Enzimas Celuloliticas (4) - Copiar

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Diseño y optimización de un
proceso de fermentación para la
obtención de enzimas
hemicelulolíticas y celulolíticas a
partir de Trichoderma
koningiopsis Th003
María Alejandra Jaramillo Rodríguez
Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ingeniería, Departamento de Ingeniería química y ambiental
Bogotá D.C, Colombia
2020
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Diseño y optimización de un
proceso de fermentación para la
obtención de enzimas
hemicelulolíticas y celulolíticas a
partir de Trichoderma
koningiopsis Th003
María Alejandra Jaramillo Rodríguez
Tesis o trabajo de investigación presentada(o) como requisito parcial para optar al título
de:
Magister en Ingeniería Química
Director:
Dr. Ing. Juan Carlos Serrato Bermúdez
Codirectora:
Ph.D. Eddy Johana Bautista Bautista
Línea de Investigación:
Bioproductos
Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ingeniería, Departamento de Ingeniería Química y Ambiental
Bogotá, Colombia
2020
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A la vida, mis padres, hermanos y Alaska.

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Agradecimientos
A mis papas y hermanos, por apoyarme en esta locura.
A AGROSAVIA por darme la oportunidad de desarrollar mi trabajo.
A mis directores Eddy Johana Bautista y Juan Carlos Serrato: no he podido dar con
mejores personas, los admiro como personas y como profesionales y no me alcanzaría la
vida para agradecerles por todo lo que aprendí de ustedes y todo el apoyo que me dieron.
Al grupo BAL, especialmente a Leyanis Mesa y Luis Fernando Rodríguez, por todo el
aporte que dieron a este proyecto.
A Carlos Rafael Castillo, por siempre tener la disposición de ayudarme, aún en la distancia.
A mis amigos del laboratorio: Ana María Jiménez, Duván Millán, John Pablo Vargas, Oscar
Monrroy, Stella Rincón … los llevo siempre en el corazón.
A mis amigas de la vida: Melissa Sánchez, Angela Alvarado, Marcela Ramos, Carel
Carvajal, por siempre estar ahí.
A Luis Antonio Soto, por la ayuda en el laboratorio.
A Freddy Escobar: Por salvarme de muchas (siempre).
Finalmente, a ti (Mono), por darme paz y tranquilidad.

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Resumen y Abstract IX
Resumen
La biomasa lignocelulósica es muy abundante en la naturaleza, una parte se genera a
partir de procesos agroindustriales especialmente del sector agrícola. Muchos de estos
materiales no tienen una aplicación directa en la industria, por lo tanto, su acumulación en
grandes cantidades puede generar problemas ambientales. Esto se puede contrarrestar
mediante el uso de estos materiales de bajo costo para generar productos con valor
agregado como enzimas, las cuales tienen una aplicación en diferentes industrias. Este
trabajo tuvo como objetivo el diseño de un proceso de fermentación a partir de bagazo de
caña y salvado de trigo para la producción de enzimas hemicelulolíticas y celulolíticas de
Trichoderma koningiopsis Th003. Inicialmente se realizó la evaluación de tres métodos de
pretratamiento químico sobre el bagazo de caña: básico con NaOH 5%, ácido H2SO4 2,5%,
y mixto H2SO4 1% + NaOH 4%. Posteriormente, usando una estrategia de diseño
experimental, se establecieron las condiciones físicas (temperatura de fermentación),
biológicas (concentración del inóculo), nutricionales (selección y concentración de fuente
de nitrógeno) del proceso de fermentacíón. Finalmente, a través de técnicas de
optimización se definieron las mejores condiciones nutricionales (selección de la
concentración de las fuentes de carbono y nitrógeno) y fisicoquímicas (pH, altura de lecho
y tamaño de partícula) para la producción de enzimas en un sistema de fermentación en
fase sólida. Las condiciones que favorecieron esta producción fueron: temperatura de
28°C; concentración de inóculo de 1x106 conidios/mL, relación bagazo/salvado 1:0,8;
extracto de levadura 3,2 g/L, pH 5,0; tamaño de partícula 5 cm, y altura de lecho 0,5 cm
con cinco días de fermentación. Con ellas se obtuvieron las siguientes actividades
enzimáticas FPasa 0,275 U/gss, CMCasa 1,834 U /gss, y xilanasa 1261,05 U/gss.
Palabras clave: xilanasas, celulasas, bagazo de caña, fermentación en estado

sólido.
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X Título de la tesis o trabajo de investigación
Abstract
Lignocellulosic biomass is the most abundant raw material in nature, a part is generated
from agro-industrial processes, especially in the agricultural sector. Many of these
materials do not have a direct application in industry, therefore their accumulation in large
quantities can generate environmental problems. This can be counteracted by using these
low-cost materials to generate value-added products such as enzymes, which have an
application in different industries. The objective of this work was to design a fermentation
process from sugarcane bagasse and wheat bran for the production of hemicellulolytic and
cellulolytic enzymes from Trichoderma koningiopsis Th003. Initially, the evaluation of three
chemical pretreatment methods was carried out on sugarcane bagasse: basic with 5%
NaOH, 2.5% H2SO4 acid, and mixed H2SO4 1% + NaOH 4%. Subsequently, using an
experimental design strategy, the physical (fermentation temperature), biological (inoculum
concentration), and nutritional (selection and concentration of nitrogen source) conditions
were established. Finally, through optimization techniques, the best nutritional conditions
(selection of the concentration of carbon and nitrogen sources) and physicochemical (pH,
bed height and particle size) for the production of enzymes in a fermentation system were
defined. in solid phase. The conditions that favored this production were: temperature of
28 °C; inoculum concentration of 1x106 conidia / mL, bagasse / bran ratio 1: 0.8; yeast
extract 3.2 g/L, pH 5.0; particle size 5 cm, and bed height 0.5 cm with five days of
fermentation. With them the following enzymatic activities were obtained: FPase 0.275
U/gss, CMCase 1.834 U/gss, and xylanase 1261.05 U/gss.
Keywords: xylanases, cellulases, sugarcane bagasse, solid state fermentation.

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Contenido XI
Contenido
Contenido
Introducción .................................................................................................................... 1
Objetivos....................................................................................................................... 6
Objetivo general ......................................................................................................... 6
Objetivos específicos ................................................................................................. 6
1. Marco teórico ............................................................................................................ 7

1.1 Biomasa lignocelulósica ..................................................................................... 7
1.2 Composición química de la biomasa lignocelulósica .......................................... 7
1.2.1 Celulosa .......................................................................................................... 8
1.2.2 Hemicelulosa ................................................................................................... 8
1.2.3 Lignina ............................................................................................................. 9
1.3 Limitaciones de la conversión de la biomasa lignocelulósica .............................. 9
1.4 Pretratamientos ................................................................................................ 10
1.4.1 Pretratamientos físicos .................................................................................. 10
1.4.2 Pretratamiento químico .................................................................................. 11
1.4.3 Pretratamiento fisicoquímico .......................................................................... 12
1.4.4 Pretratamiento biológico ................................................................................ 13
1.5 Hidrólisis de la biomasa lignocelulósica pretratada........................................... 13
1.5.1 Hemicelulasas ............................................................................................... 13
1.5.2 Celulasas ....................................................................................................... 15
1.6 Aplicaciones de la celulasas y hemicelulasas................................................... 16
1.7 Procesos de producción de enzimas ................................................................ 16
1.7.1 FES ............................................................................................................... 17
1.7.2 Trichoderma sp .............................................................................................. 18
1.8 Tipos de biorreactores utilizados en FES ......................................................... 19
1.8.1 Biorreactor en bandejas ................................................................................. 19
1.8.2 Biorreactor de lecho empacado ..................................................................... 19
1.8.3 Biorreactor de tambor rotatorio ...................................................................... 20
1.9 Parámetros fisicoquímicos de la FES ............................................................... 20
1.9.1 Temperatura .................................................................................................. 21
1.9.2 Contenido de humedad en el sustrato ........................................................... 21
1.9.3 Aireación........................................................................................................ 21
1.9.4 pH .................................................................................................................. 22
1.9.5 Tamaño de partícula ...................................................................................... 22
1.10 Parámetros nutricionales de la FES ................................................................. 23
1.10.1 Fuente de carbono......................................................................................... 23
1.10.2 Fuente de nitrógeno....................................................................................... 24
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XII Título de la tesis o trabajo de investigación
2. Evaluación de pretratamientos químicos para la producción de hemicelulasas

y celulasas..................................................................................................................... 25
2.1 Introducción ........................................................................................................... 25
2.2 Materiales y métodos............................................................................................. 26
2.2.1 Microorganismo y producción del inóculo ........................................................ 26
2.2.2 Sustrato de fermentación ................................................................................ 27
2.2.3 Pretratamiento del sustrato ............................................................................. 27
2.2.4 FES ................................................................................................................. 28
2.2.5 Obtención del extracto enzimático .................................................................. 29
2.2.6 Métodos analíticos .......................................................................................... 29
2.2.7 Determinación de la composición química del bagazo de caña y su fracción
celulósica ................................................................................................................. 31
2.2.8 Diseño estadístico ........................................................................................... 31
2.3 Resultados y discusión .......................................................................................... 32
2.3.1 Producción de enzimas hemicelulolíticas y celulolíticas a partir de bagazo de
caña pretratado con diferentes métodos de hidrólisis química. ................................ 32
2.3.2. Determinación de la composición química de los residuos agroindustriales
usados como medio de fermentación....................................................................... 37
2.4. Conclusiones parciales ......................................................................................... 39
3. Selección de parámetros físicos, biológicos y nutricionales para la producción

de enzimas hemicelulolíticas y celulolíticas de T. koningiopsis Th003 .................... 41
3.1 Introducción ........................................................................................................... 41
3.2 Materiales y métodos............................................................................................. 43
3.2.2 Efecto de la concentración de inóculo de T. koningiopsis Th003 y la
temperatura sobre la producción de enzimas hemicelulolíticas y celulolíticas. ......... 43
3.2.3 Selección de la fuente de nitrógeno y de la relación bagazo/salvado para la
producción de enzimas hemicelulolíticas y celulolíticas. .............................................. 44
3.2.4 Obtención del extracto enzimático .................................................................. 45
3.2.5 Métodos analíticos .......................................................................................... 46
3.2.6 Tratamiento estadístico ................................................................................. 46
3.3 Resultados y discusión .......................................................................................... 47
3.3.1 Influencia de la concentración de inóculo. ....................................................... 47
3.3.2 Efecto de la temperatura de incubación .......................................................... 51
3.3.3 Efecto de la fuente de nitrógeno y la relación bagazo/salvado ........................ 52
3.4 Conclusiones parciales .......................................................................................... 59
4. Optimización de los parámetros fisicoquímicos y nutricionales y efecto de la

aireación sobre la producción de hemicelulasas y celulasas ................................... 61
4.1 Introducción ........................................................................................................... 61
2.3. Materiales y métodos ........................................................................................ 63
4.2.2 Optimización de la concentración del extracto de levadura y la relación
bagazo/salvado........................................................................................................ 63
4.2.2.1 Validación del efecto de los parámetros nutricionales .................................. 64
4.2.3 Efecto de las condiciones fisicoquímicas (pH, tamaño de partícula, altura de
lecho) sobre la producción de enzimas hemicelulolíticas y celulolíticas. .................. 64
4.2.3.1 Validación del efecto de los parámetros fisicoquímicos ................................ 65
4.2.4 Efecto de la aireación sobre la producción de enzimas hemicelulolíticas y
celulolíticas .............................................................................................................. 66
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Contenido XIII
4.2.5 Obtención del extracto enzimático y métodos analíticos .................................. 69

4.2.6 Diseño estadístico ........................................................................................... 69
4.3 Resultados y discusión ......................................................................................... 70
4.3.1 Optimización de la concentración de extracto de levadura y la relación
bagazo/salvado ........................................................................................................ 70
4.3.2 Optimización del pH, tamaño de partícula y altura de lecho ............................ 77
4.3.3 Efecto de la aireación ...................................................................................... 87
4.3.4 Actividad enzimática antes y después de la optimización ................................ 89
4.4 Conclusiones parciales ......................................................................................... 90
5. Conclusiones y recomendaciones ........................................................................ 93

Conclusiones .............................................................................................................. 93
Recomendaciones ...................................................................................................... 94
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Contenido XIV
Lista de figuras
Pág.
Figura 1. Composición de la pared celular vegetal (A. Kumar et al., 2020) ....................... 8
Figura 2. Actividad FPasa durante 9 días de fermentación bajo diferentes
pretratamientos. .............................................................................................................. 32
Figura 3. Actividad CMCasa durante 9 días de fermentación usando bagazo pretratado
con diferentes tratamientos. ............................................................................................ 34
Figura 4. Actividad xilanasa durante 9 días de fermentación bajo diferentes
pretratamientos. .............................................................................................................. 35
Figura 5. Influencia de la concentración de inóculo en la producción de FPasa de T.
koningiopsis Th003 ......................................................................................................... 48
Figura 6. Influencia de la concentración de inóculo en la producción de enzima CMCasa
de T. koningiopsis Th003 ................................................................................................ 49
Figura 7. Influencia de la concentración de inóculo en la producción de xilanasas de T.
koningiopsis Th003 ......................................................................................................... 50
Figura 8. Influencia de la temperatura de incubación sobre la producción de FPasa,
CMCasa y xilanasa de T. koningiopsis Th003 ................................................................. 51
Figura 9. Efecto de la fuente de nitrógeno y la relación bagazo/salvado sobre la
producción de enzimas FPasas. (a) extracto de levadura; (b) sulfato de amonio ............ 53
Figura 10. Efecto de la fuente de nitrógeno y la relación bagazo/salvado sobre la
producción de CMCasa. (a) extracto de levadura; (b) sulfato de amonio ........................ 54
Figura 11. Efecto de la fuente de Nitrógeno y la relación bagazo/salvado sobre la
producción de enzimas Xilanasa. (a) extracto de levadura; (b) sulfato de amonio .......... 55
Figura 12. Diagrama de Pareto de los efectos de la relación bagazo/salvado y extracto
de levadura sobre la producción de enzimas xilanasas al día 5 de fermentación. Efecto
positivo (rojo), efecto negativo (gris). .............................................................................. 56
Figura 13. Diagrama de contorno de interacción entre la relación bagazo/salvado y
concentración del extracto de levadura (g/L) teniendo como respuesta la producción de
enzimas xilanasas (U/gss) .............................................................................................. 57
Figura 14. Esquema del fermentador de lecho fijo PROPHYTA® L05 (Cruz, 2014). ...... 66
Figura 15. Efecto de la concentración de extracto de levadura y la relación
bagazo/salvado sobre la producción de enzimas FPasa. ................................................ 70
Figura 16. Efecto de la concentración del extracto de levadura y la relación
bagazo/salvado sobre la producción de enzimas CMCasa. ............................................ 71
bagazo/salvado sobre la producción de enzimas xilanasa .............................................. 72
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Contenido XV
Figura 18. Diagrama de Pareto de los efectos de la relación bagazo/salvado y extracto

de levadura sobre la producción de enzimas xilanasas al día 5 de fermentación. Efecto
positivo (rojo), efecto negativo (gris). .............................................................................. 75
Figura 19. Gráfico de superficie de respuesta 3D para la actividad xilanasa al día 5 de
fermentación. ................................................................................................................. 76
Figura 20. Efecto del pH, tamaño de partícula y altura de lecho sobre la producción de
enzimas FPasa............................................................................................................... 78
enzimas CMCasa. .......................................................................................................... 79
enzimas xilanasa. ........................................................................................................... 80
Figura 23. Diagrama de Pareto de los efectos del pH, tamaño de partícula y altura de
lecho sobre la producción de enzimas xilanasas al día 5 de fermentación. Efecto positivo
(rojo), efecto negativo (gris). ........................................................................................... 82
Figura 24. Superficie de respuesta (3D) y gráfico de contorno que muestran los efectos
de la interacción para la producción de xilanasas al día 5 de fermentación. (a,b) efectos
del pH y tamaño de partícula; (c,d) efectos del pH y la altura de lecho; (d,e) efectos del
tamaño de partícula y la altura de lecho. La variable de respuesta aumenta de negro a
rojo ................................................................................................................................. 83
Figura 25. Efecto de la aireación sobre la producción de enzimas FPasa, CMCasa y
xilanasa al día 5 de fermentación. .................................................................................. 87
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XVI Título de la tesis o trabajo de investigación
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Contenido XVII
Lista de tablas
Pág.
Tabla 1. Métodos de pretratamiento utilizados en la biomasa lignocelulósica ................ 10

Tabla 2. Producción de xilanasas por diferentes hongos ............................................... 14
Tabla 3. Hongos productores de enzimas generadas mediante procesos de FES ......... 17
Tabla 4. Pretratamientos químicos empleados para el bagazo. ..................................... 28
Tabla 5. Composicion del forraje de avena. ................................................................... 37
Tabla 6. Composición química de la fracción celulósica del bagazo antes y después del
tratamiento alcalino y del salvado de trigo ...................................................................... 37
Tabla 7. Tratamientos para evaluar el efecto de la concentración de inóculo de T.
koningiopsis Th003 ........................................................................................................ 44
Tabla 8. Tratamientos para evaluar el efecto de temperatura de incubación de T.
koningiopsis Th003 ........................................................................................................ 44
Tabla 9. Factorial con fuente de nitrógeno orgánica ....................................................... 45
Tabla 10. Factorial con fuente de nitrógeno inorgánica ................................................. 45
Tabla 11. Diseño de tratamientos para la selección de la fuente de nitrógeno y la relación
bagazo/salvado para cada uno de los diseños factoriales. ............................................. 45
Tabla 12. Coeficientes codificados para la producción de xilanasas al día 5. ................. 55
Tabla 13. Factores y niveles empleados en la optimización relación bagazo/salvado y
fuente de nitrógeno ........................................................................................................ 63
Tabla 14. Diseño central compuesto para la optimización de la fuente de nitrógeno y la
relación bagazo/salvado. ................................................................................................ 63
Tabla 15. Box Behnken para la optimización parámetros fisicoquímicos........................ 64
Tabla 16. Diseño de tratamiento para la optimización de parámetros fisicoquímicos. .... 65
Tabla 17. Dimensiones de los parámetros para evaluar el efecto de la aireación .......... 68
Tabla 18. Tratamientos para evaluar el efecto de la aireación ....................................... 69
Tabla 19. Coeficientes codificados para la producción de xilanasas al día 5 de
fermentación. ................................................................................................................. 73
Tabla 20. Datos experimentales y predicción del modelo para la obtención de enzimas
xilanasas a partir de Trichoderma koningiopsis Th003 ................................................... 77
fermentación .................................................................................................................. 81
xilanasas a partir de Trichoderma koningiopsis Th003 ................................................... 84
Tabla 23. Porcentaje de humedad del sustrato al final del proceso de FES. .................. 88
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XVIII Título de la tesis o trabajo de investigación
Tabla 24. Actividades enzimáticas antes y después de la optimización. ......................... 90

Tabla 25. Productividad y porcentaje de aumento de la actividad enzimática con la
optimización .................................................................................................................... 90
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Contenido XIX
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Introducción
La ganadería bovina en Colombia representa uno de los principales sectores
económicos del país pues aporta el 48,7 % del PIB pecuario, el cual corresponde
al 3,3% del PIB nacional (FEDEGAN, 2019). Los sistemas de producción ganadera
en el país utilizan técnicas de pastoreo para la alimentación de los animales, pues
esta práctica disminuye los costos de mano de obra, sin embargo, pueden tener un
efecto negativo en la productividad, puesto que los efectos producidos por la
estacionalidad y el cambio climático han afectado considerablemente la producción
de leche y carne (FAO, 2020). Durante las épocas secas, hay una disminución en
la disponibilidad de forraje que reduce los niveles productivos por no encontrar
alimento de calidad, y en época de lluvia hay un exceso de forraje que se suministra
al animal en avanzado estado de madurez, el cual no le brinda los nutrientes
necesarios (FAO, 2020). Por tal motivo, el ensilaje se ha convertido en una
alternativa viable y de bajo costo para enfrentar los cambios producidos por las
variaciones climáticas. Sin embargo, Colombia aún no dispone de información
consolidada que demuestre procesos de ensilaje eficientes y controlados
(FENALCE, 2018). Por lo tanto, diversas investigaciones se han centrado en
estandarizar y mejorar los procesos de ensilaje, siendo la inoculación de enzimas
del complejo hemicelulolítico, uno de los factores claves para obtener silos que
puedan satisfacer las necesidades alimentarias del ganado, principalmente en
época de sequía.
El ensilaje, es un proceso de fermentación anaerobia de forraje verde de pastos,

gramíneas, leguminosas o cereales, mediada por la acción de las bacterias ácido-
lácticas (BAL) que transforman los carbohidratos simples en ácido láctico,
provocando la disminución del pH del medio, lo que impide la colonización de
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2 Introducción
microorganismos, principalmente patógenos, favoreciendo su conservación (Dogi

et al., 2015). Este proceso proporciona alimento estable para los sistemas de
producción ganadera; sin embargo, la baja concentración de azúcares simples que
presentan algunos forrajes y las malas prácticas de ensilaje, conllevan a una
desestabilización del sistema permitiendo la proliferación de microorganismos no
deseables como Clostridium sp, afectando negativamente la calidad del proceso y
por consiguiente del producto final (Dogi et al., 2015). Para contrarrestar estos
efectos, y que el proceso sea más eficiente, se ha aplicado una mezcla de enzimas
al forraje para aumentar la hidrólisis de polisacáridos complejos logrando la
liberación de los carbohidratos simples, haciéndolos disponibles para las BAL, y
con ello obteniendo mayor concentración de ácido láctico en menor tiempo (Muck
et al., 2018). La adición de estas enzimas a los inoculantes bacterianos ha tenido
un efecto positivo en la calidad del ensilaje, aumentando y mejorando la eficacia de
la alimentación en el ganado de engorde y lechero (Muck et al., 2018). Silva et al,
evaluaron la influencia de la alimentación con silo de maíz tratado con enzimas
hemicelulolíticas y celulolíticas sobre el rendimiento en novillas lactantes,
encontrando que el silo de maíz tratado con enzimas favoreció la ingesta de materia
seca y la digestibilidad de la fibra detergente neutra (FDN), aumentando de esta
manera el tiempo de rumia de las vacas, y la producción de cadenas cortas de
ácidos grasos en el rumen, parámetros que estarían involucrados en el rendimiento
de leche (T. A. L. Silva et al., 2018). Por otro lado, Gandra et al, demostraron que
el uso de enzimas hemicelulolíticas y celulolíticas en el ensilaje de maíz, aumentó
la FDN del ensilaje, la cual al ser suministrada a vacas lactantes mejoró la ingesta
de nutrientes, la fermentación ruminal, la síntesis de proteínas microbianas y la
producción de metabolitos sanguíneos teniendo como resultado mayores
rendimientos en la producción de leche (Gandra et al., 2017).
En AGROSAVIA (Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria) se han

venido adelantando estudios para el mejoramiento de los ensilajes principalmente
de avena forrajera (variedad Altoandina), en donde la producción de enzimas y de
inoculantes microbianos a base de BAL han sido uno de sus objetivos (Agrosavia,
2018). De acuerdo con análisis bromatológicos realizados por el Laboratorio de
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Introducción 3
microbiología pecuaria de AGROSAVIA, el cultivo de avena forrajera arrojó como

resultado una baja concentración de azúcares libres (0,76-1%), lo que llevaría a
una baja producción de ácido láctico durante el proceso de ensilaje (sin adición de
enzimas), y por consiguiente un proceso deficiente. Sin embargo, se observaron
altos porcentajes de celulosa (22,09%) y hemicelulosa (36,91%) en el forraje, que
con la inoculación de enzimas se podrían hidrolizar y de esta manera aumentar los
azúcares libres, principalmente glucosa, xilosa, manosa, galactosa y arabinosa,
favoreciendo la producción de ácido láctico por parte de las BAL.
Adicionalmente, las esporas del hongo T. koningiopsis Th003 son el principio activo
del bioplaguicida Tricotec y han sido objeto de varios estudios en AGROSAVIA por
sus características para el control biológico de diferentes patógenos en cultivos de
tomate, lechuga y arroz. Este bioplaguicida se produce en un proceso de
fermentación en estado sólido usando granos de cereal como sustrato (Corpoica.,
2010). Se ha podido demostrar que este hongo además de su capacidad
antagónica tiene un alto potencial para producir una amplia variedad de enzimas
hidrolíticas, especialmente celulasas (11,149 ± 0,523 U/gss de FPasa, 10,94 ±
0,276 U/gss de CMCasa) y xilanasas (115,8 ± 1,08); sin embargo, la concentración
lograda es baja, en comparación con las actividades de otros microorganismos
pertenecientes al mismo género, pues el sustrato de fermentación en el que se
produce masivamente no está diseñado para este propósito (Bautista, Jiménez,
Chavarro-anzola, & Gómez, 2018).
Por tal motivo, es necesaria la búsqueda de sustratos que favorezcan la producción

de enzimas hidrolíticas para poder ser adicionadas a los procesos de ensilaje.
En ese sentido, la biomasa lignocelulósica es una de las materias primas más

abundantes en la naturaleza, gran parte se genera a partir de procesos
agroindustriales especialmente del sector agrícola (Bill & Ozkan, 2019). Se ha
demostrado que estos materiales son una importante fuente de energía renovable,
con potencial para la producción de biocombustibles, generación de energía,
compuestos químicos y orgánicos, entre otros (Chun, Zhenquan, & Yeong, 2019).
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4 Introducción
Uno de los muchos ejemplos de esta biomasa es la producida por el sector

industrial de la caña, del procesamiento de arroz y el café. De acuerdo con cifras
de la Unidad de Planeación Minero-Energética de Colombia, para el año 2019 se
produjeron alrededor de 9 millones de toneladas de biomasa residual procedentes
de estas industrias, de las cuales 1.871.023 toneladas corresponden a desechos
de bagazo de caña (Asocaña, 2019), 2.564.250 toneladas corresponden a tamo de
arroz (Fedearroz, 2019) y 3.420.000 a pulpa de café (Asocafé, 2019). Por tal
motivo, existe un alto potencial para el uso de la biomasa lignocelulósica que se
genera a partir de los procesos productivos agrícolas (Y. P. Castro, 2014). En
general, la biomasa lignocelulósica está compuesta por celulosa, hemicelulosa y
lignina. La celulosa es el polímero orgánico en mayor proporción y está compuesto
por monómeros de D-glucosa unidos entre sí por enlaces glucosídicos β-1,4. La
hemicelulosa es un heteropolisacárido ramificado de hexosas (D- glucosa, D-
galactosa y D- manosa) y pentosas (D- xilosa y L- arabinosa). La lignina es un
biopolímero aromático y rígido con un alto peso molecular. La celulosa y la
hemicelulosa están estrechamente vinculadas con la lignina mediante enlaces
covalentes y puentes de hidrógeno, lo que hace que la estructura de la biomasa
sea robusta con una alta resistencia a los ataques biológicos y físicos (Cheah et
al., 2020).
Como se mencionó anteriormente, entre los residuos lignocelulosicos

agroindustriales de interés en Colombia estan el bagazo y el salvado de trigo, los
cuales van a ser utilizados en esta investigación. A pesar del uso que se les da a
esos residuos, grandes cantidades se acumulan en las plantas de procesamiento
convirtiéndose en una fuente de contaminación. No obstante, esta biomasa es
recalcitrante al ataque enzimático, ya que, la lignina actúa como una barrera que
interfiere en la accesibilidad de las enzimas para hidrolizar la celulosa y la
hemicelulosa y por tanto en su aprovechamiento (Philippini, Martiniano, Chandel,
Carvalho, & Silvio, 2019). Para reducir dicha recalcitrancia, se aplican
pretratamientos químicos, físicos, y termoquímicos, que afectan la composición y
estructura del material vegetal. Particularmente, los métodos alcalinos,
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Introducción 5
hidrotérmicos, y ácidos son los más comúnmente utilizados para mejorar la

sacarificación enzimática (Savou et al., 2019). Los tres métodos de pretratamiento
tienen diferentes ventajas y desventajas con respecto a los requerimientos
energéticos y la facilidad del proceso, por tal motivo, se ha buscado el desarrollo
de pretratamientos combinados que requieran bajos niveles energéticos, sean de
fácil manejo y mejoren la hidrólisis de la biomasa lignocelulósica (Philippini et al.,
2019).
Posteriormente, se logra la hidrólisis de la biomasa lignocelulósica previamente

tratada mediante la acción sinérgica de diferentes enzimas entre las que se
encuentran las xilanasas y celulasas (Yang, Yang, Duan, Alexandra, & Wang,
2019). Estas enzimas son producidas por una gran variedad de microorganismos,
específicamente hongos del género Trichoderma. Se ha reportado que este hongo
es capaz de producir 0,26 U/gss de FPasa, 64,54 U/gss de CMCasa, 1130,70 U/gss
de xilanasas (Alves et al., 2013), las cuales son producidas para diferentes
aplicaciones industriales como la producción de azúcares fermentables utilizados
para biocombustibles, prebióticos, textiles y la industria de pulpa y papel. Sin
embargo, como fue mencionado anteriormente, una de las aplicaciones que se ha
venido desarrollando dada la necesidad de intensificar los sectores productivos,
especialmente del sector ganadero, es el mejoramiento de las propiedades del
ensilaje por acción enzimática para alimentación bovina (Muck et al., 2018).
Por lo anterior, la producción de enzimas celulolíticas por T. koningiopsis Th003

puede constituir un paso importante para el mejoramiento de los procesos de
ensilaje que se están llevando a cabo en AGROSAVIA para la alimentación de
ganado bovino a partir de avena Altoandina. La optimización del medio de cultivo y
las condiciones de operación, principalmente la relación carbono: nitrógeno:
fósforo, el pH del medio, temperatura y tiempo de incubación, humedad y el tamaño
del inóculo son parámetros a tener en cuenta para la producción de celulasas y
hemicelulasas (Taherzadeh-ghahfarokhi, Panahi, & Mokhtarani, 2019).
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6 Introducción
Por lo anterior, surge la pregunta de investigación ¿cuáles son los parámetros

fisicoquímicos y nutricionales para un proceso de fermentación en estado sólido
que favorecen la producción de enzimas del complejo hemicelulolítico?
Para dar respuesta a la pregunta de investigación, se presentarán cinco capitulos

en los cuales, en el primer capítulo se mostrará una recopilación de investigaciones
previas y consideraciones teóricas en las que se sustenta el proyecto de
investigación, permitiendo la interpretación de los resultados y la formulación de las
conclusiones. En el capítulo 2 se estudian los pretratamientos realizados al sustrato
de fermentación para la producción enzimática. En el capitulo 3, se presentan los
resultados de la selección de parámetros físicos como la temperatura de
incubación, biológicos como la concentración de inóculo y nutricionales como la
selección de la fuente de nitrógeno para la mayor producción de ezimas en un
proceso de fermentación en fase solida. Posteriormente, en el capítulo 4 se
muestran los resultados de las optimizaciones nutricionales, fisicoquímicas y el
efecto de la aireación en el proceso de fermentación, y por último las conclusiones
y recomendaciones.
Objetivos
Objetivo general
Diseñar un proceso de fermentación a partir de bagazo de caña y salvado de trigo para la
producción de enzimas degradadoras de celulosa y hemicelulosa de T. koningiopsis
Th003.
Objetivos específicos
▪ Evaluar diferentes métodos de hidrólisis química sobre el bagazo de caña como
pretratamiento para la producción de enzimas degradadoras de celulosa y hemicelulosa.
▪ Establecer a escala laboratorio las condiciones fisicoquímicas y nutricionales del

proceso de fermentación que favorezcan la producción de enzimas hemicelulolíticas y
celulolíticas.
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1. Marco teórico
1.1 Biomasa lignocelulósica
La biomasa lignocelulósica es uno de los recursos renovables de carbono orgánico en la

naturaleza (Liao, Latif, Trache, Brosse, & Hussin, 2020). Las diferentes fuentes de biomasa
lignocelulósica son los residuos agrícolas (hojas,pajas), residuos pecuarios (estiércol),
biomasa forestal (cedro, abeto, sauce), desechos forestales (aserrín, madera), desechos
industriales (pulpas) y desechos municipales (desechos de alimentos) (Su, Zhao,
Khodadadi, & Len, 2020). Es considerada como una de las materias primas más
prometedoras para la producción de biocombustibles y otros productos químicos debido a
que es renovable, no compite con la producción de alimentos, además ayuda en la
reducción de emisión de gases de efecto invernadero (Alayoubi et al., 2020).
Algunos de los residuos agroindustriales más utilizados a nivel mundial para la producción
de diferentes productos son: bagazo de caña, residuos de yuca, bagazo de naranja, pulpa
de café, salvado de trigo, entre otros (Ferreira, Mahboubi, Lennartsson, & Taherzadeh,
2016). Los componentes básicos de estos materiales son principalmente: lignina, celulosa,
hemicelulosa, almidón, pectina y fibras.
1.2 Composición química de la biomasa lignocelulósica
La pared celular de la biomasa lignocelulósica consiste en una mezcla compleja de

polisacáridos y otros polímeros, organizados por medio de un conjunto de enlaces
covalentes y no covalentes. Es una matriz amorfa que contiene pectina, proteínas, lignina,
hemicelulosa y celulosa que es conocida como complejo lignocelulósico (Figura 1).
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8 Diseño y optimización de un proceso de fermentación para la obtención de
enzimas celulolíticas y hemicelulolíticas a partir de Trichoderma koningiopsis
Th003
Hemicelulosa Celulosa
Lignina Biomasa
lignocelulósica
Pared
celular
Figura 1. Composición de la pared celular vegetal (A. Kumar et al., 2020)
1.2.1 Celulosa
La celulosa está constituida por una larga cadena de monómeros de glucosa que se unen
entre sí mediante enlaces β-1,4, lo que le otorga la característica de ser insoluble en agua.
Estos enlaces forman cadenas lineales de glucosa estables que son resistentes a los
tratamientos físicos y químicos principalmente por la interacción de los puentes de
hidrógeno (Laluce, Roldan, Pecoraro, Igbojionu, & Ribeiro, 2019).
1.2.2 Hemicelulosa
La hemicelulosa es la estructura que sirve de conexión entre la lignina y la celulosa. A
diferencia de la celulosa, la hemicelulosa es un heteropolímero de cadena corta más
amorfo, ramificado y aleatorio lo que facilita las reacciones de hidrólisis que dan lugar a
azúcares fermentables (Laluce et al., 2019). Está compuesta principalmente por hexosas
(glucosa, galactosa, manosa, ramnosa, fructosa) y pentosas (xilosa y arabinosa).
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Capítulo 1 9
Adicionalmente también se pueden encontrar ácidos como el ácido galacturónico,

glucurónico, etc (Liao et al., 2020).
1.2.3 Lignina
La lignina después de la celulosa es el segundo biopolímero más abundante sobre la tierra.
Su función es rodear y proteger las fibras de celulosa, otorgándole mayor rigidez y
resistencia al ataque enzimático a la estructura vegetal. Es un heteropolisacárido fenólico
altamente complejo que consta de tres monómeros diferentes: alcoholes cumarílico,
coniferílico y sinapílico, los cuales están unidos entre sí por enlaces éter, y a su vez estan
unidos a la celulosa y a la hemicelulosa (Jatuwong et al., 2020). La estructura de la lignina
depende principalmente del tipo de material vegetal, por lo tanto no ha sido posible
establecer una estructura definida (Laluce et al., 2019).
1.3 Limitaciones de la conversión de la biomasa

lignocelulósica
Debido a las propiedades de los polímeros presentes en la estructura de la biomasa

lignocelulósica y a la interacción entre ellos, la biomasa lignocelulósica exhibe una
resistencia biológica, química y mecánica que dificulta la separación de sus tres
componentes principales (lignina, hemicelulosa y celulosa), y que le da su conocida
recalcitrancia (Lorenci Woiciechowski et al., 2020). Para reducir esta última y aprovechar
la hemicelulosa y la celulosa, se pueden aplicar diferentes tratamientos físicos, químicos
y/o biológicos, que afectan la composición y estructura del material vegetal con el fin de
obtener diferentes productos de interés industrial (Cheah et al., 2020).
Una variedad de pretratamientos han sido desarrollados con el objetivo de desintegrar la

fracción reticulada de la biomasa lignocelulósica para mejorar la accesibilidad a la celulosa
y la hemicelulosa por acción de enzimas celulasas y hemicelulasas respectivamente (de
Oliveira Gorgulho Silva & Filho, 2017). A continuación, se presentarán algunos de estos
métodos, sus ventajas y desventajas.
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Th003
1.4 Pretratamientos
Un pretratamiento efectivo debe ser capaz de: 1) mejorar los rendimientos del azúcar para
su posterior procesamiento, 2) tratar todo tipo de biomasa lignocelulósica, 3) ayudar en la
disminución en la formación de coproductos o inhibidores y 4) minimizar los costos de
energía y operación (Cheah et al., 2020). Por tal motivo, se han evaluado una variedad de
pretratamientos para determinar su efectividad hacia la biodegradación de la celulosa y la
hemicelulosa (Tian, Zhao, & Chen, 2018). La elección de los métodos de pretratamiento
depende del factor económico, el tipo de materia prima y sus impactos ambientales (R.
Kumar, Singh, & Singh, 2008). La tabla 1 muestra un resumen de los métodos de
pretratamiento más utilizados para la desintegración de la biomasa lignocelulósica.
Tabla 1. Métodos de pretratamiento utilizados en la biomasa lignocelulósica
Químicos Físicos Fisicoquímicos Biológicos
- Explosión de
- Molienda vapor
- Acido
- Extrusión - Explosión - Bacterias
- Alcalino con
- Congelación - Hongos
amoniaco
- Organosolv
- Ultrasonido
- Percolación
- Oxidativo
- Irradiación - Agua
caliente
1.4.1 Pretratamientos físicos

Los pretratamientos físicos como la molienda, la extrusión, congelación, ultrasonido y la
irradiación se aplican sobre la biomasa. La extrusión es un método reconocido utilizado
para producir carbón y productos gaseosos, en donde la biomasa lignocelulósica se trata
a temperaturas superiores a 300°C con una mezcla de cizallamiento para eliminar y acortar
la fibras de la biomasa (Cheah et al., 2020).
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Capítulo 1 11
La molienda es otro de los pretratamientos físicos utilizados, ya que aumenta el área de

superficie específica y reduce la cristanilidad de la celulosa para la hidrólisis enzimática
(Rezania et al., 2020).
La biomasa lignocelulósica puede pretratarse usando el método de congelación; el

volumen de agua cambia a medida que se transforma de líquido a sólido a bajas
temperaturas. A medida que el agua se difunde en la biomasa, el volumen de agua
aumenta durante la congelación, lo que resulta en la descomposición de las paredes
celulares (Rooni, Raud, & Kikas, 2017).
El pretratamiento con ultrasonido es otra alternativa, a través de la deslignificación y

erosión de la superficie, ofrece un tiempo de corto de procesamiento, una temperatura de
funcionamiento más baja y menos uso de productos químicos; la eficiencia de este
pretratamiento varía dependiendo del solvente utilizado, la frecuencia ultrasónica y el
diseño del reactor (Cheah et al., 2020).
La irradiación con microondas proporciona una operación fácil. Sin embargo, la duración
de la irradiación es un factor importante a tener en cuenta para un tratamiento efectivo. Un
mayor tiempo de exposición puede conllevar a la producción de inhibidores y la
degradación de los azúcares ya presentes (Soltanian et al., 2020).
En general, los petratamiento físicos son difíciles de escalar ya que incurren en altos costos
de operación y energía (Abraham et al., 2020).
1.4.2 Pretratamiento químico

Los pretratamientos químicos son los más aplicados a escala comercial. Los productos
químicos aplicados pueden ser: ácidos (orgánicos e inorgánicos), álcalis, y líquidos iónicos
(Liao et al., 2020).
▪ Pretratamiento ácido
Este pretratamiento es uno de los pretratamientos más utilizados. Consiste en exponer la
biomasa a una solución ácida, donde el ácido sulfúrico, el ácido nítrico, el ácido fosfórico y
el ácido clorhídrico se usan típicamente. El proceso se puede llevar a cabo a temperaturas
mayores a 180°C durante uno a cinco min, o temperaturas bajas (<120 ° C) pero con
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Th003
tiempos de contacto más largos (30-90 min); también se puede realizar a temperaturas
menores a 100°C pero con concentraciones más altas de ácidos (30-70%) o viceversa: a
temperaturas más altas (100-250 °C) con ácidos diluidos (<10%) (Baruah et al., 2018). Las
desventajas de la utilización de este pretratamiento incluyen: 1) La producción de
inhibidores como: furfural, hidroximetil furfural, ácido fórmico, entre otros; 2) la naturaleza
corrosiva del ácido y 3) pérdida de azúcares fermentables debido a las reacciones de
degradación mediadas por el ácido (M. F. Li, Yang, & Sun, 2016).
▪ Pretratamiento alcalino
Es caracterizado por su efectividad para remover la lignina de la biomasa, a través de la
ruptura de los enlaces que la unen con la hemicelulosa y la celulosa. La hemicelulosa se
solubiliza, sin embargo, lo hace en menor proporción que con los pretratamientos
hidrotérmicos y ácidos. Los puentes de hidrógeno entre la cadena de glucanos se rompen
parcialmente permitiendo que la celulosa esté más disponible, además se generan menos
inhibidores. Soluciones básicas de hidróxido de sodio (NaOH), hidróxido de potasio (KOH),
hidróxido de calcio (Ca(OH2)) son las más utilizadas (de Oliveira Gorgulho Silva & Filho,
2017)
▪ Pretratamiento organosolv
Es una mezcla de solventes orgánicos capaces de extraer la lignina y solubilizar la
hemicelulosa. Los solventes que se usan comúnmente para catalizar el proceso
organosolv son: metanol, etanol, acetona, etilenglicol, ácido oxálico, ácido salicílico y ácido
acetil salicílico. Está técnica conduce a la deslignificación e hidrólisis completa de la
hemicelulosa (Cheah et al., 2020).
1.4.3 Pretratamiento fisicoquímico

La biomasa lignocelulósica también puede tratarse física y químicamente en combinación,
como por ejemplo la molienda (pretratamiento físico) se puede realizar junto con el
pretratamiento alcalino (pretratamiento químico) para mejorar la eficiencia del
pretratamiento. En general esta combinación de métodos es efectiva para modificar la
estructura lignocelulósica en tiempos reducidos y a bajo costo (de Oliveira Gorgulho Silva
& Filho, 2017).
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Capítulo 1 13
1.4.4 Pretratamiento biológico

Algunas especies de hongos y las bacterias son capaces de tratar biológicamente la
biomasa lignocelulósica, al modificar su estructura e hidrolizarla en sustratos mas simples.
Este pretratamiento elimina la lignina mediante la utilización de hongos de podredumbre
marrón o blanca, exponiendo la celulosa y la hemicelulosa al ataque enzimático
microbiano. Los hongos de podredumbre blanca promueven la degradación de la lignina a
través de una variedad de enzimas ligninolíticas oxidativas, como la lignina peroxidasa,
manganeso peroxidasa y lacasas (B. Kumar, Bhardwaj, Agrawal, Chaturvedi, & Verma,
2020). Este pretratamiento está influenciado por varios factores, incluidos factores físicos
como la temperatura, la humedad, el tiempo de incubación, la aireación, el tamaño de
partícula, el área superficial accesible, entre otros; factores químicos como pH y la
composición del sustrato; y factores biológicos como los consorcios de microorganismos,
su interacción y competencia, que requieren mucho tiempo y un estrecho seguimiento a
estas condiciones (A. Kumar, Anushree, Kumar, & Bhaskar, 2020). Sin embargo, las
ventajas que presenta es la baja utilización de energía y la no utilización de químicos
(Rezania et al., 2020).
1.5 Hidrólisis de la biomasa lignocelulósica pretratada
Varios microorganismos son capaces de producir enzimas que degradan la celulosa y la

hemicelulosa de la pared celular de las plantas para generar compuestos de alto valor
industrial. Estas enzimas se conocen como celulasas y hemicelulasas, las cuales son
secretadas como metabolitos extracelulares por hongos filamentosos, actinomicetos y
algunas bacterias aerobias (Bajaj & Mahajan, 2019).
1.5.1 Hemicelulasas
Las hemicelulasas o xilanasas son enzimas glicosidasas que catalizan la hidrólisis de los
enlaces 1,4-β-D xilosídicos del xilano presente en la hemicelulosa, lo que conlleva a la
liberación de xilosa. La hidrólisis de la hemicelulosa requiere de varias enzimas que tienen
diversos modos de acción: endoxilanasa y exoxilosidasa (β-xilosidasa) (Yang et al., 2019).
▪ Las endoxilanasas (endo-1,4-β-xilanasa (EC 3.2.1.8) y endo-1,3-β-xilanasa (EC

3.2.1.32)) catalizan la hidrólisis de los enlaces 1,4-β-D-xilosídicos y 1,3-β-D-xilosídicos
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Th003
respectivamente, de la cadena principal del xilano de manera aleatoria liberando

xilooligosacáridos, lo que reduce el grado de polimerización de la hemicelulosa.
▪ Las exoxilanasas (exo-1,4-β-xilosidasa (EC 3.2.1.37) y exo-1,3-β-xilosidasa (EC

3.2.1.72)), catalizan la hidrólisis de los enlaces 1,4-β-D y 1,3-β-D de los extremos no
reductores de los xilooligosacáridos liberando xilobiosa y xilosa respectivamente.
Cuando la hemicelulosa presenta ramificaciones, la hidrólisis se ve favorecida por la acción

de enzimas como las glucuronidasas, arabinasas, acetil xilano esterasas, ácido ferúlico
esterasas y ácido p-cumárico esterasas, que hidrolizan las cadenas laterales. Sin embargo,
la determinación de la actividad hemicelulolítica, se hace a partir de las endoxilanasas,
debido a la dificultad de purificar las otras enzimas del complejo hemicelulósico (V. Kumar,
Dangi, & Shukla, 2018).
▪ Microorganismos productores de hemicelulasas
Estas enzimas son producidas por una gran variedad de microorganismos incluidos
hongos filamentosos, levaduras y bacterias.
Los hongos filamentosos han sido usados como productores potentes de enzimas a nivel
industrial, especialmente de enzimas hidrolíticas como las xilanasas. Los genomas de
hongos como Aspergillus fumigatus, Trichoderma reesei, Phialophora sp., Malbranchea
pulchella y Myceliophthora thermophila codifican para una diversidad de enzimas que
hidrolizan los componentes de la hemicelulosa (Basit, Liu, Rahim, Jiang, & Lou, 2018). Sin
embargo, en estudios recientes se ha podido demostrar que los mejores microorganismos
para la producción de xilanasas son: Aspergillus niger, Trichoderma harzianum, Penicillium
sp., Fusarium oxysporum, y Humícola sp (Tabla 2) (Corrêa et al., 2014).
Tabla 2. Producción de xilanasas por diferentes hongos

Unidades de actividad
Microorganismo Referencia
xilanasa
Aspergillus niger 42,5 U/g
Trichoderma harzianum 288 U/mL
Penicillium canescens 8932 U/g (Alokika & Singh, 2019)

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Capítulo 1 15
Fusarium oxysporum 1840 U/g
Humicola laniginose 7832 U/g
1.5.2 Celulasas
Las celulasas, son enzimas que hidrolizan los enlaces β-1,4 de la celulosa para liberar
oligosacáridos, celobiosa y glucosa (Patel, Singhania, Sim, & Pandey, 2019). Según el
modo de acción, existen tres tipos de celulasas: endoglucanasas, exoglucanasas, y β-
glucosidasa (EC 3.2.1.21) (Yang et al., 2019).
▪ Endoglucanasa (β-1,4-endoglucanasa (EC3.2.1.4): hidroliza al azar los sitios amorfos

de la celulosa, generando cadenas más cortas (oligosacáridos), y nuevos extremos en
la cadena.
▪ Exoglucanasa (celobiohidrolasa (EC3.2.1.91) y celodextrinasa (EC3.2.1.74)):
Hidrolizan los extremos reductores y no reductores de la cadena de celulosa y de los
oligosacáridos produciendo celobiosa.
▪ β-glucosidasa: actúa sobre la celobiosa liberada por las exoglucanasas para liberar
monómeros de glucosa.
Estas celulasas pueden actuar en la cadena de celulosa solas o en combinación. Sin
embargo, la acción de dos o más enzimas celulasas de manera sinérgica, facilita la
degradación de la estructura celulósica (Shokrkar, Ebrahimi, & Zamani, 2018).
▪ Microorganismos productores de celulasas
Existe una gran variedad de microorganismos que realizan la hidrólisis de la celulosa. Se

han aislado complejos enzimáticos de un sinnúmero de bacterias, particularmente
bacterias anaerobias presentes en los sistemas digestivos de bovinos (Garvey, Klose,
Fischer, Lambertz, & Commandeur, 2013). No obstante, los hongos son los
microorganismos más estudiados para la producción de estas enzimas debido a la gran
variedad de enzimas que pueden producir cuando se inducen adecuadamente, además
que estas son producidas de manera extracelular lo que facilita su separación.
Trichoderma reesei, es el hongo más extensamente estudiado. Otros de los géneros más
estudiados son: Humicola sp, Penicillium sp y Aspergillus sp. (H. Wang, Zhai, & Geng,
2020).
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Th003
1.6 Aplicaciones de la celulasas y hemicelulasas
Se han encontrado diversas aplicaciones de las celulasas y hemicelulasas en la industria.

Estudios recientes han demostrado que la aplicación de xilanasas y celulasas tiene un
papel importante en la industria de alimentos y concentrados (Alokika & Singh, 2019).
Recientemente, las investigaciones se han centrado en el desarrollo de mejores alimentos
para los animales con el fin de aumentar el rendimiento de productos como leche, carne y
huevos (Thapa et al., 2019).
Otra de las aplicaciones importantes actualmente es la utilización de enzimas en la

industria de pulpa y papel. El proceso de blanqueamiento químico es el proceso
convencional en la fabricación de papel, este proceso requiere altas temperaturas (de
hasta 170°C) y productos químicos como el Cl2, ClO2 y NaClO para la eliminación de la
lignina (Basit et al., 2018). Estos agentes, en altas concentraciones son cancerígenos,
mutágenicos y causan contaminación ambiental. Por consiguiente, el uso de enzimas
como las xilanasas, es una alternativa ecológica para reducir el tiempo de procesamiento,
el consumo de energía y el uso de productos químicos tóxicos (Alokika & Singh, 2019).
Las xilanasas y celulasas se usan para degradar los sustratos lignocelulósicos, en

azúcares fermentables, que posteriormente se fermentan en bioetanol, biobutanol,
acetoína y 2,3-butanodiol, entre otros (Bala & Singh, 2019).
Las enzimas en los detergentes ayudan a mejorar la blancura de la tela, su color, suavizan
el algodón y aumentan la eficiencia en la limpieza de manchas y la suciedad clásica como
la hierba, la grasa animal, vegetal, entre otros. Además, las celulasas contribuyen a
modificar la estructura de la fibra de celulosa para mejorar el brillo del color y el cuidado
general del tejido (Basit et al., 2018).
1.7 Procesos de producción de enzimas
La producción de enzimas se puede llevar a cabo en procesos de fermentación en estado

líquido (FEL) o procesos de fermentación en estado sólido (FES). La FEL implica el
crecimiento de los microorganismos en un medio líquido el cual permite mantener las
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Capítulo 1 17
condiciones del medio homogeneas, (Uday, Choudhury, Bandyopadhyay, & Bhunia, 2016),
mientras que la FES es el proceso en el que los microorganismos crecen sobre materiales
sólidos, sin la presencia de agua libre. La FES es utilizada principalmente para el cultivo
de hongos filamentosos, permitiendo una mayor productividad enzimática en comparación
con las FEL (Farinas, 2015). Adicionalmente, las enzimas producidas en FES son menos
susceptibles a problemas de inhibición por sustrato, y son más estables a los cambios de
temperatura, y pH (Farinas, 2015).
1.7.1 FES
La FES es un proceso de fermentación que emplea una matriz sólida ya sea natural o
inerte, con la humedad necesaria para el crecimiento y desarrollo de los microorganismos,
es decir, ocurre en ausencia de agua libre (Farinas, 2015). La matriz sólida puede ser la
fuente de nutrientes o un soporte saturado con los nutrientes adecuados que permitan el
desarrollo de los microorganismos.
Desde una perspectiva ambiental, la FES presenta una importante ventaja sobre la
fermentación en estado líquido (FEL), la cual, es la posibilidad de utilizar residuos
agroindustriales sólidos como sustrato que simulan al hábitat natural del microorganismo,
además hay bajo riesgo de contaminación por parte de bacterias debido a la baja humedad
que requiere el proceso y por consiguiente hay baja producción de efluentes al final del
proceso, los cuales sirven como fuente de carbono y energía para la producción de
productos de interés. En la Tabla 3., se presentan algunos ejemplos de producción de
enzimas a partir de hongos utilizando residuos agroindustriales en FES.
Tabla 3. Hongos productores de enzimas generadas mediante procesos de FES

Residuo Enzimas que
Hongos Referencia
utilizado producen
Aspergillus niger Pulpa cítrica Fitasas (Jatuwong et al., 2020)
Bagazo de
Pleurotus ostreatus Lacasas (F. Wang et al., 2019)
caña
Bagazo de
Trichoderma
caña Xilanasas (Alokika & Singh, 2019)
harzianum
pretratado
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Th003
Penicillium
Paja de trigo Xilanasas (Alokika & Singh, 2019)
canescens
(R. J. S. de Castro & Sato,

Aspergillus oryzae Harina de trigo Proteasas
2015)
Penicillium Pulpa de café

Tanasas (Aharwar & Parihar, 2018)
verrucosum pretratada
Cáscara de (Patidar, Nighojkar, Kumar, &

Aspergillus sp Pectinasas
naranja Nighojkar, 2018)
Ganoderma Manganeso (Lizardi-Jiménez &

Hoja de piña
lucidum peroxidasas Hernández-Martínez, 2017)
Paja de trigo y
Fusarium
mazorca de Celulasas (Ferreira et al., 2016)
oxysporum
maíz
1.7.2 Trichoderma sp
Trichoderma sp es un género perteneciente a la familia Hypocreaceae. Es un
microorganismo de vida libre, aerobio y puede crecer y desarrollarse en suelos con pH
neutro hasta ácido (Nathan, Esther Rani, Rathinasamy, Dhiraviam, & Jayavel, 2014). Son
cosmopolitas en su distribución y podrían aislarse fácilmente de la madera en
descomposición, de diferentes formas de materia orgánica y del suelo. Puede
caracterizarse por la producción masiva de conidios de varios tonos de color verde y un
rápido crecimiento sobre diferentes medios de cultivo (Adnan et al., 2019). Ha sido utilizado
ampliamente como agente de control biológico ya que tiene la capacidad de producir un
complejo de enzimas hidrolíticas y de metabolitos antimicrobianos, que tienen efecto
antagónico sobre una amplia gama de fitopatógenos transmitidos por las semillas y el
suelo. Además, por la gran diversidad de enzimas que es capaz de producir, está implicado
en la transformación de compuestos lignocelulósicos para obtener productos de interés
industrial (Fraceto et al., 2018). Debido a esto, varias especies de Trichoderma sp. han
adquirido importancia industrial y sus formulaciones actualmente se comercializan en todo
el mundo a escala industrial, utilizando diferentes sustratos principalmente residuos
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Capítulo 1 19
agroindustriales. Hasta la fecha, las especies de Trichoderma más utilizadas para la

producción de celulasas y xilanasas son T. viride, T. reesei, T. virens, T. asperellum, T.
tubingensis. Siendo T. reesei el gran exponente en este género (Ezeilo, Lee, Huyop,
Zakaria, & Wahab, 2019a), ya que ha sido ampliamente producido a escala industrial por
su capacidad de producir celobiohidrolasas (CBHI y CBHII), endoglucanasas (GE1 y GE2),
y xilanasas con diferentes fines industriales (Astolfi et al., 2019).
1.8 Tipos de biorreactores utilizados en FES
Diferentes tipos de biorreactores han sido utilizados para la producción de enzimas en

sistemas FES, la mayoría de ellos a escala laboratorio. Sin embargo, otros biorreactores
como: bandejas, tambor rotatorio, lecho empacado y lechos fluidizados también han sido
empleados (Shokrkar et al., 2018) y serán descritos a continuación.
1.8.1 Biorreactor en bandejas

El biorreactor tipo bandeja utiliza bandejas planas, donde el sustrato se fija sobre la
superficie, creando una capa de entre 1,5 cm y 2 cm. Las bandejas son colocadas en un
cuarto con temperatura constante y con circulación de aire húmedo (Farinas, 2015). El uso
de bandejas es uno de los métodos más simples para la FES. La aplicación de este tipo
de biorreactor a escala industrial ofrece ciertas ventajas como por ejemplo la baja
utilización de energía ya que no necesita agitación durante el proceso, adicionalmente
ofrece un proceso de fácil operación y bajo costo (Thomas, Larroche, & Pandey, 2013).
Sin embargo, el intercambio gaseoso es limitado creando dificultades en la transferencia
de masa y energía (Shokrkar et al., 2018). Este tipo de reactores son ideales para la
fabricación en volumenes relativamente pequeños, no obstante, puede no ser atractivo
para procesos a gran escala ya que se requieren grandes espacios para la instalación de
equipos y mucha mano de obra.
1.8.2 Biorreactor de lecho empacado

Es utilizado frecuentemente en FES por ser un proceso de bajo costo y ser espacialmente
eficiente. Este sistema consiste en columnas en las cuales el sustrato sólido se sostiene
sobre una base perforada desde la cual se inyecta aire a través del sustrato. Este tipo de
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Th003
biorreactores es ideal para sustratos que no necesiten mezcla debido al efecto adverso
que puede causar sobre el crecimiento o la estructura del producto final. Adicionalmente
se pueden equipar con controles de temperatura durante el proceso de fermentación
(Farinas, 2015).
Los biorreactores de lecho empacado son comúnmente utilizados para la hidrólisis de

biomasa lignocelulósica para la obtención de enzimas; sin embargo, a gran escala no es
utilizado comúnmente debido a las dificultades relacionadas con la caída de presión y la
canalización cuando al sistema se le inyecta un alto flujo de aire. Otros inconvenientes
asociados con el uso de este biorreactor son el crecimiento no uniforme del
microorganismo y la dificultad para la transferencia de calor dentro del sistema (Singhania,
Patel, Soccol, & Pandey, 2009).
1.8.3 Biorreactor de tambor rotatorio

Este biorreactor consiste en un tambor con o sin paletas, que gira para mezclar el sustrato
de fermentación. El tambor rotatorio con paletas fue diseñado para proveer una adecuada
aireación y homogenización del sustrato por que proporciona una mejor transferencia de
oxígeno dentro del sistema y reduce la aglomeración de partículas del sustrato durante el
crecimiento microbiano (Shokrkar et al., 2018).
1.9 Parámetros fisicoquímicos de la FES
Hay varios factores importantes involucrados en el éxito de una FES. Estos factores
incluyen: la selección del microorganismo, la selección del sustrato, y los parámetros
óptimos del proceso. Los hongos y levaduras son los microorganismos más utilizados en
este tipo de procesos por tener bajos requerimientos de humedad (Singhania et al., 2009).
La eficiencia de los procesos de FES para obtener productos de interés depende

principalmente de las condiciones fisicoquímicas, operativas y ambientales. La
temperatura, el pH, la humedad, aireación, la porosidad, el tamaño de partícula y la
capacidad de absorción del sustrato utilizado, son las variables clave que influyen en los
procesos de FES (Farinas, 2015).
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Capítulo 1 21
1.9.1 Temperatura
La temperatura es uno de los parámetros que más afectan los procesos de FES. En niveles
extremos de temperatura, puede tener efectos desfavorables en el crecimiento del
microorganismo y la producción de metabolitos, especialmente se puede dar la
desnaturalización de las enzimas producidas (Raghavarao, Ranganathan, & Karanth,
2003). Por tal motivo, la caracterización del microorganismo de interés, particularmente la
influencia de la temperatura sobre la cinética de crecimiento y de producción de enzimas,
es esencial para el desarrollo de este tipo de bioprocesos.
1.9.2 Contenido de humedad en el sustrato

El agua tiene varias funciones en un bioproceso: ayuda en la difusión de los nutrientes
dentro del sistema de fermentación para ser tomados por los microorganismos y en la
estabilidad y mantenimiento de la función biológica de proteínas, carbohidratos,
nucleótidos; entre otros (R. J. S. de Castro & Sato, 2015).
Un bajo contenido de agua puede reducir las tasas de crecimiento microbiano, y puede
reducir la formación de los productos de interés. Si el contenido de humedad es muy alto,
los espacios vacíos entre el sustrato son llenados por el agua, lo que dificulta la difusión
gaseosa, impidiendo la transferencia de oxígeno y el desplazamiento del CO2 (producto
del metabolismo) fuera del sistema, por tanto se pueden crear microambientes anaeróbicos
dentro del reactor que inhiben el crecimiento de los microorganismos aeróbicos (Farinas,
2015).
El contenido óptimo de humedad depende del microorganismo y del sustrato. Una

consideración importante para tener en cuenta es que la humedad varía durante el tiempo
en que se lleva a cabo la fermentación (Sharma, Kumar, Panwar, & Kumar, 2017).
1.9.3 Aireación
Las principales funciones del aire en la FES son mantener condiciones aeróbicas, remover
el CO2 producido y regular la temperatura y el contenido de humedad del sustrato. La baja
producción de metabolitos, principalmente de enzimas en FES, puede estar relacionada
con la limitación de oxígeno durante el crecimiento microbiano puesto que la transferencia
de O2 se da principalmente por difusión (Hölker, Höfer, & Lenz, 2004). Además, la
transferencia de calor y la dispersión del CO2 se ven favorecidas por inyección de aire. La
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Th003
velocidad de aireación debe evaluarse cuidadosamente, ya que la pérdida de humedad a

altas velocidades de flujo puede afectar negativamente el crecimiento del microorganismo
limitando la producción de enzimas (Thomas et al., 2013).
1.9.4 pH
Así como los otros parámetros mencionados anteriormente, el pH juega un papel
importante en los procesos de FES, principalmente debido a que este puede cambiar en
respuesta a las actividades metabólicas entre el sustrato y el microorganismo.
La producción de enzimas está fuertemente influenciada por el pH, ya que en ciertas

ocasiones, los sitios activos de las enzimas dependen de la presencia de iones para
mantener una unión eficiente con el sustrato (Brijwani, Oberoi, & Vadlani, 2010). El
monitoreo y control del pH durante la FES no es fácil, por tal motivo solo se ha descrito la
influencia del pH inicial del sustrato de fermentación.
1.9.5 Tamaño de partícula

El tamaño de partícula del sustrato es un parámetro importante a tener en cuenta, ya que
está relacionado con la caracterización del sustrato y la transferencia de calor y masa
durante el proceso de FES (Krishna, 2005). Adicionalmente afecta la relación
superficie/volumen de la partícula, que determina la porosidad del sustrato y la fracción de
este que es accesible para el microorganismo. Dado que la velocidad de transferencia de
oxígeno afecta el crecimiento microbiano, el sustrato debe contener partículas de tamaño
adecuado para mejorar la transferencia de masa (Krishna, 2005). Generalmente las
partículas más pequeñas proporcionan un área superficial más grande para la acción
microbiana, por eso, los sustratos generalmente son pretratados con mecanismos físicos,
como la molienda para disminuir su tamaño y aumentar el área superficial, sin embargo,
las partículas muy pequeñas pueden provocar aglomeración en el sustrato interfiriendo con
la transferencia de oxígeno provocando una inhibición en el crecimiento (Raghavarao et
al., 2003). Por otro lado, las partículas más grandes, proporcionan una mejor relación
respiración/aireación, pero proporcionan una superficie limitada para la colonización por
parte de los microorganismos (Lizardi-Jiménez & Hernández-Martínez, 2017). Es
importante recalcar que el tamaño de partícula puede variar durante la fermentación,
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Capítulo 1 23
debido a la actividad metabólica del microorganismo al consumir el sustrato (R. J. S. de

Castro & Sato, 2015).
1.10 Parámetros nutricionales de la FES
El sustrato debe brindarle al microorganismo todos los nutrientes necesarios de forma

balanceada para su crecimiento, reproducción y formación de productos. Principalmente
la relación entre la fuente de carbono y nitrógeno ejerce la mayor influencia en los procesos
de FES. Sin embargo, algunos microorganismos requieren de microelementos como el
fósforo (P), hierro (Fe), azufre (S), magnesio (Mg), calcio (Ca), manganeso (Mn), zinc (Zn),
cobalto (Co), entre otros (Thomas et al., 2013).
1.10.1 Fuente de carbono

Diferentes sustratos, tanto residuos del agro como industriales, sintéticos o naturales han
sido evaluados como fuentes de carbono para los procesos de FES. Altas concentraciones
de la fuente de carbono no siempre resultan en altos niveles de producto, por el contrario,
puede darse una limitación de la transferencia de oxígeno y el agotamiento de otro de los
nutrientes necesarios. Se ha demostrado que la mejor fuente de carbono para la inducción
de enzimas celulolíticas es la carboximetilcelulosa, aunque se han investigado diversas
materias primas. La celobiosa actúa como un inductor efectivo de celulasas, se ha
reportado que la adición de celobiosa + glucosa al sustrato de fermentación, incrementa la
tasa de producción de las endoglucanasas. Otros azúcares utilizados para la inducción de
celulasas son xilosa y sacarosa (R. Kumar et al., 2008), y lactosa para la producción de
CMCasas, FPasas y β-glucosidasas (R. Kumar et al., 2008). Para las xilanasas, está
reportado que la utilización de xilano, azúcares como la sacarosa y la lactosa, fuentes de
carbono orgánicas como el salvado de trigo actúan como inductores para la producción de
estas enzimas.(Alokika & Singh, 2019).
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Th003
1.10.2 Fuente de nitrógeno

La adición de una fuente de nitrógeno al proceso de fermentación estimula la germinación
de los conidios fúngicos, adicionalmente el nitrógeno está involucrado en la producción de
proteínas esenciales para el crecimiento (Raghavarao et al., 2003). El efecto de diferentes
fuentes de nitrógeno como el sulfato de amonio, el nitrato de amonio, cloruro de amonio, y
el nitrato de sodio han sido estudiados. Se ha reportado que el sulfato de amonio permite
una mayor producción de celulasas (R. Kumar et al., 2008). Sin embargo, la incorporación
adicional de una fuente de nitrógeno a la FES incrementa los costos del proceso. Para la
xilanasas, las fuentes de nitrógeno orgánicas como el extracto de levadura, la harina de
soya, la triptona, el extracto de carne y la peptona mejoran la producción de xilanasa; en
ciertos casos, la combinación de dos o más fuentes de nitrógeno en el medio permite una
mayor producción de xilanasa (Alokika & Singh, 2019).
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2. Evaluación de pretratamientos químicos

para la producción de hemicelulasas y
celulasas
2.1 Introducción
El bagazo de caña se obtiene del tallo de la caña después de la extracción de su jugo y
está compuesto por 41-44% de celulosa, 25-27% de hemicelulosa y 20-22% de lignina. En
las fábricas de producción de azúcar el bagazo se usa comúnmente para la generación de
vapor y electricidad utilizando calderas de alta presión (Savou et al., 2019), además en la
industria panelera se utiliza para proporcionar la energía necesaria en ese proceso.
El salvado de trigo es un residuo proveniente de la industria de procesamiento de la harina

de trigo que está compuesto por celulosa (2 - 9%), hemicelulosa (28 - 30%), y lignina (6,5
- 9,9%). Este residuo se utiliza principalmente para alimentación animal por su contenido
de micronutrientes principalmente de hierro, magnesio, manganeso, y vitaminas (B3, B6)
(Debi, Wichert, & Liesegang, 2019).
Estos residuos pueden utilizarse para los procesos de FES de manera natural (sin
pretratar) o pretratada dependiendo del porcentaje en la composición de la lignina. La alta
concentración de lignina en el bagazo de caña (20 -22%) implica la realización de
pretratamientos al sustrato para la modificación de la estructura lignocelulósica y poder
utilizar la hemicelulosa y la celulosa como fuentes de carbono para la producción de
enzimas por parte de Trichoderma koningiopsis Th003 (Maibam & Maiti, 2019). Los
pretratamientos químicos son las técnicas más estudiadas entre los diferentes métodos de
pretratamiento que se han desarrollado y, por lo tanto, se han utilizado ampliamente para
la deslignificación de materiales lignocelulósicos (D. F. Silva, Hergesel, Campioni,
Carvalho, & Oliva-Neto, 2018). Para el pretratamiento del bagazo de caña se han aplicado
una diversidad de tratamientos, sin embargo, los pretratamientos químicos (utilización de
ácidos y álcalis) han sido los más utilizados para la producción de enzimas. Salomão et
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Th003
al., utilizaron bagazo de caña pretratado en dos etapas, primero con una solución de H2SO4
y posteriormente con un solución de NaOH en donde lograron obtener 8,2 U/gss de
CMCasa a partir de T. koningii (Salomão et al., 2019). Por otro lado, Marques et al.,
obtuvieron 0,26 U/gss, 64,56 U/gss y 351,74 U/gss de FPasa, CMCasa y xilanasa
respectivamente de T. viridae a partir de bagazo de caña pretratado con NaOH (Marques
et al., 2018). F. L. da Silva, et al., obtuvieron a partir de bagazo de caña pretratado con
NaOH 2,4 U/gss de FPasa y 172 U/gss de xilanasa con una ccepa de T. reesei (F. L. da
Silva et al., 2020)
Una vez el sustrato ha sido pretratado es más sencillo aprovecharlo para usos como la
producción de diferentes compuestos de interés comercial. Entre ellos, la producción de
enzimas ha mostrado un gran potencial (Maibam & Maiti, 2019), usando especies del
género Trichoderma que pueden crecer y desarrollarse sobre residuos agrícolas.
Por lo anterior, en este capítulo se presentará la evaluación de diferentes métodos de

hidrólisis química (ácido, básico, y mixto) en la transformación del bagazo de caña para la
producción de enzimas hemicelulolíticas y celulolíticas de Trichoderma koningiopsis
Th003.
2.2 Materiales y métodos
2.2.1 Microorganismo y producción del inóculo

El microorganismo utilizado en este estudio fue el hongo Trichoderma koningiopsis Th003,
actualmente conservado en el Banco de trabajo de Agrosavia. Esta cepa es nativa de
Colombia, y se tiene permiso de uso bajo el contrato de acceso a recursos genéticos y
productos derivado No. 168 de 2017.
A partir de un cultivo del hongo, se tomó un disco de agar de la cepa y se transfirió a una
caja Petri con agar avena donde se dejó crecer el hongo durante 7 días. Posteriormente,
se realizó un raspado de los conidios y se agregaron a una solución de tween 80 al 0,01%.
Se ajustó la concentración a 1x106 conidios/mL por recuento en cámara de Neubauer.
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Capítulo 2 27
2.2.2 Sustrato de fermentación

Se utilizó una mezcla de bagazo de caña - salvado de trigo (1:1) y una solución de sacarosa
al 1%. El bagazo de caña fue suministrado por la estación experimental CIMPA de
AGROSAVIA ubicada en Barbosa – Santander. Se aseguró que tuviera un tamaño máximo
de 10 cm para realizar los respectivos experimentos. Se secó en cuarto de secado a 40°C
hasta obtener una humedad <10%, que se determinó mediante una balanza de humedad
Kern© MLS 50-3, y se almacenó en bolsas de plástico herméticas a 4°C hasta su uso. La
sacarosa fue marca comercial Riopaila-Castilla S.A.
2.2.3 Pretratamiento del sustrato

Se probaron tres tratamientos de hidrólisis química para el bagazo de caña: básico con
NaOH, ácido con H2SO4, y mixto con H2SO4 y NaOH (Tabla 3). Teniendo en cuenta que el
salvado de trigo tiene una concentración <10% de lignina, no se le realizó ningún
pretratamiento.
2.2.3.1. Pretratamiento básico
El bagazo de caña se mezcló con una solución de NaOH al 5% en una relación de 1:6 (g
sustrato:mL de solución) y se sometió a 15 PSI durante 30 minutos en autoclave.
Posteriormente, se lavó con agua de la llave hasta obtener un pH = 7,0, se secó a 40 °C
durante 48 horas o hasta obtener una humedad <10% y se almacenó en bolsas herméticas
a 4°C hasta su uso (Asgher, Ahmad, Muhammad, & Iqbal, 2013).
2.2.3.2. Pretratamiento ácido.
El tratamiento ácido consistió en mezclar el bagazo de caña con una solución de H2SO4 al
2,5% (1 g sustrato: 5 mL solución), se llevó a 121°C durante 30 minutos, después se lavó
con agua hasta obtener un pH = 7, se secó a 40°C durante 48 horas o hasta obtener una
humedad <10% y se almacenó en bolsas herméticas a 4°C hasta su uso (Unrean & Ketsub,
2018).
2.2.3.3. Pretratamiento mixto.
El tratamiento mixto se realizó con una solución de H2SO4 al 1% a una relación de 1:2 (g
de sustrato: mL de solución), se llevó a 15 PSI durante 30 minutos en autoclave, se lavó
con agua hasta obtener un pH = 7 y se retiró el exceso de agua. Posteriormente, el bagazo
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Th003
se mezcló con una solución de NaOH al 4% en una relación 1:5 (g sustrato: mL de

solución), se llevó a 121°C durante 30 minutos. Se lavó con agua hasta ajustar el pH 7.0,
se secó a 40°C durante 48 horas o hasta obtener una humedad <10% y se almacenó en
bolsas herméticas a 4°C hasta su uso (Rocha, Maeda, Santa Anna, & Pereira, 2013).
Tabla 4. Pretratamientos químicos empleados para el bagazo.
Relación g sustrato/
Tto Sustrato Solución Condiciones
mL solución
Bagazo de
Control - -
caña
Bagazo de 15 psi durante

Básico NaOH 5% 1:6
caña 30 min.
Bagazo de 15 psi durante

Ácido H2SO4 2.5% 1:5
caña 30min.
1% H2SO4 + 15
psi durante 1:2
Bagazo de H2SO4 1% +
Mixto 30min + NaOH
caña NaOH 4% 1:5
al 4% a 15 psi
durante 30min.
2.2.4 FES
Se realizaron fermentaciones en estado sólido por triplicado en bandejas de aluminio de
18 cm x 10 cm, las cuales contenían el bagazo previamente pretratado con salvado de
trigo en una relación 1:1 y una solución de sacarosa al 1%. Se utilizó una relación 1:3 (g
de sustrato/mL de agua) de agua. Las bandejas con el sustrato fueron esterilizadas en
autoclave a 15 psi durante 30 minutos. Se inocularon las bandejas con una relación 1,05:1
(mL de inóculo/g de sustrato), se sellaron con una película plástica, y se incubaron en un
cuarto de fermentación por nueve días a 28°C ± 2, con una humedad relativa del 80-90%.
Como variable de respuesta de cada uno de los tratamientos se determinaron las

actividades enzimáticas (FPasa, CMCasa y xilanasa) a los 0, 3, 5, 7 y 9 días de
fermentación haciendo muestreos destructivos con el fin de establecer el tratamiento y el
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Capítulo 2 29
tiempo que favorece la producción de estas enzimas. Se tuvo como control la fermentación
del hongo sobre bagazo de caña sin pretratar.
2.2.5 Obtención del extracto enzimático

Se tomó una muestra compuesta de 10 g de diferentes puntos de la bandeja de cada uno
de los tratamientos a los días 0, 3, 5, 7 y 9 de fermentación, se les adicionó una solución
de Tween 80 (0,1%) (1:2 (g/mL)) y se agitó durante un minuto en vortex. Se dejó reposar
durante una hora a 4°C. El material suspendido y la biomasa fueron separadas por
centrifugación a 8000 rpm durante 15 min y se filtraron al vacío con papel filtro Whatman
#1. Al sobrenadante obtenido se le realizaron las pruebas de actividad enzimática.
2.2.6 Métodos analíticos

Todas las actividades enzimáticas se expresaron como Unidades de actividad
enzimática/gramo de sustrato seco (U/gss). Una unidad de actividad enzimática (U) es
definida como la cantidad de extracto enzimático capaz de liberar 1 mmol de azúcar
(glucosa/xilosa) por minuto bajo las condiciones de reacción.
2.2.6.1. Actividad FPasa
La actividad FPasa (celulasas totales) se evaluó utilizando filtros Whatmann #1 como

sustrato, de acuerdo con la metodología descrita por Ghose (1987) y Pachauri, et al (2017).
La reacción enzimática se realizó en microtubos Eppendorf®. La mezcla del ensayo
contenía 500 µL de extracto enzimático, 1,0 mL de solución tampón citrato de sodio 0,05
M (pH:4,8) y papel filtro Whatmann #1 (6 cm x 1 cm). El blanco consistió en 1,5 mL de
solución tampón citrato de sodio 0,05 M (pH:4,8). El control enzimático consistió en la
mezcla de 500 µL de extracto enzimático y 1,0 mL de solución tampón citrato de sodio 0,05
M (pH:4,8) (sin sustrato) y el control del sustrato consistió en la mezcla de 1,5 mL de
solución tampón citrato de sodio 0,05 M (pH:4,8) y papel filtro Whatmann #1 (6 cm x 1 cm).
Se homogenizaron las muestras y controles en shaker y se incubaron durante 30 minutos
a 50°C y al finalizar el tiempo se detuvo la reacción en hielo. Se tomaron 250 µL de cada
muestra y se transfirieron a tubos de ensayo 15x100mm, se mezclaron con 250 µL de
ácido dinitrosalicílico (DNS), se llevó a ebullición durante 5 minutos y se frenó la reacción
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Th003
en hielo. Se leyó la absorbancia en espectrofotómetro a 540 nm (Pachauri, Chakradhari, &

Veeramani, 2017). La glucosa liberada se determinó comparando la absorbancia con la
curva de calibración que se realizó usando como estándar una solución de glucosa (Anexo
A).
2.2.6.2. Actividad CMCasa
La actividad endo β 1-4 glucanasa o CMCasa, se evaluó utilizando como sustrato una
solución de carboximetil celulosa (CMC) al 1% en buffer citrato de sodio 0,05M, de acuerdo
con la metodología estándar descrita por Ghose (1987) y Pachauria, et al (2017). La
reacción enzimática se realizó en microtubos Eppendorf®. La mezcla del ensayo contenía
1 mL del extracto enzimático y 1 mL de la solución de CMC. El blanco consistió en 2 mL
de solución tampón citrato de sodio 0,05 M (pH:4,8). El control enzimático consistió en la
mezcla de 1 mL de extracto enzimático y 1 mL de solución tampón citrato de sodio 0,05 M
(pH:4,8) (sin sustrato) y el control del sustrato consistió en la mezcla de 1 mL de solución
tampón citrato de sodio 0,05 M (pH:4,8) y 1 mL de la solución de CMC 1% (sin extracto
enzimático). Se incubaron las muestras y los controles durante 30 minutos a 50°C y se
detuvo la reacción en hielo. Posteriormente, se tomaron 250 µL de la muestra y se
transfirieron a tubos de ensayo 15x100mm, se mezclaron con 250 µL de DNS, se llevó a
ebullición durante 5 minutos y se frenó la reacción en hielo. Se leyó la absorbancia en
espectrofotómetro a 540 nm (Pachauri et al., 2017). La glucosa liberada se determinó
comparando la absorbancia con la curva de calibración que se realizó usando como
estándar una solución de glucosa (Anexo A)
2.2.6.3. Actividad xilanasa
La actividad xilanasa se evaluó utilizando una solución de xilano de beechwood

(Megazyme® Purified, 10g; P-XYLNBE-10G) al 2% en buffer citrato de sodio 0,05M como
sustrato. La mezcla del ensayo contenía 500 µL del extracto enzimático y 500 µL de la
solución de xilano al 2%. El blanco consistió en 1 mL de solución tampón citrato de sodio
0,05 M (pH:4,8). El control enzimático consistió en la mezcla de 500 µL del extracto
enzimático y 500 µL de solución tampón citrato de sodio 0,05 M (pH: 4,8). El control del
sustrato consistió en 500 µL de solución tampón citrato de sodio 0,05 M (pH: 4,8) y 500 µL
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Capítulo 2 31
de la solución de xilano al 2%. Las muestras y controles se incubaron a 50°C durante 60

minutos y se frenaron las reacciones en hielo. Se tomaron 250 µL de la muestra y se
mezclaron con 250 µL de DNS, se llevó a ebullición durante 5 minutos y se frenó la reacción
en hielo. Se leyó la absorbancia en espectrofotómetro a 540 nm. La xilosa liberada se
determinó comparando la absorbancia con la curva de calibración que se realizó usando
como estándar una solución de xilosa (Ezeilo, Lee, Huyop, Zakaria, & Wahab, 2019)
(Anexo B)
2.2.6.4. Humedad
La humedad se determinó usando una balanza de humedad Kern® MLS 50-3, para esto
se tomó un g de sustrato de las bandejas correspondientes a los días 0, 3, 5 y 7 de
fermentación y se secó hasta peso constante. Con el dato de humedad se determinaron
los gramos de sustrato seco (gss) usando la ecuación que se describe a continuación:
Ecuación 1.
(𝑔 𝑑𝑒 𝑠𝑢𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜 ℎú𝑚𝑒𝑑𝑜 ∗ % 𝑑𝑒 ℎ𝑢𝑚𝑒𝑑𝑎𝑑)
𝑔𝑠𝑠 = [𝑔 𝑑𝑒 𝑠𝑢𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜 ℎú𝑚𝑒𝑑𝑜 −
100
2.2.7 Determinación de la composición química del bagazo de

caña y su fracción celulósica
Los componentes químicos del bagazo de caña sin pretratar y con pretratamiento básico
(celulosa, hemicelulosa y lignina) fueron determinados de acuerdo con el método AOAC
973.18 de 2016 por el laboratorio de nutrición animal de AGROSAVIA. Los análisis
químicos descritos se realizaron por duplicado y los valores se expresaron en g/100g (%).
2.2.8 Diseño estadístico

Los experimentos se realizaron por triplicado y los datos se presentan como el promedio ±
DS (Desviación estándar). Las diferencias estadísticamente significativas fueron
determinadas realizando un análisis de varianza (ANOVA) con un p<0,05 utilizando un
modelo lineal generalizado con la prueba de comparaciones de Tukey con el software
Minitab (versión 18.0, Minitab Inc, Pennsylvania, EE. UU).
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Th003
2.3 Resultados y discusión
2.3.1 Producción de enzimas hemicelulolíticas y celulolíticas a

partir de bagazo de caña pretratado con diferentes métodos
de hidrólisis química.
Para evaluar el efecto de los tres pretratamientos sobre el bagazo de caña, se llevó a cabo
la cinética de producción enzimática durante los 9 días de fermentación en estado sólido
con T. koningiopsis Th003 para las enzimas FPasa (Figura 2), CMCasa (Figura 3) y
xilanasa (Figura 4).
2,0
Sin tratamiento
Unidades de actividad FPasa (U/gss)
1,8 H2SO4 + NaOH

H2SO4
NaOH
1,6
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
1 3 5 7 9
Tiempo (Día)
Figura 2. Actividad FPasa durante 9 días de fermentación bajo diferentes pretratamientos.
Como se muestra en la Figura 2, todos los pretratamientos tuvieron una mayor actividad
FPasa (excepto al dia 3) en comparación con las fermentaciones realizadas con bagazo
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Capítulo 2 33
de caña sin pretratar, adicionalmente tanto el pretratamiento con NaOH como el

pretratamiento con H2SO4 + NaOH tienen un comportamiento creciente en el tiempo,
mientras que el pretratamiento ácido se mantiene constante después del día 7. Con el
sustrato de caña sin pretatar no se observa una tendencia definida. Se observa que las
máximas actividades encontradas en cada uno de los pretratamientos presentaron
diferencias estadísticamente significativas (p=0,000). La máxima actividad FPasa se da al
día 7 de fermentación utilizando sustrato pretratado con H2SO4 (1,622 ± 0,29 U/gss) y se
mantiene constante hasta el día 9 (1,55 ± 0,34 U/gss). La segunda mayor actividad se da
con pretratamiento con NaOH al día 9 (0,95 ± 0,06 U/gss). La actividad con sustrato sin
tratamiento logra un máximo de 0,84 ± 0,03 U/gss al día 3 de fermentación, un 51,7%
menos en comparación con el obtenido en el pretratamiento ácido (día 7). Para el
pretratamiento H2SO4 + NaOH se obtuvo la mejor producción a los 9 días, obteniendo 0,59
± 0,02 U/gss de actividad FPasa.
La evaluación de la actividad CMCasa se presenta en la Figura 3, en donde se observa

que todos los pretratamientos tuvieron una mayor actividad CMCasa (excepto al día 5) en
comparación con las fermentaciones realizadas con el bagazo de caña sin pretratar. Las
actividades correspondientes a los pretratamientos con H2SO4 y con H2SO4 + NaOH tienen
una tendencia creciente, mientras que con el pretratamiento con NaOH y sin pretatar
disminuye a partir del día 7 de fermentación. La máxima actividad se encuentra al día 7 de
fermentación con pretratamiento ácido, la cual no presentó diferencias significativas
(p=0,070) desde el día 5 hasta el final de la fermentación (2,49 ± 0,10 U/gss). Las máximas
actividades encontradas para cada uno de los pretratamientos presentaron diferencias
estadísticamente significativas (p=0,000).
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Th003
3,0
Sin tratamiento
Unidades de actividad CMCase (U/gss)
H2SO4 + NaOH
H2SO4
2,5
NaOH
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
1 3 5 7 9
Tiempo (Día)
Figura 3. Actividad CMCasa durante 9 días de fermentación usando bagazo pretratado
con diferentes tratamientos.
El pretratamiento ácido produjo una mayor producción de enzimas FPasa y CMCasa en

comparación a los otros pretratamientos evaluados. La hidrólisis ácida del bagazo
solubiliza la mayoría de la hemicelulosa y permite que la fracción celulósica restante
induzca la producción de enzimas celulolíticas facilitando su accesibilidad a la matriz de
celulosa y lignina restante en la biomasa (Ladeira-Ázar, Morgan, Maitan-Alfenas, &
Guimarães, 2019). Sin embargo, varias desventajas se han relacionado con su utilización,
ya que se ha demostrado que durante el pretratamiento se da la formación de
componentes tóxicos como furfural, hidroxil-metilfurfural, ácido acético, ácido fórmico,
ácido levulínico, que afectan directamente el crecimiento del hongo (Salihu, Abbas, Sallau,
& Alam, 2015). En contraste, la actividad CMCasa se empieza a producir al tercer día de
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Capítulo 2 35
fermentación, esto puede ser debido al hecho de que está reportado que varias especies
del género Trichoderma presentan endoglucanasas (CMCasa) constitutivas localizadas en
la membrana plasmática las cuales pudieron ser liberadas (Gutiérrez-Rojas, Moreno-
Sarmiento, & Montoya, 2015), pudiendo ser las responsables de la actividad temprana.
Figura 4. Actividad xilanasa durante 9 días de fermentación bajo diferentes pretratamientos.
La Figura 4 muestra la actividad xilanasa. Se puede observar que al igual que con la
actividad FPasa y CMCasa, todos los experimentos con el sustrato pretratado tuvieron
mayor actividad xilanasa (excepto al dia 5 con H2SO4 y H2SO4 + NaOH y al día 3 con
H2SO4) en comparación con las fermentaciones con bagazo de caña sin pretratar. Se
observa que tanto el pretratamiento con NaOH, como sin pretratar tienen una tendencia
creciente hasta el día 5, después de este día la actividad comienza a disminuir; por otro
lado, el pretratamiento ácido tiene una tendencia creciente hasta el día 7, mientras que el
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Th003
pretratamiento H2SO4 + NaOH no tiene una tendencia definida. Se obtuvo la máxima

actividad (579,94 ± 5,3 U/gss) con el bagazo pretratado con NaOH al día 5 de fermentación
y después disminuyó un 29,0% (411,70 ± 1,5 U/gss). Para el pretratamiento con H2SO4 +
NaOH se obtuvo la máxima actividad al día 3 (442,67 ± 3,6 U/gss), siendo este valor un
31% menor que el obtenido con el pretratamiento de NaOH. El bagazo sin pretratamiento
tiene su máxima actividad al día 5 (348,46 ± 1,09 U/gss), sin embargo, este representa un
66,4% menos de actividad en comparación con el máximo obtenido con NaOH. Las
máximas actividades encontradas para cada uno de los pretratamientos presentaron
diferencias estadísticamente significativas (p=0,000).
Con base en los resultados obtenidos, el pretratamiento alcalino (NaOH 5%) es el método
químico más efectivo para la producción de enzimas xilanasas y el segundo mejor para la
producción de celulasas (FPasa y CMCasa), puesto que este método ayuda en la
precipitación de la lignina presente en la biomasa lignocelulósica, lo que conduce a la
ruptura de los enlaces éster que unen la lignina y el xilano, y en efecto ayuda a aumentar
la porosidad de la biomasa y al aumento de la superficie interna dejando casi intacta la
hemicelulosa (Salihu et al., 2015); por lo tanto, los polisacáridos restantes (celulosa y
hemicelulosa) actúan como fuente de carbono y energía para el hongo ya que son más
susceptibles a la hidrólisis enzimática principalmente de las enzimas celulasas y
hemicelulasas (Philippini, Martiniano, Chandel, de Carvalho, & da Silva, 2019). Se ha
demostrado que el xilano y sus derivados (xilooligosacáridos) son fuertes inhibidores de
las enzimas celulolíticas (H. Li et al., 2019), de esta manera la hidrólisis de la celulosa
aumenta a medida que el hongo consume la xilosa y los xilooligosacáridos producidos
durante la hidrólisis del xilano (Huang et al., 2018).
Teniendo en cuenta los resultados obtenidos se decidió usar como sustrato de

fermentación para la producción de enzimas hemicelulolíticas y celulolíticas de T.
koningiopsis Th003 una mezcla de bagazo de caña pretratado con NaOH 5% + salvado de
trigo en una relación 1:1 y solución de sacarosa al 1%. Ya que, 1) este hongo, tiene más
potencial para la producción de enzimas xilanasas que celulasas; está reportado que
hongos del género Trichoderma tienen una alta actividad FPasa y CMCasa; T. koningii es
capaz de producir 120,15 U/gss de FPasa y 253,67 U/gss de CMCasa (Pachauri et al.,
2017). T. viridae produce 0,26 U/gss y 64,54 U/gss de FPasa y CMCasa respectivamente
(Marques et al., 2018) y T. reesei tiene una actividad de 6,71 U/gss de FPasa y 20,7 U/gss.
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Capítulo 2 37
Mientras que con T. koningiopsis Th003 se obtuvo 1,622 ± 0,29 U/gss de FPasa y 2,49 ±
0,10 U/gss de CMCasa; 2) teniendo en cuenta que el extracto enzimático producido va a
ser usado para el ensilaje de la avena forrajera y en ella la hemicelulosa es el componente
en mayor proporción (36,91%) (Tabla 5), por lo tanto, las xilanasas producidas hidrolizarían
este componente liberando más azúcares disponibles como xilosa, manosa, galactosa,
entre otros, para la producción de ácido láctico durante el proceso del ensilaje por las BAL;
3) como se mencionó anteriormente, el xilano y sus derivados son fuertes inhibidores de
la hidrólisis de la celulosa por lo tanto, al encontrar xilano, xilooligosacáridos o xilosa en el
sustrato de fermentación, se va a inhibir la producción de enzimas celulasas por parte de
T. koningiopsis Th003 y 4) los bovinos pueden aprovechar directamente la celulosa del
ensilaje ya que dentro de sus sistemas digestivos tienen microorganismos nativos
productores de enzimas celulolíticas.
Tabla 5. Composicion del forraje de avena.

Componente %
Lignina 8,31
Hemicelulosa 36,91
Celulosa 22,09
Almidón 15,2
2.3.2. Determinación de la composición química de los residuos

agroindustriales usados como medio de fermentación.
Una vez definido el sustrato de fermentación para FES, el cual corresponde a bagazo de
caña pretratado con NaOH 5% + salvado de trigo (1:1) y solución de sacarosa al 1%, se
realizó el análisis de la composición química del bagazo de caña antes y después del
pretratamiento con NaOH, del salvado de trigo y del sustrato después de la fermentación
con el hongo, los resultados se presentan en la Tabla 6.
Tabla 6. Composición química de la fracción celulósica del bagazo antes y después del
tratamiento alcalino y del salvado de trigo
Composición química
Tratamiento Celulosa Hemicelulosa Lignina
%
Bagazo Sin pretratar 38,02 ± 1,37 22,77 ± 5,06 9,42 ± 0,12
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Th003
Bagazo pretratado con NaOH

72,015 ± 0,67 10,77 ± 1,30 4,89 ± 0,53
5%
Salvado de trigo 11,33 28,85 5,52
Sustrato FES* 41,6 19,81 5,20
Sustrato después de
49,41 17,41 11,48
fermentación
*La composición del sustrato FES fue calculada de acuerdo con la composición del bagazo pretratado con
NaOH 5% y el salvado de trigo, teniendo en cuenta la relación en la que se encuentran en el sustrato (1:1)
Como primera medida, se puede observar que la composición determinada para las dos
materias primas empleadas están dentro de los rangos reportados para materiales
lignocelulósicos: 10 - 20% de lignina, 20 - 35% de hemicelulosa y 35 - 50% de celulosa
para el bagazo de caña (T. A. L. Silva et al., 2018), y 2.2 - 9,0% de lignina, 20 - 35% de
hemicelulosa y 6,5 - 9,9% de celulosa para el salvado de trigo (Prückler et al., 2014).
En la tabla 6 se observa como el pretratamiento alcalino causa una reducción de la lignina,

la hemicelulosa y otros compuestos del bagazo, lo que a su vez genera una concentración
de la celulosa. Esto se debe a que, como se mencionó anteriormente, el tratamiento
alcalino elimina eficazmente la lignina de la biomasa. Adicionalmente, la composición del
sustrato después de la FES muestra como el metabolismo del hongo usa la hemicelulosa
como fuente de carbono primaria disminuyendo su composición, además probablemente
los puentes de hidrógeno entre las cadenas de glucano que unen la celulosa se rompen
parcialmente haciendo que la celulosa sea más accesible (de Oliveira Gorgulho Silva &
Filho, 2017).
El sustrato usado para la fermentación sólida contiene mayoritariamente celulosa

proveniente principalmente del bagazo de caña, mientras que el salvado de trigo aporta
mas hemicelulosa. Aunque se esperaría que, al tener más celulosa disponible, las enzimas
producidas mayormente fueran celulasas, esto no ocurrió. Varios artículos que usan otras
cepas de T. koningiopsis también reportan este tipo de comportamiento, por ejemplo,
Nutongkaew et al; obtuvieron 56,46 U/gss de xilanasa y 2,13 U/gss de FPasa
respectivamente a partir de tronco de palma aceitera, el cual contenía 36,60% ± 1.17 de
celulosa y 16,80% ± 1 de hemicelulosa (Nutongkaew, Prasertsan, Leamdum,
Sattayasamitsathit, & Noparat, 2020). Esto podría deberse al hecho de que el regulador
ACEII (regulador positivo de la transcripción de genes que codifican para la producción de
celulasas), también afecta la regulación de las xilanasas (Singh, Devi, Jaryal, & Rani,
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Capítulo 2 39
2018). Por lo tanto, la presencia de celulosa en el medio de fermentación no solo induce

la producción de enzimas celulolíticas, sino también actúa como inductor en la producción
de xilanasas.
2.4. Conclusiones parciales

En general, todos los pretratamientos obtuvieron mayor actividad FPasa, CMCasa y
xilanasa, en comparación con las fermentaciones realizadas con bagazo de caña sin
pretratar.
La utilización del pretratamiento ácido permitió una mayor actividad FPasa y CMCasa,
mientras que el pretratamiento alcalino permitió una mayor actividad xilanasa.
Se seleccionó el pretratamiento alcalino del bagazo de caña para realizar las

fermentaciones para las siguientes etapas del proyecto debido al gran potencial para la
producción de enzimas xilanasas en comparación con la actividad celulasa.
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3. Selección de parámetros físicos,

biológicos y nutricionales para la
producción de enzimas hemicelulolíticas y
celulolíticas de T. koningiopsis Th003
3.1 Introducción
La producción de hemicelulasas y celulasas mediante un proceso de fermentación en
estado sólido está influenciada por parámetros tanto biológicos (tamaño y concentración
del inóculo) como fisicoquímicos (temperatura) y nutricionales (fuente de nitrógeno y
carbono) (Alokika & Singh, 2019). Estos varían de un proceso a otro dependiendo del tipo
de sustrato, el microorganismo utilizado y la escala del proceso (Krishna, 2005).
Uno de los factores biológicos más importantes, además de la selección del

microorganismo, es el tipo de inóculo y su concentración (Krishna, 2005). Se han reportado
ventajas en el uso de esporas fúngicas en lugar de células vegetativas para el inóculo
iniciador. Las esporas a diferencia del micelio vegetativo, sirven como catalizador en las
reacciones de bioconversión, ya que a menudo pueden llevar a cabo las mismas
reacciones que el micelio, adicionalmente las esporas en general poseen mayor
resistencia a las condiciones medioambientales, lo que permite mayores tiempos de
almacenamiento en caso de ser necesario (Krishna, 2005). Sin embargo, tienen una fase
de adaptación más larga la cual requiere de condiciones óptimas para su germinación y
un mayor requisito de tamaño y concentración de inóculo (Krishna, 2005). A pesar de ello,
una suspensión de esporas con una concentración aproximadamente de 1x106
esporas/mL a menudo se utiliza como inóculo iniciador en los procesos de FES (Yoon,
Ang, Ngoh, & Chua, 2014).
Entre los parámetros fisicoquímicos, la temperatura es una de las variables importantes

para tener en cuenta en los procesos de FES, pues el crecimiento microbiano en
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Th003
condiciones aeróbicas produce la liberación de calor metabólico. Por ello, temperaturas

extremas pueden desnaturalizar las enzimas producidas, así como también pueden
ocasionar otros efectos negativos sobre el crecimiento del microorganismo y la producción
de metabolitos. La mayoría de los estudios realizados se han centrado en encontrar la
temperatura óptima de crecimiento de hongos para la producción de enzimas, además esa
caracterización puede usarse para predecir los efectos de los cambios de temperatura en
la productividad enzimática (Farinas, 2015). Por ejemplo, Pachauri et al., encontraron que
el hongo T. koningii tiene una temperatura óptima para la producción de celulasas y
hemicelulasas de 35°C (Pachauri et al., 2017). Sin embargo, la temperatura óptima puede
variar entre especies del mismo género.
Por otro lado, diferentes nutrientes pueden regular el crecimiento de los microorganismos.
Estos nutrientes incluyen fuentes de carbono, nitrógeno, minerales, vitaminas y cofactores.
La fuente de carbono representa la fuente de energía, la cual debe estar disponible para
el crecimiento y desarrollo de los microorganismos. Esta puede ser un monosacárido
simple como la glucosa, xilosa, lactosa, entre otras, o fuentes de carbono más complejas
como la celulosa y hemicelulosa presentes en la biomasa lignocelulósica (Krishna, 2005).
La biomasa lignocelulósica como sustrato actúa como una fuente de carbono esencial con
un importante rol para la inducción de enzimas. Sin embargo, la producción de biomasa
microbiana y de enzimas (hemi) celulolíticas puede ser estimulada por la presencia de una
fuente de nitrógeno en el medio de fermentación. Fuentes de nitrógeno como sulfato de
amonio, nitrato de amonio, cloruro de amonio, nitrato de sodio, peptonas, extracto de
levadura han sido las más estudiadas para la producción de enzimas (hemi) celulolíticas
(R. Kumar et al., 2008).
En este capítulo se estudió el efecto de la temperatura de incubación, de la concentración

de inóculo y de la selección de una fuente de nitrógeno en la producción de las enzimas
CMCasa, FPasa y xilanasas, usando como sustrato base bagazo de caña pretratado con
NaOH + salvado de trigo (1:1) y solución de sacarosa 1%.
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Capítulo 3 43
3.2 Materiales y métodos

A partir de un cultivo del hongo, se tomó un disco de agar de la cepa y se transfirió a una
caja Petri con agar avena. Se dejó crecer el hongo durante 7 días a 28°C. Posteriormente,
se realizó un raspado de los conidios y se agregaron a una solución de tween 80 al 0,01%.
Luego, dependiendo del experimento a realizar se ajustó la concentración por recuento en
cámara de Neubauer.
3.2.2 Efecto de la concentración de inóculo de T. koningiopsis

Th003 y la temperatura sobre la producción de enzimas
hemicelulolíticas y celulolíticas.
Se realizaron experimentos del tipo un factor a la vez iniciando con la variable
concentración de inóculo, con tres posibles concentraciones (Tabla 7). Una vez se obtuvo
la concentración que favorece la producción de enzimas se evaluó la temperatura usando
dos valores (Tabla 8). Para estos experimentos el sustrato utilizado fue una mezcla de
bagazo de caña pretratado con NaOH 5% - salvado de trigo (1:1) y solución de sacarosa
al 1%.
Los ensayos se realizaron por triplicado en bandejas de aluminio de 13 cm x 11 cm x 5 cm,

las cuales contenían 40 gramos del sustrato con una relación 1:3 (g sustrato/mLde agua).
Las bandejas con el sustrato fueron esterilizadas en autoclave a 15 psi durante 30 minutos.
Se inocularon las bandejas a una relación 1,05:1 (mL de inóculo/g de sustrato)
posteriormente se sellaron con una película plástica y se incubaron en cuarto de
fermentación con una humedad relativa del 80-85%, haciendo muestreo destructivo a los
0, 3, 5, 7, 9 y 11 días de fermentación para la concentración de inóculo, y a los 0, 3, 5, 7 y
9 para los ensayos de temperatura.
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Th003
Tabla 7. Tratamientos para evaluar el efecto de la concentración de inóculo de T.

koningiopsis Th003
Temperatura de
Concentración de inóculo
Tratamiento incubación
(conidios/mL)
(°C)
T1 1𝑥104 28
T2 1𝑥105 28
T3 1𝑥106 28
Tabla 8. Tratamientos para evaluar el efecto de temperatura de incubación de T.

koningiopsis Th003
Concentración de
Temperatura de incubación
Tratamiento inóculo
(°C)
(conidios/mL)
T1 28 1𝑥106
T2 38 1𝑥106
3.2.3 Selección de la fuente de nitrógeno y de la relación

bagazo/salvado para la producción de enzimas
Para la selección de la fuente de nitrógeno y la relación bagazo/salvado, se realizaron dos
diseños factoriales completos con 4 repeticiones en el punto central para un total de 8
tratamientos por factorial (16 tratamientos en total): uno con fuente de nitrógeno orgánica
(Tabla 9) y el otro con fuente de nitrógeno inorgánica (Tabla 10). Para cada uno de los
diseños se evaluaron dos relaciones de bagazo pretratado con NaOH 5% y salvado de
trigo, y dos concentraciones de cada fuente de nitrógeno. El diseño de los experimentos
se muestra en la Tabla 11. Adicionalmente, se realizó una fermentación sin ninguna fuente
de nitrógeno adicionada como control.
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Capítulo 3 45
Las fermentaciones se realizaron por triplicado en bandejas de aluminio de 13 cm x 11 cm

x 5 cm, las cuales contenían el bagazo previamente tratado + salvado de trigo y solución
de sacarosa al 1% con una relación 1:3 (g/mL) de agua. Las bandejas con el sustrato
fueron esterilizadas en autoclave a 15 psi durante 30 minutos. Se inocularon las bandejas
a una relación 1,05:1 (mL de inóculo/g de sustrato), se sellaron con una película plástica,
y se incubaron en cuarto de fermentación por 7 días a 28°C ± 2 con una humedad relativa
del 80-90%., haciendo muestreo destructivo a los 0, 3, 5, y 7 días de fermentación.
Tabla 9. Factorial con fuente de nitrógeno orgánica
FACTOR 1 -1
Relación bagazo/salvado (g/g) 1:1 3:1
Extracto de levadura Tecnas ®(g/L) 10 4
Tabla 10. Factorial con fuente de nitrógeno inorgánica
FACTOR 1 -1
Relación bagazo/salvado (g/g) 1:1 3:1
Sulfato de amonio (g/L) 10 4
Tabla 11. Diseño de tratamientos para la selección de la fuente de nitrógeno y la

relación bagazo/salvado para cada uno de los diseños factoriales.
RELACIÓN FUENTE DE
TRATAMIENTO
BAGAZO/SALVADO NITRÓGENO (g/L)
T1 (1:1) 10
T2 (1:1) 4
T3 (3:1) 10
T4 (3:1) 4
T5 (x4) (2:1) 7
3.2.4 Obtención del extracto enzimático

Se siguió el mismo procedimiento descrito en el numeral 2.2.5, sin embargo, la obtención
del extracto se realizó hasta el día 7 de fermentación.
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Th003
3.2.5 Métodos analíticos

Se siguió el mismo procedimiento descrito en el numeral 2.2.6 para la determinación de la
actividad FPasa, CMCasa, xilanasa y la humedad. Sin embargo, para las actividades
enzimáticas se redujo el volumen de los reactivos a la mitad y las lecturas se realizaron en
lector de ELISA a 540 nm (Anexo C).
3.2.6 Tratamiento estadístico

▪ Temperatura y concentración de inóculo
DE (desviación estándar). Las diferencias estadísticamente significativas fueron
determinadas realizando un análisis de varianza (ANOVA) con un p<0,05 utilizando un
modelo lineal generalizado con la prueba de comparaciones de Tukey con el software
Minitab (versión 18.0, Minitab Inc, Pennsylvania, EE. UU).
▪ Diseños factoriales
DS (desviación estándar). Se realizó un análisis de regresión basado en los datos
experimentales y se ajustó a un modelo polinómico de primer orden como se muestra a
continuación en la ecuación 2 con un p<0,07 utilizando el software Minitab (versión 18.0,
Minitab Inc, Pennsylvania, EE. UU). Para demostrar la normalidad de datos se usó la
prueba de Shapiro Wilk, para la igualdad de varianzas (homocedasticidad) se utilizó la
prueba de Bartlett levene
Ecuación 2:
𝒀 = 𝜷𝟎 + ∑ 𝜷𝟏 𝑿𝟏
Donde Y representa la variable de respuesta (actividad enzimática), β0 indica la

intercepción, β1 el coeficiente lineal y X1 el nivel de la variable independiente.
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Capítulo 3 47
3.3.1 Influencia de la concentración de inóculo.

En la Figura 5 se presentan los resultados del efecto de la concentración del inóculo sobre
la producción de FPasa. Se observa que no existen diferencias significativas (p= 0,906)
entre las máximas actividades de FPasa alcanzadas con el sustrato inoculado con
1𝑥105 𝑐𝑜𝑛𝑖𝑑𝑖𝑜𝑠/𝑚𝐿 en el día 7 (1,38 ± 0,13 U/gss) y el inoculado con 1𝑥106 𝑐𝑜𝑛𝑖𝑑𝑖𝑜𝑠/𝑚𝐿
en el día 9 (1,40 ± 0,26 U/gss). Sin embargo, con la primera concentración se logra una
mayor productividad (0,1968 U/gss/día) ya que la maxima actividad se logra en menor
tiempo. Con la concentración de inóculo de 1𝑥104 𝑐𝑜𝑛𝑖𝑑𝑖𝑜𝑠/𝑚𝐿 se logra la máxima
actividad en el día 9 (0,969 ± 0,08 U/gss; no obstante, esta es un 42,4% menor a la
obtenida con las otras concentraciones.
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Th003
1,8
10E4
Unidades de Actividad FPase (U/gss)
1,6 10E5
10E6
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
1 3 5 7 9 11
Tiempo (Día)
Figura 5. Influencia de la concentración de inóculo en la producción de FPasa de T.
koningiopsis Th003
La máxima actividad CMCasa (figura 6) y xilanasa (figura 7) se da con la mayor

concentración de inoculación al día 9 de fermentación (4,81 ± 0,10 U/gss) y (964,04 ± 6,83
U/gss), respectivamente. Con esta concentración se obtuvo un 24,2% más de actividad
CMCasa en comparación con la concentración 1𝑥104 𝑐𝑜𝑛𝑖𝑑𝑖𝑜𝑠/𝑚𝐿 (3,87 ± 0,08 U/gss) y
un 87,8% más en comparación a la concentración 1𝑥105 𝑐𝑜𝑛𝑖𝑑𝑖𝑜𝑠/𝑚𝐿 (2,56 ± 0,1U/gss).
Por otro lado, se obtuvo un 94,7% y 210,5% más de actividad xilanasa en comparación
con las concentraciones de 1𝑥104 𝑐𝑜𝑛𝑖𝑑𝑖𝑜𝑠/𝑚𝐿 (494,98 ± 10,45 U/gss) y de
1𝑥105 𝑐𝑜𝑛𝑖𝑑𝑖𝑜𝑠/𝑚𝐿 (310,46 ± 1,44 U/gss) respectivamente.
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Capítulo 3 49
Con los anteriores resultados se encuentra que la suspensión de conidios con una
concentración de 1𝑥106 𝑐𝑜𝑛𝑖𝑑𝑖𝑜𝑠/𝑚𝐿 es la concentración adecuada como inóculo iniciador
para la producción principalmente de enzimas xilanasas.
5,0
10E4
Unidades de Actividad CMCasa (U/gss)
4,5
10E5
10E6
4,0
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
1 3 5 7 9 11
Tiempo (Día)
Figura 6. Influencia de la concentración de inóculo en la producción de enzima CMCasa
de T. koningiopsis Th003
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Th003
1000
10E4
Unidades de Actividad Xilanasa (U/gss)
900 10E5
10E6
800
700
600
500
400
300
200
100
0
1 3 5 7 9 11
Tiempo (Día)
Figura 7. Influencia de la concentración de inóculo en la producción de xilanasas de T.
koningiopsis Th003
Es importante que se utilice una adecuada concentración de inóculo cuando se cultivan

hongos para la producción de enzimas en FES. Una concentración de inóculo muy baja
podría tomar un tiempo más largo para que el hongo colonice el sustrato. En consecuencia,
se aumentaría el riesgo de contaminación donde otros hongos, o incluso bacterias de
rápido crecimiento puedan colonizar el sustrato afectando el proceso (Yoon et al., 2014).
Un mayor tamaño de inóculo no solo da como resultado una mayor producción de xilanasa
debido a una mayor degradación del sustrato y una mayor disponibilidad de nutrientes,
sino que también minimiza el período de latencia para el crecimiento de hongos (Ezeilo,
Lee, Huyop, Zakaria, & Wahab, 2019).
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Capítulo 3 51
3.3.2 Efecto de la temperatura de incubación

La Figura 8 presenta los resultados del efecto de las dos temperaturas estudiadas (28°C
y 38°C) sobre las actividades enzimáticas FPasa, CMCasa y xilanasa.
Figura 8. Influencia de la temperatura de incubación sobre la producción de FPasa, CMCasa y

xilanasa de T. koningiopsis Th003
En el caso de las FPasas, se observa que a 28°C hay una tendencia creciente hasta el día
5, mientras que a 38°C se observa la tendencia creciente va hasta el día 3. La máxima
actividad FPasa se da al día 5 de fermentación (0,809 ± 0,07 U/gss) a 28°C, valor que es
151,2% mayor con respecto a la actividad máxima obtenida a 38°C al día 3 de fermentación
(0,322 ± 0,1 U/gss). A pesar de que a 38°C la máxima actividad FPasa se da al día 3 de
fermentación (0,107 U/gss/día), la actividad a 28°C sigue siendo mayor en términos de
productividad (0,1618 U/gss/día).
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Th003
Por otro lado, para la actividad CMCasa a 28°C se observa una tendencia creciente hasta
el día 5 y se mantiene constante hasta el día 7, mientras que a 38°C la actividad crece
hasta el día 3, manteniéndose constante hasta el día 5 y decrece al día 7. La máxima
actividad CMCasa ocurre al día 5 de fermentación a 28°C (2,98 ± 0,01 U/gss), un 61,9%
más de actividad que la obtenida a 38°C (1,84 ± 0,16 U/gss) al día 3 de fermentación. A
pesar de que a 38°C la máxima actividad CMCasa se da al día 3 de fermentación (0,107
U/gss/día), la actividad a 28°C sigue siendo mayor en términos de productividad (0,1618
U/gss/día).
En cuanto a la actividad xilanasa tanto a 28°C como a 38°C se observa una tendencia
similar la cual es creciente hasta el día 5 y decrece el día 7, en donde no existen diferencias
significativas entre las dos temperaturas desde el día 0 hasta el día 5 (866,0 ± 6,28 U/gss
y 836,51 ± 26,1 U/gss, 28°C y 38°C respectivamente).
El efecto de la temperatura de incubación para la producción de hemicelulasas y celulasas

por T. koningiopsis Th003 revela que 28°C es la temperatura adecuada para la producción
de estas enzimas. Un aumento en la temperatura conduce a una disminución de la
actividad debido al cambio en los procesos metabólicos que lleva a cabo el hongo
(Pachauri et al., 2017). Cada especie de Trichoderma tiene sus propias preferencias
ecológicas, sin embargo, la mayoría de ellas crecen mejor en condiciones mesofílicas.
Diversos estudios relacionados con la temperatura óptima de crecimiento para diferentes
especies de Trichoderma, específicamente para la producción de enzimas
hemicelulolíticas y celulolíticas, han reportado un rango de temperatura de incubación de
25°C – 35°C (Jampala, Tadikamalla, Preethi, Ramanujam, & Uppuluri, 2017).
3.3.3 Efecto de la fuente de nitrógeno y la relación bagazo/salvado

A continuación, se presentan los resultados de la evaluación del efecto de la
suplementación del sustrato de fermentación con dos concentraciones de dos fuentes de
nitrógeno: extracto de levadura (orgánica) y sulfato de amonio (inorgánica), además de la
relación del bagazo de caña y el salvado de trigo.
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Capítulo 3 53
Los resultados de FPasa que se presentan en la Figura 9 indican que el extracto de

levadura utilizado como fuente suplementaria de nitrógeno es la más adecuada para la
producción de estas enzimas, todos los tratamientos al día 7 de fermentación con extracto
de levadura (a excepción del T3) obtuvieron mayor actividad FPasa en comparación con
las fermentaciones realizadas sin la adición de fuente de nitrógeno (control), mientras que
con las fermentaciones realizadas con sulfato de amonio, no hubo actividad FPasa con
ningún tratamiento a excepción del tratamiento 5 (T5), el cual no presenta diferencias
significativas con la máxima actividad obtenida con el control (p>0,05). El tratamiento 1 con
extracto de levadura (T1) (relación bagazo/salvado 1:1, 10 g/L extracto de levadura) obtuvo
la máxima actividad FPasa al día 7 de fermentación (1,095 ± 0,06 U/gss), representando
un 91% más de actividad con respecto al control al día 5 (0,573 U/gss). Por otro lado, la
máxima actividad obtenida con sulfato de amonio corresponde al tratamiento 5 (T5)
(relación bagazo/salvado 2:1, 7 g/L sulfato de amonio) al día 7 de fermentación (0,591
U/gss). Tanto el control, como el T5 con sulfato de amonio representan un 85,2% menos
de actividad a la obtenida en el T1 con extracto de levadura.
1,2
(a) 1,2
(b)
T1 T1
1,1 1,1
T2 T2
1,0 T3 1,0 T3
T4 T4
Unidades de actividad FPasa
0,9 T5 0,9 T5
CONTROL
CONTROL
0,8 0,8
0,7 0,7
0,6 0,6
0,5 0,5
0,4 0,4
0,3 0,3
0,2 0,2
0,1 0,1
0,0 0,0
1 3 5 7 1 3 5 7
Tiempo (Dias) Tiempo (Dias)
Figura 9. Efecto de la fuente de nitrógeno y la relación bagazo/salvado sobre la producción de

enzimas FPasas. (a) extracto de levadura; (b) sulfato de amonio
En cuanto a la actividad CMCasa (Figura 10) se puede observar que en general todos los
tratamientos tanto con extracto de levadura como con sulfato de amonio tuvieron mayores
actividades CMCasa en comparación con el control. No se observan diferencias
significativas (p=0,099) entre las máximas actividades obtenidas con extracto de levadura
(3,74 ± 0,34 U/gss) y sulfato de amonio (4,31 ± 0,36 U/gss). Sin embargo, se observa una
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Th003
actividad superior en un 71% utilizando cualquiera de las dos fuentes de nitrógeno en

comparación con el control (sin fuente de nitrógeno) y una relación bagazo/salvado de 2:1.
(a) (b)
5,0 5,0
T1
T1
4,5 T2 4,5
T2
Unidades de actividad CMCasa (U/gss)

T3
T3
4,0 T4 4,0 T4
T5
T5
3,5 CONTROL 3,5 CONTROL
3,0 3,0
2,5 2,5
2,0 2,0
1,5 1,5
1,0 1,0
0,5 0,5
0,0 0,0
1 3 5 7 1 3 5 7
Figura 10. Efecto de la fuente de nitrógeno y la relación bagazo/salvado sobre la producción

de CMCasa. (a) extracto de levadura; (b) sulfato de amonio
En la Figura 11, se muestran los resultados obtenidos para la actividad xilanasa. Se puede
observar que con extracto de levadura todos los tratamientos tuvieron una mayor actividad
en comparación con el control (a excepción del T3 y T4 al día 5 de fermentación y T4 al
día 7), mientras que con sulfato de amonio el control obtuvo mayor actividad xilanasa en
comparación con todos los tratamientos a excepción del T5 al día 7 de fermentación. La
máxima actividad se da en el tratamiento 1 (T1) con extracto de levadura (relación
bagazo/salvado 1:1 ; 10 g/L de extracto de levadura) al día 7 de fermentación (971,27 ±
6,8 U/gss), sin embargo si se observan los resultados en términos de productividad, se
puede observar que los tratamientos 2 (T2: relación bagazo/salvado 1:1 ; 4 g/L de extracto
de levadura) y 5 (T5: relación bagazo/salvado 2:1 ; 7 g/L extracto de levadura) (7,409 ±
0,01 U/gss/h y 7,474 ± 0,10 U/gss/h respectivamente) obtienen mejores resultados que el
obtenido con el T1 (6,295 ± 0,13 U/gss/h). El tratamiento que obtuvo la máxima actividad
con sulfato de amonio fue T5 (relación bagazo/salvado 2:1; 7g/L sulfato de amonio) al día
7 de fermentación (617,74 ± 23,17 U/gss), sin embargo, este representa un 57,22% menos
de actividad al obtenido en el T1 con extracto de levadura.
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Capítulo 3 55
(a) (b)
1200 1200
1100 T1 1100 T1
T2 T2
Unidades de actividad Xilanasa (U/gss)
Unidades de actividad xilanasa (U/gss)

1000 T3 1000 T3
T4 T4
900 900
T5 T5
800 CONTROL 800 CONTROL
700 700
600 600
500 500
400 400
300 300
200 200
100 100
0 0
1 3 5 7 1 3 5 7
Figura 11. Efecto de la fuente de Nitrógeno y la relación bagazo/salvado sobre la producción

de enzimas Xilanasa. (a) extracto de levadura; (b) sulfato de amonio
Teniendo en cuenta el potencial que tiene T. koningiopsis Th003 para la producción de

enzimas xilanasas, en comparación con las otras enzimas, y que la producción de estas
enzimas va enfocada principalmente a la hidrólisis de la hemicelulosa del ensilaje de la
avena forrajera, se realizó el análisis estadístico de los datos de la actividad xilanasa al día
5 de fermentación con extracto de levadura, los cuales correspondieron al tiempo y fuente
de nitrógeno de mayor producción. El análisis estadístico determinó que el factor con efecto
significativo p<0,07 sobre la producción de xilanasas fue la relación bagazo/salvado. Los
valores de los coeficientes se presentan en la Tabla 12, que expone el efecto, tanto positivo
como negativo, de los parámetros evaluados.
Tabla 12. Coeficientes codificados para la producción de xilanasas al día 5.

EE del
Término Efecto Coef Valor T Valor p
coef.
Constante 745,8 46,0 23,73 0
Relación bagazo/Salvado 455,1 227,5 65,1 9,08 0,004a
Extracto de Levadura -37,3 -18,6 65,1 -0,74 0,780
Relación bagazo/salvado*Extracto de -96,5 -48,2 61,5 -2,22 0,473
levadura
Normalidad Shapiro-Wilk >0,100
Homocedasticidad Bartlett levene Nivel de confianza: 98,833% 0,000
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Th003
a
Nivel de significancia del 7% (p<0,07)
De acuerdo con la prueba de normalidad Shapiro-Wilk la hipótesis nula indica que los datos
siguen una distribución normal. Puesto que el valor p es >0,100 que es mayor al nivel de
significancia utilizado en este experimento (p=0,07), la decisión es que no se puede
rechazar la hipótesis nula (Anexo D). Los intervalos de confianza de Bonferroni indican
que se puede estar un 97 % seguro de que todo el conjunto de intervalos de confianza
incluye las verdaderas desviaciones estándar de población para todos los experimentos.
Por otro lado, de acuerdo con la prueba de Bartlett Levene, se puede estar un 98.833 %
seguro de que la desviación estándar para los tratamientos se encuentra dentro del
intervalo de confianza, el valor p de la prueba (p=0,000) de comparaciones múltiples es
menor que el nivel de significancia (p= 0.07) por lo tanto las diferencias entre algunas de
las desviaciones estándar son estadísticamente significativas (Anexo E).
Figura 12. Diagrama de Pareto de los efectos de la relación bagazo/salvado y extracto de

levadura sobre la producción de enzimas xilanasas al día 5 de fermentación. Efecto positivo
(rojo), efecto negativo (gris).
La relación bagazo/salvado tiene una incidencia significativa (p=0,004) mostrando un

efecto positivo (455,1), como se puede observar en la gráfica de Pareto de efectos
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Capítulo 3 57
estandarizados (Figura 12). Esto coincide al observar que la actividad enzimática varió
entre 348,57 ± 8,34 U/gss y 840,89 ± 82,1 U/gss al modificar la relación bagazo/salvado
del nivel bajo a nivel alto, mientras que la actividad enzimática no cambió en gran medida
con la variación de la concentración del extracto de levadura (Figura 13).
Gráfica de contorno de Xilanasa vs. Extracto de Levadura; Relación bag

10
Xilanasa
< 500
500 – 600
9 600 – 700
700 – 800
800 – 900
Extracto de Levadura
8 900 – 1000
> 1000
4
0,4 0,6 0,8 1,0
Relación bagazo/Salvado
Figura 13. Diagrama de contorno de interacción entre la relación bagazo/salvado y

concentración del extracto de levadura (g/L) teniendo como respuesta la producción de
enzimas xilanasas (U/gss)
La ecuación 3 expresa el modelo matemático que representa la actividad enzimática de

las xilanasas en función de las variables independientes (concentración extracto de
levadura y relación bagazo/salvado). Entre los dos factores evaluados, la relación
bagazo/salvado tuvo el mayor impacto en la producción de enzimas dada por el valor
absoluto del coeficiente lineal (972). El coeficiente de regresión (R2) de 0,9106 indica un
ajuste adecuado de los datos al modelo.
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Th003
Ecuación 3. Ecuación de regresión en unidades no codificadas.
Xilanasa = 158 + 972 Relación bagazo/Salvado + 23,6 Extracto de Levadura

Día 5 - 45,9 Relación bagazo/Salvado*Extracto de Levadura
(U/gss)
El objetivo principal del diseño factorial fue realizar un experimento exploratorio para
seleccionar la mejor fuente de nitrógeno, determinar si los intervalos de concentración de
la fuente de nitrógeno y la relación bagazo/salvado eran adecuados para favorecer la
producción de enzimas, principalmente xilanasas. Sin embargo, se puede observar que no
son los rangos óptimos de las variables, por consiguiente, es necesario otro diseño
experimental para hallarlos.
Los resultados de los experimentos determinaron que una relación bagazo/salvado (1:1) y
una concentración de extracto de levadura de 4 g/L mejoran la producción de enzimas
xilanasas.
De acuerdo con los resultados obtenidos, se pudo observar que se aumentó un 91% de
actividad FPasa, 71% de actividad CMCasa y un 57,22% de actividad xilanasa cuando se
le adiciona al medio de fermentación una fuente de nitrógeno orgánica. Algunos estudios
han demostrado que la adición de fuentes de nitrógeno inorgánicas, como el sulfato de
amonio, estimulan la producción de enzimas cuando se encuentran en la concentración
adecuada, debido a la rápida acción de estos compuestos. Sin embargo, un aumento
significativo en las concentraciones de estas fuentes conduce a la disminución de la
actividad enzimática ya que pueden ser tóxicas para los hongos (Kalsoom, Ahmed,
Nadeem, Chohan, & Abid, 2019), adicionalmente, el extracto de levadura tiene
aminoácidos (necesarios para la producción de enzimas) que el hongo puede incorporar a
su metabolismo y por lo tanto no requiere producirlos, mientras que, cuando se utiliza una
fuente inorgánica, el hongo debe utilizar parte de la energía para la producción de estos
aminoácidos, de esta manera, las fermentaciones llevadas a cabo con sulfato de amonio
la actividad enzimática disminuyó en comparación con el extracto de levadura. La
suplementación con altas concentraciones de fuente de nitrógeno orgánica en sustrato
lignocelulósico estimula la producción de enzimas celulolíticas y hemicelulolíticas (Jampala
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Capítulo 3 59
et al., 2017), debido a la presencia de iones presentes en el extracto de levadura como

potasio (4,5-6,3%) y fósforo (1.0-2,7%), además de vitaminas del complejo B (B1, B2, B5,
B6, B8, B9, B12) y algunos aminoácidos, que ejercen un efecto positivo para el crecimiento
micelial del hongo mejorando la producción de enzimas (Pachauri et al., 2017).
3.4 Conclusiones parciales

Una concentración de inóculo de T. koningiopsis Th003 de 1𝑥106 𝑐𝑜𝑛𝑖𝑑𝑖𝑜𝑠/𝑚𝐿 y una
temperadura de 28°C son las condiciones mas adecuadas para esta FES para la
producción de enzimas celulasas y xilanasas.
La adición de extracto de levadura aumenta en mayor medida las actividades enzimáticas,

especialmente la xilanasa, en comparación con la fuente de nitrógeno inorgánica.
La relación bagazo/salvado tuvo una incidencia significativa en la producción enzimática,

siendo el término que mas ejerce efecto sobre la producción de xilanasas.
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4. Optimización de los parámetros

fisicoquímicos y nutricionales y efecto de
la aireación sobre la producción de
hemicelulasas y celulasas
4.1 Introducción
En el Capítulo 3 se mostró cómo la adición de una fuente de nitrógeno, la temperatura de
fermentación y la concentración de inóculo tienen efecto sobre la producción de
hemicelulasas y celulasas. No obstante, existen otros factores que afectan directamente la
producción enzimática y encontrar su punto óptimo se convierte en un factor clave para
aumentar la productividad en los procesos de FES (Pathak, Bhardwaj, & Singh, 2014).
Factores como: la relación y concentración óptima de los parámetros nutricionales, el pH,
el tamaño de partícula, la altura de lecho de fermentación y la aireación son algunos de los
parámetros para tener en cuenta.
La actividad enzimática es fuertemente influenciada por el pH, este es un parámetro

importante para ser optimizado ya que la actividad metabólica del organismo puede
provocar un cambio de pH durante el curso de la fermentación afectando su crecimiento,
adicionalmente los sitios activos de las enzimas generalmente dependen de la presencia
de iones específicos, de la carga de los aminoácidos en su estructura para mantener la
conformación que permite la unión eficiente al sustrato. Sin embargo, el monitoreo y control
del pH en FES no es usual, y solo se ha reportado la influencia del pH inicial del medio de
fermentación (Pathak et al., 2014). En general, un pH inicial de aproximadamente 6 es
adecuado para la producción de hemicelulasas y celulasas (Ezeilo et al., 2019). También
es importante señalar que la mayoría de los sustratos lignocelulósicos tienen una
capacidad amortiguadora que minimiza los cambios de pH durante la fermentación (Yoon
et al., 2014).
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Th003
El tamaño de partícula está relacionado entre otros factores, con la caracterización del
sustrato y la capacidad del sistema de fermentación para el intercambio de calor y masa
lo que a su vez está relacionado con el crecimiento microbiano durante el proceso de FES.
El tamaño del sustrato determina el espacio vacío que está ocupado por el aire. Dado que
la velocidad de transferencia del oxígeno al espacio vacío determina el crecimiento
microbiano, el sustrato debe tener un tamaño adecuado para mejorarlo. Generalmente, las
partículas más pequeñas proporcionan un área superficial mayor para la acción de los
microorganismos; sin embargo, partículas demasiado pequeñas pueden provocar
aglomeración en el sustrato, lo que puede interferir en los procesos metabólicos
provocando un crecimiento deficiente (Krishna, 2005).
La altura de lecho es otro factor crucial ya que afecta directamente el crecimiento fúngico
y por consiguiente la producción enzimática. Con alturas de lecho muy grandes, puede
haber una inhibición del crecimiento del hongo, puesto que disminuye la transferencia de
oxígeno dentro del sistema, permitiendo que el calor metabólico generado durante el
proceso se acumule, ocasionando en consecuencia un aumento de temperatura dentro del
sistema que puede afectar el desarrollo del microorganismo, adicionalmente por la baja
tasa de aireación dentro del sistema se pueden generar microcosmos anaeróbicos que
afectan directamente la productividad del microorganismo (Krishna, 2005).
La aireación tiene una influencia significativa en los procesos de FES, debido a la demanda
de oxígeno del microorganismo y a los fenómenos de transferencia de masa y calor. La
aireación proporciona oxígeno, elimina el dióxido de carbono y metabolitos tóxicos volátiles
además del calor metabólico producido dentro del fermentador (Krishna, 2005). Muchos
parámetros del proceso y características del sustrato como la presión del aire, la velocidad
del flujo, la porosidad del sustrato, la profundidad del lecho, el contenido de humedad, la
geometría del reactor, pueden afectar la transferencia de oxígeno (Mansour et al., 2016).
Por lo tanto, en este capítulo se presentará la optimización de los parámetros nutricionales

(relación bagazo/salvado y concentración del extracto de levadura) y fisicoquímicos
(tamaño de partícula, pH, y altura de lecho), y el efecto de la aireación sobre la producción
de enzimas hemicelulolíticas y celulolíticas.
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Capítulo 4 63
2.3. Materiales y métodos

Para la optimización de los parámetros nutricionales y fisicoquímicos se siguió el mismo
procedimiento realizado en el Capítulo 3 para la producción del inóculo.
4.2.2 Optimización de la concentración del extracto de levadura y

la relación bagazo/salvado
Habiendo escogido la fuente de nitrógeno (extracto de levadura), se optimizó su
concentración y la relación de bagazo/salvado para obtener la mayor producción de
enzimas hemicelulolíticas. Para ello se realizó un diseño central compuesto 23 con tres
repeticiones del punto central haciendo muestreo destructivo a los 0, 3, 5 y 7 días de
fermentación. La Tabla 13 presenta los valores de los factores y la Tabla 14 presenta los
11 tratamientos experimentales.
Tabla 13. Factores y niveles empleados en la optimización relación bagazo/salvado y

fuente de nitrógeno
FACTOR -1,41 -1 +1 +1,41
Relación bagazo/salvado 1:0,8 1:1 1:2 1:2,2
Fuente de nitrógeno (g/L) 3,2 4 8 8,8
Tabla 14. Diseño central compuesto para la optimización de la fuente de nitrógeno y la

relación bagazo/salvado.
RELACIÓN FUENTE DE
TRATAMIENTO
BAGAZO/SALVADO NITRÓGENO (g/L)
T1 1:2 8
T2 1:2 4
T3 1:1 8
T4 1:1 4
T5 (x3) 1:1,5 6
T6 1: 0,8 6
T7 1: 2,2 6
T8 1:1,5 3,2
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Th003
T9 1:1,5 8,8
4.2.2.1 Validación del efecto de los parámetros nutricionales

Las condiciones óptimas encontradas en el numeral anterior (relación bagazo/salvado y
concentración de la fuente de nitrógeno) se validaron realizando cinco fermentaciones en
bandejas de aluminio de 13 cm x 11 cm, las cuales contenían 20 gramos del sustrato con
una relación 1:3 (g sustrato/mL de agua). Las bandejas con el sustrato fueron esterilizadas
en autoclave a 121°C y 15 psi durante 30 minutos. Se inocularon las bandejas a una
relación 1,05:1 (mL de inóculo/g de sustrato) con una concentración de 1𝑥106 𝑐𝑜𝑛𝑖𝑑𝑖𝑜𝑠/
𝑚𝐿, se sellaron con una película plástica y se incubaron en cuarto de fermentación por
cinco días con luz constante a 28°C ± 2, con una humedad relativa del 80-85%.
4.2.3 Efecto de las condiciones fisicoquímicas (pH, tamaño de

partícula, altura de lecho) sobre la producción de enzimas
Se realizó un diseño experimental Box Behnken de tres factores y tres niveles que se
presentan en la Tabla 15. Los factores estudiados fueron pH, el tamaño de partícula y la
altura de lecho. Adicionalmente, se realizaron tres repeticiones del punto central para un
total de 16 tratamientos (los datos de los puntos centrales fueron promediados y agrupados
en un mismo tratamiento), los cuales se muestran en la Tabla 16. Se utilizó el sustrato y
las condiciones de fermentación de acuerdo con los resultados obtenidos en la Capítulo 3,
las cuales correspondían a una relación bagazo/salvado 1:1 más 4 g/L de extracto de
levadura y solución de sacarosa 1% haciendo muestreo destructivo a los días 0, 3, y 5 de
fermentación.
Tabla 15. Box Behnken para la optimización parámetros fisicoquímicos.
FACTOR -1 0 +1
pH 5 6 7
Tamaño Partícula (log10 cm) -0,69 0 0,69
Altura de lecho (cm) 0,5 2,5 4,5

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Capítulo 4 65
Tabla 16. Diseño de tratamiento para la optimización de parámetros fisicoquímicos.

Altura de lecho
TRATAMIENTO pH Tamaño partícula
(cm)
T1 5 -0,69 2,0
T2 7 -0,69 2,0
T3 5 0,69 2,0
T4 7 0,69 2,0
T5 5 0 0,5
T6 7 0 0,5
T7 5 0 3,5
T8 7 0 3,5
T9 6 -0,69 0,5
T10 6 0 0,5
T11 6 -0,69 3,5
T12 6 0,69 3,5
T13 (x3) 6 0 2,0
Control ≈7 -0,69 3,0
4.2.3.1 Validación del efecto de los parámetros fisicoquímicos

El pH, tamaño de partícula y altura de lecho que permitieron obtener la máxima actividad
hemicelulolítica se validaron realizando cinco fermentaciones en bandejas de aluminio de
13 cm x 11 cm, las cuales contenían la cantidad de sustrato de acuerdo con los resultados
obtenidos en el diseño Box Behnken y una relación 1:3 (g sustrato/mL de agua). Las
bandejas con el sustrato fueron esterilizadas en autoclave a 121°C y 15 psi durante 30
minutos. Se inocularon las bandejas a una relación 1,05:1 (mL de inóculo/g de sustrato)
con una concentración de 1𝑥106 𝑐𝑜𝑛𝑖𝑑𝑖𝑜𝑠/𝑚𝐿, se sellaron las bandejas con una película
plástica y se incubaron en cuarto de fermentación por cinco días con luz constante a 28°C
± 2, con una humedad relativa del 80-85%.
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Th003
4.2.4 Efecto de la aireación sobre la producción de enzimas

hemicelulolíticas y celulolíticas
Se evalúo el efecto de dos flujos de aireación (alta y baja) sobre la producción enzimática.
La fermentación se llevó a cabo en un biorreactor PROPHYTA® GmbH modelo L05. El
biorreactor consistió en un sistema a escala piloto de 4 niveles, cada uno con un área de
25 x 25 cm, y un serpentín para el control la temperatura utilizando un baño termostatado
externo (Cruz, 2014). Adicionalmente estuvo equipado con un sistema en línea para
controlar el flujo de aire, el cual se pasó a través de un filtro de 0,22 micras y se alimentó
al reactor a través de una manguera de silicona previamente estéril conectada al
biorreactor (Figura 14). Para este estudio, el aire de entrada se burbujeaba en un
recipiente con agua estéril que se encontraba a 30°C para asegurar que el aire estuviera
saturado.
Figura 14. Esquema del fermentador de lecho fijo PROPHYTA® L05 (Cruz, 2014).
Teniendo en cuenta que el ensayo se llevó en un fermentador a escala piloto, se aplicó el

principio de similaridad; este permitió mantener la proporcionalidad de las relaciones
sustrato/área de la bandeja (g/cm2) (ecuación 4), agua/sustrato (mL/g) (ecuación 5) y
cantidad de inoculo/ sustrato (mL/g) (ecuación 6).
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Capítulo 4 67
Ecuación 4
𝑆𝑏 𝑆𝑝
=
𝐴𝑏 𝐴𝑝
𝑆𝑏
𝑆𝑝 = × 𝐴𝑝
𝐴𝑏
10 𝑔 𝑠𝑢𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜
𝑆𝑝 = × 625 𝑐𝑚2
143 𝑐𝑚2
10 𝑔 𝑠𝑢𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜
𝑆𝑝 = × 625 𝑐𝑚2
143 𝑐𝑚2
Sb: peso en g de la cantidad de sustrato en bandejas

Sp: peso en g de la cantidad de sustrato en prophyta
Ab: Área de las bandejas
Ap: Área de un nivel del Prophyta.
Ecuación 5
𝑤𝑏 𝑤𝑝
=
𝑆𝑏 𝑆𝑝
𝑤𝐵
𝑤𝑝 = × 𝑆𝑝
𝑆𝑏
30 𝑚𝐿 𝑑𝑒 𝑎𝑔𝑢𝑎
𝑤𝑝 = × 43,7 𝑔 𝑑𝑒 𝑠𝑢𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜
10 𝑔 𝑑𝑒 𝑠𝑢𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜
𝑤𝑝 = 131, 1 ~ 131 𝑚𝐿 𝑑𝑒 𝑎𝑔𝑢𝑎
wb= mL de agua en bandejas
wp= mL de agua en prophyta
Ecuación 6
𝐼𝑏 𝐼𝑝
=
𝑆𝑏 𝑆𝑝
𝐼𝐵
𝐼𝑝 = × 𝑆𝑝
𝑆𝑏
10,5𝑚𝐿 𝑑𝑒 𝑖𝑛ó𝑐𝑢𝑙𝑜
𝐼𝑝 = 10 𝑔 𝑑𝑒 𝑠𝑢𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜
× 43,7 𝑔 𝑑𝑒 𝑠𝑢𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜
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Th003
𝐼𝑝 = 45,8 𝑚𝐿 𝑑𝑒 𝑖𝑛ó𝑐𝑢𝑙𝑜
Ib= mL de inóculo bandejas
Ip= mL de inóculo prophyta
La composición y las cantidades de sustrato, inóculo, y agua que se usaron para los
bioreactores empleados se encuentran en la Tabla 17. Se determinó el área de la bandeja
de aluminio para la producción a escala de laboratorio y las dimensiones del biorreactor
Prophyta® empleando las dimensiones del área de un rectángulo (lado x ancho).
Tabla 17. Dimensiones de los parámetros para evaluar el efecto de la aireación
Biorreactor en Biorreactor
PARÁMETRO
bandejas Prophyta ®
Ancho (cm) 13 25
Largo (cm) 11 25
Cantidad de sustrato (g) 10 43,7
Cantidad de inóculo (mL) 10,5 45,8
Cantidad de agua 30 131
𝐴𝑏 = 𝐿 𝑋 𝐴 𝐴𝑃 = 𝐿 𝑋 𝐴
Área (cm2) 𝐴𝑏 = 11 𝑋 13 𝐴𝑃 = 25 𝑋 25
𝐴𝑏 = 143 𝑐𝑚2 𝐴𝑃 = 625𝑐𝑚2
La fermentación se realizó con los resultados de la optimización de las variables

nutricionales y fisicoquímicas las cuales correspondieron a una relación bagazo/salvado
1:08; 3,2 g/L de extracto de levadura; un pH inicial del sustrato de 6 y una altura de lecho
de 0,5 cm, haciendo muestreo únicamente el dia 5 de fermentación. Los tratamientos
llevados a cabo se observan en la Tabla 18, en donde se probaron en el Prophyta dos
flujos de aire de entrada: alto (20 L/min) y bajo (2 L/min).
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Capítulo 4 69
Tabla 18. Tratamientos para evaluar el efecto de la aireación
Tratamiento Flujo de aire (L/min) Biorreactor
T1 2 Prophyta
T2 20 Prophyta
4.2.5 Obtención del extracto enzimático y métodos analíticos

Se siguió el mismo procedimiento descrito en el capítulo 3 para la obtención del extracto
enzimático, la cuantificación de las enzimas FPasa, CMCasa y xilanasa, y la determinación
de humedad.
4.2.6 Diseño estadístico

DE (desviación estándar). Las diferencias estadísticamente significativas fueron
determinadas realizando un análisis de varianza (ANOVA) con un p<0,07 para el diseño
central compuesto y un p<0,05 para el diseño Box Behnken, utilizando un modelo de
regresión cuadrática
Para el diseño central compuesto y el Box Behnken se realizó un análisis de regresión

basado en los datos experimentales y se ajustó a un modelo polinómico de segundo orden
como se muestra a continuación en la ecuación 7, utilizando el software Minitab (versión
18.0, Minitab Inc, Pennsylvania, EE.UU).
Para demostrar la normalidad de datos se usó la prueba de Shapiro Wilk y para la igualdad
de varianzas (homocedasticidad) se utilizó la prueba de Bartlett levene
Ecuación 7
𝟑 𝟑 𝟐 𝟑
𝒀 = ∑ 𝑨𝟎 + ∑ 𝑨𝒊 𝑿𝒊 + ∑ 𝑨𝒊𝒊 𝑿𝟐𝒊 + ∑ ∑ 𝑨𝒊𝒋 𝑿𝒊 𝑿𝒋

𝒊=𝟏 𝒊=𝟏 𝒊=𝟏 𝒋=𝒊+𝟏
Donde Y, es la variable de respuesta; A0, Ai, Aii, Aij son los coeficientes de regresión de las
variables para los términos de intercepción, lineal, cuadrático e interacción
respectivamente y Xi y Xj representan las variables independientes.
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Th003
4.3.1 Optimización de la concentración de extracto de levadura y

la relación bagazo/salvado
La máxima actividad FPasa (Figura 15) se da con el tratamiento 5 (T5) el cual corresponde
a una relación bagazo/salvado de 1:1,5 y 6 g/L de extracto de levadura al día 3 de
fermentación (0,704 ± 0,18 U/gss), y con el tratamiento 7 (T7) que corresponde a una
relación bagazo/salvado de 1:2,2 y 6 g/L de extracto de levadura al 7 día de fermentación
(0,55 ± 0,18 U/gss), los cuales no presentan siferencias significativas (p=0,321); sin
embargo, a pesar de que presentaron la misma actividad T5 se produce en menor tiempo
(0,234 U/gss/día) en comparación con T7 (0,078 U/gss/día).
1,0
T1: (1:2)(8g/L)
0,9 T2: (1:2)(g/L)

T3: (1:1)(g/L)
T4: (1:1)(4g/L)
0,8 T5: (1:1,5)(6g/L)
T6: (1:0,8)(6g/L)
0,7 T7: (1:2.2)(6g/L)
T8: (1:1,5)(3,2g/L)
T9: (1:1,5)(8,8g/L)
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
1 3 5 7
Tiempo (Dias)
Figura 15. Efecto de la concentración de extracto de levadura y la relación bagazo/salvado
sobre la producción de enzimas FPasa.
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Capítulo 4 71
3,0
T1: (1:2)(8g/L)
T2: (1:2)(g/L)
T3: (1:1)(g/L)
2,5 T4: (1:1)(4g/L)
T5: (1:1,5)(6g/L)
T6: (1:0,8)(6g/L)
T7: (1:2.2)(6g/L)
T8: (1:1,5)(3,2g/L)
2,0 T9: (1:1,5)(8,8g/L)
1,5
1,0
0,5
0,0
1 3 5 7
Tiempo (Dias)
bagazo/salvado sobre la producción de enzimas CMCasa.
Para la actividad CMCasa (Figura 16), se observa que no se presentan diferencias

significativas (p= 0,279) en su valor (1,705 ± 0,15 U/gss en promedio) al día 5 de
fermentación para los tratamientos T1, T3, T4, T5, T6, T7, T8 y T9. En el T2 (0,964 ± 0,14
U/gss) el cual corresponde a relación bagazo/salvado 1:2 y 4 g/L de extracto de levadura,
se observa una disminución del 76,86% de la actividad respecto al promedio de los otros
tratamientos en el mismo día de fermentación. Sin embargo, se puede observar que T3 y
T5 al día 3 de fermentación no presenta diferencias significativas con los tratamientos
anteriormente mencionados (p= 0,121) al día 5 de fermentanción, teniendo un
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Th003
productividad mayor (0,52 U/gss/día en comparación con los tratamientos del día 5, los
cuales tienen una productividad promedio de 0,341 U/gss/día.
En cuanto a las xilanasas (Figura 17), todos los tratamientos (excepto T5 que tiene una
tendencia variable) tienen una actividad creciente hasta el día 5, en donde para los
tratamientos T1, T2 y T6 continúa asi hasta el día 7, mientras que T3, T4, T7 y T8
disminuyen su actividad. La máxima actividad se presenta al día 5 de fermentación con el
tratamiento 4 (T4) el cual, corresponde a una relación bagazo/salvado de 1:1; y 4 g/L de
extracto de levadura (1130,31 ± 20,40 U/gss).
1200
Unidades de actividad Xilanasa (U/gss)
T1: (1:2)(8g/L)
1100 T2: (1:2)(g/L)
T3: (1:1)(g/L)
1000 T4: (1:1)(4g/L)
T5: (1:1,5)(6g/L)
900 T6: (1:0,8)(6g/L)
T7: (1:2.2)(6g/L)
800 T8: (1:1,5)(3,2g/L)
T9: (1:1,5)(8,8g/L)
700
600
500
400
300
200
100
0
1 3 5 7
Tiempo (Dias)
Figura 17. Efecto de la concentración del extracto de levadura y la relación bagazo/salvado
sobre la producción de enzimas xilanasa
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Capítulo 4 73
El diseño central compuesto permitió determinar las interacciones entre las variables
independientes (relación bagazo/salvado y concentración del extracto de levadura) y al
mismo tiempo maximizar la producción de xilanasas.
Se realizó el análisis estadístico de los datos experimentales de la actividad de xilanasa al

día 5 de fermentación el cual corresponde al día de mayor producción. Los valores de los
coeficientes se presentan en la Tabla 19. El valor de p del modelo fue 0,027 (p<0,07) lo
que indicó que el término del modelo fue significativo.

fermentación.
EE del
Término Coef Valor T Valor p
coef.
Constante 375 122 3,08 0,027
-52,3 74,6 -0,7 0,514
Relación Bagazo/Salvado (A)
20,8 74,6 0,28 0,791
Extracto de levadura (B)
Relación bagazo/salvado*Relación 216,2 88,8 2,44 0,059 a
Bagazo/salvado (AA)
289,2 88,8 3,26 0,023 a
Extracto Levadura*Extracto Levadura (BB)
Relación Bagazo/salvado*Extracto Levadura 94 105 0,89 0,415
(AB)
Normalidad Shapiro-Wilk 0,010

a
Nivel de significancia del 7% (p<0,07)
La ecuación 5, representa el modelo matemático de la actividad enzimática de xilanasas

en función de las variables independientes. El coeficiente de regresión (R2) igual a 0,7417
indica que el 25,83% de la variación total no podría explicarse por el modelo, esto debido
principalmente a la variabilidad de las actividades enzimáticas en cada una de las réplicas
de las fermentaciones.
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Th003
Ecuación 5. Ecuación de regresión en unidades no codificadas para parámetros

nutricionales
Actividad = 5862 +(- 3262 Relación Bagazo/salvado) + (- 998 Extracto Levadura)

Xilanasa + (865 Relación Bagazo/salvado*Relación Bagazo/salvado)
(U/gss) + (72,3 Extracto Levadura*Extracto Levadura)
Día 5 + (94 Relación Bagazo/salvado*Extracto Levadura
siguen una distribución normal. Puesto que el valor p=0,010 que es mayor al nivel de
rechazar la hipótesis nula (Anexo F). Los intervalos de confianza de Bonferroni indican
que se puede estar un 97 % seguro de que todo el conjunto de intervalos de confianza
menor que el nivel de significancia (p= 0.07) por lo tanto las diferencias entre algunas de
las desviaciones estándar son estadísticamente significativas (Anexo G).
En la gráfica de Pareto de efectos estandarizados (Figura 18) y en la tabla 18, se evidencia

que tanto el término cuadrático de la relación bagazo/salvado (AA) como el del extracto de
levadura (BB) son significativos (p=0,059 y 0,023 respectivamente) y tienen una incidencia
positiva en la producción de xilanasas (216,2 y 289,2 respectivamente), siendo el BB el
que mayor efecto ejerce sobre la producción de enzimas xilanasas.
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Capítulo 4 75
Figura 18. Diagrama de Pareto de los efectos de la relación bagazo/salvado y extracto de

levadura sobre la producción de enzimas xilanasas al día 5 de fermentación. Efecto
positivo (rojo), efecto negativo (gris).
La superficie de respuesta mostrada en la Figura 19, es un paraboloide cóncavo hacia

abajo mostrando un mínimo de actividad, por lo tanto, su valor máximo se logra tanto en
el nivel más alto de relación bagazo/salvado (1:2,2) y extracto de levadura (8,8 g/L), como
en el más bajo (1:0,8 y 3,2 g/L respectivamente). Sin embargo, la adición de grandes
cantidades de extracto de levadura y la utilización de mayor cantidad de salvado de trigo
aumentaría el costo, pudiendo ser inviable su producción a gran escala.
De acuerdo con la predicción de respuesta múltiple, la configuración óptima para obtener

la máxima actividad xilanasa es: relación bagazo/salvado 1:0,8 y 3,2 g/L de extracto de
levadura.
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Th003
15 00
Xilanasa (U/gss)
1000
500
2,0
1 ,5
4 6 8 1,0
Relación Bagazo/salvado
Extracto Levadura (g/L)
Figura 19. Gráfico de superficie de respuesta 3D para la actividad xilanasa al día 5 de

fermentación.
▪ Validación
La validación de la relación bagazo/salvado y la concentración del extracto de levadura

óptimas de acuerdo con la predicción del modelo se verificó experimentalmente por medio
de cinco fermentaciones y los resultados se presentan en la Tabla 20. La producción de
xilanasa al día 5, en condiciones óptimas produjo una actividad de 1227,58 ± 81,56 U/gss,
en comparación con el rendimiento previsto, el cual se encontraba en un intervalo entre
995 – 1241 U/gss. La excelente correlación entre los valores experimentales y los
predichos, indica la validez del modelo, y confirma la existencia del punto óptimo bajo las
condiciones del proceso FES descrito aquí.
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Capítulo 4 77
xilanasas a partir de Trichoderma koningiopsis Th003
Desviación Rango
Actividad enzimática Promedio
Validación estándar Predicción
(U/gss) experimental (U/gss)
(DS) (U/gss)
1 1273,63
2 1205,7
3 1096,27 1227,588 81,56 995 - 1241
4 1303,81
5 1258,53
4.3.2 Optimización del pH, tamaño de partícula y altura de lecho

Los resultados obtenidos de la actividad FPasa se presentan en la Figura 20, en donde se
observa que todos los tratamientos, a excepción del T6, tuvieron una actividad FPasa baja
(T4 y T12), siendo mínima en los tratamientos T1, T2, T3, T5, T7, T8, T9, T10, T11, T13 y
el control. La máxima actividad que se da con el tratamiento (T6) al día 5 de fermentación
es de 0,503 ± 0,03 U/gss, el cual corresponde a la configuración: pH 7; tamaño de partícula
1 cm y altura de lecho 0,5 cm, siendo este 100% más de actividad respecto al control (pH
≈7; tamaño de partícula 5 cm y altura de lecho 3 cm).
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Th003
Figura 20. Efecto del pH, tamaño de partícula (T) y altura (A) de lecho sobre la producción
de enzimas FPasa.
En la Figura 21 se presentan los resultados para CMCasa, allí se puede observar que los
tratamientos T3, T7, T8, T9, T10, T11 y el control tienen una tendencia creciente hasta el
dia 5 de fermentación, mientras que los tratamientos T2, T4, T5, T6 y T12 disminuyen su
actividad al día 5. El tratamiento T10 (2,656 ± 0,17 U/gss) fue el que obtuvo la mayor
actividad CMCasa, aumentando un 52,64% la actividad respecto al control (1,74 ± 0,35
U/gss). Su máxima actividad se mantiene constante desde el día 3 hasta el día 5 de
fermentación (2,36 ± 0,05 U/gss; 2,65 ±0,17 U/gss, respectivamente) (pH 6; tamaño de
partícula 1 cm; altura de lecho 0,5 cm).
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Capítulo 4 79
enzimas CMCasa.
Los resultados del diseño experimental para la producción de xilanasas se presentan en

la Figura 22. Se puede observar que, en general, todos los tratamientos evaluados tienen
una tendencia creciente en el tiempo, a excepción del tratamiento T6, el cual disminuye su
actividad al día 5. La máxima actividad se obtiene con el tratamiento T5 al día 5 de
fermentación (1227,86 ± 19,69 U/gss), el cual corresponde a la configuración: pH:5;
tamaño de partícula 1 cm; altura de lecho de 0,5 cm, con el cual se obtuvo un aumento del
8,63% (1130,31 ± 20,40 U/gss), respecto al control.
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Th003
enzimas xilanasa.
Los resultados del diseño Box Behnken que se utilizó para determinar los factores claves
(pH, tamaño de partícula y altura de lecho), sus interacciones y para optimizar la
producción de enzimas xilanasas fueron analizados utilizando un análisis de variancia
(ANOVA) de los datos experimentales de la actividad xilanasa al día 5 de fermentación, el
cual corresponde al día de mayor producción. El valor de p del modelo fue 0,001 (p<0,05)
(Tabla 21) lo que indicó que el modelo fue significativo. De acuerdo con los valores de p
todas las variables y sus interacciones fueron significativos (p<0,05), con excepción de la
interacción pH * altura (p=0,054).
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Capítulo 4 81

fermentación
EE del
Término Coef Valor T Valor p
coef.
Constante 446,2 64,0 6,97 0,001
pH (A) -173,7 39,2 -4,43 0,007a
Tamaño de partícula (B) 221,7 39,2 5,66 0,002a
Altura de lecho (C) -207,6 39,2 -5,30 0,003a
pH * pH (AA) -213,3 57,7 -3,70 0,014a
Tamaño * Tamaño (BB) 290,2 57,7 5,03 0,004a
Altura * Altura (CC) 220,4 57,7 3,82 0,012a
pH * Tamaño (AB) -138,8 55,4 -2,51 0,054
pH * Altura (AC) 291,9 55,4 5,29 0,003a
Tamaño *Altura (BC) 165,9 55,4 2,99 0,030a
Normalidad Shapiro-Wilk 0,010

a Nivel de significancia del 5% (p<0,05)
La ecuación de regresión (ecuación 6) obtenida después del análisis de varianza (ANOVA)

expresó el nivel de la actividad xilanasa al día 5 de fermentación en función de las variables
independientes (pH, tamaño de partícula y altura de lecho). El coeficiente de regresión (R2)
igual a 0,9728 indica que únicamente el 7,6% de la variación total, no podría explicarse por
el modelo, lo que demuestra que el modelo de regresión representa bien el
comportamiento del sistema en el intervalo definido.
Ecuación 6. Ecuación de regresión en para parámetros fisicoquímicos.
Actividad = -3777 + (2204 pH) + (-19 Tamaño) + (-1868 Altura) + (- 213,3 pH*pH)
Xilanasa + (72,5 Tamaño*Tamaño) + (98,0 Altura*Altura) + (- 69,4 pH*Tamaño)
(U/gss) + (195,3 pH*Altura) + (55,3 Tamaño*Altura)
Día 5
siguen una distribución normal. Puesto que el valor p=0,010 que es mayor al nivel de
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Th003
rechazar la hipótesis nula (Anexo H). Los intervalos de confianza de Bonferroni indican
que se puede estar un 95% seguro de que todo el conjunto de intervalos de confianza
mayor que el nivel de significancia (p= 0.07) por lo tanto las diferencias entre las
desviaciones estándar no son estadísticamente significativas. (Anexo I).
Figura 23. Diagrama de Pareto de los efectos del pH, tamaño de partícula y altura de lecho
sobre la producción de enzimas xilanasas al día 5 de fermentación. Efecto positivo (rojo),
efecto negativo (gris).
En la gráfica de Pareto de efectos estandarizados (Figura 23) se puede observar que el

tamaño de partícula (B), la altura (C) y la interacción pH*altura (AC) ejercen los mayores
efectos, seguidos por el término cuadrático del tamaño (BB), el pH (A), el término
cuadrático de la altura (CC) y la interacción tamaño*altura (BC). Adicionalmente se puede
observar que, B, AC, BB, CC y BC ejercen un efecto positivo sobre la producción de
xilanasas al día 5 de fermentación, mientras que C, A, AA tienen un efecto negativo.
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Capítulo 4 83
Gráfica de superficie de Xilanasa vs. Tamaño de partícula (Log cm); pH
Valores fijos
Gráfica de contorno
Altura de lecho (cm) 2 de Xilanasa vs. Tamaño de partícula (Log cm);
(a) (b) Xilanasa

< 200
0,50 200 – 400
400 – 600
Tam o de par cula (Log cm)

600 – 800
800 – 1000
12 0 0 0,25 > 1000
Valores fijos
Altura de lecho (cm
800 0,00
tí
Xilanasa
U/gss
400
-0,25
0,5
añ
0 0,0
Gráfica
5 de superficie de Xilanasa vs. Altura de lecho
-0,50 (cm); pH
6 -0 ,5
pH 7 Valores fijos
5,0 5,5 6,0 6,5 7,0
Tamaño de partícula (Log cm) 0
Gráfica de contorno de pH Xilanasa vs. Altura de lecho (cm);
3,5
Xilanasa
(c) (d) < 200

200 – 400
3,0 400 – 600
600 – 800
800 – 1000
Altura de lecho (cm)

1200 2,5 > 1000
Valores fij
Xilanasa
Tamaño de partícula
800 2,0
U/gss
1,5
400
3
1,0
0 2
5 1
Gráfica de superficie de6Xilanasa vs. Altura de lecho (cm); Tamaño de 0,5
5,0 5,5 6,0 6,5 7,0
pH 7 pHvs. Altura de lecho (cm); Tamaño d
Gráfica de contorno de Xilanasa
Valores fijos
pH 6
3,5
Xilan
(e) (f) 500 –
<
3,0 700 –
900 –
>
1250
Altura de lecho (cm)
2,5
Valores
pH 6
1000
Xilanasa
2,0
750
U/gss
1,5
500 3
2 1,0
-0 ,5 1
0,0 0,5
Tamaño partícula (Log 0,5 -0,50 -0,25 0,00 0,25 0,50
cm) Tamaño de partícula (Log cm)
Figura 24. Superficie de respuesta (3D) y gráfico de contorno que muestran los efectos de la
interacción para la producción de xilanasas al día 5 de fermentación. (a,b) efectos del pH y tamaño
de partícula; (c,d) efectos del pH y la altura de lecho; (d,e) efectos del tamaño de partícula y la
altura de lecho. La variable de respuesta aumenta de negro a rojo
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Th003
Los gráficos de superficie de respuesta y los gráficos de contorno se muestran en la Figura

24 (a-f), los cuales representan las interacciones entre dos variables manteniendo las
terceras variables en sus niveles medios.
Tanto en la Figura 24a, b como en la Figura 24c, d, se puede observar que no hay una
interacción con un único punto óptimo entre las variables independientes, por consiguiente,
es necesario de otro diseño experimental para hallar los valores óptimos. El análisis de la
interacción del pH*altura (Figura 24c, d) sugiere que a mayor pH y mayor altura de lecho
se disminuye la actividad enzimática siendo la altura de lecho el factor que más efecto
ejerce sobre la actividad. La distribución de los datos en los gráficos (superficie de
respuesta curva (Figura 24e) y contornos elípticos (Figura 24f) demuestra que el modelo
contiene términos cuadráticos que son estadísticamente significativos, es decir existen
fuertes interacciones significativas entre los dos factores. Los contornos elípticos obtenidos
en la Figura 24f indican una fuerte interacción entre las variables independientes tamaño
de partícula * altura de lecho siendo la altura de lecho el factor que más efecto ejerce sobre
la actividad enzimática. El análisis sugiere que a menor altura de lecho y mayor tamaño de
partícula se obtienen mayores actividades enzimáticas.
De acuerdo con la predicción de respuesta múltiple, la configuración óptima de los

parámetros fisicoquímicos para obtener la máxima actividad de xilanasa es: pH 5; tamaño
de partícula 5 cm, y altura de lecho de 0,5 cm.
4.3.1.1. Validación
La validación de los parámetros fisicoquímicos óptimos de acuerdo con la predicción del

modelo se verificó experimentalmente por medio de cinco fermentaciones (Tabla 22).
xilanasas a partir de Trichoderma koningiopsis Th003
Desviación Rango
Actividad enzimática Promedio
Validación estándar Predicción
(U/gss) experimental (U/gss)
(DS) (U/gss)
1 1380,43
2 1277,01
3 1307,13 1291,29 70,55 1276 - 1949
4 1279,81
5 1211,97
PDFelement
Capítulo 4 85
La producción de xilanasa al día 5, en condiciones óptimas produjo una actividad promedio

de 1291,29 ± 70,55 U/gss, en comparación con el rendimiento previsto, el cual se
encontraba en un rango entre 1276 - 1949 U/gss. La excelente correlación entre los valores
experimentales y los pronosticados, ratifica la validez del modelo.
El pH es uno de los parámetros cruciales de los procesos de FES, este parámetro afecta
directamente el transporte entre las membranas celulares, el crecimiento del hongo y la
producción de enzimas (Ezeilo et al., 2019b). Cada microorganismo tiene un rango de pH
dentro del cual es posible su crecimiento y normalmente posee un pH óptimo bien definido
para el desarrollo de sus funciones metabólicas (Nanjundaswamy & Okeke, 2020). Sin
embargo, debido a la dificultad para monitorear el pH en los procesos de FES, el pH
normalmente no es un parámetro que se controle durante el proceso, sino se realiza un
ajuste de este al inicio de la fermentación y las variaciones durante el tiempo de
fermentación generalmente no se tienen en cuenta (Yoon et al., 2014). Trichoderma sp
posee un amplio rango de pH para su crecimiento, puede crecer en sustratos con pH neutro
(pH 7) hasta pH ácidos (pH 4). Las condiciones ácidas de los sustratos incrementan la tasa
de crecimiento del hongo reflejándose en la formación de conidióforos, la germinación de
conidios y por consiguiente en la producción de enzimas necesarias para el crecimiento
(Pérez-Rodríguez et al., 2014). Pachauri, et al., observaron una mayor producción de
enzimas FPasa (120,15 U/gss), CMCasa (253,67 U/gss) y xilanasa (87,56 U/gss) de
Trichoderma koningii a un pH 6, a partir de carboximetilcelulosa (CMC) y sulfato de amonio
como fuente de carbono y nitrógeno respectivamente (Pachauri et al., 2017). Por otro lado,
Pathak, Bhardwaj, & Singh, encontraron que el pH 6,5, era el pH óptimo para la producción
de enzimas FPasas (6,85 ± 0,25 U/gss) y CMCasa (23,52 ± 0,94 U/gss) de Trichoderma
harzianum a partir de salvado de trigo y sulfato de amonio como fuentes de carbono y
nitrógeno respectivamente. Para la obtención de enzimas xilanasas encontraron que el pH
óptimo correspondía a pH 6, obteniendo una actividad máxima de 1280,3 ± 78,4 U/gss
(Pathak et al., 2014). Paganini et al., obtuvieron una actividad máxima de Fpasa (0,26
U/gss), CMCasa (64,56 U/gss) y xilanasa (351,74 U/gss) a partir de Trichoderma viridae
utilizando bagazo de caña y salvado de trigo como sustrato de fermentación con un pH
ajustado de pH 4,5 (Marques et al., 2018).
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Th003
Por lo anterior, se puede afirmar que la producción de enzimas, principalmente las que
hacen parte de la hidrólisis del complejo lignocelulósico, pueden variar entre especies,
incluso entre especies pertenecientes al mismo género taxonómico. Sin embargo, se
evidencia que la máxima producción de FPasas y CMCasas se obtiene entre un intervalo
de pH entre 6 y 7, mientras que la producción máxima de xilanasas se da con pH más
ácidos (entre pH 4,5 y pH 5,0), tal y como se evidenció en los resultados obtenidos en esta
investigación, en donde obtuvimos que la máxima actividad FPasa (0,503 ± 0,03 U/gss) se
dio en pH 7, la actividad CMCasa (2,65 ±0,17 U/gss) a pH 6 y la actividad xilanasa (1227,86
± 19,69 U/gss) a pH 5.
El tamaño de partícula del sustrato y la altura de lecho son dos parámetros involucrados
en la FES que están relacionados entre sí, debido a que están vinculados con la capacidad
del sistema para la transferencia de calor y masa durante el proceso (Krishna, 2005).
Debido a que la velocidad de transferencia del oxígeno al espacio vacío que es ocupado
por el aire afecta el crecimiento, el sustrato deber contener partículas del tamaño adecuado
y alturas de lecho adecuadas para mejorar la transferencia de masa (Mohamad Ikubar,
Abdul Manan, Md. Salleh, & Yahya, 2018). Generalmente, las partículas más pequeñas
proporcionarían un área superficial más grande en la cual el hongo podría crecer más
fácilmente. Sin embargo, se pudo observar que las partículas muy pequeñas en
combinación con alturas de lecho muy altas provocan aglomeración del sustrato inhibiendo
el crecimiento por la acumulación de altas concentraciones de CO2 y la baja disponibilidad
de O2 dentro del sistema (Mohamad Ikubar et al., 2018), un ejemplo de esto es el obtenido
en el tratamiento 11 (T11), con el menor tamaño de partícula (0,2 cm) y la mayor altura de
lecho (3,5 cm) en donde se obtuvieron bajas actividades 0,606 ± 0,1 U/gss y 424,74 ±
13,41 U/gss de CMCasa y xilanasa respectivamente en comparación con los mejores
tratamientos obtenidos para FPasa (T6) (0,503 ± 0,03 U/gss), CMCasa (T10) ( 2,656 ± 0,17
U/gss) y xilanasa (T5) (1227,86 ± 19,69 U/gss) los cuales tenían partículas más grandes
(1 cm) y alturas de lecho más bajas (0,5 cm). Las partículas más grandes proporcionan
una mejor eficiencia de respiración, pero proporcionan una superficie limitada para la
colonización del microorganismo (Krishna, 2005).
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Capítulo 4 87
4.3.3 Efecto de la aireación

Los resultados de la evaluación del efecto de aireación sobre la producción de enzimas
FPasa, CMCasa y xilanasa al día 5 de fermentación se muestran en la Figura 25. Se puede
observar que en los tratamientos T1 y T2, los cuales corresponden a aireación baja y alta
respectivamente no se obtuvo producción de enzima FPasa.
Unidades de actividad FPasa y CMCasa (U/gss)
3,0 900
2,8
Unidades de actividad xilanasa U/gss

FPasa 800
2,6 CMCasa
2,4 Xilanasa
700
2,2
2,0 600
1,8
500
1,6
1,4
400
1,2
1,0 300
0,8
200
0,6
0,4
100
0,2
0,0 0
T1 T2
Tratamiento
Figura 25. Efecto de la aireación sobre la producción de enzimas FPasa, CMCasa y
xilanasa al día 5 de fermentación.
En cuando a la actividad CMCasa y xilanasa, se puede observar que existen diferencias

significativas entre los dos tratamientos (p=0,000). La máxima actividad CMCasa y
xilanasa se obtiene con el tratamiento T1 (aireación baja) obteniendo 1,611 ± 0,04 U/gss y
840,79 ± 20,26 U/gss de actividad CMCasa y xilanasa, respectivamente. Estas actividades
representan un 382,3% y 373,6% más de actividad en comparación con el tratamiento T2
(CMCasa: 0,334 ± 0,03 U/gss y xilanasa: 177,53 ± 4,36 U/gss).
El control del calor metabólico en los procesos de FES es muy importante ya que afecta el
crecimiento del microorganismo, la formación de esporas y la germinación, así como
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Th003
también la formación de los productos de interés (Krishna, 2005). Su eliminación es

probablemente el factor crucial en los procesos de FES, por tal motivo se utilizan sistemas
de aireación y/o agitación para mantener las condiciones de temperatura controladas (Lee,
Darah, & Ibrahim, 2017). Sin embargo, la aireación tiene efectos adversos, ya que con
flujos muy altos puede haber pérdidas de humedad, impidiendo el buen desarrollo del
microorganismo dentro del fermentador y por consiguiente baja producción de enzimas.
En la Tabla 23, se puede observar que hubo una disminución de la actividad enzimática
cuando se utiliza el sistema de fermentación con aireación (T1 y T2), esto posiblemente
debido al alto flujo de aire inyectado que disminuyó la humedad del sustrato durante el
proceso.
Tabla 23. Porcentaje de humedad del sustrato al final del proceso de FES.
Humedad FPasa CMCasa Xilanasa

Tratamiento
(%) U/gss
T1 70,23 ± 0,68 - 1,619 ± 0,04 840,79 ± 20,26
T2 61,49 ± 1,78 - 0,334 ± 0,03 177,53 ± 4,36
Bioreactor
82,96 ± 0,74 0,275 ± 0,03 1,83 ± 0,21 1261,05 ± 32,9
en bandejas
Se puede apreciar que los tratamientos T1 y T2, presentaron menor humedad durante el
proceso (70,23% ± 0,68 y 61,49% ± 1,78 respectivamente) y por consiguiente menores
actividades enzimáticas en comparación con las fermentaciones realizadas en bandejas,
las cuales mantuvieron su humedad por encima del 80% (82,96% ± 0,74). De acuerdo con
estos resultados, se puede señalar que las condiciones de flujo evaluadas en este estudio
no son las adecuadas para la producción de enzimas celulolíticas y hemicelulolíticas, pues
se observa una disminución considerable en la actividad enzimática de T. koningiopsis
Th003.
La mayoría de las células viables se caracterizan por un contenido de humedad entre 70-
80%, sin embargo, para la producción de xilanasas se tiene estimado que una humedad
óptima puede estar entre el 70-85% (Lee et al., 2017). Pérez-Rodríguez et al., evaluaron
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Capítulo 4 89
la producción enzimática de Aspergillus niger en un biorreactor de tubo horizontal utilizando

como sustrato mazorcas de maíz a un flujo de 0,2 L/min, en donde obtuvieron una actividad
xilanasa y FPasa de 2926 U/gss y 1,116 U/gss respectivamente (Pérez-Rodríguez et al.,
2014), por tal motivo, es necesario encontrar una tasa de flujo de aireación óptima para
evitar la pérdida de humedad que afecta los procesos metabólicos del hongo.
Para el caso de Trichoderma sp, Rocky-Salimi & Hamidi-Esfahani, evidenciaron que la

aireación aumentó el crecimiento de T. reesei y la producción de enzimas celulasas. Sin
embargo, determinaron que a un flujo de aireación mayor a 0,526 L/min se produce un
secado del sustrato lo que conduce a una disminución en la producción (Rocky-Salimi &
Hamidi-Esfahani, 2010) .
4.3.4 Actividad enzimática antes y después de la optimización

La Tabla 24 resume la evolución observada de las enzimas FPasa, CMCasa y xilanasa
durante toda la investigación. A pesar de que las optimizaciones se realizaron a partir de
la actividad xilanasa, las actividades FPasa y CMCasa tuvieron cambios en las diferentes
condiciones analizadas. En cualquier caso, las actividades de estas dos enzimas fueron
“residuales” en comparación con la actividad xilanasa ya que está reportado que hongos
del género Trichoderma tienen una alta actividad FPasa y CMCasa, por ejemplo, de
acuerdo con Pachauri et al., T. koningii es capaz de producir 120,15 U/gss de FPasa y
253,67 U/gss de CMCasa utilizando como sustrato bagazo de caña suplementado con
sulfato de amonio (Pachauri et al., 2017). Marques et al., reportan que T. viridae produce
0,26 U/gss y 64,54 U/gss de FPasa y CMCasa respectivamente, a partir de bagazo de
caña y salvado de trigo como sustratos de fermentación (Marques et al., 2018) y Astolfi et
al., obtuvieron una actividad de 6,71 U/gss de FPasa y 20,7 U/gss de CMCasa utilizando
como sustrato cáscara de fríjol para una cepa de T. reesei. Por lo anterior los extractos
obtenidos después de la fermentación de T. koningiopsis Th003 pueden considerarse
como extractos de xilanasa mayoritariamente.
No solo se muestra un aumento en la actividad xilanasa a medida que se variaron las

condiciones de fermentación, sino también un incremento en términos de productividad,
como se puede observar en los resultados de la Tabla 25. La productividad aumentó desde
69,69 U/gss/día hasta 252,21 U/gss/día, (261,9%) con respecto a las condiciones iniciales
de fermentación.
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Th003
Tabla 24. Actividades enzimáticas antes y después de la optimización.
FPasa CMCasa Xilanasa

U/gss
Sin pretratamiento 0,846 ± 0,03 2,09 ± 0,04 348,46 ± 1,91
Pretratamiento con NaOH 5% 0,95 ± 0,06 2,18 ± 0,21 579,94 ± 5,39
Selección fuente de nitrógeno
1,095 ± 0,06 3,309 ± 0,49 889,12 ± 2,05
(Ext levadura)
Optimización parámetros
0,704 ± 0,18 1,74 ± 0,35 1130,41 ± 20,4
nutricionales
0,503 ± 0,03 2,65 ± 0,17 1291,29 ± 70,5
fisicoquímicos
Parámetros nutricionales y
0,275 ± 0,03 1,834 ± 0,21 1261,05 ± 32,9
fisicoquímicos óptimos
Tabla 25. Productividad y porcentaje de aumento de la actividad enzimática con la

optimización
Xilanasa Productividad Aumento

U/gss (U/gss/día) (%)
Sin pretratamiento 348,46 ± 1,91 69,69 -
Pretratamiento con NaOH 5% 579,94 ± 5,39 115,98 66,4
Selección fuente de nitrógeno (Ext
889,12 ± 2,05 177,8 155,12
levadura)
1130,41 ± 20,4 226,08 224,4
nutricionales
1291,29 ± 70,5 258,25 270,56
fisicoquímicos
Parámetros nutricionales y
1261,05 ± 32,9 252,21 261,9
fisicoquímicos óptimos
4.4 Conclusiones parciales

En los diseños experimentales se encontró que el término cuadrático de la relación
bagazo/salvado, el término cuadrático del extracto de levadura, y todos los términos
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Capítulo 4 91
fisicoquímicos evaluados, con excepción de la interacción pH* altura, tuvieron un efecto

significativo.
La relación bagazo/salvado 1:0,8 con 3,2 g/L de extracto de levadura, (los niveles mas
bajos estudiados), maximizan la producción de xilanasas.
Un pH inicial de sustrato de 5, una altura de lecho de 0,5 cm y un tamaño de partícula de

5 cm maximizan la producción de xilanasas.
Bajo los flujos de aire evaluados en este estudio, no fue posible el aumento de la
producción enzimática, muy probablemente por la disminución de la humedad causada por
el flujo de aire.
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5. Conclusiones y recomendaciones
Conclusiones
El bagazo de caña pretratado con NaOH mejoró en un 261,9% la producción de enzimas
xilanasas con respecto a la biomasa lignocelulósica sin pretratar. Esta mejora puede
atribuirse a la modificación de la estructura lignocelulósica, donde este pretratamiento se
enfoca principalmente en la precipitación de la lignina para dejar expuesta la hemicelulosa
y la celulosa.
El uso de una fuente de nitrógeno tuvo un efecto positivo para la producción de FPasa,
CMCasa y especialmente para la producción de xilanasas. El extracto de levadura permitió
aumentar la actividad xilanasa en un 155,12% en comparación con las fermentaciones
realizadas sin adición de fuente de nitrógeno, adicionalmente, se logró disminuir de 7 días
a 5 días de fermentación.
El sustrato de fermentación que contiene una mezcla de bagazo/salvado (1:0,8); extracto

de levadura 3,2 g/L; pH 5,0; tamaño de partícula 5 cm y altura de lecho de 0,5 cm durante
5 días da como resultado una producción máxima de xilanasas de 1261,05 ± 32,9 U/gss
la cual corresponde a un 261,9% mas de actividad al sustrato inicial. Esta configuración
fue validada experimentalmente mostrando una correlación con los valores pronosticados.
Los resultados obtenidos de la evaluación del efecto de la aireación indicaron que, bajo los
flujos evaluados en este estudio, no fue posible aumentar la producción enzimática debido
probablemente a la disminución de la humedad durante el proceso de fermentación. Hubo
una disminución de la actividad enzimática con los flujos de aire probados.
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94 Título de la tesis o trabajo de investigación
Recomendaciones
Hacer reúso del bagazo pretratado, teniendo en cuenta que al final de la fermentación
queda un porcentaje considerable de hemicelulosa y celulosa para disminuir el uso del
NaOH que genera residuos químicos
Para disminuir costos de producción y llegar a un único punto óptimo, evaluar relaciones
de bagazo/salvado y concentraciones de extracto de levadura menores a los estudiados
en esta investigación.
Se deben evaluar menores flujos de aireación para optimizar el proceso de fermentación

con aireación, también se deben considerar factores como transferencia de calor y el
contenido de humedad, dada la estrecha relación entre ellos.
Realizar la caracterización del extracto enzimático y pruebas de estabilidad (Temperatura

y tiempo de incubación óptima, intervalos de pH)
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A. Anexo: Curva de calibración de

glucosa para la cuantificación de
enzimas FPasa y CMCasa en
espectrofotómetro
1,2
y = 0,5453x - 0,0222
R² = 0,9974
1
0,8
Abs 540nm
0,6
0,4
0,2
0
0 0,5 1 1,5 2 2,5
Concentración glucosa g/L
Cálculo de la actividad FPasa y CMCasa
- Se realizó la curva de calibración utilizando diferentes concentraciones de glucosa

como patrón (0,2 -3,0 g/L). Se determinó la ecuación de la recta y el R2
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- La absorbancia obtenida de cada actividad enzimática se sustituyó por Y en la

ecuación y se despejó X. X corresponde a los mg de azúcares reductores/mL de
solución.
𝒈 𝒂𝒃𝒔 𝟓𝟒𝟎𝒏𝒎 + 𝟎, 𝟎𝟑𝟏𝟖
𝑿( )=
𝑳 𝟎, 𝟑𝟒𝟓𝟒
- Para hallar las unidades de actividad enzimática/mL entonces:

𝑼 (𝒈/𝑳)𝒙(𝑽𝒐𝒍𝒖𝒎𝒆𝒏 𝒅𝒆𝒍 𝒆𝒏𝒔𝒂𝒚𝒐)
=
𝑳 (𝒕𝒊𝒆𝒎𝒑𝒐 𝒅𝒆 𝒓𝒆𝒂𝒄𝒄𝒊ó𝒏) ∗ (𝒗𝒐𝒍𝒖𝒎𝒆𝒏 𝒅𝒆 𝒍𝒂 𝒆𝒏𝒛𝒊𝒎𝒂) ∗ (𝒈/𝒎𝒎𝒐𝒍 𝒈𝒍𝒖𝒄𝒐𝒔𝒂)
FPasa CMCasa
Volumen ensayo: 1,5mL Volumen ensayo: 0,5mL

Tiempo de reacción: 30min Tiempo de reacción: 30min
Volumen de la enzima: 0,5mL Volumen de la enzima: 0,25mL
Glucosa (g/mmol): 0,18016 Peso glucosa (g/mmol): 0,18016
- Para halla las unidades de actividad enzimática/gramo de sustrato seco entonces:
𝑼 𝑼
= ( ) /𝑭𝒂𝒄𝒕𝒐𝒓 𝒔𝒆𝒄𝒐
𝒈𝒔𝒔 𝑳
El factor seco se determinó por la humedad del sustrato. La humedad se determinó usando
una balanza de humedad Kern® MLS 50-3, para esto se tomó un g de sustrato de las
bandejas correspondientes a los días de fermentación y se secó hasta peso constante.
Con el dato de humedad se determinaron los gramos de sustrato seco (gss) usando la
ecuación que se describe a continuación:
Ecuación 1.
100
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B. Anexo: Curva de calibración de

xilosa para la cuantificación de
enzima xilanasa en
espectrofotómetro
1,200
y = 0,5433x - 0,0304
R² = 0,9982
1,000
0,800
ABS 540nm
0,600
0,400
0,200
0,000
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
Concentración xilosa (g/L)
Cálculo de la actividad xilanasa
- Se realizó la curva de calibración utilizando diferentes concentraciones de xilosa

como patrón (0,2 -3,0 g/L). Se determinó la ecuación de la recta y el R2
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- La absorbancia obtenida de cada actividad enzimática se sustituyó por Y en la

ecuación y se despejó X. X corresponde a los g de azúcares reductores/mL de
solución.
𝒈 𝒂𝒃𝒔 𝟓𝟒𝟎𝒏𝒎 + 𝟎, 𝟎𝟐𝟔𝟏
𝑿( )=
𝑳 𝟎, 𝟑𝟒𝟑𝟕
- Para hallar las unidades de actividad enzimática/mL entonces:

𝑼 (𝒈/𝑳)𝒙(𝑽𝒐𝒍𝒖𝒎𝒆𝒏 𝒅𝒆𝒍 𝒆𝒏𝒔𝒂𝒚𝒐)
=
𝑳 (𝒕𝒊𝒆𝒎𝒑𝒐 𝒅𝒆 𝒓𝒆𝒂𝒄𝒄𝒊ó𝒏) ∗ (𝒗𝒐𝒍𝒖𝒎𝒆𝒏 𝒅𝒆 𝒍𝒂 𝒆𝒏𝒛𝒊𝒎𝒂) ∗ (𝒈/𝒎𝒎𝒐𝒍 𝒅𝒆 𝒙𝒊𝒍𝒐𝒔𝒂)
Xilanasa
Volumen ensayo: 0,5mL

Tiempo de reacción: 60min
Volumen de la enzima: 0,250mL
Peso xilosa (g/mmol): 0,15013
- Para halla las unidades de actividad enzimática/gramo de sustrato seco entonces:
𝑼 𝑼
= ( ) /𝑭𝒂𝒄𝒕𝒐𝒓 𝒔𝒆𝒄𝒐
𝒈𝒔𝒔 𝑳
El factor seco se determinó por la humedad del sustrato. La humedad se determinó usando
una balanza de humedad Kern® MLS 50-3, para esto se tomó un g de sustrato de las
bandejas correspondientes a los días de fermentación y se secó hasta peso constante.
Con el dato de humedad se determinaron los gramos de sustrato seco (gss) usando la
ecuación que se describe a continuación:
Ecuación 1.
100
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C. Anexo: Curva de calibración de

xilosa para la cuantificación de
enzima Fpasa, CMCasa y xilanasa en
microplaca
1,2
y = 0,3454x - 0,0318
R² = 0,9994
1
0,8
Absorbancia 540nm
0,6
0,4
0,2
0
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5
Concentración Glucosa g/L
Series1 Series2 Series3 Lineal (Series3)

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1,2
y = 0,3437x - 0,0261
1 R² = 0,9992
0,8
Absorbancia 540nm
0,6
0,4
0,2
0
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5
Concentración xilosa (g/L)
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D. Prueba de normalidad diseño

factorial Ext Levadura
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E. Prueba de Bartlett Levene diseño

factorial Ext Levadura
Prueba de igualdad de varianzas: Xylanasa vs. Tratamiento

Prueba de Bartlett
Control
Valor p 0,000
T1
Tratamiento
T2
T3
T4
T5
0 500 1000 1500 2000 2500

Intervalos de confianza de Bonferroni de 93% para Desv.Est.
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Bibliografía 103
F. Prueba de normalidad diseño

central compuesto
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G. Prueba de Bartlett Levene diseño

central compuesto
Prueba de igualdad de varianzas: Xilanasa vs. Tratamiento

T1 Prueba de Bartlett
Valor p 0,000
T2
T3
T4
Tratamiento
T5
T6
T7
T8
T9
0 100 200 300 400 500

PDFelement
Bibliografía 105
H. Prueba de normalidad box

behnken
PDFelement
I. Prueba de Bartlett Levene box

Behnken
Prueba de igualdad de varianzas: Xilanasa vs. Tratamiento

T1 Prueba de Bartlett
T10 Valor p 0,659
T11
T12
T13
Tratamiento
T2
T3
T4
T5
T6
T7
T8
T9
0 100 200 300 400 500
PDFelement
Bibliografía 107
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María Alejandra Jaramillo Rodríguez

Universidad Nacional de Colombia

María Alejandra Jaramillo Rodríguez

Universidad Nacional de Colombia

A la vida, mis padres, hermanos y Alaska.

A mis papas y hermanos, por apoyarme en esta locura.

A AGROSAVIA por darme la oportunidad de desarrollar mi trabajo.

A Luis Antonio Soto, por la ayuda en el laboratorio.

A Freddy Escobar: Por salvarme de muchas (siempre).

Finalmente, a ti (Mono), por darme paz y tranquilidad.

Palabras clave: xilanasas, celulasas, bagazo de caña, fermentación en estado

Keywords: xylanases, cellulases, sugarcane bagasse, solid state fermentation.

1. Marco teórico ............................................................................................................ 7

2. Evaluación de pretratamientos químicos para la producción de hemicelulasas

3. Selección de parámetros físicos, biológicos y nutricionales para la producción

4. Optimización de los parámetros fisicoquímicos y nutricionales y efecto de la

4.2.5 Obtención del extracto enzimático y métodos analíticos .................................. 69

5. Conclusiones y recomendaciones ........................................................................ 93

Figura 18. Diagrama de Pareto de los efectos de la relación bagazo/salvado y extracto

Tabla 1. Métodos de pretratamiento utilizados en la biomasa lignocelulósica ................ 10

Tabla 24. Actividades enzimáticas antes y después de la optimización. ......................... 90

El ensilaje, es un proceso de fermentación anaerobia de forraje verde de pastos,

microorganismos, principalmente patógenos, favoreciendo su conservación (Dogi

En AGROSAVIA (Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria) se han

microbiología pecuaria de AGROSAVIA, el cultivo de avena forrajera arrojó como

Por tal motivo, es necesaria la búsqueda de sustratos que favorezcan la producción

En ese sentido, la biomasa lignocelulósica es una de las materias primas más

Uno de los muchos ejemplos de esta biomasa es la producida por el sector

Como se mencionó anteriormente, entre los residuos lignocelulosicos

hidrotérmicos, y ácidos son los más comúnmente utilizados para mejorar la

Posteriormente, se logra la hidrólisis de la biomasa lignocelulósica previamente

Por lo anterior, la producción de enzimas celulolíticas por T. koningiopsis Th003

Por lo anterior, surge la pregunta de investigación ¿cuáles son los parámetros

Para dar respuesta a la pregunta de investigación, se presentarán cinco capitulos

▪ Establecer a escala laboratorio las condiciones fisicoquímicas y nutricionales del

1.1 Biomasa lignocelulósica

La biomasa lignocelulósica es uno de los recursos renovables de carbono orgánico en la

1.2 Composición química de la biomasa lignocelulósica

La pared celular de la biomasa lignocelulósica consiste en una mezcla compleja de

Adicionalmente también se pueden encontrar ácidos como el ácido galacturónico,

1.3 Limitaciones de la conversión de la biomasa

Debido a las propiedades de los polímeros presentes en la estructura de la biomasa

Una variedad de pretratamientos han sido desarrollados con el objetivo de desintegrar la

Tabla 1. Métodos de pretratamiento utilizados en la biomasa lignocelulósica

Químicos Físicos Fisicoquímicos Biológicos

1.4.1 Pretratamientos físicos

La molienda es otro de los pretratamientos físicos utilizados, ya que aumenta el área de

La biomasa lignocelulósica puede pretratarse usando el método de congelación; el

El pretratamiento con ultrasonido es otra alternativa, a través de la deslignificación y

1.4.2 Pretratamiento químico

1.4.3 Pretratamiento fisicoquímico

1.4.4 Pretratamiento biológico

1.5 Hidrólisis de la biomasa lignocelulósica pretratada

Varios microorganismos son capaces de producir enzimas que degradan la celulosa y la

▪ Las endoxilanasas (endo-1,4-β-xilanasa (EC 3.2.1.8) y endo-1,3-β-xilanasa (EC

respectivamente, de la cadena principal del xilano de manera aleatoria liberando

▪ Las exoxilanasas (exo-1,4-β-xilosidasa (EC 3.2.1.37) y exo-1,3-β-xilosidasa (EC

Cuando la hemicelulosa presenta ramificaciones, la hidrólisis se ve favorecida por la acción

▪ Microorganismos productores de hemicelulasas

Tabla 2. Producción de xilanasas por diferentes hongos

Aspergillus niger 42,5 U/g

Trichoderma harzianum 288 U/mL