PROPUESTA DE TRABAJO

Implementación de un método analítico de espectrometría de masas de

imágenes por matriz asistida láser por desorción/ionización (MALDI),
para análisis de lesiones de Leishmaniasis cutánea (LC), piel sana y piel
con LC (no tratados).

Implementación del MALDI-MSI en piel sana y con LC

Obtención y procesamiento de la piel (Colombia)
Se realizará a partir de piel normal de ratones. Después del sacrificio, se obtendrá
piel de la parte dorsal sin lesiones. Se dejarán 5 secciones de piel con tejido
subcutáneo y 5 secciones de piel sin tejido subcutáneo. Una vez retirada la piel una
parte se crio-preservará a -80°C y otra será fijada con formalina al 10% e incluidas
en parafina.
Con la piel crio preservada se realizarán cortes de 10-12μm utilizando un criostato
CM1850-UV 3-1/Leica Microsystems®. Estos serán recolectados en láminas
portaobjetos de indio-estaño (ITO), se realizarán tres cortes por cada lámina, se
realizarán lavados de alcohol, se dejarán secar para la aplicación de la matriz.
Con la piel incluida en parafina se realizarán cortes de 3 - 4μm utilizando un
micrótomo RM2135/Leica Microsystems®. Estos se recolectarán en láminas
portaobjetos de indio-estaño (ITO), se realizarán tres cortes por cada lámina, las
secciones de tejido serán desparafinadas y rehidratadas con alcoholes en
concentraciones ascendentes.
el número de muestras analizar es de 20 en total, las cuales serán distribuidas de a
cuatro por slide.
Selección y aplicación de la matriz
Se ensayarán dos tipos de matriz ácido α-ciano-4-hidroxicinámico (HCCA) y ácido
2,5-dihidroxibenzoico (DHB) para observar la relación señal/ruido y el rendimiento
de cada una en el tejido de estudio. La matriz será aplicada utilizando un sprayer
Suncollect prayer (Sunchrom, Germany). utilizando los métodos estándar del equipo
para cada matriz.
Adquisición de datos
Las muestras serán analizadas en un espectrómetro de masas Bruker tims Tof Flex
(Bruker Daltonik GmbH, Fahrenheitstr, Alemania). Como resultados se obtendrán
imágenes y espectros de masas de los péptidos y proteínas. Se realizará un análisis
estadístico utilizando los softwares RStudio®, R®, (Chaurand, Sanders, Jensen, &
Caprioli, 2004), para permitir la interpretación de imágenes con relaciones m/z en
los espectros, así como tambien los componentes del tejido y su distribución de
péptidos y proteínas con una región particular del tejido.

Aplicación de un método MALDI-MSI en LC tratadas por diferentes vías

tópica, intralesional e intraperitoneal con PMD.

Determinación de la expresión diferencial in situ de proteínas y péptidos

Se realizará en las biopsias de lesiones de LC de los ratones tratados con diisetionato
de pentamidina, PMD por las diferentes vías (tópica, IL e IP). Las muestras tratadas
y con la matriz se analizarán en el espectrómetro de masas Bruker tims Tof Flex
(Bruker Daltonik GmbH, Fahrenheitstr, Alemania). utilizando el método propuesto
en la fase anterior. Como resultados se obtendrán imágenes y espectros de masas
de los péptidos y proteínas. Se realizará un análisis estadístico utilizando los
softwares RStudio®, R®, (Chaurand et al., 2004) para permitir la interpretación de
imágenes con relaciones m/z en los espectros, así como tambien los componentes
del tejido y su distribución (m/z), correlacionar el de péptidos y proteínas con una
región particular del tejido.
Distribución in situ de la PMD y sus metabolitos en lesiones de LC después
de ser administrada por diferentes vías.
Se tomarán biopsias de lesiones de los ratones tratados (tópico, intralesional e
intraperitoneal) que serán procesadas y analizadas de acuerdo con la metodología
descrita en la fase I. Se obtendrán imágenes de la PMD y sus metabolitos presentes
en las diferentes capas de la piel. Los resultados serán expresados como intensidad
vs la relación masa/carga de PMD y metabolitos y su co-localización en el tejido
(capas de la piel).
Análisis de resultados
Para el análisis de los resultados de este proyecto se tendrán en cuenta las variables

Fase Actividad Tipo De Ensayo Tipo De Variable

Tejido fresco
Muestra (piel sana y con Cuantitativa nominal
(10-12µm)
LC)
Tejido sano (3-4µm) Cuantitativa nominal
Número de picos en
espectro con Cuantitativa nominal
Matriz (HCCA)
Número de picos en
FASE III Cuantitativa nominal
espectro con (DHB)
Resolución de
Cuantitativa nominal
scanner
Condiciones del equipo
Raster size Cuantitativa nominal
Reflector Cuantitativa nominal
Expresión de proteínas/o Imagen Cualitativa nominal
péptidos Espectro (m/z) Cualitativa nominal
Expresión de proteínas/o Imagen Cualitativa nominal
péptidos Espectro (m/z) Cualitativa nominal
FASE IV
Perfil de PMD y Imagen Cualitativa nominal
metabolitos Espectro (m/z) Cualitativa nominal

El análisis estadístico se realizará para resaltar los péptidos y las proteínas que se
encuentran relacionadas en cada uno de los ensayos (piel sana, piel con lesión, piel
con lesión tratada piel con lesión sin tratar). Se utilizarán los softwares RStudio®,
R®, Felximaging 3.0, Rcardinal MSI®, Scils® entre otros.

Resultados esperados
Al finalizar este trabajo de investigación se esperan los siguientes resultados:
• Encontrar diferencias en la expresión de proteínas y péptidos, in situ entre (la
piel sana y lesionada con LC, la piel lesionada con LC con tratamiento con
PMD y sin tratamiento, la piel lesionada con LC entre las diferentes vías de
aplicación PMD).
• Contribuir en la implementación de métodos analíticos de espectrometría de
masas de imágenes para el análisis de piel de ratón y lesiones de
leishmaniasis cutánea en el laboratorio de espectrometría de masas de la
Universidad Industrial de Santander.
• Fortalecer el análisis de tejidos por la técnica MALDI-MSI para análisis de
tejidos para implementarla en la Universidad Industrial de Santander UIS,
inicialmente para piel y LC, y luego se podrán establecer protocolos para
análisis de otros tejidos, que beneficiarán otros grupos de investigación en el
área de salud de la UIS e incluso ofrecer servicios para análisis de tejidos a
otras instituciones o centros del departamento de Santander y a nivel
nacional.
• Divulgar los resultados encontrados en un artículo científico en revistas
indexadas.

Ene-feb Mar-Abr
ACTIVIDADES 2022 2022

1. Obtención y procesamiento de la piel

2. Selección y aplicación de la matriz.

3. Adquisición de datos.

4. Análisis de la expresión diferencial de

proteínas y péptidos.

Análisis de resultados

Informe final