Generalitat de Catalunya
Departament de Sanitat i Seguretat Social
Direcció General de Salut Pública
Año 11, núm. 82, marzo/abril de 2001, ISSN, 1130-7048.
TOXIINFECCIONES ALIMENTARIAS Y ZOONOSIS
La tuberculosis (III)
En los boletines número 12 y número 51 se trató con carácter general la tuber -
culosis humana y animal. Aquí volveremos a insistir en la prevalencia de esta histó -
rica enfermedad en los animales, que decididamente se intenta controlar en la
UE.
Historia
Las primeras referencias a la tuberculosis bovina proceden del año 2000 aC, e
implicaban a los elefantes indios. Las grandes difusiones por Occidente apare -
cieron inicialmente en la edad media, a través de programas de mejora con
vacas de Lombardía y posteriormente en el siglo XIX, con vacas frisonas holan -
desas y shorton británicas. Actualmente, de los 1.300 millones de bovinos que
hay en el mundo, solo un tercio se localiza en áreas con la enfermedad erradi -
cada.
En referencia a la tuberculosis considerada como una zoonosis, Mycobacterium
bovis cada vez tiene menos peso específico en la tuberculosis humana de los
países desarrollados. Sin embargo, en países como el Reino Unido, donde la tuber -
culosis humana se considera controlada, en los años 1998 y 1999 se diagnosti -
caron en Inglaterra y en el País de Gales 14 y 23 casos de tuberculosis humana
producida por M.bovis, respectivamente.
En relación a las ayudas entre los estados miembros de la UE para la lucha con -
tra las enfermedades animales, de un total de 1.370 millones de pesetas desti -
nados a la tuberculosis bovina para el año 2000, 831.930.000 pesetas se han
destinado a España. Nuestro país también es él que recibe más ayudas para la
cofinanciación de programas de erradicación de epizootías y zoonosis.
Mycobacterium bovis
De las 54 especies del género Mycobacterium, M. bovis es uno de los patóge -
nos y es uno de los que tiene un mayor número de huéspedes potenciales.
Puede infectar a los primates, a los ungulados y a los carnívoros, tanto domés -
ticos como salvajes. El vacuno es la especie más susceptible, mientras que las
cabras, los cerdos y los gatos ocupan una posición intermedia, y las ovejas y los
caballos presentan una considerable resistencia natural. La infección de los cier -
vos cautivos así como la de los tejones, que actúan como reservorio para el vacuno
en el Reino Unido, en Irlanda y en Nueva Zelanda, es importante dada su facili -
dad de transmisión al hombre.
La transmisión más importante entre el vacuno se realiza a través del aire y de
los esputos de los animales enfermos, y también por medio de las heces, de la
orina y de los flujos vaginales y uterinos. La dosis mínima infectiva se ha calcu -
lado en 0.01 mg de M. bovis viables por vía aerógena y 10 mg por vía digestiva.
1
BUTLLETÍ
INFORMATIU
per a la
VETERINÀRIA de SALUT PÚBLICA
Marcadores epidemiológicos
Las cepas de M. bovis son muy uniformes y no muestran diferencias por feno -
tipos, por serotipos, por fagotipos ni por perfiles proteícos ni por captación de ami -
noácidos. Ha sido la ingenería genética la que ha puesto a punto técnicas capa -
ces de detectar los polimorfismos del DNA, como el análisis de fragmentos de
restricción o la transferencia de los productos de la digestión a una membrana.
Hasta la fecha se han utilizado hasta 8 marcadores genéticos.
Diagnóstico anatomopatológico
Las lesiones macroscópicas de la tuberculosis bovina son muy características.
Un buen examen postmortem incluye la investigación de los ganglios linfáticos
retrofaríngeos medianos, de los mediastínicos craneales y caudales, de los ingui -
nales superficiales y del pulmón. Además de la inspección directa, se han de sec -
cionar los ganglios en láminas finas y se tiene que realizar una cuidadosa pal -
pación de los pulmones y cortarlos meticulosamente. La presencia de tubérculos
microscópicos constituye una lesión casi patognómónica.
El test de la tuberculina
El método diagnóstico in vivo utilizado en nuestro país para la erradicación de la
tuberculosis bovina es el test de la tuberculina, tal como se mencionó en los bole -
tines referenciados al inicio. Este método se basa en la hipersensibilidad de base
celular tipo IV o retardada que experimentan los individuos expuestos previamente
a los antígenos proteícos de las micobacterias. La tuberculina bovina se prepara
a partir de cepas AN5 o Vallée M. bovis, y la aviaria de las cepas D4ER o TB56
de M. avium. La técnica usada en nuestras campañas es la de tuberculinización
intradérmica (TBID) simple y la de comparación.
La sensibilidad no alcanza el 100 %, debido a la existencia de reacciones fal -
sas. Los falsos negativos son un peligro sanitario para el resto del ganado y los
falsos positivos suponen una pérdida económica y además, de confianza en los
test para los ganaderos.
Causas de los falsos resultados negativos
-Prealergia: hasta 30-50 días después de la infección no hay respuesta a la
tuberculina.
-Anergia: la enfermedad está muy avanzada pero no produce reacción.
-Desensibilización temporal: despues de la TBID se produce un periodo de 40-
60 días en el que los animales infectados no reaccionan.
-Immunosupressión postparto.
-Utilización de tuberculina de poca potencia o en dosis insuficiente.
-Errores en la identificación de los animales.
-Variaciones en los métodos de observación, cambio de observador y de criterios
de interpretación del test.
-Manipulaciones (aplicaciones de frío o de fármacos: dexametasona/cortisona).
Causas de los falsos resultados positivos
-Sensibilización contra M. paratuberculosis por infección o por vacunación con -
tra la enfermedad de Johne.
-Infección por micobacterias del complejo M. avium.
-Sensibilización contra micobacterias saprofitas o productoras de tuberculosis cutá -
nea.
-Errores en la identificación de los animales.
-Variaciones en el método de observación, cambio de observador o de los criterios
de interpretación del test.
-Manipulaciones: aplicación de calor o de agentes irritantes.
2. Control alimentario
E. coli O-157-H7 (VIII)
Resumen
Se investigaron cepas de Escheríchia coli en el Southern Crop Protection and
Food Research Center de Ontario (Canadá), aisladas de humanos y de los ali -
mentos en relación con su capacidad de crecimiento y de pervivencia en pH orgá -
nico bajo (ácido acético) y en un inorgánico (HCL). Las cepas se cultivaron pre -
viamente en un caldo de triptona-soja ajustado a diferentes pH (de 3,75 a 4,75
para el HCL y 4,75 a 5,75 para el ácido acético), con incubación durante 72h a
37ºC, para determinar el valor mínimo de pH con el que era viable el crecimiento.
Estos valores fueron de 4,25 y 5,5 para el HCL y el acético, respectivamente.
Las cepas también estuvieron expuestas a un pH de 2,0 (HCL) y 4,0 (acético)
durante 24 horas a 37ºC para evaluar la capacidad de pervivencia. A las 6 horas
de exposición el más efectivo fue el HCL mientras que a las 24 horas el más efec -
tivo fue el ácido acético. Las cepas aisladas de brotes epidémicos aguantaron
mejor el tratamiento ácido que las obtenidas de alimentos de humanos o de ani -
males, ácidos o fermentados. También hubieron diferencias significativas entre
cepas y entre E. coli 0157-H7 y otros serotipos después de 3 y 6 horas de expo -
sición a los ácidos.
Investigación
La Escheríchia coli ha sido identificado como un agente causal de toxiinfeccio -
nes alimentarias desde 1982. De los cuatro grupos de E. coli que provocan dia -
rreas, uno de estos produce colitis hemorrágica y el síndrome hemolítico urémico,
del cual la 0157-H7 es el principal representante, como también lo son los sero -
avares 026 y 0111. Es un germen muy tolerante a las temperaturas de crecimiento,
desde 2,5 hasta 45ºC, aunque con dificultad a 44-45ºC y por debajo de 8-10ºC.
La vía de transmisión son los alimentos o el agua de beber, siendo los más fre -
cuentes los primeros. Últimamente se han implicado en brotes epidémicos ali -
mentos ácidos como la sidra de manzana, el queso de leche descremada, el yogurt,
la mayonesa y el salami.
Los ácidos orgánicos se encuentran en los alimentos, donde se pueden añadir
intencionadamente para potenciar el gusto, o se producen en los procesos fer -
mentativos. También se ha hallado que E. coli O157-H7 es capaz de sobrevivir
al salami (Clavero MRS i Beuchat, 1996), durante el proceso de elaboración de
salchichas secas, en emprebats (embutidos curados con pimienta) (Riordan,
DCG et al. 1998) y en ensaladas de carne de vacuno con un 40% de mayonesa
mantenidas a 5ºC durante tres días. A pesar de ello, hay pocas comunicaciones
relativas a la supervivencia comparativa de diferentes cepas de E. coli entero -
hemorrágico, y éste ha sido el objetivo de la investigación, identificar la cepa, el
serotipo y la procedencia de una ó mas cepas capaces de sobrevivir en un medio
ácido.
Resultados y discusión
El pH mínimo para el crecimiento de todas las cepas de E.coli en un TSB (caldo
con triptona-soja) fue de 5,5 y 4,25 para el ácido acético y HCL, respectivamente.
El ácido acético fue un inhibidor más efectivo que el HCL para un mismo valor
2
Como conclusión, podemos afirmar que la TBID es la técnica de diagnóstico que
ha permitido erradicar la tuberculosis bovina de algunos países y que, además,
es la técnica oficial de las campañas de saneamiento sanitario. Es un test barato
y sencillo y con una especificidad aceptable. Los principales inconvenientes son
la sensibilidad relativamente baja, entre un 68 y un 91 %, motivo por el cual, a
medida que avanza la campaña de saneamiento, baja su utilidad y destacan más
los que reaccionan como falsos positivos. Además, se tarda 72 horas en poder
realizar la lectura, que puede ser manipulada; se necesitan dos inmobilizaciones
y se altera su sistema inmunológico, hasta el punto de que en estos animales no
se puede realizar un segundo test hasta pasados 60 días..
Fuente
González Llamazares O R, Gutiérrez Martín C B, Rodríguez Ferri E F. Etiologia
i diagnòstic de la tuberculosi bovina. Medicina Veterinaria 1998; 15-10: 514-37.
de pH. El pKa más alto del ácido acético (4,75) comparado con otros ácidos orgá -
nicos y minerales es responsable de la mayor eficacia de este ácido contra E.
coli O157-H7.
Estudios de inactivación ácida
Se utilizaron modelos lineales generales para evaluar el efecto superior de un
tipo de ácido sobre la pervivencia de cepas de E. coli durante un periodo de tra -
tamiento de 24 horas. La eficacia de los dos ácidos para inhibir E. coli era igual,
pero, durante las 3 primeras horas; a pesar de ello, el HCL era más eficaz que
el ácido acético después de 6h y, sin embargo, después de 24h se producía lo
contrario.
Las cepas E. coli, que se habían aislado de alimentos moderadamente ácidos
implicados en toxiinfecciones alimentarias, eran generalmente más tolerantes a
la acidez en comparación con cepas humanas o animales no procedentes de ali -
mentos. Esta precisión no concuerda con los resultados de algunos estudios que
se han hecho en relación a esta materia y que atribuyen más acidoresitencia a
las cepas provenientes de brotes epidémicos (Waterman SR y Samall PLC,
1996).
En resumen, se puede decir que esta investigación aporta la siguiente informa -
ción sobre la respuesta a la acidez de E. coli enterohemorrágico: 1) el valor mínimo
de pH que permite el crecimiento depende del tipo de ácido, no de la cepa ni del
serotipo; 2) las cepas aisladas de brotes epidémicos y de alimentos ácidos son
las más aceptables para el crecimiento con valores bajos de pH, y 3) las cepas
de E. coli O157-H7 no aisladas de brotes epidémicos tienen una capacidad ili -
mitada para sobrevivir en un medio ácido y son difícilmente distinguibles de otros
serotipos.
Fuentes
Clavero M R S, Beuchat L R. Survival of E. coli O157-H7 in broth and processed
salami as influenced by pH, water activity, temperature and suitability of media
for its recovery. Appl Environ Microbiology 1996; 62:2735-40.
Mckellar Robin C, Knight Kelley P. Growth and survival of various strains of
Enterohaemorrhagic E. coli in hydrochloric and acetic acid. J ournal of Food
Protection 1999; 62 (12):1466-9.
Riordan D C, Duffy G, Sheridan J J, Eblen B S, Whiting R C, Blair I S, Mcdowell
D A. Survival of E. coli O157-H7 during the manufacture of pepperoni. J of Food
Protection 1998; 61:146-51.
Waterman S R, Small P L C. Characterization of the acid resistance phenotipe
and rpos alleles of Shiga–like toxin-producing E. coli. Infect Immun 1996; 64:2808-
11.
 3. Legislación y tecnología alimentarias
La impedancia microbiológica
Resumen
La impedáncia microbiológica es un método rápido que permite determinar cua -
litativamente y cuantitativamente los microorganismos de un medio midiendo la
conductividad eléctrica. Con la tecnología de la impedancia directa la variación
de la conductividad de un medio de cultivo líquido sirve para medir, mientras que
con la impedancia indirecta se mide el cambio de conductividad eléctrica de una
solución reactiva, la cual se consigue mediante la absorción de gases del cultivo
bacteriano inoculado.
La mayoría de las investigaciones sobre la aplicabilidad de la impedanciometría
en microbiología alimentaria hacen referencia a la detección impedimétrica o a
la enumeración de Enterobacteriacias, especialmente la detección de Salmonella,
si bien también se ha utilizado para otros grupos de bacterias y de especies. Los
datos publicados hacen referencia principalmente a recuentos totales de bacte -
rias. También se ha llevado a cabo la aplicación con éxito de este método rápido
en otras áreas de higiene alimentaria, como residuos de antibióticos y evalua -
ción de aditivos por su efecto antimicrobiano. Sin embargo, el tiempo y los gas -
tos necesarios para optimizar el método, las deficiencias cuando el grado de con -
taminación de la muestra es muy bajo o cuando las bacterias están lesionadas
y la necesidad de efectuar una calibración individual para cada categoría de ali -
mento limitan la aplicabilidad de la impedanciometría.
Definiciones
Los métodos convencionales para un recuento bacteriano o para la investigación
de algunos agentes patógenos bacterianos requieren mucho tiempo, esfuerzo y
material. La garantía moderna de calidad sobre la base del análisis y el control
de los puntos críticos necesita métodos con resultados disponibles rápidamente
para poder llevar a cabo actuaciones inmediatas de cara a posible riesgos. La
duración de las pruebas tiene especial importancia cuando se trata de produc -
tos con vida comercial corta. Además, la disminución en los costes de almace -
namiento que permiten los métodos rápidos es una ventaja para la industria ali -
mentaria.
El proceso de medida se denomina se acuerdo con los parámetros comprendi -
dos en el sistema. El término impedancia es sinónimo de la resistencia total que
se produce en el circuito de corriente alterna, que incluye las resistencias óhmica,
inducida y de capacidad. Una constante material, la resistencia específica, influye
en la resistencia óhmica. La conductividad se define como el valor recíproco de
la resistencia específica y contribuye a la conductancia, que se define como el
valor recíproco de la resistencia total.
Métodos de medida y equipamiento
El equipo técnico necesario para realizar la impedancia microbiológica está for -
mado por incubadores especiales y cubetas de cultivo (equipadas con electro -
dos), con una unidad de evaluación informatizada, una impresora y el programa
apropiado.
Los dos principios básicos de medidas son las técnicas de impedancia directa e
indirecta. Con el método de impedancia directa, los electodos se sitúan dentro
del medio de cultivo líquido que ha estado inoculado con la muestra de material.
Como resultado de la actividad metabólica de los microorganismos contenidos
en la muestra, las moléculas grandes se disocian en otras fracciones más
pequeñas, con carga eléctrica. Estos cambios en la composición molecular
aumentan la conductividad del líquido y la capacitance (capacidad de almacenar
carga eléctrica) que surge especialmente de polarización de la interfase líquida
del electrodo. El método de impedancia-fraccionada (impedance splitting methode)
se distinge de los métodos usuales de medida de la impedancia total por un regis -
tro separado del cambio de impedancia del medio y del cambio de impedancia
del sistema de electodo. El medio de cultivo reacciona como una resistencia óhmica,
mientras que la impedancia del sistema de electrodo es óhmica y de capacidad.
El método de impedancia indirecta permite el uso de medios de cultivo con con -
centraciones altas de sal. La cubeta de cultivo para este método consiste en dos
secciones separadas, acondicionadas de forma que se posibilita el intercambio
de gases. Una de las secciones contiene el medio de cultivo y la muestra, y la
otras, en la que se realiza la lectura de la impedancia, contiene una solución alca -
lina o un puente de agar alcalino. Consecuentemente, los gases y especialmente
3
el CO 2 producido por la actividad metabólica en el medio inoculado durante la
incubación, son absorbidos por el hidróxido de potasio en la otra sección de la
cubeta, y de esta forma produce un descenso de la conductancia de la sustan -
cia alcalina.
El principio de todos los sistemas de impedancia es la medida de los cambios
absolutos o relativos de la conductancia, la impedancia o la capacitance a inter -
valos regulares. La enumeración de microorganismos por medio de la impedan -
cia se basa en el tiempo de detección que está en relación inversa con la con -
taminación de la muestra. Es indispensable realizar una calibración meticulosa
de al menos 30 muestras de las que varíen diversas magnitudes, tanto por el
método convencional como por el de impedancia. Los recuentos convenciona -
les se comparan con los respectivos tiempos de impedancia para compilar una
ecuación regresiva y calcular el coeficiente de correlación y la variación mediana.
El programa del ordenador calcula el recuento bacteriano de la muestra de mate -
rial a partir del tiempo de detección medido.
Uso de la impediometría en la microbiología alimentaria
La posibilidad de medir la impedancia para detectar y enumerar ciertos microor -
ganismos en los alimentos se ha intentado en diversas ocasiones, sobre todo en
relación con las enterobacteriaceas y al recuento total de aerobios mesófilos (ufc).
También se ha utilizado para la detección de otros grupos de bacterias impor -
tantes para la industria alimentaria como Listeria, Clostridium y Lactabacilaceas.
Lo que sucede es que cuando el grado de contaminación es muy bajo, los resul -
tados del recuento por impedanciometría no concuerdan plenamente con los del
método convencional. En el supuesto de C. perfringens (Monika Wawerla et al.,
1999) se ha comprobado que con contaminaciones experimentales de carne picada
con menos de 10 3 ufc/g se obtienen resultados de falsos negativos. También se
ha comprobado que cuanto más grande es el número de cepas de especies dife -
rentes utilizadas en una prueba, más baja es la correlación entre la numeración
por impedancia y el recuento por métodos convencionales. Ésto se debe al resul -
tado de diferentes actividades metabólicas de las diversas especies implicadas
(Lanzanova, M. et al., 1993). Además, y teniendo en cuenta las diferentes micro -
floras de los alimentos (incluso cuando son elaborados por diferentes fabrican -
tes) se ha recomendado calibrar el sistema de impedancia para cada categoría
de alimento para las determinaciones de las ufc (Jöckel,J., 1996).
Otras áreas de aplicación de la impedancia microbiológica
La utilización de la impedancia también es útil es otros ámbitos de la microbio -
logía. Así, también se ha aplicado en la determinación de residuos de antibióti -
cos, donde es 30 veces más sensible que los métodos clásicos de investigación
de penicilina G en la leche. Lo mismo se puede decir en las determinaciones de
eficiencia de las sustancias antimicrobianas en la conservación de los alimentos.
En relación a la industria láctica, la impedanciometría es un método válido para
determinar la calidad de los cutivos estárter. Por otra parte, de las medidas de
los cambios de conductancia de cultivos microbianos expuestos a condiciones
ambientales distintas, se pueden elaborar modelos de predicción.
Conclusiones
En la mayoría de las publicaciones relativas a la adecuación de la impedancio -
metría para la detección y la enumeración de microorganismos en los alimentos,
se constata que la impedancia microbiológica es una alternativa práctica a los
métodos convencionales. Sin embargo, la sustitución de un método por el otro
en los tests rutinarios solo compensa cuando un alto porcentaje de las pruebas
que hay que realizar son similares, ya que la optimización del método y la nece -
sidad de una calibración específica suponen mucho tiempo. Hay que recordar,
finalmente, los posibles falsos negativos que pueden aparecer cuando las mues -
tras están poco contaminadas y cuando los microorganismos han estado expues -
tos a influencias que implican un estado subletal de las bacterias.
Fuentes
Jöckel J. Einsatz der Impedanzmethode in der amtlichen Lebensmittel-überwa -
chung. Fleichwirtschaft 1996;76:945-50.
Lanzanova M, Mucchetti G, Neviani E. Analysis of conductance chances as a growth
index of lactic acid bacteria in milk. J Dairy Science 1993; 76:20-28.
Wawerla Monika , Stolle A, Schalch Barbara, Eisgruber H. Impedance Microbiology:
Applications in Food Hygiene. Journal of Food Protection 1999; 62 (12):1488-96.
 4. Información general
Disposiciones recientes
1) Decisión de la Comisión 2000/773/CE, de 30 de noviembre, por la que se aprue -
ban programas de vigilancia de la BSE presentados para el año 2000 por los
estados miembros y por la que se fija el nivel de participación financiera de
la Comunidad (DOCE de 8.12.2000: 35-7).
2) Decisión del Consejo 2000/766/CE, de 4 de diciembre (Anexo I), relativa a deter -
minadas medidas de protección contra las encefalopatías espongiformes
transmisibles y la utilización de proteínas animales en la alimentación animal.
3) Orden del MAPA de 15 de deciembre de 2000 (Anexo II), por la que se esta -
blecen baremos de indemnización por el sacrificio obligatorio de animales sos -
pechosos o afectados de encefalopatías espongiformes transmisibles.
4) Real decreto 3454/2000, de 22 de diciembre (Anexo III), por él que se esta -
blece y se regula el Programa integral coordinado de vigilancia y control de
las encefalopatias transmisibles de los animales.
5) Decreto 398/2000, de 5 de diciembre (Anexo IV), por él que se modifica la
lista de enfermedades de declaración obligatoria y brotes epidémicos en el
Departamento de Sanidad y Seguridad Social.
6) Orden de 28 de diciembre de 2000 (Anexo V), por él que se establece el plan
de adquisición de bovinos de más de 30 meses a los que se haya practicado
la prueba de detección de la EEB.
7) Reglamento de la Comisión 2908/2000/CE, de 29 de diciembre (Anexo VI),
sobre límites máximos de residuos de medicamentos veterinarios en los ali -
mentos de origen animal.
8) Decisión de la Comisión 2001/2/CE, de 27 de diciembre de 2000 (Anexo VII),
por la que se modifica la Decisión 2000/418/CE, relativa a materiales de
riesgo en relación con las encafalopatías espongifomes transmisibles.
9) Directiva de la Comisión 2000/82/CE, de 20 de diciembre, relativa a conteni -
dos máximos de residuos de plaguicidas sobre y en la fruta y las hortalizas,
los cereales, los productos alimentarios de origen animal y determinados pro -
ductos de origen vegetal (DOCE L; 3:18-26).
10) Decisión de la Comisión 2001/8/CE, de 29 de diciembre Anexo VIII), que modi -
fica la Decisión 2000/764/CE, relativa a la detección de la encefalopatía espon -
giforme bovina en los bovinos, y se actualiza el anexo IV de la Decisión
98/272/CE, relativa a la vigilancia epidemiológica de las encefalopatias
espongiformes transmisibles.
5. Anexo legislativo y técnico
Anexo l: Decisión del Consejo 200/766/CE.
Anexo Il: Orden del MAPA de 15.12.2000.
Anexo lll: Real decreto 3454/2000, de 22.12.
Anexo IV: Decreto 398/2000, de 5 de diciembre.
Anexo V: Orden de 28.12.2000.
Anexo Vl: Reglamento (CE) 2908/2000 de la Comisión.
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11) Decisión de la Comisión 2001/9/CE, de 29 de diciembre (Anexo IX), relativa
a medidas de control requeridas para la aplicación de la Decisión del Consejo
2000/766/CE, relativa a determinadas medidas de protección contra las
encefalopatías espongiformes transmisibles y la utilización de proteínas ani -
males en la alimentación animal.
12) Real decreto 3484/2000, de 29 de diciembre (Anexo X), por él que se esta -
blecen las normas de higiene para la elaboración, la distribución y el comer -
cio de los alimentos preparados.
13) Decisión de la Comisión 2001/25/CE, de 27 de diciembre (Anexo XI), por la
que se prohibe el uso de determinados subproductos animales en la ali -
mentación animal.
14) Órden de 12 de enero de 2001 (Anexo XII), que desarrolla el anexo XI del
Real decreto 3454/2000, por él que se establece y se regula el Programa
integral coordinado de vigilancia y control de les encefalopatías espongifor -
mes transmisibles de los animales.
15) Recomendación de la Comisión 2001/42/CE, de 22 de diciembre de 2000,
relativa a un programa comunitario coordinado respecto a los límites máxi -
mos de residuos de plaguicidas en los cereales y en determinados produc -
tos de origen vegetal, incluidas la fruta y las hortalizas (DOCE de 16.01.01:
40-5)
16) Órden del Ministerio de la Presidencia, de 22 de enero de 2001, por la que
se modifica el anexo II del Real decreto 2280/1994, sobre límites máximos
de residuos de plaguicidas en determinados productos de origen vegetal (BOE
de 24.01.01: 2879-93).
17) Decreto 40/2001, de 6 de febrero, por él que se establecen medidas adicio -
nales, en Cataluña, de control de la encefalopatía espongiforme bovina (apli -
cación de medidas de vigilancia activa en los animales de edad superior a
24 meses) (DOGC de 14.2.01: 1979).
Anexo Vll: Decisión de la Comisión 2001/2/CE.
Anexo VlII: Decisión de la Comisión 2001/8/CE.
Anexo IX: Decisión de la Comisión 2001/9/CE.
Anexo X: Real decreto 3484/2000, de 29.12.
Anexo Xl: Decisión de la Comisión 2001/25/CE.
Anexo Xll: Orden de 12 de enero de 2001.