboratorio intenta optimizar
una reacción. La RT-PCR de dos pasos también es útil para la detección de
más de un tipo de
ERRNVPHGLFRVRUJ
transcripción de una muestra. Por ejemplo, la plantilla de ADNc podría
eliminarse del primer tubo y agregarse a un segundo tubo, con cebadores
específicos para un tipo de transcripción. Al mismo tiempo, se podría
agregar la misma plantilla de ADNc a un segundo tubo diferente, con otros
cebadores específicos para una transcripción diferente. El uso de RT-PCR
de dos pasos requiere un pipeteo cuidadoso; Los laboratorios clínicos
deben usar una campana de flujo para reducir el riesgo de arrastre al abrir
el primer tubo de ADNc.
El paso inicial de RT-PCR implica sintetizar ADNc complementario a una
transcripción de ARN con transcriptasa inversa. Esta no es una reacción
específica; El ADNc se sintetiza a partir de todas las transcripciones en un
tubo. Se encuentran disponibles varios tipos de transcriptasa inversa,
incluida la transcriptasa inversa del virus de la mieloblastosis aviar (AMV), la
transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Moloney y la
transcriptasa inversa rTth deT. thermophilus, entre otros. Muchas
transcriptasas inversas comerciales son enzimas mezcladas que tienen
diferentes propiedades, incluidas las enzimas que tienen características de
transcriptasa inversa y ADN polimerasa. Por tanto, la misma enzima se
puede utilizar en RT-PCR de un tubo. Muchas transcriptasas inversas
funcionan mejor a 42 ° C, por lo que el primer paso de muchos ensayos de
RT-PCR se produce a 42 ° C durante 30 minutos. Después de este paso, la
temperatura se eleva a 95 ° C durante 1 a 5 minutos para desnaturalizar el
ADN y, para varias enzimas comerciales, inactivar la función de
transcriptasa inversa de la enzima. El aumento de la temperatura también
activa la función de la ADN polimerasa de las enzimas mezcladas. A
continuación, se realiza un ciclo de PCR estándar y se analizan los
productos de PCR.
La RT-PCR se utiliza a menudo en los laboratorios de microbiología clínica
para detectar virus de ARN a partir de muestras clínicas. La RT-PCR se puede
utilizar para cuantificar la cantidad de virus en muestras clínicas; esto se realiza
para el VIH y el virus de la hepatitis C con el sistema Roche Amplicor. Otras
aplicaciones de la RT-PCR incluyen el análisis cuantitativo de la expresión génica,
la detección de genes humanos implicados en enfermedades y la detección de
cánceres a partir de muestras humanas.
Reacción en cadena de la polimerasa multiplex. Algunos laboratorios
utilizan PCR multiplex para detectar simultáneamente dos o más objetivos
diferentes de un tubo de PCR. Esta técnica emplea dos conjuntos de cebadores
diferentes y se utiliza a menudo para detectar un control interno en el mismo
tubo que la secuencia objetivo. Por ejemplo, un ensayo de PCR diseñado para
detectar el gen de resistencia a la meticilina (mecA) en S. aureus puede utilizar
un juego de cebadores de control interno para asegurarse de que el organismo
está S. aureus y un par de cebadores para el mecUn gen en un tubo. Esta técnica
se puede adaptar para PCR en tiempo real o análisis mediante electroforesis en
gel de agarosa.
Si el control interno no es detectable, los resultados del ensayo no son
válidos y la prueba debe repetirse. Si se detecta el control interno y no se detecta
la secuencia diana, se puede suponer razonablemente que la diana de interés no
está presente. Sin embargo, las condiciones del ensayo de PCR para la PCR
multiplex deben optimizarse cuidadosamente. Todos los juegos de cebadores
deben tener una T similarmetro, y esto no siempre es fácil de diseñar. Además, se
deben optimizar otras condiciones de reacción, como las concentraciones de
todos los reactivos y los tiempos de desnaturalización, hibridación y extensión.
En algunos casos, la mezcla de imprimaciones provoca interferencias. La
configuración de un ensayo de PCR multiplex eficiente puede llevar una cantidad
considerable de tiempo. En lugar de esto, muchos laboratorios usan un tubo
para la reacción de control interno y un tubo para el objetivo de interés.Figura
11.15 muestra productos de PCR multiplex separados por electroforesis en gel
de agarosa y visualizados con un sistema de imagen.
 CAPÍTULO 11 Aplicaciones del diagnóstico molecular
M12 34 5 6 7 8 9 10 11 12 13
100 pb Æ
HIGO. 11.15Productos de la reacción en cadena de la polimerasa múltiple
(PCR) separados por electroforesis en gel de agarosa. PCR multiplex para
ermA (139-bp) y ermC (190-bp) genes de Staphylococcus aureus
aislamientos. El carril M es la escalera de 100 pb; la banda de 100 pb está
indicada por unflecha a la izquierda de la imagen. Carril 1,Control negativo
(destilado H2O como plantilla). Carril 2, ermA- control positivo (producto de
PCR clonado). Carril 3, ermC-control positivo (producto de PCR clonado).
Carriles 4 a 13, Resistente a la meticilina
S. aureus aislamientos. Los aislamientos de los carriles 6, 7, 9, 11 y 13
fueron positivos paraermA, mientras que el aislado del carril 12 fue
positivo para ermC.
Reacción en cadena de la polimerasa anidada. La PCR anidada es una
técnica de PCR altamente sensible y específica que sirve como una forma de
control interno que asegura la especificidad. La PCR anidada consta de dos
ensayos de PCR consecutivos diferentes. La primera reacción es un ensayo de
PCR estándar que utiliza un conjunto de cebadores de PCR. El amplicón
producido a partir de esta primera reacción se utiliza luego como diana en un
ensayo de PCR posterior. El segundo par de cebadores es complementario a una
región interna del amplicón derivado del primer ensayo de PCR. El amplicón se
sintetiza durante este segundo ensayo de PCR solo si el amplicón se produjo a
partir de la primera reacción, por lo que este mecanismo de control interno sirve
como marcador de especificidad.
Algunos laboratorios clínicos utilizan la PCR anidada cuando la cantidad de
ADN molde inicial es muy baja, de modo que la primera reacción genera ADN
molde que se amplifica aún más hasta una cantidad detectable. Además,
algunos laboratorios utilizan un par de cebadores específicos para un género o
una familia viral. Si hay amplicón, según se determina mediante electroforesis en
gel de agarosa o PCR en tiempo real, se utilizan cebadores que determinan la
especie, la cepa o el tipo de una reacción posterior. Por ejemplo, el primer
ensayo de PCR podría usarse para determinar si un herpesvirus humano está
presente en una muestra. Si están presentes, se podrían usar cebadores
específicos para el virus del herpes humano tipo 1 o 2 para determinar el virus
específico. Uno de los inconvenientes de la PCR anidada es que no es un sistema
cerrado, ya que el primer tubo de ensayo debe abrirse, por lo que existe la
posibilidad de contaminación.
Reacción en cadena de la polimerasa digital. La PCR digital es una técnica
de PCR cuantificable en tiempo real que traduce los datos de amplificación
exponencial en señales digitales. La PCR digital divide una muestra de ácido
nucleico en particular en una gran cantidad de PCR individuales. Algunas de las
reacciones no contienen molde y otras contienen moléculas de ácido nucleico
diana individuales. Las reacciones que tienen ácido nucleico diana se
transforman en señales digitales positivas y las reacciones sin ácido nucleico
diana se transforman en señales digitales negativas. La cantidad absoluta de
ácido nucleico se puede determinar mediante el recuento de señales positivas
(reacciones positivas). La PCR digital se ha utilizado en varias aplicaciones,
incluido el cribado genético, la oncología y la detección de un número reducido
de ácidos nucleicos de microorganismos.
Otro ácido nucleico
Reacciones de amplificación
Amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicosNASBA es un
procedimiento isotérmico, lo que significa que las reacciones ocurren a
una sola temperatura (generalmente 41 ° C) y no requiere un
termociclador. NASBA también se conoce comoreplicaciones de secuencia
autosostenidas (3SR). El método original fue descrito en 1989,
ERRNVPHGLFRVRUJ
235
pero el método descrito entonces no era isotérmico; en cambio, utilizó calor para
desnaturalizar los híbridos que se formaron durante el procedimiento.
NASBA, en su forma actual, utiliza tres enzimas: transcriptasa inversa
AMV, ribonucleasa H (RNase H) y T7 RNA polimerasa. El procedimiento de
amplificación da como resultado múltiples copias de ARN de la secuencia
diana, a diferencia de la PCR, que da como resultado múltiples copias de
ADN de la secuencia diana. El ácido nucleico diana puede ser ADN o ARN,
aunque NASBA se usa con mayor frecuencia para detectar virus de ARN,
como el VIH. Durante la amplificación, se utilizan cebadores que se
aparean con el ácido nucleico diana. Uno de los cebadores tiene un
promotor de polimerasa de ARN T7 incorporado, y este cebador se hibrida
inicialmente con la secuencia diana (Figura 11.16). La transcriptasa inversa
genera una copia de ADNc de la diana, lo que da como resultado un
híbrido ADN: ARN. La enzima RNasa H luego degrada el ARN, dejando la
copia del ADNc de la diana; La ARNasa H solo degrada el ARN de los
híbridos ADN: ARN. El segundo cebador luego se hibrida con la cadena de
ADNc. El ADN bicatenario de la diana se produce mediante la actividad ADN
polimerasa dependiente de ADN de la transcriptasa inversa AMV. El
cebador original con el promotor de la ARN polimerasa T7 se integra en
esta copia de ADN bicatenario del ácido nucleico diana original. La ARN
polimerasa de T7 genera grandes cantidades de transcripción del ADN
bicatenario. La transcripción se puede utilizar de nuevo como plantilla para
una mayor amplificación; en cambio, en este punto, el segundo cebador se
hibrida con la transcripción generada y la actividad de la ADN polimerasa
dependiente de ADN de la transcriptasa inversa de AMV hace una vez más
una copia de ADNc de estas transcripciones. La ARNasa H vuelve a
degradar el ARN y el primer cebador con el promotor de la ARN polimerasa
de T7 se hibrida con las copias de ADNc. La transcriptasa inversa vuelve a
sintetizar dsDNA, y la polimerasa de RNA T7 produce aún más
transcripción.
Por lo tanto, la amplificación es un proceso continuo, y la transcripción
del orden de 109 es producido. El mismo método se utiliza para los
objetivos de ADN, aunque se requiere un paso de desnaturalización inicial
antes de que pueda comenzar NASBA. NASBA se utiliza para detectar
muchos tipos de virus y microorganismos a partir de muestras clínicas. El
sistema NucliSens (bioMérieux, Marcy l'Etoile, Francia) utiliza NASBA para la
detección o cuantificación de virus como el VIH-1 y el citomegalovirus.
También está disponible un kit NASBA básico (bioMérieux) que se puede
utilizar para diseñar pruebas para cualquier virus o microorganismo que
tenga secuencias conocidas.
Amplificación mediada por transcripción
TMA, desarrollado por Hologic, se dirige a las secuencias de ARNr de varios
microorganismos y produce una gran cantidad de transcripciones
utilizando los mismos procesos enzimáticos que NASBA. La principal
diferencia entre los dos métodos es que TMA utiliza una transcriptasa
inversa con actividad de ARNasa H y ARN polimerasa de T7. El transcrito
amplificado resultante se detecta mediante el ensayo de protección de
hibridación de Hologic. Muchos laboratorios clínicos utilizan TMA para
detectarC. trachomatisy N. gonorrhoeae en muestras clínicas. El ensayo
Aptima Combo 2 comercializado por Hologic en el sistema Tigris o en el
sistema Panther automatiza el método TMA para laboratorios que tienen
un gran volumen de muestras. Además, Hologic ofrece ensayos Aptima
paratricomonas vaginalis y VPH.
Reacciones de amplificación de señal
Se han descrito varios métodos y se utilizan actualmente en los laboratorios de
microbiología clínica que aprovechan la amplificación de la señal para la
detección, en lugar de la amplificación del ácido nucleico diana. Señal
236 PARTE 1 Introducción a la microbiología clínica

3′ 5′ Primer 1 Muchos
transcripción
copias
5′ 3′
A GRAMO

5′ 3′
3′ 5′
Primer 2
B
5′ 3′
3′ 5′
5′ 3′
3′ 5′ H
C 5′ 3′
3′ 5′
ARNasa H I
5′ 3′ F K ARNasa H
3′ 5′
D
5′ 3′
Primer 2 3′ 5′
Primer 1
5′ 3′ J
3′ 5′
5′ 3′
mi 3′ 5′

5′ 3′
3′ 5′
HIGO. 11.16Amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos (NASBA). A, El cebador 1 se hibrida con el ARN
objetivo. B, La transcriptasa inversa sintetiza una copia de ADN de la plantilla de ARN. C, La ribonucleasa H (RNasa H)
degrada la plantilla de ARN original. D, El cebador 2 se hibrida con la copia de ADN. MI, La transcriptasa inversa
sintetiza otra hebra de ADN, lo que da como resultado ADN de doble hebra (dsDNA). F, La ARN polimerasa de T7
sintetiza muchas copias de la transcripción utilizando el ADNdc como plantilla. GRAMO, El cebador 2 hibrida con las
transcripciones sintetizadas. H La transcriptasa inversa hace una copia de ADN de las transcripciones.
I, La RNasa H degrada las copias de la transcripción y el cebador 1 se hibrida con las copias de ADN. J La
transcriptasa inversa sintetiza nuevas hebras de ADN, lo que nuevamente da como resultado dsDNA. K, Las muchas
copias de dsDNA son luego utilizadas como plantilla por la T7 RNA polimerasa, que sintetiza aún más transcripción.
Este proceso continúa en bucle.

Los procedimientos de amplificación utilizados en los laboratorios clínicos incluyen la
detección de ADNb, la captura híbrida y la tecnología de sonda cíclica (CPT).
Detección de ADN ramificado. La detección de ADN ramificado es una
técnica de amplificación de señal sensible que generalmente se ha utilizado para
cuantificar ácidos nucleicos virales a partir de muestras clínicas. La técnica se
describió por primera vez en 1991 y se encuentran disponibles ensayos
comerciales para la cuantificación del ARN del virus de la hepatitis C y el VIH y la
cuantificación del ADN del virus de la hepatitis B. Este método utiliza sondas de
captura de oligonucleótidos que hibridan el ácido nucleico diana con un
mecanismo de soporte sólido, como una bandeja de microtitulación (Figura
11.17). Otras sondas, las sondas diana, se aparean a una región diferente del
ácido nucleico diana que las sondas de captura. Las sondas diana también se
hibridan con sondas de preamplificador. Luego, las sondas amplificadoras se
unen a las sondas del preamplificador, que forman una estructura de ADNb.
Finalmente, se añaden sondas marcadas con fosfatasa alcalina (AP) y se hibridan
al complejo; el complejo es grande y muchas sondas AP pueden hibridar con la
estructura del bDNA.
Cuando se agrega el sustrato AP, los resultados de la quimioluminiscencia y
la emisión de luz son detectados por un analizador y reportados como unidades
de luz. La cantidad de señal luminosa está relacionada con la cantidad de ácido
nucleico presente en la muestra. Los estándares se utilizan con concentraciones
conocidas de ácido nucleico diana, por lo que se establece una curva estándar en
unidades de luz durante cada ensayo de ADNb. Desconocido
A continuación, las muestras se comparan con la curva estándar para determinar
la concentración de ácido nucleico. Además de los ensayos de bDNA aprobados
por la FDA en el mercado, los kits básicos de bDNA están disponibles
comercialmente para adaptar la detección de bDNA a un objetivo particular que
un laboratorio desea probar. Estos kits son compatibles con la mayoría de los
materiales de partida, incluidos tejido incluido en parafina, tejido fresco, células y
otras muestras.
Captura híbrida. El método de captura híbrido fue desarrollado por
Digene en 1995 para detectar el VPH en muestras clínicas. El ensayo inicial,
la prueba de captura híbrida I, detectó el VPH en dos grupos de riesgo de
cáncer de cuello uterino según el tipo de VPH detectado, los tipos de VPH
de alto riesgo y de bajo riesgo. La prueba se realizó en tubos y el método
fue un ensayo de hibridación líquida. El método Hybrid Capture II (Qiagen,
Frederick, MD) detecta los tipos de VPH de riesgo intermedio a alto de
cáncer de cuello uterino,C. trachomatis, y N. gonorrhoeae.Un resultado
"detectado" para el VPH no identifica cuál de los 13 serotipos analizados se
detectó. Los tres agentes infecciosos se pueden detectar a partir de una
sola muestra clínica en un formato de placa de microtitulación, aunque
actualmente está aprobado por la FDA para muestras de frotis de
Papanicolaou. Por lo tanto, la prueba se utiliza para pacientes femeninas.
Hybrid Capture II se ha automatizado.
El ácido nucleico diana se libera primero de las muestras clínicas con un
agente alcalino. Este proceso desnaturaliza el ADN en la muestra.

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 CAPÍTULO 11 Aplicaciones del diagnóstico molecular 237

Sonda de captura

Ácido nucleico viral

Sonda de destino
Sonda de preamplificador

Sonda amplificadora
B

C
Sonda de etiqueta

HIGO. 11.17Detección de ADN ramificado (ADNb). A, Sondas de captura unidas a una superficie de hibridación al ácido
nucleico diana. B, Las sondas diana se aparean con el ácido nucleico y con las sondas del preamplificador. C, Las sondas del
amplificador se acoplan a las sondas del preamplificador, formando una estructura de ADNb. D, Las sondas de marcaje (con
fosfatasa alcalina unida [AP]) se hibridan con la estructura del bDNA. Una gran señal amplificada se detecta enzimáticamente
cuando se agrega el sustrato AP.

y destruye el ARN. Luego, se agrega a la muestra una sonda de ARN específica
para el ADN diana y se forma un híbrido de DNARNA (Figura 11.18). Se utiliza un
anticuerpo de captura para unir el híbrido a los pocillos de microvaloración. En
este punto, se agregan anticuerpos conjugados a AP para detectar los híbridos
capturados. Múltiples anticuerpos de AP se unen a cada híbrido, lo que da como
resultado una amplificación de la señal de aproximadamente 3000 veces
después de que se agrega un sustrato quimioluminiscente para AP. Un
luminómetro lee las señales de luz como RLU.
Tecnología de sonda de ciclismo. CPT procede en condiciones
isotérmicas. La técnica utiliza una sonda quimérica, compuesta de ADN y
ARN, generalmente en una secuencia de ADN-ARN-ADN (Figura 11.19). Se
adjunta un tinte fluorescente al 5′ extremo de la sonda y un extintor está
conectado a los 3′ fin. Mientras la sonda esté intacta, solo se emite
fluorescencia de fondo bajo debido a la acción de la molécula de extinción.
La sonda de quimera se hibrida con su secuencia objetivo y forma un
híbrido. La enzima RNasa H luego se usa para escindir el ARN en la sonda.
Esta escisión separa el fluoróforo del extintor y aumenta la fluorescencia. El
ácido nucleico diana ahora está libre de la sonda y una nueva sonda de
quimera se hibrida con él. Esta sonda también se escinde, lo que da como
resultado aún más fluorescencia. La reacción procede de esta manera,
dando como resultado la amplificación de la señal. El método CPT ha sido
comercializado por ID Biomedical (GlaxoSmithKline, Filadelfia, PA) y se
ha utilizado para mecUna detección en S. aureus.
Tipificación e identificación de deformaciones
Con el aumento de un gran número de microorganismos resistentes a los
antimicrobianos, el aumento de las tasas de bacterias productoras de toxinas y
la propagación de microbios patógenos en todo el mundo, existe la necesidad de
una vigilancia epidemiológica precisa de estos organismos. Las técnicas estándar
en los laboratorios de microbiología clínica no suelen proporcionar la resolución
necesaria para distinguir tipos y cepas. En cambio, las técnicas más refinadas
que separan los organismos relacionados entre sí a nivel genético son
necesarias para las investigaciones epidemiológicas. Se han descrito muchos
métodos de tipificación para determinar la relación genética entre bacterias,
hongos y parásitos, y algunos proporcionan una mejor resolución que otros.
Estas técnicas, a menudo llamadasADN o huellas dactilares genéticas, se basan
en mutaciones que se acumulan en los organismos biológicos a lo largo del
tiempo.
Las técnicas de tipificación de cepas se utilizan a menudo para comparar
cepas locales y determinar si un brote local es causado por un solo tipo de cepa
o por múltiples cepas. Una sola cepa responsable de un brote de enfermedad
puede tener una fuente puntual a la que se puede atacar

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238 PARTE 1 Introducción a la microbiología clínica

Sonda de ARN Investigacion

F Q
ADN objetivo

A A

ARN: ADN híbrido

Ácido nucleico diana

Captura de anticuerpos

B B F Q

Anticuerpos AP

C
Híbrido

HIGO. 11.18Captura híbrida. A, Las sondas de ARN se hibridan con el

ADN diana, lo que da como resultado híbridos de ARN: ADN. B, Los
híbridos están unidos para capturar anticuerpos unidos a un ARNasa H
mecanismo de soporte sólido. C, Varios anticuerpos conjugados con
fosfatasa alcalina (AP) se unen a híbridos. El sustrato se agrega para el C
AP y la emisión de luz resultante es capturada por un luminómetro. Q
F

por los servicios de salud pública. Los métodos de tipificación de cepas también se
utilizan para comparar aislamientos locales con aislamientos mundiales, que pueden
mostrar la propagación a largo plazo de una cepa o cepas (clonalidad).
Ya sea probando aislamientos locales o aislamientos de muchos lugares, la
técnica elegida debe tener un alto poder discriminatorio o la capacidad de
resolver con precisión diferentes cepas. Las técnicas de huellas dactilares
genéticas implican métodos amplificados y no amplificados. Los métodos de
tipificación de cepas no amplificados generalmente implican el análisis de
fragmentos de enzimas de restricción del ADN cromosómico. A medida que las
cepas divergen genéticamente con el tiempo, los sitios de las enzimas de
restricción en el ADN cromosómico también cambiarán a medida que se
acumulen mutaciones puntuales. Cuando el ADN cromosómico de diferentes
cepas se digiere con una enzima de restricción y se separa mediante
electroforesis en gel de agarosa, se observarán fragmentos de diferentes
tamaños. Estos fragmentos se denominanpolimorfismos de longitud de los
fragmentos de restricción(RFLP). Las comparaciones de estos patrones RFLP
conducen a la tipificación de cepas, y los ancestros evolutivos pueden derivarse
de los patrones RFLP de las cepas. Patrones de RFLP similares implican una
relación genética. Las técnicas de tipificación no amplificadas incluyen
transferencia Southern,análisis de perfil de plásmido, electroforesis en gel de
campo pulsado (PFGE) yelectroforesis enzimática multilocus (MLEE). Los
métodos de toma de huellas dactilares de ADN amplificado utilizan PCR. Se
utilizan cebadores conocidos o cebadores arbitrarios, dependiendo de la técnica
particular. Los métodos amplificados comúnmente utilizados incluyen PCR
cebada arbitrariamente (AP-PCR), también llamadaADN polimórfico
amplificado al azar (RAPD),PCR repetitiva de elementos extragénicos
palindrómicos (Rep-PCR) y escritura de secuencia multilocus (MLST).
Métodos de tipificación no amplificados
Análisis de perfil de plásmido
Esta técnica fue uno de los primeros métodos utilizados para tipificar cepas de
bacterias. Plásmidos son moléculas de ADN circulares extracromosómicas que
se encuentran en número variable en el citoplasma de muchas bacterias.
Muchas bacterias portan genes de resistencia a los antimicrobianos, genes de
virulencia y otros objetivos de interés en los plásmidos. los
F
D Q
HIGO. 11.19Tecnología de sonda de ciclismo. A, La sonda quimérica
ADN: ARN: ADN con un 5′ tinte fluorescente (F, en verde) y un 3′
molécula de extinciónQ, en negro) se incuba con el ácido nucleico
diana; El ADN está enrojo y el ARN en la sonda está en azul. B,La
sonda se hibrida con el ácido nucleico diana y forma un híbrido.
C, La ribonucleasa H (RNasa H) digiere el ARN en la sonda quimérica.
D, La digestión del ARN libera el tinte fluorescente de la vecindad del
extintor, lo que produce fluorescencia. Luego, una nueva molécula de
sonda se hibridará con la misma molécula de ácido nucleico diana y el
proceso continúa. Resultados de la amplificación de la señal.
La teoría detrás de esta técnica es que una cepa determinada con un
perfil de plásmido será única de otras cepas con otros plásmidos.
Cuando un perfil de plásmido de diferentes aislados es el mismo, es
posible que estas cepas sean idénticas.
El ADN plasmídico se extrae de las bacterias y se separa mediante electroforesis en
gel de agarosa. Desafortunadamente, debido a que los plásmidos son elementos
genéticos extracromosómicos, las bacterias los pierden fácilmente. Algunos plásmidos
también contienen transposones, o los llamados genes saltarines, que se transfieren
fácilmente a otras bacterias. Además, los plásmidos pueden existir en diferentes
formas en las células bacterianas. Los plásmidos que han sido cortados o mellados
tendrán diferentes tamaños en geles de agarosa que los plásmidos sin cortar. Todos
estos factores pueden cambiar fácilmente el perfil de plásmido de un aislado
bacteriano dado, por lo que esta técnica no se usa con frecuencia y no se considera
muy reproducible.

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 CAPÍTULO 11 Aplicaciones del diagnóstico molecular 239

Transferencia del sur

La transferencia Southern, como se describió anteriormente, a veces se
usa en investigaciones epidemiológicas para analizar los patrones de RFLP.
El ADN cromosómico se digiere con una enzima de restricción y los
fragmentos resultantes se separan mediante electroforesis en gel de
agarosa. Estos fragmentos se transfieren del gel de agarosa a una
membrana de nailon o nitrocelulosa y se usa una sonda marcada para
identificar un objetivo específico. Uno de los objetivos más populares es el
ADN que codifica el ARNr en los microorganismos. Cuando los patrones de
ARNr RFLP se detectan mediante transferencia Southern, la técnica se
denominaribotipado. Los genes que codifican el ARNr se conservan en
diferentes especies de organismos y aparecen en posiciones conservadas
del cromosoma de una especie. Por tanto, el ribotipado muestra una
excelente reproducibilidad y poder discriminatorio.
Una plataforma de ribotipado totalmente automatizada que utiliza la
metodología de análisis Southern es el sistema de caracterización microbiana
RiboPrinter (DuPont Qualicon, Wilmington, DE). El instrumento automatiza todo
el proceso, incluida la lisis de células y el procesamiento de datos. Los patrones
desconocidos se comparan con patrones conocidos para identificar cepas.
Algunos informes han indicado que otros métodos, como PFGE y RAPD, tienen
mayor poder discriminatorio que el ribotipado automatizado. Sin embargo, el
ribotipado automatizado es ventajoso para laboratorios de gran volumen que HIGO. 11.20Ejemplo de análisis de electroforesis en gel de campo pulsado
evalúan un gran número de aislamientos. Otros objetivos para el análisis de (PFGE) de Staphylococcus aureus son. Carriles 1 y 5, Cepas de control
transferencia Southern son las secuencias de inserción y los transposones, que a conocidas de S. aureus aislar. Carriles 2 a 4, Cepas desconocidas de
menudo contienen genes implicados en la virulencia y la resistencia a los diferentes pacientes con S. aureus aislamientos. Los carriles 2 y 3 tienen el
mismo patrón de bandas después de PFGE y son las mismas cepas. El
antimicrobianos. Sin embargo, las secuencias de inserción no están presentes en
aislado del carril 4 es una cepa no relacionada.
todas las cepas de bacterias, por lo que algunas cepas no son tipificables.

Análisis de enzimas de restricción

del ADN cromosómico
Esta técnica es similar a la transferencia Southern. El ADN cromosómico se
extrae de los aislados de interés y se digiere con una enzima de restricción
(o más de una enzima de restricción). La enzima utilizada para la digestión
debe cortar el ADN cromosómico en varios lugares para que se produzcan
fragmentos grandes y pequeños. El patrón RFLP resultante se analiza
mediante electroforesis en gel de agarosa; no se realiza la transferencia a
una membrana y el uso posterior de una sonda para identificar una
secuencia específica. El poder discriminatorio de este método no es alto y
muchos de los fragmentos se superponen y son difíciles de distinguir entre
sí.
Electroforesis en gel de campo pulsado
Schwartz y Cantor desarrollaron PFGE a principios de la década de 1980. La
técnica es extremadamente popular y es quizás el método de investigación
epidemiológica más conocido. También puede ser la más utilizada de las
técnicas de tipificación e identificación de cepas.
Se usa una enzima de restricción para digerir el ADN cromosómico en una
pequeña cantidad de sitios a lo largo del cromosoma. Esto da como resultado
grandes fragmentos de ADN que son difíciles de resolver mediante electroforesis
en gel de agarosa estándar. Durante la PFGE, estos grandes fragmentos se
separan en un gel de agarosa mediante un campo eléctrico en ángulo que
cambia periódicamente de orientación. Estos cambios en la orientación del
campo eléctrico son pulsos que fuerzan con éxito los grandes fragmentos de
ADN a través del gel de agarosa y los separan por tamaño. Se utiliza un gel de
agarosa de bajo porcentaje para los fragmentos de ADN grandes y la agarosa de
bajo punto de fusión permite que los fragmentos grandes migren más
fácilmente. De este proceso resultan patrones de RFLP relativamente simples,
por lo que las comparaciones suelen ser fáciles.
El PFGE también es muy reproducible y teóricamente se puede usar en
cualquier organismo. Figura 11.20 muestra patrones de PFGE representativos de
diferentes S. aureus son. Generalmente, se debe obtener equipo especial que
pueda proporcionar pulsos eléctricos específicamente para PFGE. La mayoría de
los ensayos de PFGE toman varias horas (hasta toda la noche) para separar de
manera eficiente los grandes fragmentos de ADN producidos en la reacción de la
enzima de restricción. La mayoría de los sistemas PFGE incorporan un módulo de
enfriamiento dentro del sistema para enfriar el tampón de electroforesis y
hacerlo circular para mejorar la separación. Sin circulación y sin una unidad de
enfriamiento, el tampón se calentará mucho cuando la separación continúe
durante varias horas, lo suficientemente caliente como para degradar los geles
de agarosa de bajo punto de fusión utilizados en PFGE. Las temperaturas cálidas
también podrían producir patrones RFLP ondulados y difíciles de interpretar.
Entre los diversos sistemas de PFGE disponibles se encuentra el sistema de
tipificación de cepas GenePath (Bio-Rad, Hercules, CA).
Electroforesis de enzimas multilocus
A diferencia de las otras técnicas de tipificación descritas en esta sección,
MLEE analiza el polimorfismo de expresión génica. El análisis de
polimorfismos de proteínas por electroforesis se ha estudiado desde la
década de 1970. MLEE implica la extracción de proteínas de los aislados de
interés, seguida de la separación electroforética y la tinción selectiva de
estas proteínas. La expresión del genotipo de la proteína se refleja en la
posición de la banda teñida, según la movilidad de la proteína. La
movilidad está determinada por la carga neta de la proteína y por la
estructura de la proteína. Dos bandas de la misma proteína en diferentes
posiciones después de la separación sugieren dos conformaciones
diferentes de la proteína, en otras palabras, dos alelos del mismo gen.

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240 PARTE 1 Introducción a la microbiología clínica
MLEE se considera un excelente método de tipificación de cepas.
Desafortunadamente, la secuencia de ADN de las proteínas separadas
durante MLEE no puede asumirse directamente porque diferentes
secuencias de ADN pueden dar como resultado la misma proteína debido a
la redundancia del código genético. Además, dos proteínas completamente
diferentes podrían tener la misma movilidad y podrían interpretarse como
las mismas proteínas. Otro problema es que las comparaciones entre
laboratorios son difíciles. Debido a estos problemas potenciales con MLEE,
MLST finalmente se desarrolló; te veo despues.
Métodos de tipificación amplificados
Técnica de ADN polimórfico amplificado al azarLa técnica RAPD, también
llamada PCR cebada arbitrariamente, fue descrito por primera vez en 1990 por
dos grupos diferentes, Welsh y McClelland y Williams y colegas. Este es un
método popular de toma de huellas dactilares de ADN. Durante la RAPD se
utilizan cebadores pequeños, de aproximadamente 10 nucleótidos de longitud,
con secuencias aleatorias. Por tanto, estos cebadores no tienen un objetivo
específico. En cambio, los cebadores aleatorios amplifican indiscriminadamente
el ADN cromosómico durante los ciclos de PCR, lo que da como resultado
fragmentos de varias longitudes. Después de la separación por electroforesis en
gel de agarosa, diferentes cepas tendrán diferentes patrones de fragmentación.
RAPD es un método simple de toma de huellas dactilares de ADN capaz
de proporcionar alta resolución. Se puede usar un cebador único en un
ensayo de PCR RAPD porque el oligonucleótido aleatorio único puede
unirse a objetivos aleatorios en cualquier hebra de ADN molde. Sin
embargo, el poder discriminatorio de un solo cebador es bajo con RAPD. El
poder discriminatorio aumenta si se utilizan tres o más cebadores, aunque
esto aumenta el tiempo de ensayo. Muchos laboratorios utilizan ocho o
más cebadores para la toma de huellas dactilares de ADN RAPD. Un
problema potencial de RAPD es el acuerdo entre laboratorios y la
reproducibilidad; aunque este método proporciona típicamente una
excelente reproducibilidad intralaboratorio. RAPD a menudo produce
algunos amplicones menores que exhiben baja reproducibilidad en el
mismo laboratorio. Algunos investigadores creen que PFGE tiene mayor
poder discriminatorio que el análisis RAPD.
Reacción en cadena de la polimerasa de elementos
extragénicos palindrómicos repetitivos
La técnica Rep-PCR es un método de tipificación de cepas de amplificación
descrito por primera vez en 1991 por Versalovic et al. Todos los organismos
tienen secuencias de ADN repetitivas, los elementos extragénicos palindrómicos
repetitivos, que se repiten en todo el genoma. Las secuencias de ADN únicas que
se encuentran entre estas repeticiones palindrómicas se amplifican durante Rep-
PCR utilizando cebadores específicos para el ADN repetido. Rep-PCR da como
resultado fragmentos de varios tamaños, dependiendo de las ubicaciones de las
repeticiones palindrómicas. La cantidad de ADN entre las repeticiones difiere de
una cepa a otra.
Se cree que el poder discriminatorio de Rep-PCR es un poco menor que
el de PFGE, aunque los resultados parecen correlacionarse bien entre los
métodos; algunos estudios sugieren que Rep-PCR tiene un poder
discriminatorio superior. La técnica es fácil de usar y se puede ampliar para
varios aislados, aunque los ensayos RAPD son algo más fáciles de realizar.
Como siempre, un laboratorio determinado debe evaluar los métodos para
determinar el mejor procedimiento de toma de huellas dactilares de ADN
para la cantidad de aislamientos esperados y para el tipo de equipo y
experiencia disponible.
El sistema DiversiLab (Bacterial Barcodes, Athens, GA) es un
instrumento Rep-PCR automatizado que utiliza Rep-PCR patentado
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cebadores para diferentes organismos (p. ej., C. difficile y S. aureus). El
sistema utiliza un chip de microfluidos que evalúa los productos Rep-PCR.
Se pueden evaluar hasta 13 aislamientos diferentes en un chip. Los
fragmentos del producto Rep-PCR se analizan con el software DiversiLab
basado en Internet (bioMérieux) para determinar la relación entre las
cepas. Los patrones de deformación también se pueden comparar con los
patrones obtenidos por otros laboratorios que utilizan el sistema
DiversiLab.
Número variable de enfoque múltiple de análisis de
repetición en tándem
Como Rep-PCR, número variable de enfoque múltiple de análisis de
repetición en tándem (MLVA) aprovecha las secuencias repetitivas de ADN
en los genomas. MLVA amplifica regiones de ADN que contienen
repeticiones. Las secuencias repetidas en los genomas tienden a ser
inestables, por lo que una cepa bacteriana determinada puede tener más
repeticiones en un locus que una cepa bacteriana diferente de la misma
especie. Cuando hay diferentes números de secuencias repetidas en un
locus dado, esto se conoce como un número variable de repeticiones en
tándem (VNTR). MLVA mapea VNTR entre cepas bacterianas mediante PCR.
Este es un método de mecanografía útil porque produce datos
cuantitativos y es fácil de realizar y los resultados son fáciles de interpretar
y es reproducible.
Escritura de secuencia multilocus
La tipificación de secuencias multilocus (MLST) es una derivación de MLEE,
descrita en 1998 por Maiden y colaboradores, que analiza las secuencias
de genes. Específicamente, MLST se utiliza para identificar alelos
determinando las secuencias internas degenes de limpieza. Los genes
domésticos son genes que codifican proteínas necesarias para las
funciones celulares básicas. Los genes domésticos son genes constitutivos
(es decir, casi siempre se expresan). Tanto los organismos eucariotas como
los procariotas tienen genes de mantenimiento. Los genes de
mantenimiento bacteriano incluyen el gen 16S rRNA y la dihidrofolato
reductasa. Debido a que los genes de mantenimiento casi siempre están
activados, también son excelentes controles para muchos métodos
moleculares.
Para un ensayo MLST típico, se eligen varios loci que representan
diferentes regiones internas de genes de mantenimiento. El ensayo de PCR
se utiliza para amplificar el ADN en cada locus; los cebadores están
diseñados para actuar como complemento de regiones altamente
conservadas de los genes internos. Una vez que se obtiene un amplicón, se
secuencia con un secuenciador automático y se le asigna un número único
basado en la secuencia. Las cepas de una especie en particular se pueden
comparar utilizando los mismos loci. Es posible una alta resolución entre
cepas comparando estas secuencias de ADN o los números que
representan estas secuencias.
Este método ha logrado excelentes comparaciones entre laboratorios;
otros laboratorios simplemente necesitan usar cebadores publicados para
loci de la misma especie para comparar datos y determinar la propagación
de cepas. El método ha logrado reconocimiento mundial y existen bases de
datos basadas en Internet del tipo de cepa (http://www.mlst.net). El sitio
web proporciona protocolos, información y software para el análisis de
secuencias. Un inconveniente de MLST es que el laboratorio requiere un
secuenciador automático y el método es caro en comparación con PFGE.
Sin embargo, de todos los métodos descritos en este capítulo para la toma
de huellas dactilares de ADN de cepas, MLST probablemente tiene la
resolución más alta y la mayor probabilidad de acuerdos entre
laboratorios.
 CAPÍTULO 11 Aplicaciones del diagnóstico molecular
Futuro de las pruebas de diagnóstico
molecular en el laboratorio de
microbiología clínica
A medida que los procedimientos de pruebas moleculares se vuelven más
baratos, más fáciles de usar y más disponibles, más laboratorios de
microbiología clínica los utilizarán para las muestras clínicas. Varias empresas
ofrecen ASR ahora, y en un futuro próximo estarán disponibles más ASR
específicos de organismos. Los genomas de muchos microorganismos se han
secuenciado total o parcialmente, y estos datos ofrecen la posibilidad de
desarrollar pruebas de detección y confirmación basadas en la secuencia de
ácidos nucleicos del organismo. El sitio web del Centro Nacional de Información
Biotecnológica (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) enumera secuencias de
organismos y enlaces asociados. Se está desarrollando una tendencia hacia la
estandarización de los métodos de diagnóstico molecular a medida que los ASR
y la detección de microorganismos basada en kits se han vuelto más disponibles.
A medida que aumenta la estandarización, también aumentará el número de
laboratorios que utilizan procedimientos de diagnóstico molecular. También se
introducen continuamente nuevas mejoras y métodos tecnológicos. Ahora
existen sistemas automatizados de extracción de ácidos nucleicos y plataformas
de amplificación automatizadas. El aumento de la automatización hace que las
técnicas de diagnóstico molecular sean más atractivas para el laboratorio de
microbiología clínica. La automatización también ayuda a la estandarización con
otros laboratorios.
A medida que se dispone de más secuencias de microbios clínicamente
significativos y de la automatización de los procedimientos de diagnóstico molecular,
más laboratorios clínicos están comenzando a utilizar procedimientos de secuenciación
de ADN para identificar microbios a partir de muestras clínicas o confirmar la
identificación de cepas bacterianas. Por ejemplo, la secuenciación del rDNA 16S se está
convirtiendo en una herramienta importante en los laboratorios de microbiología
clínica modernos. Una técnica de secuenciación más nueva llamadapirosecuenciación
también se ha utilizado para identificar microorganismos y detectar genes de
resistencia a los antimicrobianos.
Además, ahora está disponible el cribado a gran escala de ácidos nucleicos y
proteínas, especialmente a medida que ha aumentado la secuenciación del
genoma del organismo. La información obtenida de la secuenciación del
genoma de un organismo permite comprender los procesos celulares, las
asociaciones de proteínas y la interrelación de las actividades biológicas.
Investigación genómica, junto con el uso denanobiotecnología, ha estimulado
la invención de métodos como el análisis de microarrays de ADN y la proteómica.
Técnicas comoMicroarrays de ADN (y nanoarrays), proteómica, y
metagenómica tienen la capacidad de revolucionar el análisis de poblaciones de
microorganismos y la interpretación y tratamiento de enfermedades. No todos
estos métodos están listos para su uso rutinario en los laboratorios de
microbiología clínica; actualmente, muchos son principalmente herramientas de
investigación.
Secuenciación
Secuenciación está determinando el orden de los nucleótidos en un fragmento
de ADN; Generalmente se utiliza el método de terminación de cadena ideado por
Frederick Sanger. La secuenciación de ADN ha estado disponible durante años;
Inicialmente, la técnica era algo laboriosa y se usaba con mayor frecuencia para
identificar secuencias de genes. Ahora, la secuenciación está automatizada y se
ha aplicado a procesos a gran escala, como la secuenciación del genoma
completo. Se ha secuenciado el genoma humano, al igual que los genomas de
varios otros organismos eucariotas y los de varios organismos procariotas. La
secuenciación del genoma completo no es una técnica que suelen realizar los
laboratorios clínicos;
ERRNVPHGLFRVRUJ
241
sin embargo, los laboratorios clínicos han comenzado a utilizar técnicas de
secuenciación a menor escala para identificar microorganismos.
Muchos laboratorios de microbiología clínica ahora realizan la secuenciación
del gen ARNr 16S para confirmar la identidad de aislados bacterianos
problemáticos. También se pueden secuenciar otros genes para determinar la
identidad, comorpoB (ARN polimerasa B), que se utiliza a menudo para
identificar micobacterias. Para identificar hongos mediante secuenciación, se
han utilizado una variedad de dianas, generalmente dentro del complejo de
genes de ARNr, que abarcan los genes de ARNr 18S, 5.8S y 28S, las regiones
espaciadoras transcritas externas 1 y 2 que flanquean los genes de ARNr, y la
variable regiones espaciadoras transcritas internas 1 y 2.
Hay diferentes formas de realizar la secuenciación. En un método
popular, se hibrida un par de cebadores con el ADN molde preparado a
partir de células bacterianas y se realiza una PCR para amplificar un
producto de 500 a 1500 pb. A continuación, los productos de la PCR se
purifican con un kit comercial para eliminar el exceso de cebadores y ADN
molde. Se realizan dos reacciones durante el siguiente paso, llamado
secuenciación de ciclos; una reacción usa un cebador directo y la otra
reacción usa un cebador inverso. En cada reacción, los amplicones de PCR
purificados de la PCR anterior se utilizan como molde de ADN.
En las reacciones de secuenciación del ciclo, las cuatro bases de
desoxinucleótidos estándar (A, C, G, T) se incluyen en la mezcla de
reacción, junto con concentraciones bajas de nucleótidos de terminación
de cadena de cada dNTP. Estos nucleótidos que terminan la cadena a
menudo se denominannucleótidos didesoxinucleótidos (ddNTPs). Cada
ddNTP está etiquetado con un tinte fluorescente diferente llamado
terminador de tinte. Cuando un ddNTP marcado se incorpora a la hebra
complementaria de ADN en crecimiento, termina esa hebra en particular;
No se pueden agregar dNTP en este momento. Por lo tanto, se sintetiza
una serie de fragmentos de ADN relacionados, y estos terminan en la
posición en la que se incorporó el ddNTP marcado. Durante este proceso
se generan fragmentos de todos los tamaños. Los fragmentos generados
se purifican para eliminar los terminadores de tinte no incorporados y
luego se separan mediante electroforesis capilar en un analizador
automático. Por tanto, la secuencia se genera basándose en el tamaño del
fragmento, y un fluorímetro determina el tinte particular en el extremo de
cada fragmento. Cada ddNTP tiene un fluoróforo de color diferente, lo que
permite la identificación del ddNTP al final de cada fragmento.
Una vez que se ha determinado la secuencia, se puede utilizar el software
para comparar la secuencia generada con una base de datos de secuencias
conocidas. Entonces se puede determinar una identidad más probable. Al
examinar la relación de diferentes especies y cepas de bacterias mediante
secuenciación,dendrogramas se utilizan a menudo. Los diferentes métodos
para generar dendrogramas incluyen el método de unión de vecinos, el método
de grupos de pares no ponderados con promedios aritméticos y el método de
grupos de pares ponderados con promedios aritméticos. Generalmente, estos
diferentes métodos producen resultados comparables.
Para determinar la identidad más probable de la secuencia
desconocida, el usuario del software elige organismos similares para
compararlos. Por ejemplo, si el aislado desconocido que se secuenció es un
bacilo gramnegativo no fermentador, oxidasa positivo,Pseudomonasspp. y
los organismos relacionados pueden elegirse de la base de datos del
software para compararlos con el aislado desconocido. Además, se elige
un grupo externo; esta es una secuencia con la que se comparan todas las
demás secuencias similares. El grupo externo debe estar relacionado de
alguna manera con los otros organismos elegidos, pero aún fuera del
grupo que se está estudiando.
242 PARTE 1 Introducción a la microbiología clínica
Unión N: 10,269%
Morganella morganii
Providencia stuartii
Proteus mirabilis
Proteus vulgaris
Yersinia enterocolitica
Serratia marcescens
Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae
Enterobacter cloacae
Citrobacter freundii
Klebsiella oxytoca
Salmonella enteritidis serotipo Choleraesuis
Salmonella enteritidis serotipo Typhi
Escherichia coli
Shigella dysenteriae
Pseudomonas aeruginosa
HIGO. 11.21Ejemplo de un dendrograma que muestra las relaciones
genéticas entre diferentes especies de Enterobacteriaceae basado en la
secuenciación del gen de ARN ribosómico 16S.
Una vez que se ha generado el dendrograma, el software produce una
línea horizontal con un porcentaje en la parte superior del dendrograma
junto al nombre del método utilizado para generarlo. Esta línea horizontal
se puede utilizar como una medida aproximada del grado de relación o
diferencia entre los aislamientos en el dendrograma. Para determinar la
relación, agregue las dos líneas horizontales de los dos aislados en
cuestión y compárelos con el porcentaje de la línea horizontal superior.
Aunque este método no es completamente exacto, proporciona una
estimación útil de la relación. VerFigura 11.21 para una representación de
un dendrograma de diferentes especies de Enterobacteriaceae, generado
con el paquete de software MicroSeq (Life Technologies, Grand Island, NY).
Pseudomonas aeruginosa fue elegido como el grupo externo para este
dendrograma.
Pirosecuenciación
La pirosecuenciación es una secuenciación por técnica de síntesis que no
requiere nucleótidos o cebadores marcados y tampoco requiere un paso de
electroforesis posterior a la reacción. Es una técnica de secuenciación rápida que
genera secuencias de aproximadamente 20 a 50 bases de longitud por cebador,
por lo que es mejor utilizar esta técnica para secuencias cortas. La secuenciación
convencional es la mejor opción para fragmentos de ADN más largos.
La pirosecuenciación utiliza las enzimas ADN polimerasa,
adenosina trifosfato (ATP) sulfurilasa, luciferasa y apirasa y los
sustratos adenosina 5′ -fosfosulfato (APS) y luciferina. Un cebador de
secuenciación se hibrida con una plantilla de ADN de una sola hebra y
se incuba con la mezcla enzima-sustrato. Los cuatro nucleótidos
diferentes se agregan luego uno a la vez en un orden definido. Si las
bases de nucleótidos añadidas se emparejan con la plantilla de ADN,
la ADN polimerasa incorporará el nucleótido con la liberación de
pirofosfato (PPi). En presencia del sustrato APS, ATP
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la sulfurilasa convierte PPi en ATP. Luego, la luciferasa usa el ATP
recién formado para convertir la luciferina en oxiluciferina, que libera
luz. La luz se detecta con una cámara de dispositivo de carga
acoplada. Este es un proceso cuantitativo y en tiempo real; cada señal
luminosa indica que la ADN polimerasa ha incorporado un nucleótido.
La luz generada se visualiza como un pico y la altura del pico indica
cuántos nucleótidos se incorporaron. La enzima apirasa degrada el
exceso de nucleótidos. Después de la degradación, se agrega un
nuevo nucleótido y el proceso comienza nuevamente. Por tanto, la
secuencia de nucleótidos de interés se determina a partir de los picos
de luz que se producen durante el proceso de adición e incorporación
de nucleótidos.
La pirosecuenciación se utilizó inicialmente para determinar secuencias en
análisis de mutaciones del ADN humano. Sin embargo, la técnica también se ha
utilizado para identificar microorganismos y para detectar varios genes de
resistencia a los antimicrobianos enTuberculosis micobacteriana.
Secuenciación de próxima generación
La secuenciación de próxima generación (NGS) aporta un alto rendimiento
y precisión a la secuenciación a través de plataformas automatizadas. Hay
varias plataformas diferentes disponibles, como los sistemas HiSeq y
MiSeq de Illumina (San Diego, CA), Roche 454 GS FLX + e Ion Torrent y ABI
SOLiD de Thermo Fisher (Waltham, MA). Cada una de estas tecnologías
difiere en la longitud de secuencia que lee la plataforma. Además, el
método de secuenciación, el tiempo de ejecución y el costo son diferentes.
El rendimiento (velocidad) se mejora con los métodos NGS porque las
plataformas pueden ejecutar numerosas reacciones de secuenciación en
paralelo y la reacción química se puede combinar con la detección de
señales.
Microarrays y nanoarrays de ADN
El término Micromatriz de ADN se refiere a una agrupación a nivel de
micras de moléculas de ADN unidas a un soporte sólido, como chips de
silicio, vidrio o plástico. La micromatriz de ADN a veces se denominaChip
de ADN o chip genético. Una micromatriz de ADN brinda a los
investigadores la posibilidad de evaluar la expresión génica de un
organismo completo, o incluso de varios organismos. Los microarrays de
ADN se utilizan a menudo para analizar los niveles de transcripción de
genes durante una enfermedad en particular. Esta técnica se ha utilizado
para muchos propósitos, como determinar mutaciones, identificar nuevos
genes, monitorear la respuesta después del tratamiento, determinar los
sitios de unión para los factores de transcripción e identificar patógenos.
Una micromatriz de ADN, por ejemplo, podría usarse para detectar casi
todos los patógenos simultáneamente. Esto podría aplicarse a patógenos
de interés en medicina clínica y veterinaria, para problemas de salud
pública y para la seguridad nacional (p. Ej., Detección de todos los agentes
biológicos potenciales en un chip de ADN).
Una micromatriz de ADN se construye con microinstrumentos especiales,
capaces de colocar puntos microscópicos de ADN en una superficie sólida. Se
pueden colocar miles o más en un chip. Estas manchas de ADN se denominan
comúnmentereporteros. Las cadenas de ADN o ARN marcadas con fluorescencia
de una muestra de interés se incuban con el ADN en el chip. Un escáner lee la
fluorescencia que se desarrolla solo cuando se produce un híbrido. El híbrido
que emite fluorescencia se corresponde con el mapa conocido del chip de ADN.
Por ejemplo, un investigador puede tener una micromatriz de ADN construida
con una secuencia de ADN monocatenario de cada bacteria respiratoria
patógena conocida. El ARN se extrae de una muestra de un paciente y la
transcriptasa inversa se usa para preparar grandes cantidades de ADNc de cada
transcripción.
 CAPÍTULO 11 Aplicaciones del diagnóstico molecular 243

Una sonda fluorescente se une enzimáticamente al ADNc producido. A
continuación, el ADNc marcado se incuba con el ADN en el chip y un
cribador lo analiza. Una señal fluorescente de una mancha de ADN
indicaría un híbrido y podría implicar un papel de enfermedad para un
organismo en particular. Los procedimientos de amplificación también se
pueden acoplar a microarrays de ADN para una herramienta de
identificación y análisis potencialmente más poderosa.
Con el reciente aumento en el uso de la nanotecnología, se han desarrollado
nanoarrays (nanochips). Un nanoarray tiene moléculas colocadas en una
superficie en ubicaciones definidas, con resolución espacial nanométrica. Al igual
que los microarrays, los nanoarrays se están desarrollando para aplicaciones
genómicas y proteómicas, como la identificación de organismos. La
nanotecnología aplicada a un chip no necesita reporteros acoplados, como lo
hacen los microarrays de ADN, y puede filtrar más moléculas, por lo que los
nanoarrays serán más sensibles.
Proteómica
La secuenciación genómica también ha llevado a una mayor comprensión
de las interrelaciones de proteínas y la expresión en las células. La
proteómica es el estudio de las proteínas a nivel celular. Al igual que la
genómica, la proteómica es un proceso a gran escala, pero probablemente
más complicado que el análisis a nivel genético y transcripcional. La
expresión de proteínas cambia, por ejemplo, de una célula a otra, de un
estado de enfermedad a otro, durante el ciclo de vida de una célula y
durante las respuestas a las condiciones ambientales cambiantes. Además,
las proteínas con el mismo origen genético pueden ser muy diferentes
después de la modificación postraduccional y el empalme alternativo.
El genoma de un organismo es la suma del material genético; el proteoma
de un organismo es la suma de proteínas que se encuentran durante todas las
condiciones cambiantes de una célula. Por tanto, el proteoma suele ser más
grande y más complejo que el genoma. La proteómica se utiliza para determinar
la expresión de proteínas en enfermedades, como cánceres, enfermedades
genéticas y otras enfermedades, incluidas las infecciones microbianas. Por
ejemplo, las proteínas identificadas en una determinada enfermedad pueden
convertirse en objetivos de nuevas pruebas de laboratorio. En otro ejemplo, la
terapia para una afección determinada puede basarse en la expresión de
proteínas implicadas en otra enfermedad.
involucran biopelículas. Es posible que muchas de las bacterias que
intervienen en los procesos infecciosos no sean cultivables en el
laboratorio. En resumen, la aplicación potencial de la metagenómica está
limitada solo por la imaginación.
Espectrometría de masas MALDI-TOF
La espectrometría de masas con desorción-ionización por láser asistida por
matriz (MALDI-TOF) es una tecnología que se utiliza para identificar
rápidamente microorganismos, incluidos los hongos. Esta técnica se ha
utilizado durante años en química para analizar masas molares de
moléculas. La identificación microbiana se puede realizar en minutos a
partir de colonias aisladas. Una vez que se ha comprado el instrumento, el
análisis MALDI-TOF tiene un costo muy bajo. Actualmente, dos plataformas
MALDI-TOF están aprobadas por la FDA para su uso en los Estados Unidos:
VITEK MS (bioMérieux) y MALDI Biotyper (Bruker, Billerica, MA;Figura 11.22
).
Después de que un organismo se recupera en un medio sólido, se
aplica una pequeña cantidad de material de colonia en un punto de un
objetivo metálico (Figura 11.23). Se agrega una solución de matriz química
absorbente de energía al material de la colonia. La solución de matriz
consta de una sustancia química cristalizada como ácido α-ciano-4-
hidroxicinámico, agua y un disolvente orgánico como acetonitrilo. El
solvente orgánico (y el agua) extrae proteínas de los microorganismos en
el objetivo. Se deja secar la solución de matriz sobre el material de la
colonia; el solvente se vaporizará y esto dará como resultado que las
proteínas de la colonia se cocristalicen con el químico de la matriz.

Metagenómica
Se estima que solo alrededor del 1% de todos los procariotas de la mayoría de
los entornos de nuestro planeta son cultivables en el laboratorio. Comprender la
complejidad y las interacciones de las poblaciones microbianas mixtas puede
generar información valiosa que puede afectar la salud humana y nuestra
asociación con el medio ambiente. Por ejemplo, la investigación ha demostrado
que los billones de células bacterianas que componen la microbiota intestinal
humana influyen en la fisiología, el metabolismo, la nutrición y la función
inmunológica humanos. El intestino contiene aproximadamente 1000 especies
bacterianas y 100 veces más genes que los que se encuentran en el genoma
humano.
La metagenómica se desarrolló como un medio para identificar
microorganismos no cultivables; es la identificación de genomas microbianos de
poblaciones mixtas utilizando técnicas moleculares. En metagenómica se han
utilizado tanto métodos de secuenciación como de expresión génica. Este
método tiene gran aplicación en estudios ambientales; por ejemplo, la
metagenómica se ha aplicado para estudiar las poblaciones microbianas del
suelo, las biopelículas y el mar de los Sargazos. La metagenómica también se ha
utilizado para estudiar poblaciones de microorganismos del cuerpo humano,
como la microbiota intestinal o del tracto urogenital. Muchas infecciones HIGO. 11.22Sistema Bruker MALDI Biotyper (Bruker). (Imagen
humanas son polimicrobianas y cortesía de Steve D. Mahlen).

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244 PARTE 1 Introducción a la microbiología clínica

moléculas diana microbianas de otras sustancias en una muestra biológica. Las

nanopartículas acopladas a sondas (p. Ej., Anticuerpos y ácidos nucleicos), con
afinidad por los biomarcadores microbianos, pueden reconocer microbios de
forma selectiva. Los nanomateriales utilizados para el diagnóstico microbiano
incluyen nanopartículas magnéticas, de oro y fluorescentes.
Las nanopartículas magnéticas, como las nanopartículas de óxido de hierro
superparamagnéticas (SPION), se han utilizado como marcadores para detectar
secuencias de ácidos nucleicos de cinco especies de levaduras del género.
Candida en sangre humana. Hibridación de oligonucleótidos marcados con
SPION para amplificarCandida El ADN produce grandes cambios en la señal de
resonancia magnética T2 de la muestra. El ensayo tarda unas 3 horas en
realizarse. Las nanopartículas de oro también se han utilizado como marcadores
de oligonucleótidos para detectar secuencias de ADN bacteriano, como elmeca
gen que codifica la resistencia a la meticilina en S. aureus. Las nanopartículas de
sílice conjugadas con anticuerpos que encapsulan miles de moléculas de
colorante fluorescente producen una señal amplificada que puede detectar una
sola célula bacteriana en el tejido en menos de 20 minutos.

HIGO. 11.23Objetivo metálico, sistema Bruker MALDI Biotyper (Bruker).

(Imagen cortesía de Steve D. Mahlen).
Puntos para recordar
- Las tres aplicaciones básicas de diagnóstico molecular de ácidos nucleicos utilizadas en

A continuación, el objetivo metálico se carga en la cámara de ionización
del instrumento MALDI-TOF, y la red de matriz / proteína del organismo
cocristalizado se pulsa con un láser UV. La actividad del láser hace que la
matriz transfiera protones al material de la colonia, produciendo iones
protonados individuales de las proteínas, lo que les da a estas proteínas
una carga positiva. La matriz también absorbe la luz láser, la convierte en
energía térmica y se vaporiza (desorción), junto con las proteínas, en
los laboratorios de microbiología clínica son (1) ensayos de hibridación de ácidos
nucleicos, (2) técnicas de amplificación de ácidos nucleicos y (3) técnicas de tipificación
de cepas.
- Los ensayos de hibridación de ácidos nucleicos detectan dianas de ácidos nucleicos con
sondas marcadas. Estos ensayos pueden realizarse sobre un soporte sólido, in situ o en
solución.
- Los procedimientos de amplificación aumentan exponencialmente la cantidad
de ácido nucleico diana o la señal que se une al ácido nucleico diana. Los

nanosegundos. Las proteínas ionizadas luego ingresan a un tubo de vuelo.
Luego, un electrodo acelera los iones cargados positivamente en un
analizador de masas. El analizador de masas separa los iones por su
relación masa / carga. La cantidad de tiempo que tardan los iones en
moverse a través del analizador y ser detectados es el tiempo de vuelo.
Cada proteína genera una señal distinta, y cada microorganismo tiene un
conjunto único de señales proteicas. Se genera así un espectro de masas
procedimientos de amplificación incluyen PCR y variantes de PCR (por ejemplo,
RT-PCR, PCR multiplex y PCR anidada), NASBA, TMA, ensayo de bDNA, captura
híbrida y tecnología de sonda cíclica.
- La PCR se utiliza con frecuencia en los laboratorios y consta de tres pasos
básicos: desnaturalización del ADN diana, hibridación de cebadores y extensión
de cebadores. Estos pasos se repiten en varios ciclos para aumentar la cantidad
de ADN objetivo a niveles lo suficientemente altos para una fácil detección.
- La PCR en tiempo real es una técnica de detección popular que se utiliza para ver los productos

de PCR a medida que se acumulan. La técnica también se utiliza para cuantificar el ADN.
para cada microorganismo, y es único para cada especie. Se utiliza un
software específico de la empresa para identificar el organismo basándose
- La RT-PCR se utiliza para estudiar el ARN diana. El paso inicial de RT-PCR produce
en una comparación con una base de datos de referencia de espectros.
copias de ADNc de la transcripción con transcriptasa inversa. Luego, el ADNc se
amplifica mediante PCR. La RT-PCR, como la PCR estándar, a menudo se analiza

Nanomedicina -
mediante PCR en tiempo real.
La PCR multiplex utiliza más de un conjunto de cebadores durante la PCR. Uno de los conjuntos

Nanotecnología es la creación de materiales, dispositivos y sistemas de cebadores a menudo se dirige a un gen de control interno, mientras que el otro conjunto de

cebadores se utiliza para amplificar el gen objetivo.

funcionales a través de la comprensión y el control de la materia en
dimensiones en la escala nanométrica, en la que se observan y aprovechan
nuevas funcionalidades y propiedades de la materia para una amplia gama
de aplicaciones. Nanomedicina se define como la aplicación de la
nanotecnología en la medicina, incluido el diagnóstico y tratamiento de
enfermedades y la reparación de tejidos dañados como huesos, músculos
y tejido nervioso. Las ventajas de incorporar medicamentos en
nanopartículas son minimizar los efectos secundarios del medicamento en
el cuerpo y maximizar la eficacia del medicamento. La nanomedicina tiene
el potencial de eliminar el riesgo de efectos secundarios al prevenir la
propagación de medicamentos a lugares no deseados del cuerpo y
también puede ayudar a desarrollar tratamientos rentables para muchas
enfermedades crónicas. Se pueden usar nanopartículas para administrar
- La PCR anidada es esencialmente dos ensayos de PCR diferentes que se ejecutan
uno tras otro. El primer ensayo utiliza un par de cebadores que amplifica el ADN
diana. A continuación, el producto de PCR se utiliza como molde de ADN para el
segundo ensayo de PCR. Los cebadores del segundo ensayo son internos al
primer producto de PCR.
- NASBA y TMA se realizan a una sola temperatura y producen grandes
cantidades de copias de ARN del ácido nucleico diana. Estas técnicas
utilizan tres actividades enzimáticas: transcriptasa inversa, RNasa
Polimerasa H y T7.
- Los ensayos de ADN ramificado utilizan varias sondas diferentes para amplificar
la señal en lugar de la secuencia de ácido nucleico. Se utiliza una sonda
ramificada que permite que muchas moléculas de sonda de detección se unan a
ella para amplificar la señal.
- La captura híbrida utiliza una sonda de ARN para unirse al ADN objetivo y

agentes antimicrobianos al sitio de infección; verCapítulo 12.
La nanotecnología también puede proporcionar un diagnóstico sensible y
específico de enfermedades infecciosas al capturar y distinguir selectivamente
formar un híbrido ARN: ADN. Se agrega una sonda de captura que une el híbrido
a un soporte sólido. Luego se agregan sondas de detección que amplifican la
señal.

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 CAPÍTULO 11 Aplicaciones del diagnóstico molecular 245

- CPT utiliza un ADN quimérico marcado con fluorescencia: ARN: sonda de
ADN que se hibrida con el ADN diana. El tinte fluorescente de la sonda
produce baja fluorescencia debido a una molécula extintora cercana. La
ARNasa H se usa para escindir la sonda y la fluorescencia se produce
cuando el tinte fluorescente se libera del extintor. Una nueva sonda
quimérica se une al ADN diana y el proceso continúa amplificando la
señal.
- Los métodos de tipificación de cepas se utilizan generalmente con fines
epidemiológicos. Se utilizan métodos amplificables o no amplificables para
detectar diferentes tipos de cepas. Los métodos no amplificables incluyen
transferencia Southern, análisis del perfil de plásmidos, digestión con enzimas
de restricción de ADN cromosómico, PFGE y MLEE. Los métodos amplificados
incluyen RAPD, Rep-PCR y MLST.
- De los procedimientos de tipificación de cepas no amplificados, el PFGE es
probablemente el más utilizado por los laboratorios de microbiología clínica. El
ADN cromosómico de las cepas de interés se digiere con una enzima de
restricción y se separa mediante un sistema de electroforesis que pulsa
eléctricamente los grandes fragmentos de ADN a través de un gel de agarosa.
Las cepas tendrán patrones de bandas únicos.
- RAPD-PCR utiliza cebadores aleatorios que se aparean con secuencias aleatorias en el
5. Detección de ADN ramificado:
una. Es una forma de PCR que analiza la transcripción.
B. Es un método de amplificación de señal que utiliza captura, objetivo,
preamplificador, amplificador y sondas etiquetadas.
C. Es un método de amplificación de señales que utiliza sondas de ARN,
sondas de captura y sondas marcadas con fosfatasa alcalina.
D. Es un método de amplificación de diana que utiliza transcriptasa
inversa, ribonucleasa H (RNasa H) y T7 RNA polimerasa.
6. ¿Cuál de las siguientes afirmaciones se aplica a la electroforesis en gel de agarosa?
una. Los ácidos nucleicos se separan en un campo eléctrico porque
tienen una carga neta positiva.
B. Las moléculas grandes de ácido nucleico migran a través del gel de agarosa más
rápido que las moléculas más pequeñas.
C. Los ácidos nucleicos se separan en agarosa por forma, carga y
tamaño.
D. La agarosa es un tinte que se intercala en el ADN de doble hebra.
7. ¿Cuál de los siguientes procedimientos no utiliza transferencia de energía por
resonancia de fluorescencia (FRET)?
una. 5′ ensayo de nucleasa
B. Imprimaciones Scorpion

genoma de una cepa determinada. Después de la amplificación por PCR, las cepas C. Balizas moleculares
tendrán patrones únicos. Rep-PCR usa cebadores que se aparean con secuencias D. Amplificación mediada por transcripción
palindrómicas repetidas en un genoma. El ADN entre las repeticiones de la secuencia 8. PCR de transcripción inversa:
palindrómica se amplifica mediante PCR, lo que da como resultado patrones únicos una. Utiliza transcriptasa inversa para producir ADN complementario (ADNc) a
para las cepas. partir de la transcripción.
- MLVA amplifica un número variable de repeticiones en genomas bacterianos. B. Utiliza la ARN polimerasa de T7 para producir una transcripción a partir de ADNc.
- MLST identifica mutaciones en genes secuenciando diferentes loci de C. Utiliza la ARN polimerasa de T7 para producir ADNc a partir de la transcripción.
cepas después de la amplificación por PCR. La técnica produce excelentes D. Utiliza RNasa H para degradar el ARN en híbridos de ADN: ARN.
comparaciones intralaboratorio e interlaboratorio, aunque el 9. ¿Cuál de los siguientes no es un factor que influya en las reacciones de
procedimiento es caro y requiere equipo de secuenciación. hibridación?
- Se han utilizado nanopartículas, como nanopartículas magnéticas, oro y una. pH
fluorocromos, para marcar sondas en la detección de patógenos B. Temperatura
microbianos. C. Longitud del genoma del objetivo
D. Grado de complementariedad entre la sonda y el ácido
nucleico diana
10. El procedimiento de tipificación de cepas que probablemente tenga la mayor
Preguntas de evaluación del aprendizaje concordancia entre laboratorios es:
una. Electroforesis enzimática multilocus.
1. ¿Cuál de las siguientes afirmaciones es verdadera con respecto a la transferencia Southern?
B. Escritura de secuencia multilocus.
una. La transferencia Southern detecta las transcripciones después de la digestión con
C. Electroforesis en gel de campo pulsado.
enzimas de restricción y la separación mediante electroforesis en gel de agarosa.
D. Análisis de ADN polimórfico amplificado al azar.
B. La transferencia Southern detecta un ADN diana después de la digestión con enzimas de
11. ¿Cuál de las siguientes afirmaciones no es cierta sobre las 5′ ensayo de nucleasa?
restricción y la separación mediante electroforesis en gel de agarosa.
una. También se conoce como el ensayo TaqMan.
C. La transferencia Southern detecta polimorfismos de proteínas después de la
B. El método utiliza una sonda con 5′ fluoróforo y un 3′extintor
separación por electroforesis.
que se degrada por la acción de la ADN polimerasa.
D. La transferencia Southern es una técnica de amplificación que analiza un
C. El método utiliza FRET para mantener baja la fluorescencia de fondo.
objetivo de ADN en particular.
D. El método utiliza una sonda en forma de horquilla con un
2. ¿Cuál de los siguientes marcadores de sonda se utiliza con más frecuencia para las reacciones de
fluoróforo en el 5′ final y un extintor en el 3′ fin.
hibridación de ácidos nucleicos en los laboratorios de microbiología clínica?
12. ¿Cuál de las siguientes opciones es incorrecta sobre los cebadores?
una. Fluoresceína
una. Los cebadores deben formar fácilmente dímeros de cebadores.
B. 32PAG
B. Los cebadores suelen tener una longitud de 15 a 30 nucleótidos.
C. 35S
C. Los cebadores deben tener un porcentaje de GC del 40% al 60%.
D. 3H
D. Los cebadores deben aparearse a un objetivo específico.
3. ¿Cuál de los siguientes no es un componente de un ensayo estándar de reacción en
13. Para la mayoría de las bacterias, ¿qué diana se suele secuenciar para confirmar la
cadena de la polimerasa (PCR)?
identidad de los aislados problemáticos?
una. Desoxinucleótidos
una. Región espaciadora transcrita externa 1
B. rpoB
B. Imprimaciones

C. Enzimas de restricción
C. ARN ribosómico 16S
D. Magnesio
D. Región espaciadora interna transcrita 1
4. ¿Cuál de las siguientes es una ventaja de utilizar procedimientos de
amplificación de ácidos nucleicos en laboratorios de microbiología clínica?
una. Son muy sensibles.
B. Los resultados se obtienen más rápidamente en comparación con las
BIBLIOGRAFÍA
técnicas de microbiología estándar, como el cultivo.
Alwine, JC y col. (1977). Método de detección de ARN específicos en
C. Tienen una mayor sensibilidad en comparación con los procedimientos
geles de agarosa mediante transferencia a papel de diazobenciloximetilo e
estándar de microbiología.
hibridación con sondas de ADN. Actas de la Academia Nacional de Ciencias
D. Todo lo anterior.
de los Estados Unidos de América74, 5350.

ERRNVPHGLFRVRUJ
Traducido del inglés al español - www.onlinedoctranslator.com

CAPÍTULO

7 Examen microscópico de
materiales de sitios infectados
Connie R. Mahon*

BOSQUEJO DEL CAPÍTULO

- PREPARACION DE MUESTRAS - CALIFICACIÓN O CLASIFICACIÓN DE MATERIALES
Frotis de hisopos Materiales contaminantes Materiales locales
Frotis de líquidos espesos o semisólidos Frotis de
materiales gruesos, granulares o mucoides Frotis de Purulencia
líquidos finos Materiales Mixtos
Preparaciones para citocentrífugas - INFORMES DE EXAMENES DIRECTOS
- MANCHAS - INICIACIÓN DE MANIPULACIÓN ESPECIAL DE PATÓGENOS
- Microscopios ESPECIALES O INESPERADOS
- TERMINOLOGÍA PARA EXAMENES DIRECTOS - CONTROL DE CALIDAD EN INTERPRETACIONES
- EXAMEN DE MATERIAL PREPARADO MICROSCÓPICAS DIRECTAS
Caracterización de materiales de referencia - EJEMPLOS DE OBSERVACIONES E INFORMES DE MUESTRA
Búsqueda de microorganismos

OBJETIVOS
Después de leer y estudiar este capítulo, debería poder:
1. Dada una lista de tinciones comúnmente utilizadas en el laboratorio de diagnóstico • Diplococos grampositivos
médico, y seleccione el tipo de tinción apropiado para determinar si un microbio es • Diplococos gramnegativos
una bacteria o micobacteria, un hongo o una inclusión viral. • Bastoncillos ramificados filamentosos grampositivos

2. Dado un frotis directo teñido con Gram de material de un sitio infectado,
describa el material local, el material contaminante, la purulencia y la
morfología de los microorganismos presentes utilizando la terminología
descriptiva presentada.
3. Asociar la siguiente morfología con especies comunes:
• Bacilos gramnegativos, pequeños, pleomórficos
• Cocos grampositivos en grupos o cadenas
• Levaduras y pseudohifas
4. Asocie los resultados del frotis directo con los organismos recuperados del
cultivo.
5. Aplicar los procedimientos de control de calidad utilizados en el laboratorio a
la interpretación del examen microscópico directo y los resultados del
cultivo.

Caso en punto Temas a considerar

Después de leer la historia clínica del paciente, considere:
Un hombre de 75 años con antecedentes de enfermedad pulmonar
- El papel de la tinción de Gram y la morfología microscópica en la
obstructiva crónica, tabaquismo intenso y abuso de alcohol acudió a su
identificación de microorganismos
médico con fiebre, escalofríos y tos productiva. Se recolectaron muestras
- La presencia de purulencia (inflamación) en el frotis
de esputo y se enviaron al laboratorio para frotis directo y cultivo. También
directo de la muestra y su importancia.
se extrajeron hemocultivos tres veces dentro de las 24 horas posteriores al
- La evidencia de contaminación por microbiota (flora)
ingreso en el hospital. El frotis directo fue teñido con Gram (verFigura 7.1).
normal (residente) y lo que indica
El cultivo de esputo produjo un fuerte crecimiento de colonias α-
- La importancia del organismo sospechoso observado, si es
hemolíticas. Los hemocultivos arrojaron resultados similares después de
"real" o un artefacto
24 horas de incubación.
- Los resultados de los microorganismos utilizados como control de
calidad para determinar si el procedimiento de tinción de Gram se
realizó correctamente en el frotis directo.
- Si la apariencia teñida de los elementos presentes, por
* Mis comentarios son míos y no representan la opinión de la Administración de ejemplo, polimorfonucleares, glóbulos rojos y células
Recursos y Servicios de Salud del Departamento de Salud y Servicios Humanos. epiteliales, es correcta.

121
ERRNVPHGLFRVRUJ
122 PARTE 1 Introducción a la microbiología clínica

Términos clave

Ácido rápido Tinción de Gram

Escombros amorfos Morfotipo microbiano

Unidad de formación de Colonia Monomicrobiano
Espiral de Curschmann Polimicrobiano
Citocentrifugación Tinción mediada por sonda
Tinción diferencial Purulencia
Bacterias Gram-negativo Mancha simple
Bacterias grampositivas

D
La microscopía directa, visualización de microorganismos en
muestras clínicas, ha sido posible durante más de 200 años. Sin
embargo, no fue una realidad práctica hasta que Koch estableció
HIGO. 7.1Esputo expectorado, frotis, tinción de Gram, microscopía
Lished la teoría de los gérmenes de la enfermedad en la década de 1880. En
óptica, proyección de potencia media. Purulencia, luz. Escombros
1880, un cirujano escocés había publicado sus observaciones directas de cocos amorfos, moderados. Diplococos grampositivos, encapsulados,
formadores de cúmulos enpurulencia de enfermedades humanas. Llamó a extracelulares.
estos cocosEstafilococo. En 1884 Christian Gram desarrolló el Tinción de Gram,
que coloca a la mayoría de las bacterias en uno de dos grupos:bacterias
grampositivas o Bacterias Gram-negativo. La tinción de Gram nos permite MESA 7.1 Preparación de materiales infectados para visual
examinar una muestra de pus directamente en busca de cocos grampositivos. Examen
Estafilococo. La tinción diferencial y la microscopía proporcionan la base del
diagnóstico de laboratorio de enfermedades infecciosas. Actualmente se dispone Preparación Tipo de muestra u organismo
de una serie de tinciones para ayudar al microbiólogo a visualizar
Para examen macroscópico
microorganismos en muestras clínicas. Los virus, debido a su pequeño tamaño,
Preparación húmeda Parásitos
generalmente no se pueden detectar mediante tinción. Sin embargo, los
Materiales> 1 mm de tamaño
cambios morfológicos que causan algunos virus en las células infectadas pueden
verse y pueden ayudar en la identificación de una infección viral.
Para examen microscópico
Preparación húmeda (directa o sedimentada) Líquidos o semisólidos
En muchos casos, el médico tiene una idea correcta sobre el diagnóstico
Citocentrifugado (directo o Líquidos claros o ligeramente turbios
después de tomar el historial del paciente y realizar un examen físico. En los preseditado)
casos restantes en los que el diagnóstico no es evidente, la asistencia proviene Frotis Líquidos claros o ligeramente turbios
de estudios de laboratorio o radiológicos. Con las enfermedades infecciosas, el 1. Caída Pus o líquido

médico tiene una idea de la etiología probable a partir de la tasa de progresión Homogeneizado de tejido

Enjuague con hisopo

de los síntomas y puede evaluar la extensión del proceso infeccioso. El médico se
ve fuertemente presionado para comenzar el tratamiento inmediato de los
pacientes sintomáticos. Las muestras se recolectan y envían al laboratorio para
confirmar las sospechas del médico sobre la enfermedad del paciente. La
capacidad del laboratorio para responder al médico de manera oportuna con
resultados útiles es la clave para mantener el tratamiento en la dirección
correcta o cambiar la dirección del tratamiento si el diagnóstico presuntivo del
médico resulta incorrecto. El laboratorio de microbiología de diagnóstico tiene la
oportunidad de responder al médico durante el proceso de toma de decisiones
sobre el tratamiento o al comienzo de la terapia presuntiva. La observación
directa de patógenos se convierte en evidencia primaria o directa para confirmar
o refutar la impresión clínica inicial del médico. Si esta impresión es incorrecta,
se facilita la reconsideración y se pueden realizar estudios adicionales según sea
necesario. Los resultados de los cultivos generalmente se reciben demasiado
tarde para alterar la presunta terapia. En el mejor de los casos, confirman la
exactitud de las opciones terapéuticas ya realizadas e implementadas.
Preparación de muestras
Las muestras para microscopía de campo claro de rutina se preparan de
una manera que facilite un examen adecuado en un tiempo razonable. En
el caso de los frotis, las muestras deben examinarse a gran escala para
determinar el mejor enfoque (Cuadro 7.1). Ambos gruesos, pero no
2. Pellet Cultura de sangre
Diluir la muestra
3. Laminado Material hisopado
4. Impresión (preparación táctil) Tejido
Las áreas de frotis opacas y delgadas (monocapa) deben producirse
mediante el proceso de frotis elegido.
Frotis de hisopos
Los frotis no deben prepararse a partir de un hisopo después de que se haya
utilizado para inocular los medios de cultivo. Idealmente, si la muestra se puede
recolectar solo en hisopos, se envían dos hisopos. Los frotis de hisopos se
preparan haciendo rodar el hisopo hacia adelante y hacia atrás sobre áreas
contiguas del portaobjetos de vidrio para depositar una capa delgada de
material de muestra (Figura 7.2). Este proceso conserva la morfología y las
relaciones de los microorganismos y los elementos celulares. El hisopo nunca
debe frotarse hacia adelante y hacia atrás a lo largo del portaobjetos porque es
posible que no se deposite material importante en el lado opuesto del hisopo y
se rompan los elementos del frotis.
Frotis de líquidos espesos o
semisólidos
Los hisopos también se pueden utilizar como herramienta para la preparación de frotis
a partir de muestras líquidas espesas o semisólidas, como heces (Figura 7.3). los

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 CAPÍTULO 7 Examen microscópico de materiales de sitios infectados
HIGO. 7.2Preparación de frotis de una muestra recogida en un hisopo. El hisopo
se debe enrollar hacia adelante y hacia atrás a lo largo del portaobjetos para
depositar la muestra por completo.
HIGO. 7.3Los frotis de líquidos espesos opacos o semisólidos, como las
heces, se pueden hacer con un hisopo para tomar muestras y untar el
material.
Se sumerge el hisopo en la muestra durante varios segundos y se utiliza para
preparar una fina capa de material en el portaobjetos de vidrio para teñir y
observar. Este método de preparación con hisopo es adecuado pero puede
producir resultados menos deseables que otros métodos.
Frotis de materiales gruesos,
granulares o mucoides
El material opaco debe extenderse finamente para que se deposite una
monocapa de material en algunas áreas. Es más deseable tener áreas tanto
gruesas como delgadas. Los gránulos dentro del material deben triturarse para
poder evaluar su composición. Es posible una mejor presentación de los
gránulos si los gránulos o granos se “pescan” de los materiales circundantes y se
trituran en un portaobjetos separado utilizando la técnica que se muestra en
Figura 7.4. Los gránulos que son demasiado difíciles de triturar entre dos
portaobjetos de vidrio probablemente no representan materiales infecciosos. Lo
más probable es que sean piedras pequeñas o cuerpos extraños. El examen con
un microscopio de disección puede ayudar a caracterizar la naturaleza de los
gránulos duros.
Los pasos para preparar un frotis de materiales gruesos, granulares o
mucoides son los siguientes:
1. Coloque una porción de la muestra en el portaobjetos etiquetado y presione un
segundo portaobjetos, con la etiqueta hacia abajo, sobre la muestra para aplanar o
triturar los componentes.
2. Gire las dos superficies de vidrio una contra la otra para que las
fuerzas de corte rompan el material.
3. Una vez que el material se haya aplanado y adelgazado lo suficiente,
separe los portaobjetos de vidrio suavemente entre sí para producir
dos frotis.
4. Si el material aún es demasiado grueso, repita los primeros tres pasos con
otro (tercer) portaobjetos de vidrio. El mejor frotis o ambos frotis se pueden
conservar para la tinción.
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123
Los portaobjetos de material de lugares de muestreo difíciles, muestras
escasas o pacientes con enfermedades críticas no deben descartarse hasta que
se complete la evaluación del cultivo.
Frotis de líquidos finos
Las muestras “delgadas” de líquidos como orina, líquido cefalorraquídeo
(LCR) y trasudados deben dejarse caer, pero no esparcirse sobre el
portaobjetos. El área de la gota de muestra debe marcarse en el reverso
del portaobjetos con un lápiz de cera o colocarse dentro del círculo o
pocillo de un portaobjetos premarcado. Si está disponible,
citocentrifugación se prefiere para este tipo de muestra.
El líquido delgado se puede preparar extrayendo una pequeña cantidad del
líquido o un sedimento resuspendido del líquido en una pipeta y depositándolo
como una gota de líquido en un área claramente marcada en el portaobjetos (
Figura 7.5). Es posible que el material no sea muy visible después de la tinción
debido a un bajo recuento de proteínas o células. El líquido no debe esparcirse
sobre un área más grande del portaobjetos a menos que esté turbio. Los fluidos
turbios o espesos se pueden preparar de manera más eficiente mediante el
método descrito anteriormente.
Preparaciones para citocentrífugas
La citocentrifugación es un método excelente para preparar líquidos no
viscosos como el LCR y los líquidos de lavado broncoalveolar. El proceso de
citocentrifugación deposita elementos celulares y microorganismos de la
muestra en la superficie de un portaobjetos de vidrio como una monocapa.
Los elementos celulares se depositan dentro de un área discreta para una
fácil visualización (Figura 7.6). La proteína, que tiñe los gramnegativos, se
disipa en una almohadilla de filtro, dejando el fondo más claro para ver los
morfotipos gramnegativos. La morfología celular es buena y el efecto de
concentración acorta el tiempo de visualización y aumenta el volumen de
material celular revisado.
Técnica de citocentrífuga
Se prefiere una citocentrífuga con un recipiente cerrado para microbiología. El
recipiente se puede cargar y descargar dentro de una cámara de riesgo
biológico para evitar posibles aerosoles infecciosos. Los pasos de la técnica son
los siguientes:
1. Se colocan pequeñas alícuotas de líquido (0,1 a 0,2 ml) en los
soportes de citocentrífuga.
2. El material se centrifuga durante 10 minutos.
3. Se quita la diapositiva. Si el depósito de células es demasiado
pesado, una parte del depósito celular puede mancharse (ver
Figura 7.6).
4. El sedimento se fija y descontamina en alcohol al 70% durante 5
minutos.
Manchas
La tinción imparte una coloración artificial a los materiales del frotis que les
permite ser vistos utilizando el aumento proporcionado por un microscopio. Hay
muchos tipos de manchas:manchas simples,tinciones diferenciales, y
tinciones mediadas por sonda. Las tinciones simples están dirigidas a colorear
las formas y formas presentes, las tinciones diferenciales están dirigidas a
colorear componentes específicos de los elementos presentes, y las tinciones
mediadas por anticuerpos o sondas de ADN están dirigidas específicamente a la
identificación de un organismo. Algunas tinciones se utilizan como montajes
húmedos en muestras líquidas, como la tinta china en el líquido cefalorraquídeo.
Esta es una tinción diferencial que permite la detección de la levadura
encapsulada.Cryptococcus neoformans. Manchas mas
124 PARTE 1 Introducción a la microbiología clínica

Deje caer o coloque la muestra sobre la superficie de un portaobjetos de vidrio etiquetado.

Coloque la segunda diapositiva boca abajo sobre el material.

Presione para aplanar o aplastar el material y gire las dos superficies de vidrio una contra la otra.

Tira para esparcir.

HIGO. 7.4Preparación de frotis a partir de muestras gruesas, granulares o mucoides.

HIGO. 7,6Las preparaciones de citocentrífuga depositan la muestra

HIGO. 7.5Los frotis de fluidos delgados se pueden preparar colocando concentrada dentro de un área limitada para su visualización. Si el depósito es
una sola gota de fluido o sedimento de fluido resuspendido en un área demasiado pesado, una parte del material puede mancharse para producir un
bien marcada del portaobjetos. área delgada.

de uso común en el laboratorio de diagnóstico se enumeran en Cuadro 7.2.

Cuatro manchas: Gram,ácido rápido, blanco de calcofluor y Wright-Giemsa
modificado rápido, deben estar disponibles en todos los laboratorios de
microbiología de diagnóstico (ver procedimientos en Apéndice C). La mayoría de
las otras tinciones están dirigidas a grupos de organismos específicos y deben
estar disponibles cuando sea necesario.
Microscopios
El examen de las muestras debe comenzar con una inspección visual
general y continuar hasta el nivel de aumento necesario para identificar el
patógeno o determinar que no hay ningún patógeno presente. Las
pruebas ordenadas proporcionan una guía para el examen, pero una

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 CAPÍTULO 7 Examen microscópico de materiales de sitios infectados 125

MESA 7.2 Tinciones para materiales infectados

Manchas Aplicaciones

Morfología general
Wright-Giemsa Lavados broncoalveolares
Preparaciones de Tzanck
Muestras con fondos celulares complejos (visualiza bacterias, levaduras, parásitos e inclusiones virales)

Morfología seleccionada
Leifson Flagelos
Azul de metileno Gránulos metacromáticos de Corynebacterium diphtheriae
Manchas acidorresistentes

Ziehl-Neelsen Sedimentos para micobacterias (frotis concentrados)

Resistencia al ácido parcial de Nocardia spp.
Fluorocromo Sedimentos para micobacterias (frotis concentrados, auramina y rodamina) Tinción
acidorresistente preferida
Kinyoun Modificación de tinción acidorresistente del método de Ziehl-Neelsen para Cryptosporidium y Cyclospora parásitos en muestras de heces
Calcofluor blanco Hongos broncoalveolares y algunos quistes parasitarios
Los diferencia de materiales de base de morfología similar.
Tinción de Gram

Tradicional Tinción de rutina para el área de diagnóstico

Levaduras diferenciadas de todos los demás organismos.

Mejorado Proporciona la misma tinción diferencial pero mejora los organismos rojos negativos al teñir el material de fondo de verde a
Verde Gris

Género (especie) -Manchas específicas

Sonda de anticuerpo o ADN Se utiliza para la identificación específica de patógenos seleccionados, como Chlamydia trachomatis, Bordetella pertussis, Legionella
manchas pneumophila, virus del herpes simple, virus de la varicela-zóster, citomegalovirus, adenovirus y virus respiratorios

El enfoque de rutina para el manejo de muestras debe incluir un

procedimiento de examen que descubra patógenos inesperados. En la MESA 7.3 Observación de patógenos microbianos
mayoría de los laboratorios de microbiología de diagnóstico, este
procedimiento consiste en una inspección visual en el momento de la Instrumentos Ampliación (×) Solicitud
preparación del frotis y el cultivo y el examen microscópico de una Ojos 0 Examen macroscópico
preparación Gramstained en busca de estructuras demasiado pequeñas Lupa 5 Examen macroscópico
para ser vistas a simple vista. Microscopio de disección 2.5–30 Bruto detallado
Los microscopios difieren tanto en su capacidad para resolver examen y
pequeñas estructuras como en sus modificaciones. Los microscopios se manipulación
Luz compuesta
dividen en dos tipos básicos: microscopios ópticos compuestos, con límites
microscopio
de resolución comunes de 1 a 10µmy ampliaciones hasta ×2000, y
Campo Claro 10–1000 Células teñidas
microscopios electrónicos, con ampliaciones superiores a×1.000.000 ( Campo oscuro 10–400 Células que no se tiñen fácilmente
Cuadro 7.3). El laboratorio de microbiología utiliza varias modificaciones para campo claro
del microscopio óptico compuesto, pero el caballo de batalla del microscopía
laboratorio es el microscopio de campo brillante. Contraste de fase 10–400 Células vivas o no teñidas
Fluorescencia 10–400 Preparaciones con
manchas de fluorocromo,
Terminología para exámenes directos que puede teñir directamente
las células o conjugarse con
El microscopista debe tener un vocabulario consistente para la descripción anticuerpos que
de los materiales vistos en las muestras. Este vocabulario debe ser adjuntar a las celdas

compartido por la microbiología y las comunidades médicas para que Microscopios electronicos

cuando se informen las observaciones, todos puedan comprender las Electrón de transmisión 150-10 millones Determinar la ultraestructura
de orgánulos celulares
implicaciones de las descripciones. Las observaciones comunes se pueden
Electrón de barrido 20–10 000 Determinar las formas de la superficie
codificar para que sean coherentes entre los observadores. El uso de
y estructuras
computadoras para registrar observaciones codificadas y generar informes
de los hallazgos amplía aún más la necesidad de una terminología
uniforme. Solo los hallazgos inusuales deben describirse individualmente apoya la probabilidad de infección y dirige la atención hacia tipos
en un informe. específicos de patógenos. Las descripciones de morfotipos comunes y las
Los antecedentes de la muestra que se está evaluando deben describirse especies asociadas más prevalentes se enumeran enCuadro 7.4. Ejemplos
con suficiente detalle para transmitir la composición del material. La presencia de frases descriptivas útiles con cuantificación se enumeran enCuadro 7.5.
de células que representan una respuesta a una lesión.

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126 PARTE 1 Introducción a la microbiología clínica

MESA 7.4 Morfología de la tinción de Gram y organismos asociados

Descripción del morfotipo Organismos más comunes

Bacterias
Cocci
Cocos grampositivos Aerococcus, Enterococcus, Finegoldia, Leuconostoc, Pediococcus, Planococcus,
Staphylococcus, Stomatococcus, Streptococcus
Cocos grampositivos
Pares Finegoldia, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus spp.
Tétradas Micrococcus, Staphylococcus, Peptostreptococcus spp.Finegoldia,
Grupos Staphylococcus, Peptostreptococcus, Stomatococcus spp.Streptococcus,
Cadenas Peptostreptococcus spp.
Clústeres, intracelulares Microaerofílico Estreptococo spp., estreptococos viridans, Estafilococo spp.Streptococcus
Encapsulados pneumoniae, Streptococcus pyogenes (casi nunca), Stomatococcus mucilaginosus
Diplococos grampositivos (en forma de lanceta) Streptococcus pneumoniae
Diplococos grampositivos Patógeno Neisseria spp., Moraxella catarrhalis

Bacilos
Bacilos grampositivos
Pequeña Listeria monocytogenes, Corynebacterium spp.
Medio Lactobacillus, bacilos anaeróbicosClostridium,
Grande Bacillus
Difteroide Corynebacterium, Propionibacterium, Rothia spp.
Pleomórfico, gramo variable con Gardnerella vaginalis
cuentas Micobacterias, lactobacilos afectados por antimicrobianos y corinebacterias
Filamentoso Morfotipos anaeróbicos, células afectadas por antibióticos
Formas filamentosas, con cuentas, bífidas Actinomicetos, Nocardia, Nocardiopsis, Streptomyces, Rothia
ramificadas o en V Bifidobacterium, brevibacteriasBordetella, Haemophilus (
Cocobacilos gramnegativos pleomórfico)Veillonella
Masas
Cadenas Prevotella, Veillonella
Bacilos gramnegativos
Pequeña Haemophilus, Legionella (delgado con filamentos), Actinobacillus, Bordetella, Brucella, Francisella,
Pasteurella, Capnocytophaga, Prevotella, Eikenella
Bipolar Klebsiella pneumoniae, Pasteurella, Bacteroides
Medio Entéricas, pseudomonas
Grande Clostridios o bacilos desvitalizados
Curvo Vibrio, Campylobacter
Espiral Campylobacter, Helicobacter, Gastrobacillum, Borrelia, Leptospira, Treponema
Fusiforme Fusobacterium nucleatum
Filamentos Fusobacterium necrophorum (pleomórfico)

Levaduras y Hongos
Levaduras

Pequeña Histoplasma, Torulopsis

Medio Candida
Con cápsulas Cryptococcus neoformans
Cogollos de base ancha y paredes gruesas Blastomyces

Hifas
Septate Hongos

Aseptato Cigomicetos
Con artroconidias Coccidioides
Con ramas en un ángulo de 45 grados Aspergilo
Pseudohifas Candida
Esferula (endosporas) Coccidioides
Esporangios con endosporas Prototecas

Los microorganismos pueden describirse de tal manera que, en

función de la prevalencia, la descripción implique la identificación del
organismo. Por ejemplo, la observación de un cocobacilo
gramnegativo del líquido cefalorraquídeo de un niño implica que
Haemophilus influenzae es el agente infeccioso.
Examen de material preparado
El microbiólogo encuentra regularmente un número limitado de patógenos
microbianos de los sitios infectados comúnmente muestreados. La tinción de
Gram o tinción acidorresistente es la más rápida y menos costosa

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 CAPÍTULO 7 Examen microscópico de materiales de sitios infectados 127

liberación. Existe una migración temprana de neutrófilos, pero la fagocitosis de los

MESA 7.5 Descripciones del material de referencia diplococos es limitada. El cultivo bacteriano de rutina de esta muestra debe producir un
crecimiento abundante deSteotococos neumonia.
Células y estructuras Asociaciones

Escombros amorfos (ligeros,

moderado o pesado)
Necrosis, líquido proteico pesado
Caracterización de
Escombros de partículas negras Inhalación de humo, crack eosinófilos Materiales de base
Cristales de Charcot-Leyden de cocaína El científico del laboratorio siempre debe mirar el material del portaobjetos
Epiteliales con contaminantes Paso del espécimen a través sin ayuda antes de comenzar el examen microscópico. Debe tenerse en
bacterias área contaminada durante la
cuenta la distribución y consistencia del material. El objetivo de baja
recolección
potencia del microscopio (×2,5 hasta ×10) debe utilizarse primero para
Presencia de espirales de Curschmann Broncoespasmo, obstrucción,
(esputo) asma evaluar el contenido general del material de la diapositiva. Las muestras
Células epiteliales (ligeras, moderadas, Superficie epitelial afectada o pueden ser homogéneas o heterogéneas y pueden contener patógenos
o pesado) adyacente al lugar de recolección distribuidos uniformemente por toda la muestra o limitados a un campo
Organismos intracelulares Material Asociación inferida en la infección visual. Se debe seguir una lista de verificación de indagación mental hasta
local (ligero, moderado, Reflejo del lugar de recolección
que se desarrolle el hábito de buscar sistemáticamente una diapositiva.
o pesado)
Los elementos que deben incluirse en dicha lista de verificación son los
Células mononucleares presentes Inflamación crónica
Mucosidad (ligera, moderada o pesada) Irritación de la superficie glandular siguientes:
Purulencia (ninguna, ligera, moderada, Inflamación aguda, exudación • ¿Existe evidencia de contaminación por microbiota normal (residente)?
o pesado) El científico de laboratorio debe buscar células epiteliales escamosas,
las células rojas de la sangre Trauma, hemorragia bacterias sin células de inflamación, alimentos u otros desechos. ¿Este
material constituye la muestra completa, o también hay una muestra
representativa disponible de manera que pueda reconocerse? La
contaminación de muestras no recolectadas de sitios estériles
método para el diagnóstico presuntivo en estos entornos clínicos comunes. Los disminuye el valor de los estudios de cultivo.
organismos se ven fácilmente porque más de 105 unidades formadoras de • ¿Hay restos necróticos (amorfos) en el fondo? Infección por organismos
colonias de microorganismos infecciosos por mililitro suelen estar presentes en como C. perfringens y Nocardia spp. puede provocar pocos neutrófilos
infecciones clínicamente evidentes. polimorfonucleares (PMN). Las células inflamatorias que migran al área
Es importante distinguir dos tipos de infección: infecciones causadas por un de infección se pueden lisar. Los pacientes con leucopenia también
especie única, o monomicrobianoe infecciones causadas por múltiples especies, pueden tener pocas células inflamatorias dentro de sus restos
o polimicrobiano. Los agentes individuales de infección o los agentes que inflamatorios.Escombros amorfosPor lo general, son los restos de
causan infecciones clásicas se reconocen fácilmente por microscopía y requieren tejido mezclados con los productos de degradación o los fluidos de la
interpretaciones limitadas. Las infecciones causadas por una sola especie común inflamación aguda y siempre deben buscarse organismos. Tuberculosis
o por agentes infecciosos clásicos incluyensteotococos neumonia neumonía, micobacteriana los organismos se tiñen mal como bacilos
Staphylococcus aureus abscesos o piodermas, H. influenzae traqueobronquitis o grampositivos con cuentas o no se tiñen en absoluto con la tinción de
meningitis en niños, Clostridium perfringens gangrena gaseosa,Nocardia spp. Gram; pueden aparecer dentro de los desechos necróticos como
abscesos pulmonares y uretritis gonocócica en varones. imágenes negativas.
• ¿Hay evidencia de purulencia? La purulencia con glóbulos rojos,
Las presentaciones polimicrobianas en frotis requieren más neutrófilos, fondo proteico y necrosis refleja una inflamación
interpretación y deben tener en cuenta los antecedentes del frotis, la aguda. Las células mononucleares, que incluyen linfocitos,
morfología de los microorganismos y la ubicación anatómica de la monocitos y macrófagos, reflejan inflamación crónica. Los
sospecha de infección, así como los síntomas clínicos que la acompañan. pacientes citopénicos no tienen la respuesta celular que se
Las infecciones polimicrobianas generalmente surgen de microbiota observa en individuos normales. Puede haber purulencia, sangre y
normal o alterada desplazada, y el cultivo produce las mismas especies que necrosis si se produce daño tisular traumático en ausencia de
pueden aislarse en cultivo de muestras no infectadas pero contaminadas. infección.
Estas infecciones suelen representar el desplazamiento de la biota • ¿Están presentes estructuras inesperadas? La característica estructura en
ambiental, cutánea, orofaríngea, gastrointestinal o vaginal hacia los espiral de un Espiral de Curschmann, un tapón de moco que se encuentra
tejidos, con la consiguiente infección. Las infecciones más comunes de este en el esputo de pacientes con asma, se reconoce más fácilmente a baja
tipo son infección de heridas quirúrgicas (biota cutánea), neumonía por potencia. Esta estructura no debe confundirse con las larvas parásitas, que
aspiración (biota orofaríngea), abscesos perirrectales (biota fecal) y también se pueden encontrar en el esputo utilizando un aumento de baja
abscesos tuboováricos (biota vaginal). potencia. Los gránulos grandes, granos o formas de hongos como esférulas
o esteras de hongos se pueden reconocer mejor a baja potencia.

Verificación de caso 7.1

El frotis teñido de Gram de la muestra de esputo expectorado tomada del
paciente descrito en el Caso en Punto al comienzo del capítulo mostró
restos amorfos moderados y diplococos grampositivos extracelulares
encapsulados. Ésta es una presentación de frotis típica de la neumonía
neumocócica temprana. Los neumococos han proliferado en gran número
y el pulmón está respondiendo con aumento de moco y líquido.
Búsqueda de microorganismos
Después de que se haya examinado toda la extensión del material a baja
potencia, se debe seleccionar un área representativa para ver con la lente
de inmersión en aceite. A×40 o ×Se prefiere una lente de 60 objetivos para
escanear, y una ×Se utiliza una lente de 100 para la evaluación final. En la
infección, el organismo estará íntimo con la purulencia de

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128 PARTE 1 Introducción a la microbiología clínica

restos necróticos. Todos los granos o gránulos y el fondo deben examinarse

cuidadosamente. Los delicados filamentos grampositivos deNocardia spp. puede MESA 7,6 Clasificación de la calidad de la muestra clínica
mezclarse con el fondo.H. influenzae puede estar presente en grandes Usando el Q Score
cantidades, oculto dentro del moco, en las exacerbaciones agudas de la
bronquitis crónica. Deben tenerse en cuenta las formas intracelulares y Numero promedio
Numero promedio de escamoso
extracelulares. Criterios estrictos paramorfotipos microbianosdebe ser
de neutrófilos por Células epiteliales por
mantenido. El examinador no debe distraerse con tinción grampositiva Puntaje Campo de baja potencia Puntaje Campo de baja potencia

precipitada, gránulos de queratohialina u otros artefactos. Los organismos

deben evaluarse para determinar la forma, el tamaño y la reacción de la tinción
0 0 (ninguno) 0 0 (ninguno)

+1 1-9 (pocos) -1 1-9 (pocos)

de Gram. Debido a que las bacterias dañadas en la pared celular, las bacterias
+2 10-24 (moderado -2 10-24 (moderado
tratadas con antimicrobianos o las bacterias muertas pueden parecer
números) números)
falsamente gramnegativas, sus formas y tamaños son “características co- +3 ≥25 (muchos, -3 ≥25 (muchos,
características” críticas. El ejemplo clásico de frotis engañoso es la observación numeroso) numeroso)
de diplococos gramnegativos en forma de lanceta mezclados con las formas
Interpretación:
grampositivas predominantes. Un observador sin experiencia podría
Puntuación Q = (puntos por la cantidad promedio de neutrófilos) + (puntos por la cantidad
malinterpretar esto como una infección mixta más que como la simple presencia promedio de células escamosas)
de neumococos muertos en una infección clásica. Puntuación mínima = −3
• ¿Existe un microorganismo etiológico único más probable? Si es así, ¿la Puntuación máxima = +3
Cuanto mayor sea la puntuación, mejor será la muestra.
morfología es suficientemente característica para presumir
• Una muestra con una puntuación compuesta ≥ +1 debería ser cultivado.
identificación? ¿Existe un agente antimicrobiano específico para el • Debe cultivarse una muestra de esputo de un paciente leucopénico con células
tratamiento de infecciones con este agente? ¿Es necesaria la prueba de epiteliales respiratorias ciliadas.
• Una puntuación Q compuesta que es 0 o negativa es probablemente una muestra superficial que
susceptibilidad a los antimicrobianos o es suficiente la identificación del
puede no ser una muestra confiable y, por lo tanto, generalmente no se cultiva.
patógeno sospechoso para el tratamiento empírico?
Desde Bartlett RC: Microbiología médica: calidad, costes y relevancia clínica.
• ¿La infección es monomicrobiana o polimicrobiana? ¿Los Malden, MA, 1974, John Wiley & Sons.
morfotipos presentes caracterizan la fuente de los organismos?
¿Se puede caracterizar la mezcla de organismos?
• Examine más de un área del frotis. Si es posible, se debe encontrar MESA 7.7 Criterios para determinar la idoneidad de
más de un microorganismo. Es raro no poder encontrar más de Muestra de esputo para cultivo
una célula porque en una infección los organismos suelen estar
distribuidos por toda la muestra. Se debe tener cuidado al Células epiteliales por Leucocitos por
interpretar números muy bajos de bacterias, especialmente en Campo de baja potencia Campo de baja potencia

ausencia de inflamación o necrosis y en muestras de sitios no

estériles. Se debe considerar seriamente una pequeña cantidad de
organismos en muestras de sitios estériles. Sin embargo, se
pueden hacer y examinar frotis adicionales si la probabilidad de
contaminación es alta.
• No sobreinterprete los hallazgos. El diagnóstico específico debe
limitarse a una pequeña cantidad de casos en los que el frotis es clásico
en su presentación y la extensión de la infección no es un problema. Si
se sospecha de bacterias acidorresistentes, la tinción acidorresistente
debe realizarse antes de emitir una opinión. Si un elemento fúngico no
es claramente grampositivo, se debe realizar una tinción con calcofluor.
Ambas tinciones de seguimiento se pueden realizar en la preparación
decolorada y teñida con Gram.
Clasificación o clasificación de materiales
El examen microscópico también puede revelar inmediatamente que es poco
probable que una muestra sea útil para el diagnóstico o el manejo del cultivo. La
muestra puede ser solo sangre en lugar de material infectado, o puede ser
restos de la superficie orofaríngea o algún otro material de la superficie normal.
El procesamiento y la interpretación del cultivo de tales muestras no
representativas pueden provocar un retraso en el tratamiento debido a un
cultivo falso negativo o una terapia antimicrobiana inapropiada debido a un
cultivo falso positivo del crecimiento de biota normal o biota alterada por
antimicrobianos.
Se han derivado varios sistemas de graduación o clasificación para
ayudar al científico de laboratorio a tomar decisiones relacionadas con el
cultivo de la muestra o la interpretación del crecimiento a partir del cultivo.
Grupo 1 > 25 <10
2 > 25 10-25
3 > 25 > 25
4 10-25 > 25
5 <10 > 25
Idealmente, solo las muestras que pertenecen a los grupos 4 y 5 son adecuadas para el cultivo.
Sin embargo, los individuos inmunodeprimidos también tendrán un número reducido de
leucocitos en sus secreciones cuando disminuyan sus recuentos de células. Por lo tanto, los
criterios se han revisado para que el número de células epiteliales (> 25 por campo de bajo
aumento) sea un mejor indicador de la contaminación de la mucosa o la saliva.
De Koneman E, et al: Atlas de colores y libro de texto de
microbiología diagnóstica, ed 7, Filadelfia, 2017, Wolters Kluwer.
de un espécimen. La mayoría de las evaluaciones están dirigidas a
muestras como el esputo, cuya recolección se complica por la
contaminación con la biota de la garganta y la boca porque el cultivo
por sí solo puede ser engañoso. El objetivo es separar la muestra
representativa de la muestra contaminada antes del cultivo o la
evaluación del cultivo. Puntuación Q de Bartlett de muestras de
esputo (Cuadro 7.6) y el método Murray-Washington (Cuadro 7.7) para
la evaluación de la contaminación documentar la asociación de 10 a
20 células epiteliales escamosas (SEC) por campo microscópico en ×
100 aumentos con muestras inaceptables y de 10 a 25 PMN por
campo a ×100 aumentos con muestras significativas. El método de
Heineman enfatiza la relación entre SEC y PMN.
En algunos casos, el frotis directo es un medio de diagnóstico. El
sistema de puntuación de Nugent para frotis vaginales teñidos con Gram (
Cuadro 16.4) se utiliza para diagnosticar la vaginosis bacteriana. Manchado

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 CAPÍTULO 7 Examen microscópico de materiales de sitios infectados
los frotis se examinan y puntúan para detectar la presencia de
Lactobacillus, Gardnerella, y Mobiluncus morfotipos. En este caso, se ha
demostrado que la observación de frotis teñidos con Gram es más precisa
que los cultivos para diagnosticar la vaginosis bacteriana.
Muchos laboratorios de microbiología de diagnóstico utilizan las
observaciones documentadas relacionadas con los SEC y los PMN, pero
intentan coordinar las observaciones relacionadas con los materiales de
fondo, que consisten en materiales locales, materiales contaminantes y
purulencia, y describir la relación de los microorganismos con estos
materiales de fondo. El lugar del cuerpo de la muestra, como las muestras
respiratorias y las heridas, y la clasificación del frotis juntos determinan el
alcance de la evaluación del cultivo.
Materiales contaminantes
Materiales contaminantes (ver Plato 1) se reconocen como materiales que
no provienen del sitio de recolección, que no contribuyen a la respuesta
inflamatoria de los tejidos o que no es probable que contengan el
organismo infectante. Por lo general, se han agregado a la muestra en el
curso de la recolección desde o a través de un área no estéril. Los
materiales contaminantes más molestos son los materiales que contienen
microorganismos que crecerán en cultivo y potencialmente confundirán la
interpretación del cultivo. El esputo expectorado, recolectado en las vías
respiratorias inferiores del pulmón y expulsado por la boca, es la muestra
contaminada más común manejada por el laboratorio clínico.
Criterios
Deben estar presentes menos de 25 células PMN por campo de baja
potencia (LPF) y más de 10 células epiteliales o bacterias mixtas por LPF.
Informe de frotis de Gram
Los materiales contaminantes se cuantifican como 1+ (ligero), 2+
(moderado), 3+ (moderadamente pesado) o 4+ (pesado).
Pautas de identificación de cultivos
Se debe solicitar una “nueva cultura” utilizando una técnica de recolección
cuidadosa. Si se solicita un cultivo, la identificación del organismo debe
limitarse a una breve evaluación paraS. aureus, estreptococos o
estreptococos viridans, Lactobacillus, difteroides y estreptococos β-
hemolíticos. Los bacilos gramnegativos se informan como entéricos
(coliformes, fermentadores sin lactosa oProteo spp. [colonias en
expansión]), pseudomonas (oxidasa-positivas), patógenasNeisseria spp.
(identificado),Haemophilus spp. (solo frotis), levaduras (solo nota) y
cualquier patógeno primario.
Prueba de susceptibilidad antimicrobiana
Ninguna prueba de susceptibilidad antimicrobiana es apropiada excepto en
patógenos primarios.
Materiales locales
Criterios
Se observan menos de 25 leucocitos PMN (glóbulos blancos [WBC])
por LPF y menos de 10 células epiteliales contaminantes por LPF,
junto con elementos celulares y fluidos locales en el área muestreada.
Los componentes locales pueden diferir de la siguiente manera:
• Secreciones respiratorias (ver Lámina 3), incluyendo moco, neumocitos
alveolares (macrófagos), células columnares ciliadas, células caliciformes y
ocasionalmente células epiteliales metaplásicas (células epiteliales
escamosas más pequeñas que las normales)
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• LCR (ver Lámina 5) Elementos celulares
• Fluido de la cavidad (ver Lámina 8) macrófagos, algunos leucocitos
mixtos, células mesoteliales y líquido proteico
• Heridas: sangre y fluidos proteicos
• Líquido amniótico (ver Plato 2) células escamosas anucleadas y
líquido proteináceo pesado
• Cuello uterino: moco, células epiteliales columnares, células caliciformes,
SEC metaplásicos y leucocitos (varían con el ciclo menstrual)
• Secreciones prostáticas o semen: espermatozoides y moco
Informe de frotis de Gram
La biota microbiana local se cuantifica como 1+ a 4+ (consulte la sección sobre
materiales contaminantes).
Pautas de identificación de cultivos
Se puede utilizar la designación "microbiota habitual" o una breve descripción
presuntiva de "crecimiento de tipo colonia" (véase la sección sobre estafa-
manipular materiales).
Prueba de susceptibilidad antimicrobianaNo es apropiado
realizar pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos.
Purulencia
Criterios
Se observan menos de 25 leucocitos PMN (WBC) por LPF y ninguna o
pocas (es decir, <10) células epiteliales con bacterias mixtas por LPF se
ven. Puede haber moco o material proteináceo pesado.
Informe de frotis de Gram
Sólo se cuantifican los organismos íntimamente asociados con los glóbulos
blancos, el moco o el exudado proteico. Se utiliza el siguiente sistema: 1+
(organismos raros por campo de inmersión en aceite [OIF]), 2+ (pocos
organismos por OIF), 3+ (número moderado por OIF) y 4+ (muchos por
OIF). Los materiales contaminantes que se cuantifican por separado deben
ser 1+ (ninguno o pocos).
Pautas de identificación de cultivos
El crecimiento de colonias debe correlacionarse con el frotis teñido de Gram,
como en el caso en punto al comienzo del capítulo. S. pneumoniaede
estreptococos viridans, estreptococos β-hemolíticos (grupos A, B y D de
Lancefield; C, F y G, si está indicado clínicamente), S. aureus, H. influenzae,
patógeno Neisseria spp., bacilos gramnegativos, levaduras (Cryptococcus
neoformans solamente; observe la presencia de otros géneros), hongos
filamentosos (preparación de cinta transparente en la campana de bioseguridad)
y otros organismos se identifican según lo indicado por los resultados del frotis.
Prueba de susceptibilidad antimicrobiana
S. aureus, Los bacilos gramnegativos no fastidiosos y otros organismos
deben analizarse según corresponda o se solicite específicamente.
Materiales Mixtos
Los materiales mezclados consisten en exudado purulento, materiales
contaminantes y materiales locales en un solo frotis.
Criterios
Se observan menos de 25 leucocitos PMN (WBC) por LPF y menos de 10
células epiteliales o bacterias contaminantes por LPF. También pueden
estar presentes secreciones locales.
130 PARTE 1 Introducción a la microbiología clínica
Informe de frotis de Gram
Para materiales mixtos, solo se cuantifican los organismos íntimamente
asociados con el exudado purulento. También se cuantifican las cantidades
de otros elementos, materiales contaminantes y materiales locales.
Pautas de identificación de cultivos
Se puede solicitar un “nuevo cultivo” para muestras mixtas. Se debe
solicitar una nueva muestra si la muestra muestra la presencia de
purulencia y los resultados del cultivo no se pueden interpretar. Si no se
puede obtener una nueva muestra de cultivo, la evaluación debe realizarse
como si se tratara de materiales contaminantes.
Prueba de susceptibilidad antimicrobiana
Deben usarse las pautas de purulencia para analizar organismos que
parezcan importantes.
Informes de exámenes directos
Los informes de los resultados del examen directo de la muestra
deben estar disponibles tan pronto como se completen. La
disponibilidad de informes administrados por computadora
mediante el acceso directo del médico a través de terminales de
computadora en las áreas de atención al paciente facilita la
notificación inmediata de los resultados. Los informes de los
exámenes directos deben ser simples e incluir todos los
elementos de información que el médico necesita para
comprender el informe. El informe enumera el tipo de material
enviado y establece claramente si los microbios observados son
importantes. En las muestras dadas enRecuadro 7.1.
En el informe solo deben incluirse los elementos útiles para
caracterizar el espécimen. También se pueden incluir comentarios
interpretativos cuando, sobre la base del tipo de muestra, los antecedentes
y la morfología del organismo, hay pocas dudas sobre la naturaleza del
proceso o el agente infeccioso causante. Todos los informes telefónicos de
exámenes directos deben registrarse en el informe. Una vez que se ha
completado esta evaluación escalonada del frotis, la información obtenida,
junto con el entorno clínico, permite un manejo razonable de los pacientes
infectados hasta la siguiente
CAJA 7.1 Informes de muestra de microscopía directa
Exámenes
Cultura respiratoria Acc. No. XXXX
Fuente: Esputo: expectorado
Microscópico Purulencia pesada
Contaminando bacterias, levaduras y
epiteliales pesados
Diplococos grampositivos: consistente
con neumococos
Llamado al Dr. Doe a las 8:00 PM 13/4/17
Cultura respiratoria Acc. No. XXXXX
Fuente: Seno: contenido etmoidal
Microscópico Purulencia moderada
Luz de materiales locales
Los glóbulos rojos presentan bacilos
gramnegativos: compatible con
Pseudomonas
Llamado al Dr. Doe a las 11:35 SOY 5/4/17
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pueden ocurrir etapas de aislamiento de cultivos, pruebas de susceptibilidad o
detección de anticuerpos o antígenos.
Verificación de caso 7.2
La base en el laboratorio de microbiología de diagnóstico, como en el caso en punto, es
la capacidad de combinar la respuesta rápida del examen directo de la muestra con el
aislamiento del cultivo y las pruebas de susceptibilidad a los antibióticos para lograr lo
siguiente:
• Confirmar que el material enviado para estudio sea representativo.
• Identificar los componentes celulares y los restos de inflamación y establecer la
probabilidad de infección.
• Identificar agentes infecciosos específicos mediante la detección visual directa de la forma, el
tamaño y la reacción de tinción de Gram característicos.
• Aumentar la identificación visual de microbios mediante el uso de tinciones específicas,
incluidas sondas dirigidas por anticuerpos o genes.
• Proporcionar susceptibilidades antimicrobianas de patógenos aislados para guiar el
tratamiento.
• Desarrollar datos epidemiológicos.
Inicio del manejo especial de
patógenos especiales o inesperados
El examen microscópico directo de materiales infectados, junto con el sitio de la
muestra y la información histórica, puede sugerir modificaciones en las técnicas
de cultivo de rutina para permitir el aislamiento de un patógeno sospechoso. Las
modificaciones pueden implicar solicitar otras pruebas de cultivo, agregar
medios especiales, aumentar el tiempo de incubación o cambiar la temperatura
o la atmósfera de incubación. Si el reconocimiento o la sospecha de dichos
patógenos no se produce a partir del frotis o el historial, no se realizará el
aislamiento de ciertos patógenos y el diagnóstico se retrasará o se perderá.
Algunos patógenos no crecen en cultivo y, por lo general, no se sospechan.
Uno es el parásito nematodoStrongyloides stercoralis,que se puede observar en
el esputo y el líquido broncoalveolar de pacientes con síndrome de
hiperinfestación. El reconocimiento visual puede dar lugar a una solicitud de
examen de las heces para detectar la carga de parásitos y un tratamiento rápido.
Las hiperinfestaciones no tratadas se asocian con la muerte.
Los patógenos que requieren medios de cultivo especiales para el
aislamiento de laboratorio pueden reconocerse en el frotis y redireccionarse
para un cultivo apropiado. Organismos comoLegionella spp., Mycobacterium
spp., y Bartonella spp. debe colocarse en un medio apropiado para la
confirmación del cultivo de la infección.
Control de calidad en interpretaciones
microscópicas directas
Las consideraciones de control de calidad (CC), como la calidad de las muestras
enviadas, qué tan bien se realizó el procedimiento de tinción y la idoneidad de la
interpretación del cultivo se pueden monitorear utilizando los resultados del
examen directo. La calidad de las levaduras, los reactivos de tinción y la técnica
de tinción adecuada se pueden evaluar utilizando organismos comoS. aureus y
Escherichia coli para servir como controles positivos y negativos,
respectivamente. La práctica de CC que monitorea tanto el frotis como la
interpretación del cultivo debe ser una actividad laboral continua. Se debe
establecer una correlación entre los dos resultados para cada paciente. Las
explicaciones de los resultados discrepantes deben buscarse en el material de
trabajo. Esta inspección repetida de los resultados permite a cada observador
practicar la autoeducación y mejorar las habilidades de observación. La revisión
de estas actividades de CC permite corregir las
 CAPÍTULO 7 Examen microscópico de materiales de sitios infectados
realizados en la recolección de muestras, manejo de muestras,
administración de materiales y procedimientos, y manejo de cultivos.
Las actividades de mejora de la calidad a menudo son sugeridas por los
resultados del control de calidad del examen directo de la muestra. Por ejemplo,
se puede documentar que las muestras de esputo de mala calidad se envían
sistemáticamente desde determinados consultorios médicos, clínicas o puestos
de enfermería del hospital. Esta observación se convierte en la base para
planificar las correcciones que se trasladan fuera del laboratorio para involucrar
a la comunidad de pacientes atendidos.
Ejemplos de observaciones e informes
de muestra
Estudie los ejemplos de observaciones directas y los informes y
comentarios asociados dados en Placas 1 a 110. Practique para
determinar si puede hacer un informe similar utilizando solo la
observación proporcionada. Luego lea cada informe para ver si
obtiene impresiones similares de la muestra y el patógeno a partir de
la observación y el informe escrito.
Puntos para recordar
La microscopía directa de materiales enviados al laboratorio para la identificación de
organismos infecciosos ofrece la primera, última y mejor oportunidad para:
- Confirme la probable infección.
- Confirme la calidad diagnóstica de la muestra enviada.
- Reconocer los morfotipos de organismos "clásicos" asociados con la infección.
- Reconocer patógenos que no crecerán en cultivo o el tipo de cultivo
solicitado, por lo que requieren un enfoque de diagnóstico diferente.
- Proporcione una respuesta de laboratorio “estadística” a una infección grave.
- Proporcionar una vía para confirmar la posible causa de la infección.
Preguntas de evaluación del aprendizaje
1. El frotis directo de muestras clínicas es un medio rápido para identificar
presuntamente los agentes etiológicos de enfermedades infecciosas.
¿Verdadero o falso?
2. ¿La presencia de un proceso de enfermedad infecciosa se puede evaluar en
un frotis directo según cuál de los siguientes?
una. La presencia de numerosas células inflamatorias.
B. La morfología de las bacterias presentes.
C. Reacción de tinción de Gram de bacterias presentes
D. La presencia de numerosas células epiteliales.
3. ¿Cuál de las siguientes tinciones se puede utilizar para el examen de
frotis directo?
una. Tinción de Gram
B. Tinción ácido-resistente
C. Tinción de Wright o Giemsa
D. Tinte blanco de calcofluor
mi. Todo lo anterior
4. ¿Cuál de las siguientes tinciones se usa mejor para detectar microorganismos
micobacterianos en muestras clínicas?
una. Gramo
B. Giemsa
C. Ácido rápido
D. Tinta china
5. Calcofluor white es un tinte incoloro que se une con cuál de las
siguientes estructuras?
una. Pared celular que contiene ácido micólico
B. Quitina
C. Capa de peptidoglicano
D. Gránulos metacromáticos
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131
6. ¿La citocentrifugación es un método excelente para cuál de los siguientes
tipos de muestras?
una. Muy contaminado
B. Fluidos no viscosos
C. Material purulento espeso
D. Lleno de moco
7. Se puede sospechar inmediatamente un tipo de infección monobacteriana
basándose en el examen microscópico directo de la muestra clínica. ¿Verdadero
o falso?
8. En un frotis teñido con Wright-Giemsa, las bacterias aparecerían como ¿cuál de los
siguientes colores?
una. rojo
B. Azul
C. Púrpura
D. naranja
BIBLIOGRAFÍA
Agerer, F., Waeckerle, S. y Hauck, CR (2004). Cuantificación microscópica
ción de la invasión bacteriana mediante un nuevo método de tinción independiente
de anticuerpos. Revista de métodos microbiológicos, 59, 23.
Bottone, EJ y Cho, KW (2005). Mycobacterium chelonae queratitis:
aclaración del diagnóstico mediante la evaluación de frotis de líquido del
sistema de cuidado de lentes de contacto del paciente. Córnea, 24, 356.
Chan-Tack, KM y Johnson, JK (1649). Una tinción de Gram inusual
hallazgo. Enfermedades Infecciosas Clínicas: una publicación oficial de la Sociedad
Estadounidense de Enfermedades Infecciosas, 40, 1677-2005.
Davis, KA y col. (2005). Neumonía asociada al ventilador en lesionados
pacientes: ¿confía en la tinción de Gram? El diario del trauma, 58,
462.
Hautala, T. y col. (2005). Tinción de Gram de hemocultivo y categorización clínica
terapia antimicrobiana empírica basada en la intervención de la infección del torrente
sanguíneo.Revista internacional de agentes antimicrobianos, 25, 329.
Huang, M. y Wang, JH (2005). La tinción de Gram como predictor de recaídas de
vaginosis bacteriana después del tratamiento con metronidazol. Revista de
microbiología, inmunología e infección, 38, 137.
Inglis, TJ y col. (2005). Comparación de métodos de laboratorio de diagnóstico
para la identificación de Burkholderia pseudomallei. Revista de
microbiología clínica43, 2201.
Ison, CA y Hay, PE (2002). Validación de una calificación simplificada de
Frotis vaginales teñidos de Gram para uso en clínicas de medicina genitourinaria.
Infecciones de transmisión sexual78, 413.
Koneman, E. y col. (2017).Atlas de colores y libro de texto de diagnóstico.
microbiología (7a ed.). Filadelfia: Wolters Kluwer. Kullavanijaya, P. y col.
(2004). Análisis de ocho métodos diferentes para la
detección de Helicobacter pylori Infección en pacientes con
dispepsia.Revista de gastroenterología y hepatología, 19, 1392.
Laupland, KB, Church, DL y Gregson, DB (2005). Validación de
una estrategia de diagnóstico rápido para la determinación de recuentos
bacterianos significativos en muestras de lavado broncoalveolar. Archivos de
Patología y Medicina de Laboratorio129, 78.
Matkoski, C., Sharp, SE y Kiska, DL (2006). Evaluación de la
Sistemas de puntuación Q y Q234 para una interpretación rentable y
clínicamente relevante de cultivos de heridas. Revista de microbiología
clínica44, 1869.
Morin, S. y col. (1992). Aceptabilidad de la muestra: evaluación de la muestra
calidad. En HD Isenberg (Ed.),Manual de procedimientos de microbiología
clínica (Vol. 1, págs. 1.3.1–1.3.6). Sterling, VA: Sociedad Estadounidense de
Microbiología.
Musher, DM (2005). La utilidad de la tinción de Gram de esputo y el cultivo.
Archivos de Medicina Interna165, 470.
Niederman, MS (2005). El diagnóstico clínico de ventilador asociado
neumonía. Cuidado respiratorio, 50, 788.
Procop, GW y col. (2004). Detección dePneumocystis jirovecii en
muestras respiratorias mediante cuatro métodos de tinción. Revista de
microbiología clínica42, 3333.
132 PARTE 1 Introducción a la microbiología clínica

Thrall, M. y Cartwright, CP (2005). Conidiosporas fúngicas en un peritoneal
tinción de Gram líquida. Archivos de Patología y Medicina de Laboratorio, 129, 123.
Wang, H. y Murdoch, DR (2004). Detección deCampylobacter especies
en muestras fecales mediante microscopía de tinción de Gram directa. Patología36, 343.
Wiedbrauk, DL (2015). Microscopía. En JH Jorgensen, et al. (Eds.),
Manual de microbiología clínica (11ª ed., Pág. 5). Washington DC:
Prensa ASM.
Zarakolu, P. y col. (2004). Fiabilidad de la interpretación de la tinción de Gram.
frotis vaginales por el sistema de puntuación de Nugent para el diagnóstico de bacterias
vaginosis. Microbiología diagnóstica y enfermedades infecciosas, 48, 77.

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Traducido del inglés al español - www.onlinedoctranslator.com
CAPÍTULO 7 Examen microscópico de materiales de sitios infectados
Examen directo que muestre materiales locales y contaminantes
PLATO 1 Esputo expectorado, frotis, tinción de Gram, microscopía
óptica, proyección de bajo aumento (LPV). Purulencia, ninguna.
Bacterias contaminantes y células epiteliales, pesadas. No se
observan patógenos. Se debe enviar una muestra cuidadosamente
recolectada de material de árbol de las vías respiratorias inferiores. La
muestra es saliva, no esputo. Puede haber varias razones para enviar
esta muestra al laboratorio. El paciente podría haber sido mal dirigido
y simplemente "escupir" en el recipiente de recolección, o la tos del
paciente podría no producir esputo.
LÁMINA 3 Esputo expectorado, frotis, tinción de Gram, microscopía
óptica, LPV. Purulencia, ninguna. Materiales locales, moderados.
Bacterias contaminantes y epiteliales, pesado. No se observan
patógenos. El bolo de esputo, que consiste en moco con macrófagos
alveolares atrapados, confirma la presencia de material del árbol
respiratorio inferior. No hay evidencia de un proceso infeccioso. El
esputo está muy cubierto por materiales contaminantes de la
orofaringe o la boca. Los organismos contaminantes crecerán en un
cultivo de esputo de rutina.
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Lámina 2 Líquido amniótico, preparación de citocentrífugas, tinción de
Gram, microscopía óptica, vista de potencia media (MPV). Purulencia,
moderada. Materiales locales, moderados. No se ven organismos. La
presencia de purulencia (neutrófilos o "polis") indica un proceso
sospechoso de infección. La ausencia de organismos en este fluido
normalmente estéril es una observación crítica. Las células epiteliales
escamosas son locales para este tipo de muestra y confirman que la
muestra es líquido amniótico. Los gránulos de queratohialina azul nunca
deben confundirse con bacterias.
Lámina 4 Esputo aspirado, frotis, tinción de Gram, microscopía
óptica, vista de alta resolución (VPH). Purulencia, ninguna. Materiales
locales, moderados. Ningún organismo visto. Los macrófagos
alveolares y el moco (fondo teñido de rosa) son los materiales locales
del árbol traqueobronquial. Este frotis confirma que se tomó una
muestra de esputo y que no hay sospecha de infección ni evidencia de
contaminación significativa. El cultivo de rutina de esta muestra
puede generar una biota oral insignificante porque el cultivo es más
sensible que el examen directo.
134 PARTE 1 Introducción a la microbiología clínica
LÁMINA 5 Líquido cefalorraquídeo (LCR), preparación de citocentrífugas,
tinción de Gram, microscopía óptica, VPH. Purulencia, moderada. No se
ven organismos. El LCR es un líquido estéril y normalmente no tiene
purulencia. La presencia de neutrófilos es fundamental. Es obligatoria la
observación cuidadosa de las bacterias. La tinción con naranja de acridina
puede ser útil en entornos clínicos en los que las bacterias son bajas en
número y gramnegativas. Los sedimentos citocentrifugados comúnmente
tienen una concentración de organismos suficiente para microscopía de
rutina (≥105/ mL).
Lámina 7 Traumatismo ocular, aspirado vítreo, frotis, tinción de Gram,
microscopía óptica, VPH. Purulencia, ninguna. No se ven organismos.
Materiales locales, ligeros. El fondo de proteína clara y la célula que
contiene el pigmento son material normal local al vítreo del ojo. Este
material local confirma que la muestra es representativa. La capacidad de
ver esta célula de pigmento marrón en el material de un frotis está
relacionada con el traumatismo ocular. El énfasis importante es la ausencia
de purulencia.
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Lámina 6 Esputo expectorado, frotis, tinción de Gram, microscopía óptica,
MPV. Purulencia, pesada. Materiales locales, espiral de Curschmann. No se
ven organismos. La espiral de Curschmann(flecha) es material local del
árbol traqueobronquial pero no es normal, por lo que se informa
específicamente. Esta espiral puede manifestarse en varios tamaños
dependiendo del tamaño del bronquio involucrado. Las espirales pueden
ser particularmente prominentes después de un episodio asmático con
constricción bronquial.
Lámina 8 Ojo, aspirado vítreo, frotis, tinción de Gram, microscopía
óptica, VPH. Purulencia, luz. Escombros amorfos, moderados.
Materiales locales, ligeros. No se ven organismos. Este frotis sugiere
que ha habido una lesión. El pigmento ha sufrido fagocitosis y se ve
dentro de un gran macrófago. El pigmento nunca debe confundirse
con bacterias, y las bacterias nunca deben pasarse por alto si se
mezclan con materiales locales, como gránulos de pigmento.
 CAPÍTULO 7 Examen microscópico de materiales de sitios infectados 135

Lámina 9 Lavado broncoalveolar (BAL), frotis de citocentrífuga, tinción de
Gram, microscopía óptica, VPH. Purulencia, pesada. No se ven organismos.
Materiales locales, desechos de partículas negras (BPD)(flecha).Este
tamaño y tipo de partícula de carbono se observa comúnmente en
muestras respiratorias en pequeñas cantidades y generalmente no se
anota en un informe de frotis.
Lámina 10 BAL, frotis de citocentrífuga, tinción de Gram, microscopía
óptica, VPH. Purulencia, ninguna. No se ven organismos. Materiales
locales, BPD pesado(flechas). Esta pequeña partícula de carbono que se ve
de manera prominente en las muestras respiratorias puede estar asociada
con fumar crack. La muestra bruta suele tener un aspecto gris. El TLP no
debe confundirse con cocos grampositivos.

METRO

Lámina 11 BAL, frotis de citocentrífuga, tinción de Gram, microscopía
óptica, VPH. Purulencia, ninguna. No se ven organismos. Materiales
locales, BPD moderada. Este TLP es de forma irregular y generalmente
varía en tamaño.(flechas). Este tipo de desechos de carbono se asocia
comúnmente con la inhalación de humo de la casa u otros tipos de
incendios. En la fase inicial de la inhalación de humo, gran parte del TLP es
extracelular. Más tarde, gran parte de los desechos son intracelulares
dentro de los fagocitos. El presente macrófago dorado contiene material
amarillo asociado con fumar cigarrillos.
Lámina 12 BAL, frotis de citocentrífuga, tinción de Gram, microscopía
óptica, VPH. Purulencia, ninguna. No se ven organismos. Materiales
locales, macrófagos alveolares que contienen partículas muy pequeñas, de
color amarillo claro a dorado, refráctiles pero no polarizantes.(flecha). Estas
partículas pequeñas y finas pueden ser hemosiderina, a veces depositadas
como partículas pequeñas u otras partículas finas del medio ambiente. Por
lo general, estas partículas refráctiles no se informan excepto en respuesta
a preguntas específicas del médico del paciente.

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136 PARTE 1 Introducción a la microbiología clínica

Lámina 13 BAL, frotis de citocentrífuga, tinción de Gram, microscopía óptica,

VPH. Purulencia, ninguna. No se ven organismos. Materiales locales, macrófagos
alveolares que contienen partículas irregulares gruesas de color amarillo dorado
a safranina de Gram compatibles con hemosiderina(flechas). Este tipo de
depósito de hemosiderina de partículas grandes dentro de los fagocitos
pulmonares se asocia comúnmente con sangre en el pulmón, como se observa
en la insuficiencia cardíaca o la sangre aspirada de hemorragias nasales de gran
volumen. La sangre y la hemosiderina en un frotis teñido con Gram dificultan la
visualización del frotis.

Examen directo en infecciones bacterianas comunes

Lámina 14 Esputo expectorado, frotis, tinción de Gram, microscopía
óptica, VPH. Purulencia, pesada. La presencia de diplococos grampositivos,
la morfología intracelular sugiere un efecto antibiótico.Impresión:
enfermedad neumocócica. Ésta es una presentación típica de frotis de una
neumonía neumocócica tratada pero no resuelta. Los neutrófilos cubren el
campo, los diplococos son en gran parte intracelulares y parcialmente
digeridos, y el material amorfo de fondo ha desaparecido. El cultivo
bacteriano de rutina de esta muestra puede ser negativo para colonias
típicas deS. pneumoniae.Se pueden encontrar algunas colonias mediante
una búsqueda cuidadosa entre las colonias contaminantes de la biota
normal.
Lámina 15 Esputo aspirado, frotis, tinción de Gram, microscopía
óptica, MPV. Purulencia, luz. Escombros amorfos, pesados. Cocos
grampositivos, pares, encapsulados, extracelulares. La terapia con
antibióticos inicial puede dirigirse a los estreptococos y estafilococos (
Estomatococos). El cultivo bacteriano de rutina aisló un crecimiento
puro de una cepa encapsulada deStreptococcus pyogenes. El fondo
amorfo pesado es líquido de edema rico en proteínas del lecho capilar
dañado por S. pyogenes toxinas. Posteriormente, el paciente falleció a
causa de la infección a pesar de un diagnóstico correcto y una terapia
antimicrobiana adecuada.

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 CAPÍTULO 7 Examen microscópico de materiales de sitios infectados 137

Lámina 16 Herida, frotis, tinción de Gram, microscopía óptica, MPV.
Purulencia, moderada. Escombros amorfos, moderados. Cocos
grampositivos, cadenas, extracelulares.Impresión: enfermedad
estreptocócica. La presencia de cadenas típicas deEstreptococo sobre
un fondo que muestra purulencia con "polis" mal conservados y
detritos amorfos sugiere estreptococos hemolíticos con citotoxicidad
tisular. El cultivo bacteriano de rutina produjo un crecimiento puro de
S. pyogenes.
Lámina 17 Esputo expectorado, frotis, tinción de Gram, microscopía
óptica, MPV. Purulencia, luz. Materiales locales, moderados. Cocos,
pares, grupos, intracelulares y extracelulares grampositivos.
Impresión: enfermedad estafilocócica. La morfología del frotis es
típica de los estafilococos, pero no se encontraron colonias de
estafilococos en las placas de cultivo.Stomatococcus mucilaginosus
las colonias estaban presentes en grandes cantidades. La cuidadosa
correlación entre los exámenes directos y de cultivo demostró que
este organismo es la causa probable de infección. El informe
presuntivo que implica o sugiere estafilococos seguido de un informe
de cultivo negativo sin explicación plantea dudas sobre la
competencia del laboratorio.

Lámina 18 Aspirado de absceso, frotis, tinción de Gram, microscopía

óptica, MPV. Purulencia, pesada. Cocos grampositivos, grupos,
extracelulares.Impresión: enfermedad estafilocócica. Las placas de
cultivo aeróbico y anaeróbico fueron negativas a las 24 horas. Había
aislamiento cultural deStaphylococcus aureus de este mismo absceso
5 días antes. El paciente estaba siendo tratado con clindamicina.
Debido a que los cocos en el frotis no parecían estar dañados por el
agente antimicrobiano, se buscó otra especie de cocos grampositivos.
Creció la cultura anaeróbicaPeptostreptococcussp., que es resistente
a la clindamicina.

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138 PARTE 1 Introducción a la microbiología clínica
Examen directo en infecciones bacilares grampositivas
Lámina 19 Líquido amniótico, citocentrífuga, tinción de Gram,
microscopía óptica, MPV. Purulencia, luz. Materiales locales,
moderados. Bacilos grampositivos, pequeños. Morfología consistente
conListeria monocytogenes. Impresión:listeriosis congénita.
Lámina 21 Orina, citocentrifugación, tinción de Gram, microscopía óptica,
MPV. Purulencia, moderada. Bacilos grampositivos, medianos, largos,
encadenados. Morfología consistente conLactobacillus spp. Impresión:
cistitis.
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Lámina 20 Esputo expectorado, frotis, tinción de Gram, microscopía
óptica, MPV. Purulencia, moderada. Materiales locales, moderados.
Bacilos grampositivos, difteroides. La morfología sugiere una
infección por corineformes. Creció el cultivo bacteriano de rutina
Corynebacterium pseudodiphtheriticum.
Lámina 22 Líquido amniótico, preparación de citocentrífugas. Tinción
de Gram, microscopía óptica, VPH. Purulencia, luz. Materiales locales,
moderados. Bacilos grampositivos, medianos, largos, intracelulares.
Morfotipo consistente conLactobacillus spp. Impresión:amnionitis.
 CAPÍTULO 7 Examen microscópico de materiales de sitios infectados 139

1
2

Lámina 23 Líquido amniótico, frotis, tinción de Gram, microscopía
óptica, MPV. Purulencia, luz. Materiales locales, moderados. Bacilos
grampositivos, grandes. Morfología consistente conClostridium
perfringens. Impresión:amnionitis.
Lámina 24 Celulitis de la herida, frotis, tinción de Gram, microscopía
óptica, MPV. Purulencia, ninguna. Escombros amorfos, moderados.
Bacilos grampositivos, grandes. Bacilos gramnegativos, grandes.
Morfología consistente conClostridium spp. Impresión: gangrena
gaseosa. La tasa de crecimiento de este organismo es rápida y viable
(grampositiva,flecha 1) y bacilos no viables (gramnegativos) pueden
estar presentes en el material del frotis (flechas 2).

Lámina 25 Colonia de agar sangre, frotis, tinción de Gram, Lámina 26 Líquido amniótico, frotis, tinción de Gram, microscopía
microscopía óptica, VPH. Bacilos grampositivos, difteroides, tinción de óptica, VPH. Materiales locales, pesados. Bacilos grampositivos,
Gram variable. Morfotipo consistente conGardnerella vaginalis(ver difteroides, tinción de Gram variable. Morfotipo consistente conG.
Lámina 26). vaginalis. Impresión:amnionitis.

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140 PARTE 1 Introducción a la microbiología clínica
Examen directo en bacilos grampositivos poco frecuentes
Lámina 27 Aspirado de absceso, frotis, tinción de Gram, microscopía
óptica, VPH. Purulencia, moderada. Escombros amorfos, ligeros. Bacilos
grampositivos, con cuentas(flechas). Sospecha de micobacterias: inicie
pruebas adicionales (ver Lámina 30).
Lámina 29 Esputo expectorado, frotis, tinción de Gram, microscopía
óptica, MPV. Escombros amorfos, pesados. Formas bacilares, imagen
negativa(flechas). El aceite se quitó del frotis, se decoloró con alcohol ácido
y se volvió a teñir inmediatamente con el colorante ácido resistente de
Ziehl-Neelsen. Bacilos acidorresistentes, numerosos. Muestra recuperada;
cultivo acidorresistente solicitado por laboratorio. Sospechoso de
tuberculosis.
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Lámina 28 Aspirado de absceso, frotis, tinción ácido-resistente (Ziehl-Neelsen),
microscopía óptica, MPV. Purulencia, moderada. Bacilos acidorresistentes,
numerosos(flecha). Crecieron cultivos de micobacterias Mycobacterium kansasii.
Lámina 30 Esputo expectorado, frotis concentrado, tinción ácido-
resistente con fluorocromo, microscopía fluorescente, MPV. Bacterias
acidorresistentes típicas, numerosas.Impresión: enfermedad
micobacteriana. El paciente había sido puesto en aislamiento respiratorio
después de la exploración física y la anamnesis y la terapia antituberculosa
se inició inmediatamente después de recibir el informe de exploración
directa.Tuberculosis micobacteriana fue identificado a partir de la cultura.
 CAPÍTULO 7 Examen microscópico de materiales de sitios infectados 141

Lámina 31 Esputo expectorado, frotis, tinción de Gram, microscopía óptica,
MPV. Purulencia, luz. Materiales locales, ligeros. Escombros amorfos,
moderados. Bacilos grampositivos, medianos, con cuentas(flecha). Seguimiento
positivo de tinción acidorresistente. Radiografía de tórax con masa en el lóbulo
superior del pulmón derecho. Aislamiento cultural deRhodococcus equi.
Lámina 32 Hemocultivo, frotis de sedimentos, tinción de Gram,
microscopía óptica, MPV. Sangre. Bacilos grampositivos, ramificados,
abultados. Morfología consistente conActinomyces o
Propionibacteriumspp. Aislamiento cultural deActinomyces israelii.

Lámina 33 Esputo expectorado, frotis, tinción de Gram, microscopía Lámina 34 Esputo expectorado, frotis, tinción ácido-resistente parcial,
óptica, MPV. Purulencia, luz. Materiales locales, ligeros. Escombros microscopía óptica, MPV. Bacilos parcialmente acidorresistentes,
amorfos, moderados. Bacilos grampositivos, ramificados, abultados. ramificados, con cuentas(flecha). Morfología consistente con Nocardia spp.
Morfotipo consistente conNocardia o Actinomyces. Impresión:nocardiosis.

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142 PARTE 1 Introducción a la microbiología clínica
Examen directo en bacilos grampositivos con filamentos y ramas
Lámina 35 Aspirado de absceso mandibular, frotis, tinción de Gram,
microscopía óptica, LPV. Purulencia, pesada. Presencia de gránulos.
Sospechoso deActinomyces (ver Lámina 37).
Lámina 37 Aspirado del tracto del seno cutáneo, frotis, tinción de Gram,
microscopía óptica, VPH. Purulencia, pesada. Bacilos grampositivos,
filamentosos, con cuentas, ramificados, tinción acidorresistente parcial
negativa. Morfología consistente conActinomyces spp. (verLámina 39).
Impresión: actinomicosis.
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Lámina 36 Aspiración de absceso mandibular, frotis, tinción de Gram,
microscopía óptica, VPH. Purulencia, pesada. Bacilos grampositivos,
filamentosos, con cuentas, ramificados, tinción acidorresistente parcial
negativa. Morfología consistente conActinomyces spp. Impresión:
actinomicosis (mandíbula abultada).
Lámina 38 Aspirado del tracto del seno cutáneo, colonias en placa de
agar sangre anaeróbica. Morfotipos de colonias mixtas. Colonias de
dientes molares. Morfología consistente conActinomyces israelii.
Impresión:Infección anaeróbica mixta: actinomicosis.
 CAPÍTULO 7 Examen microscópico de materiales de sitios infectados 143

Lámina 39 Esputo expectorado, frotis, tinción de Gram, microscopía
óptica, VPH. Purulencia, pesada. Materiales locales, moderados.
Presente de grano. Bacilos grampositivos, filamentosos, con cuentas,
ramificados(flecha). Sospechoso de Nocardia o Actinomyces (ver
Lámina 41).
Lámina 40 Esputo expectorado, colonias blancas calcáreas en placa con
agar sangre de carnero al 5% a los 5 días de incubación. Cultivo de esputo
de rutina. Morfología consistente conNocardia, Nocardiopsis,o
Streptomyces spp.

Lámina 41 Gránulos del tracto sinusal, frotis de aplastamiento y tracción,
tinción de Gram, microscopía óptica, VPH. Escombros amorfos,
moderados. Bacilos grampositivos, filamentosos, con cuentas, ramificados,
tinción ácido-resistente parcial negativa. Bacilos grampositivos, regulares.
Bacilos gramnegativos, pequeños. Cocos grampositivos. La morfología
sugiere una infección anaeróbica mixta con actinomicetos.Impresión:
actinomicosis. Aislamiento cultural deActinomyces naeslundii.
Lámina 42 Biopsia quirúrgica de área anormal en mandíbula, frotis,
tinción de Gram, microscopía óptica, VPH. Escombros amorfos, pesados.
Bacilos grampositivos, filamentosos, con cuentas, ramificados, tinción
ácido-resistente parcial negativa(flechas). La morfología sugiere
actinomicetos. Cultivos aeróbicos y anaeróbicos negativos.

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144 PARTE 1 Introducción a la microbiología clínica
Examen directo en infecciones bacterianas gramnegativas seleccionadas
Lámina 43 Esputo expectorado, frotis, tinción de Gram, microscopía
óptica, MPV. Materiales mixtos, tipo I, estratificados. Bacterias
contaminantes y células epiteliales, moderada. Purulencia, luz.
Diplococos gramnegativos(flechas). La morfología sugiere patógenos
Neisseria o Moraxella spp. Cultivo bacteriano de rutina aislado
Moraxella catarrhalis.
Lámina 45 Esputo expectorado, frotis, tinción de Gram, microscopía
óptica, VPH. Purulencia, moderada. Materiales locales, pesados.
Presencia de moco. Cocobacilos gramnegativos, intracelulares,
extracelulares(flechas). Morfología consistente con Haemophilus
influenzae.
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Lámina 44 Esputo expectorado, frotis, tinción de Gram, microscopía
óptica, MPV. Purulencia, moderada. Materiales locales, moderados.
Diplococos gramnegativos, intracelulares, extracelulares(flechas).La
morfología sugiere patógenos Neisseria o Moraxella spp. Cultivo
bacteriano de rutina aisladoNeisseria meningitidis.
Lámina 46 Esputo expectorado, frotis, tinción de Gram, microscopía
óptica, VPH. Purulencia, pesada. Materiales locales, moderados.
Bacilos gramnegativos, pequeños, pleomórficos, intracelulares,
extracelulares(flecha 1). Diplococos grampositivos, encapsulados,
intracelulares, extracelulares (flecha 2). Morfología consistente con
H. influenzae y S. pneumoniae. Impresión:Infección
polimicrobiana.
 CAPÍTULO 7 Examen microscópico de materiales de sitios infectados 145

Lámina 47 BAL, preparación de citocentrífugas, tinción de Wright-Giemsa, Lámina 48 BAL, preparación de citocentrífugas, tinción de Gram,
microscopía óptica, VPH. Purulencia, ninguna. Presencia de linfocitos. microscopía óptica, VPH. Purulencia, ninguna. Presencia de linfocitos.
Materiales locales, moderados. Pequeños bacilos(flecha), numerosos (ver Materiales locales, moderados. Bacilos gramnegativos(flecha), pequeño
Lámina 49). (verLámina 50).

Lámina 49 BAL, preparación de citocentrífugas, tinción de Wright-Giemsa,
microscopía óptica, VPH. Purulencia, ninguna. Presencia de linfocitos.
Materiales locales, moderados. Bacilos gramnegativos(flechas), pequeña.
Lámina 50 BAL, preparación de citocentrífugas, tinción de Wright-
Giemsa, microscopía óptica, VPH. Purulencia, ninguna. Presencia de
linfocitos. Materiales locales, moderados. Células epiteliales cilíndricas
ciliadas con numerosos bacilos pequeños adheridos a los cilios(
flechas). Morfología consistente con Bordetella pertussis. Impresión:
tos ferina.

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146 PARTE 1 Introducción a la microbiología clínica
Examen directo en infecciones bacterianas gramnegativas seleccionadas
Lámina 51 LCR, frotis de gota, tinción de Gram, microscopía óptica,
VPH. Purulencia, moderada. Cocobacilos gramnegativos, cadenas(
flecha).Morfotipo sugiere Bacteroides spp. Impresión: meningitis
bacilar gramnegativa.
Lámina 53 BAL, preparación de citocentrífugas, tinción de Gram,
microscopía óptica, VPH. Purulencia, moderada. Materiales locales, ligeros.
Bacilos gramnegativos, pequeños, intracelulares dentro de las vacuolas
fagocíticas(flecha).
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Lámina 52 Líquido amniótico, preparación de citocentrífugas, tinción
de Gram, microscopía óptica, VPH. Purulencia, moderada. Materiales
locales, moderados. Cocobacilos gramnegativos(flecha 1). Bacilos
gramnegativos, filamentosos, medianos, fusiformes (flecha 2).La
morfología sugiere una infección por anaerobios bacilares
gramnegativos. Impresión: amnionitis, bacterias anaerobias mixtas.
Lámina 54 BAL, preparación de citocentrífuga, anticuerpo
fluorescente directo. Legionella pneumophila, antisueros
polivalentes, microscopía fluorescente, VPH. Inmunofluorescencia
positiva.Impresión: Legionelosis.
 CAPÍTULO 7 Examen microscópico de materiales de sitios infectados 147

Lámina 55 Esputo expectorado, frotis, tinción de Gram, microscopía
óptica, MPV. Purulencia, luz. Materiales locales, ligeros. Moco
moderado. Bacilos gramnegativos medianos.Impresión: Infección
bacilar entérica.
Lámina 56 Orina, frotis de gota directa, tinción de Gram, microscopía
óptica, MPV. Purulencia, pesada. Bacilos gramnegativos, medianos(flecha
1). Cocos grampositivos (flecha 2). El cultivo de orina creció Escherichia coli
y Enterococcus faecalis. El frotis es consistente con una densidad
bacteriana de 105 unidades formadoras de colonias por mililitro de orina.

Lámina 57 Úlcera cutánea por decúbito, frotis, tinción de Gram,
microscopía óptica, VPH. Purulencia, moderada. Escombros amorfos,
pesados. Bacilos gramnegativos, medianos, encapsulados. Levadura. La
morfología sugiereKlebsiella pneumoniae. Impresión:enfermedad bacilar
entérica.
Lámina 58 Esputo expectorado, frotis, tinción de Gram, microscopía
óptica, VPH. Purulencia, moderada. Moco, moderado. Bacilos
gramnegativos, aberrantes, encapsulados(flecha). La morfología
sugiere estar afectado por antibióticos Klebsiella pneumoniae.
Impresión:Enfermedad bacilar entérica, parcialmente tratada.

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148 PARTE 1 Introducción a la microbiología clínica
Lámina 59 Sangre periférica, frotis, tinción de Wright-Giemsa,
microscopía óptica MPV. Bacilos, tinción media, bipolar(flecha) (ver
Lámina 60).
Lámina 61 Esputo expectorado, frotis, tinción de Gram, microscopía
óptica, VPH. Purulencia, ninguna. Materiales locales, ninguno.
Presencia de moco. Bacilos gramnegativos, regulares(flecha).
Morfotipo sugiere Pseudomonas aeruginosa. Impresión:Enfermedad
infecciosa pseudomónica.
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Lámina 60 Sangre periférica, frotis, tinción de Gram, microscopía
óptica, VPH. Materiales locales, moderados. Bacilo gramnegativo,
mediano, con tinción bipolar prominente(flecha). Sospechoso de
Yersinia pestis. Impresión:peste bubónica.
Lámina 62 Esputo expectorado, frotis, tinción de Gram, microscopía
óptica, VPH. Purulencia, luz. Materiales locales, ninguno. Presencia de
moco. Bacilos gramnegativos, regulares, envueltos en una capa de limo
prominente(flecha). Morfotipo sugiere mucoide P. aeruginosa. Impresión:
Enfermedad infecciosa pseudomónica.
 CAPÍTULO 7 Examen microscópico de materiales de sitios infectados 149

Lámina 63 Líquido amniótico, preparación de citocentrífugas, tinción
de Gram, microscopía óptica, VPH. Purulencia, luz. Material local,
moderado. Bacilos gramnegativos fusiformes(flecha). La morfología
sugiere Fusobacterium nucleatum. Impresión:amnionitis, bacterias
anaeróbicas.
Lámina 64 Líquido amniótico, preparación de citocentrífugas, tinción
de Gram, microscopía óptica, VPH. Purulencia, moderada. Material
local, moderado. Bacilos gramnegativos, formas medianas y largas
(flechas). La morfología sugiere Fusobacterium spp. Impresión:
amnionitis, bacterias anaeróbicas.

Lámina 65 Colonias en agar sangre de carnero, subcultivo de Lámina 66 Líquido amniótico, frotis de gotas, tinción de Gram,
hemocultivo, frotis, tinción de Gram, microscopía óptica, VPH. microscopía óptica, VPH. Purulencia, moderada. Materiales locales,
Material local, ligero. Bacilos gramnegativos con espirales, alas de moderados. Bacilos gramnegativos, espiral(flecha). Impresión:amnionitis.
gaviota(flechas).La morfología sugiere Campylobacter spp.

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150 PARTE 1 Introducción a la microbiología clínica
Examen directo en infecciones polimicrobianas
Lámina 67 Absceso del espacio bucal, frotis, tinción de Gram,
microscopía óptica, VPH. Purulencia, pesada. Cocos, pares, cadenas
grampositivos. Bacilos grampositivos, pequeños, difteroides,
medianos, ramificados. Cocobacilos gramnegativos. La morfología
sugiere una infección polimicrobiana de la biota bucal.Impresión:
infección polimicrobiana, flora orofaríngea.
Lámina 69 Cuello uterino, frotis, tinción de Gram convencional,
microscopía óptica, MPV. Purulencia, pesada. Cocos grampositivos,
pares. Cocobacilos gramnegativos. Filamentos gramnegativos.
Tricomonas (flecha, Trichomonas vaginalis; Comparar con Lámina 70).
Impresión: tricomoniasis con biota bacteriana mixta aeróbica y
anaeróbica.
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Lámina 68 Aspirado del seno maxilar, frotis, tinción de Gram,
microscopía óptica, VPH. Purulencia, pesada. Cocos grampositivos,
cadenas. Cocobacilos gramnegativos, masas grandes. El morfotipo
sugiere una infección mixta con estreptococos y cocobacilos
anaerobios gramnegativos.Impresión: Infección polimicrobiana,
especies aeróbicas y anaeróbicas.
Lámina 70 Cuello uterino, frotis, tinción de Gram mejorada,
microscopía óptica, MPV. Purulencia, pesada. Cocos grampositivos,
pares. Cocobacilos gramnegativos. Filamentos gramnegativos.
Tricomonas (flecha, T. vaginalis). Impresión: tricomoniasis con biota
bacteriana mixta aeróbica y anaeróbica.
 CAPÍTULO 7 Examen microscópico de materiales de sitios infectados 151

2 1
1 2

Lámina 71 Ojo, aspirado vítreo, frotis, tinción de Gram, microscopía
óptica, MPV. Purulencia, moderada. Diplococos grampositivos,
encapsulados, en forma de lanceta(flecha 1). Bacilos gramnegativos,
pequeños, pleomórficos (flecha 2). El morfotipo sugiere una infección
mixta con S. pneumoniae y H. influenzae. Impresión:vitritis, infección
mixta.
Lámina 72 Herida, frotis, tinción de Gram, microscopía óptica, MPV.
Purulencia, pesada. Bacilos gramnegativos, medianos(flecha 1).Cocos
grampositivos, pares (flecha 2). Impresión:Enfermedad infecciosa
bacilar entérica.

Lámina 73 Drenaje, apéndice roto, frotis, microscopía óptica, VPH.
Purulencia, pesada. Bacilos grampositivos, formas grandes y
medianas. Bacilos gramnegativos, pequeños, bipolares(flecha 2).
Cocos grampositivos (flecha 1). La morfología sugiere una infección
polimicrobiana con microbiota fecal. Impresión: infección
polimicrobiana, flora fecal.
Lámina 74 Esputo aspirado, frotis, tinción de Gram, microscopía óptica, MPV.
Purulencia, luz. Materiales locales, ligeros. Bacilos grampositivos, grandes.
Bacilos gramnegativos, medianos, intracelulares. Cocos, pares, cadenas
grampositivos. La morfología sugiere una infección polimicrobiana con biota
fecal.Impresión: infección polimicrobiana, biota fecal.

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152 PARTE 1 Introducción a la microbiología clínica

Examen directo en infecciones fúngicas

Lámina 75 BAL, preparación de citocentrífugas, tinción de Gram, Lámina 76 Frotis de esputo expectorado, tinción de Gram,
microscopía, VPH. Purulencia, luz. Materiales locales, moderados. microscopía óptica, VPH. Purulencia, luz. Materiales locales,
Levadura grampositiva con yemas. Morfotipo consistente con moderados. Seudohifas grampositivas. Morfotipo consistente con
Candida spp. Impresión: candidiasis. Candida spp. Impresión: candidiasis.

Lámina 77 BAL, preparación de citocentrífugas, tinción de Gram, Lámina 78 BAL, preparación de citocentrífugas, tinción blanca de
microscopía óptica, VPH. Materiales locales, moderados. Presencia de calcofluor, microscopía de fluorescencia, VPH. Levadura fluorescente,
glóbulos rojos. Levadura Gram variable con cápsulas. La morfología pequeña, con cápsulas. La morfología sugiereCryptococcus
sugiereCryptococcus (ver Lámina 78). neoformans. Impresión:criptococosis.

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 CAPÍTULO 7 Examen microscópico de materiales de sitios infectados 153

Lámina 79 BAL, preparación de citocentrífuga, tinción blanca de Lámina 80 Esputo expectorado, frotis, tinción blanca de calcofluor,
calcofluor, microscopía óptica, VPH. Levadura fluorescente (2 a 4µm), microscopía de fluorescencia, MPV. Levadura (8 a 20µm), yema
pequeño, en ciernes. La morfología sugiereHistoplasma capsulatum. redonda, de paredes gruesas y base ancha. La morfología sugiere
Impresión:histoplasmosis. Blastomyces dermatitidis. Impresión:blastomicosis.

Lámina 81 Esputo expectorado, frotis, tinción blanca de calcofluor,
microscopía de fluorescencia, MPV. Eosinófilos. Estas células son otro
componente que se tiñe de blanco de calcofluor. Los gránulos de los
eosinófilos rotos se tiñen de manera brillante y no deben
interpretarse como restos de hongos o parásitos.
Lámina 82 Escamas de piel, raspaduras, preparación húmeda de
hidróxido de potasio (KOH), microscopía óptica, VPH. Hifas presentes,
septadas, delgadas. La morfología sugiere dermatofito.

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154 PARTE 1 Introducción a la microbiología clínica
Lámina 83 Escamas cutáneas por raspaduras, tinción blanca de
calcofluor, microscopía de fluorescencia, VPH. Hifas, delgadas. La
morfología sugiere dermatofito.Impresión: dermatofitosis.
Lámina 85 Esputo expectorado, frotis, tinción blanca de calcofluor,
microscopía de fluorescencia, MPV. Hifas fúngicas presentes (3 a 10µ
m), tabicado, ángulo ramificado de 45 grados. La morfología sugiere
Aspergilo spp. Impresión: aspergilosis.
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Lámina 84 Esputo expectorado, frotis, tinción de Gram,
microscopía óptica, VPH. Purulencia, luz. Materiales locales,
pesados. Presencia de hifas gramvariables (3 a 10µm), tabicado,
ángulo ramificado de 45 grados. La morfología sugiereAspergilo
spp. (verLámina 85).
Lámina 86 Esputo expectorado, frotis, tinción de Gram, microscopía
óptica, VPH. Purulencia, ninguna. Materiales locales, moderados.
Conidios grampositivos (2 a 4µm), en cadena. Morfotipo sugiere
Aspergilo spp. en cavidad con interfaz de aire.Impresión: aspergilosis
cavitaria. Se debe tener cuidado de no confundir estos conidios con
estreptococos o levaduras (verLámina 87).
 CAPÍTULO 7 Examen microscópico de materiales de sitios infectados 155

Lámina 87 Esputo expectorado, frotis, tinción de Gram, microscopía Lámina 88 Absceso cerebral, frotis, tinción con azul de toluidina,
óptica, VPH. Purulencia, ninguna. Materiales locales, moderados. Conidios microscopía óptica, MPV. Hifas fúngicas presentes (3 a 10µm),
gramnegativos (2 a 4µm), esporulando (flechas). Se debe tener cuidado de tabicado, ángulo ramificado de 45 grados. La morfología sugiere
no confundir estos conidios con tubos germinales de levadura. Aspergilospp. Impresión: aspergilosis cerebral.

Lámina 89 Absceso de tejidos blandos, frotis, tinción blanca de
calcofluor, microscopía de fluorescencia, VPH. Hifas fúngicas,
septadas, clamidosporas ramificadas.Impresión: micosis Estas hifas
no eran claramente visibles en el frotis de tinción de Gram, pero se
tiñen brillantemente aquí. Se aisló un dermatofito en cultivo.
Lámina 90 BAL, preparación de citocentrífugas, tinción de Gram,
microscopía óptica, VPH. Purulencia, ninguna. Materiales locales,
moderados. Molde alveolar compuesto de matriz gramnegativa y
cuerpos intraquísticos(flechas). Morfología consistente con
Pneumocystis jiroveci (ver Lámina 91).

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156 PARTE 1 Introducción a la microbiología clínica

Lámina 91 BAL, preparación de citocentrífugas, tinción blanca de

calcofluor, microscopía de fluorescencia, VPH. Quistes fluorescentes
con cuerpos cocoides. Morfología consistente conP. jiroveci.
Impresión:neumocistosis.

Examen directo en infecciones parasitarias

Lámina 92 Córnea, raspado, tinción de Wright-Giemsa, microscopía Lámina 93 Córnea, raspando de Lámina 92, tinte blanco de
óptica, VPH. Purulencia, ninguna. Materiales locales, moderados. calcofluor, microscopía de fluorescencia, MPV. Quiste parasitario
Prequiste parasitario (13µmetro) (flecha). Morfología consistente con poliédrico (13µmetro). Morfología consistente conAcanthamoeba
Acanthamoeba spp. quiste.Impresión: Acanthamoeba queratitis.

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 CAPÍTULO 7 Examen microscópico de materiales de sitios infectados 157

Lámina 94 BAL, preparación de citocentrífugas, tinción de Wright-
Giemsa, microscopía óptica, VPH. Purulencia, luz. Materiales locales,
ligeros. Escombros amorfos, ligeros. Células en forma de media luna
con núcleo central(flechas). Morfología compatible con trofozoítos
(taquizoítos) deToxoplasma gondii (ver Lámina 95).
Lámina 95 BAL, preparación de citocentrífuga, tinción naranja de acridina,
microscopía de fluorescencia, VPH. Células en forma de media luna
compuestas de ARN. Morfología compatible con trofozoítos (taquizoítos)
deToxoplasma gondii. Impresión:toxoplasmosis.

Lámina 97 Heces diarreicas por concentración, microscopía

Lámina 96 Heces diarreicas, frotis, tinción de Weber modificada, microscopía
electrónica de transmisión, ×57.000. Presencia de capa de endosporas
óptica, ×2000 aceite. Purulencia, ninguna. Esporas de parásitos, pequeñas (1,5×
y tubos polares. Morfología consistente conEnterocytozoon bieneusi.
0,9 µmetro). Morfología compatible con enterocitozoo (flecha 1) (ver Lámina 97).
Impresión:microsporidiosis intestinal.
Compare con el tamaño de la levadura (flecha 2).

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158 PARTE 1 Introducción a la microbiología clínica
Lámina 98 Heces diarreicas acuosas y espumosas, frotis, tinción
acidorresistente, MPV. Purulencia, ninguna. Materiales locales, pesados.
Ooquistes acidorresistentes (4 a 6µmetro) (flechas) (ver Lámina 99). La
medida se toma para separar este ooquiste de los 8 a 10µm ooquistes de
Cyclosporaspp.
Lámina 100 Placa de agar sangre de carnero inoculada con esputo
expectorado, incubación de 24 horas con dióxido de carbono al 5% en aire.
Observe el fuerte crecimiento bacteriano en el área de inoculación
primaria con delgados rastros de colonias.(flechas) entrelazar la superficie
del agar (ver Lámina 101).
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Lámina 99 Heces diarreicas acuosas y espumosas de Lámina 99, frotis, tinción
ácido-resistente, VPH. Ooquistes acidorresistentes (4 a 6µmetro). Ooquistes
esporulados que contienen cuatro esporozoitos(flecha). Morfología consistente
con Cryptosporidium parvum. Impresión:criptosporidiosis.
Lámina 101 Esputo aspirado, tinción de Gram, microscopía óptica, LPV.
Purulencia, ninguna. Materiales locales, moderados. Presencia de moco.
Larvas de nematodos enrolladas(flechas). Morfología consistente con
Strongyloides stercoralis. Impresión: Strongyloidessíndrome de
hiperinfestación.
 CAPÍTULO 7 Examen microscópico de materiales de sitios infectados 159

Lámina 102 Parásito, vello púbico de paciente quirúrgico, montura sin Lámina 103 Tejido muscular, visto directamente. Larvas calcificadas
teñir, microscopía óptica, LPV. Se identifican tres pares de patas con garras enquistadas(flecha). Morfología consistente con Trichinella spiralis.
características en las puntas. Morfología consistente conPhthirus pubis ( Impresión:triquinosis.
piojo de cangrejo). Impresión: infestación de piojos.

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160 PARTE 1 Introducción a la microbiología clínica
Examen directo en infecciones virales
Lámina 104 Piel, líquido vesicular, preparación de Tzanck, tinción con
hematoxilina y eosina (H&E), microscopía óptica, MPV. Purulencia, moderada.
Materiales locales, ligeros. Presencia de células epiteliales multinucleadas
(flecha). Inclusiones intranucleares presentes. Morfología compatible con
inclusiones virales del herpes.Impresión: Infección por herpes simple.
Lámina 106 Piel, líquido vesicular, preparación de Tzanck, tinción de
Wright-Giemsa, microscopía óptica, VPH. Purulencia, luz. Presencia de
células epiteliales multinucleadas. Inclusiones intranucleares presentes.
Morfología compatible con inclusiones virales del herpes.Impresión:
infección por varicelazoster.
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Lámina 105 BAL, preparación de citocentrífugas, tinción rápida de Wright-
Giemsa, microscopía óptica, MPV. Purulencia, luz. Materiales locales,
ligeros. Presencia de glóbulos rojos. Presencia de células epiteliales
multinucleadas. Inclusiones intranucleares presentes. Morfología
compatible con inclusiones virales del herpes.Impresión: Infección por
herpes simple. Comparar conLámina 104. Tenga en cuenta el cambio en la
apariencia de las células infectadas por herpes con el cambio en el tipo de
fijación y tinción. La tinción H&E muestra más claramente la apariencia de
"vidrio esmerilado" de la inclusión nuclear bordeada por la cromatina
nuclear de la célula. La tinción rápida de Wright proporciona una
presentación visual adecuada y ahorra más tiempo.
Lámina 107 Piel, líquido vesicular, preparación de Tzanck, tinción de
anticuerpos para el virus del herpes simple, microscopía de fluorescencia,
MPV. Inmunotinción positiva. Infección por herpes simple, confirmada.
 CAPÍTULO 7 Examen microscópico de materiales de sitios infectados 161

Lámina 108 BAL, preparación de citocentrífugas, tinción de Wright-
Giemsa, microscopía óptica, MPV. Purulencia, luz. Sangre, moderada.
Materiales locales, ligeros. Neumocito agrandado con inclusión
intranuclear. Morfología compatible con citomegalovirus (CMV).
Observe los cambios nucleares característicos del CMV. La célula y el
núcleo están agrandados, el núcleo es granular y la membrana
nuclear es indistinta.(flecha). La sangre es una indicación de daño
capilar. Impresión: Enfermedad por CMV.
Lámina 109 BAL, preparación de citocentrífugas, tinción de Wright-Giemsa,
microscopía óptica, MPV. Purulencia, luz. Sangre, moderada. Materiales locales,
ligeros. Neumocito agrandado con inclusiones intracitoplasmáticas(flecha).
Morfología compatible con CMV. Las grandes inclusiones virales citoplásmicas
magentas de tamaño regular, cuando están presentes, son características del
CMV.Impresión: Enfermedad por CMV.

Lámina 110 BAL, preparación de citocentrífuga, tinción de adenovirus de

anticuerpos inmunofluorescentes, microscopía de fluorescencia, VPH.
Tinción fluorescente específica prominente de células infectadas.
Impresión: infección por adenovirus. La necrosis y los restos celulares
asociados con el adenovirus dentro de los bronquios pueden pasarse por
alto fácilmente porque es posible que no se reconozcan las células
necróticas infectadas por el virus. La inmunotinción específica debe
realizarse sobre la base de la sospecha clínica y el material de
antecedentes compatible.

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