Informe de separación de macromoléculas

Fecha de la práctica: 02 de octubre 2021

Grupo: G3B

Angie Vanessa Valencia Hurtado (1005891088); Natalia Vélez Hernández

(1192788289); Isabella Villanueva Gallego (1006207997)

angie.valencia06@usc.edu.co , natalia.velez00@usc.edu.co ,
isabella.villanueva00@usc.edu.co

Facultad de Ciencias Básicas, Universidad Santiago de Cali, Laboratorio

de Bioquímica ZB192, Cali, Colombia

Resumen

En esta práctica de laboratorio se llevaron a cabo la identificación y extracción

de macromoléculas, las cuales fueron, glucógeno, ácidos nucleicos y proteínas,
estas macromoléculas se sacaron de la levadura (Saccharomyces cerevisiae).
Se inició con la prueba de determinación cualitativa de glucógeno la cual se
hizo aplicando la prueba de lugol. Posteriormente se realizó la determinación
de ácidos nucleicos que se realizó con el método bial. Finalmente se realizó la
identificación de proteínas a través de la prueba de biuret. Se evidenciaron
resultados positivos para cada prueba que se realizó.

Introducción

La levadura, conocida desde la antigüedad, se ha convertido en un organismo

de estudio muy usual cuando se trabaja en un laboratorio, ya que esta se
encuentra presente en el pan, vino, cerveza (Saccharomyces cerevisiae), etc.
Con el paso de los años, mediante investigaciones biotecnológicas, se ha
logrado mejorar sus procesos e incluso innovarlos. Por otro lado, este
organismo se ha destacado en los laboratorios al convertirse en uno de los
organismos eucariotas mejor conocidos. La investigación de su secuencia
completa del genoma de Saccharomyces cerevisiae se finalizó en 1996, esto
después de cuatros años por un proyecto que lideró la Unión Europea y
participaron cientos de laboratorios de todo el mundo.

Adicionalmente, macromoléculas son moléculas formadas por la unión de unas

subunidades más pequeñas, por ende, se refiere a aquellas moléculas que
tienen pesos moleculares muy elevados, estos pueden ser mayores a 10.000
uma y por lo general existen dos tipos, pueden ser tanto orgánicos como
inorgánicos y los más comunes en bioquímica son los biopolímeros (ácidos
nucleicos, proteínas, carbohidratos y polifenoles) y los no poliméricos (como los
lípidos y macrociclos).

● Proteínas: Son componentes estructurales de las células, formadas por

cadenas de aminoácidos, las cuales controlan sus procesos metabólicos
y actúan como mensajeros químicos; además son partes muy
importantes en las enzimas, receptores celulares, etc. Se usa el reactivo
de Biuret para su identificación, este está compuesto de hidróxido de
sodio y sulfato de cobre. El grupo amino de la proteína reacciona con los
iones de cobre del reactivo, por ende, si hay presencia de proteína el
reactivo cambia de azul a violeta y si hay presencia de polipéptidos de
cadena corta, esta vira rosa.

Reacción 1. Complejo de cobre formado en la reacción de Biuret

● Glucógeno: Es un polisacárido de reserva energética el cual está

formado por cadenas ramificadas de glucosa, no es soluble en agua, por
lo que forma dispersiones coloidales (sistema formado por dos o más
fases, normalmente una fluida y la otra dispersa). Se usa la prueba de
Lugol, la cual es una disolución de yodo molecular (𝐼2) y yoduro de
Potasio (KI) en agua destilada. Para esta prueba se tienen dos controles
uno negativo (contiene el blanco) y uno positivo (contiene el Lugol mas
lo que se le añadió a la muestra), si la prueba genera un color azul
oscuro es porque la prueba está sin ningún contaminante (control
positivo), pero si se genera un color negro es porque el Lugol está
contaminado (control negativo).
 Imagen 1. Formación del complejo helicoidal entre el glucógeno y los
iones yoduro del Lugol

● Ácidos nucleicos: Son macromoléculas basadas en la genética

biomolecular, formado por repeticiones de nucleótidos, unidos mediante
enlaces fosfodiéster. En su formación de largas cadenas las moléculas
pueden ser de ácidos nucleicos que alcanzan tamaños muy grandes, de
millones de nucleótidos enlazados. Se usa el método de Bial para
identificar los ácidos nucleicos, el cual, este método se compone del
reactivo de orcinol, entonces si hay presencia de un ácido nucleico se
deshidrata para formar un furfural (aldehído aromático, con una
estructura en anillo) el cual reacciona con el orcinol para general un
compuesto coloreado. En este método también se usa controles,
entonces si durante el método se genera un color verde oscuro se
refiere a un control positivo y significa que en el proceso no hubo
errores, pero si genera un color verde-amarillo se refiere a un control
negativo y significa que el proceso no se hizo adecuadamente y puede
qué haya algun contaminante.

Reacción 2. Método del Bial con reactivo de Orcinol.

Parte Experimental

● Inicialmente se preparó la muestra de levadura con arena y ácido

tricloroacético, centrifugó durante 5 minutos, dónde el precipitado incluía
las proteínas y ácidos nucleicos, dónde el sobrenadante contenía el
glucógeno.

● Se realizó la preparación del glucógeno tomando 2 mL de sobrenadante

y 4 mL de alcohol etílico, posteriormente se llevó a un baño frío y
después a centrifugar, dónde se desechó el sobrenadante y se utilizó el
precipitado que se disolvió en agua

● Se realizó la prueba de lugol, colocando tres láminas de vidrio de tenían:

1. Control +: lugol + cebada

2.Muestra: Glucógeno + reactivo de yodo + H2O

3.Control-: agua + reactivo de yodo

● Se prepararon las proteínas y ácidos nucleicos: con 15 mL de NaCl, se

disolvieron poco a poco en el tubo de centrífuga, posteriormente se llevó
a un baño de agua hirviendo, calentado anteriormente, se dejó hervir
durante 10 minutos y se dejó enfriar.

● Se tomaron 13.5 mL de esa solución, se centrifugó por 3 min, el

precipitado proteico se dejó en un baño de hielo.

● Se realizó la prueba de ácidos nucleicos, tomando 3 mL de precipitado y

6 mL de alcohol etílico (frío), poner a baño frío.

Los ácidos nucleicos precipitaron, se tomaron 8.5 mL, se centrifugó al frío,

descartó el sobrenadante y disolvió en 1 mL de amortiguador salino.
 ● Se usó el método de bial, 0.5 mL de ácidos nucleicos, en dos tubos 2
mL de amortiguador salino. a cada tubo se le agrega 1 mL reactivo de
orcinol.

Tubo 1 (control -) : amortiguador

Tubo 2: amortiguador + ácidos nucleicos. Se dejó hervir por 5 min.

● Se realizó prueba para detección de proteínas, 2 ml de sol NaCl. Prueba

de biuret .

Se añadió a cada tubo 0,5 ml de solución sulfato de cobre , 1 mL de hidróxido

de sodio.

Tubo 1 : 1 mL precipitado de proteínas

Tubo 2: 1 mL sol NaCl

 Resultados y Discusión

PREPARACIÓN DE MUESTRAS

Muestra: Levadura ( saccharomyces ssp)

Pruebas y métodos Controles Observaciones

Muestra Negro
Prueba de lugol
Control + Cafe

Control - Beige

Prueba de Biuret Muestra Coloración violeta

Control - Coloración Azul

Método de Bial Muestra Coloración Verde

oscuro

Control - Coloración Verde

Tabla 1. Observaciones de la muestra por cada método

Discusión

La muestra de la levadura (Saccharomyces ssp), se rompió con un mortero

para dañar su pared celular (imagen 5), para qué así se pudieran extraer sus
macromoléculas más fácilmente. Luego la levadura se trató con ácido
tricloroacético 5%, esté se usa puesto qué el Glucógeno es una molécula muy
ramificada , por ende esto aumenta la solubilidad en los disolventes de baja
polaridad, entonces esto convierte al ácido tricloroacético en un buen solvente
para el glucógeno, ya qué la parte polar del ácido solubiliza las cadenas
carbonatadas del glucógeno y por consiguiente forma puentes de de hidrógeno
con los grupos hidroxilo, aumentando así la solubilidad, por esto es qué se
pudieron observar dos fases cuando se centrifugó (una fase qué tenía el
precipitado, esta llevaba con sigo las proteínas y el ácido nucleico, mientras
qué la otra fase contenía el sobrenadante, el cual el glucógeno solubilizado).La
centrifugación se realizó con el fin de optimizar y garantizar la separación de
las dos fases mencionadas anteriormente. El sobrenadante qué se obtuvo
luego de esa centrifugación se trató con etanol y se colocó en un baño con
hielo, esto se hizo puesto qué el etanol con sus grupos hidroxilos forma
puentes de hidrógeno con los OH- del glucógeno y por ende al colocarlos en el
baño a bajas temperaturas esto permite una correcta solubilización.
Con base a lo anterior se realizó la prueba de lugol, por medio de la cual se
determinó la presencia de glucógeno en la muestra estudiada , esta mezcla
entre yodo-yoduro permito reconocer este polisacárido y se pudo comprobar
por la formación de cadenas poliyoduro apartir de la reacción del glucogeno,
del cual se obtuvo un color negro, lo cual corresponde a un control positivo.

Imagen 2. Prueba de Lugol

El sedimento qué se obtuvo anteriormente (contenía proteínas y ácidos

nucleicos) se le adiciono NaCl, ya qué los ácidos nucleicos al tener bases
nitrogenadas y grupos fosfatos, se solubilizan en solución acuosa con NaCl,
pero no se solubiliza de una manera muy notoria, por ende es qué se elevo la
temperatura, para aumentar las interacciones entre las moléculas del solvente
y el soluto, por consiguiente, favorece la solubilidad de los ácidos nucleicos y
por ende se genera mayor hidratación de la superficie.

Posteriormente se realizó otra centrifugación, con el fin de separar el

sobrenadante con los ácidos nucleicos, pero el precipitado qué contenía las
proteínas se dejó en un baño con hielo para garantizar una mayor
sedimentación de esas moléculas. Luego de esta centrifugación, el precipitado
se disolvió en 1 mL de amortiguador salino y seguidamente se pasó al método
del bial, en el cual, en un tubo de ensayo se colocó 0,5 mL de amortiguador
salino (se usó cómo blanco) y en otro tubo de ensayo se añadió 0,5 mL de
ácidos nucleicos y a ambos se le añadió 1 mL del reactivo de Orcinol y se
llevaron a agua hirviendo, mostrando gradualmente la coloración verde oscuro
lo qué indica un control positivo y por consiguiente presencia de ARN, esté
color se da porque al estar presente una pentosa, esta se deshidrata para
formar un furfural y esté reacciona con el orcinol y genera el color mencionado
anteriomente.

Imagen 3. Método del Bial en presencia del reactivo de Orcinol

Por último al precipitado proveniente de la tercera centrifugación, se trató con 2

mL NaCl 0,15M y se generó una suspensión debido a su solubilidad y para
comprobar la presencia de proteínas se realizó la prueba de Biuret, de la cual
se tomaron dos tubos de ensayo, uno qué contenía 1 mL de solución salina
0,15M y otro qué contenía la mezcla de precipitados de proteínas,
adicionalmente a ambos tubos se le añadió 𝐶𝑢𝑆𝑂4 y 1 mL de NaOH,
observando qué uno de los tubos se torno azul claro, ese color se debió a qué
ese es el color del 𝐶𝑢𝑆𝑂4cuando se encuentra en exceso, por otro lado, el otro
tubo se torno color violeta, lo cual indico presencia de proteínas y por
consiguiente se denota cómo control positivo.

Imagen 4. Detección de proteínas con prueba de Biuret

ANEXO (Preguntas de la guía)

1. Describa la apariencia del macerado inicial?

La apariencia del macerado inicial era de color cafe con gris, esto debido a la
mezcla de la levadura y la arena.

Imagen 5. Maceración de la levadura con la arena

2. ¿Cuál es la apariencia y el color del precipitado y del sobrenadante

obtenido después de la primera centrifugación?

En la primera centrifugación se observó el sobrenadante de un color café o

beige , y en el precipitado color gris .

3. ¿Qué sucede con el sobrenadante cuando se le agregan los volúmenes

de etanol frío? ¿Color?

La muestra se colocó con una consistencia lechosa.

4. ¿Cuál es la apariencia del precipitado después de la segunda

centrifugación?

Se separaron las proteínas de los ácidos nucleicos , obteniendo un precipitado

de color blanco lechoso

5. Que observan cuando agrega el reactivo de yodo (lugol)

Como se pudo observar en la imagen 2, se realizó la prueba de lugol para la

determinación de glucógenos, a la cual se le realizó dos controles y luego la
muestra:

● Control positivo: Se agrega una muestra que se tenga la certeza que

presente glucógeno que en este caso fue cebada más el reactivo de
 lugol, como se puede observar este dio positivo tornándose de un azul
oscuro en los bordes de la muestra, lo que demostraba que el reactivo
de lugol estaba en un buen estado.
● Control negativo: Se añadió una muestra que no tuviera glucógeno la
cual fue agua, para asegurarse de que el reactivo de lugol estuviera en
óptimas condiciones, como esta muestra no contenía glucógeno no se
evidencio ningún color azul oscuro o violeta.
● Muestra: Este ensayo tenía la muestra que se sacó de la levadura y se
le agregó reactivo de lugol, esta dio positivo ya que en algunas partes de
la muestra tenía manchas de un color azul oscuro, esto también se
evidenció a sus alrededores.

6. ¿Cómo interpretan este resultado?

Los resultados obtenidos se interpretan como positivo para la presencia del

glucógeno, obteniendo una coloración azul oscuro a negro.

7. ¿Cómo interpretan lo que sucede al calentar el tubo que contiene

ácidos nucleicos y proteínas?

Cuando se calientan los tubos que contenían los ácidos nucleicos y proteínas
no se observó un cambio aburto en la solucion ya se mantenia de color incial
(beige) , se observaban burbujas como señal de desnaturalizacion de las
moleculas de acidos nucleicos y las proteinas al aumentar la temperatura
sucedio la ruptura de los puentes de hidrogeno , que unen las cadenas de
doble helice ADN.

8. Describa el precipitado y el sobrenadante, productos de la tercera

centrifugación?

El precipitado que se observó fue poco espeso de color gris claro y el

sobrenadante que se observo fue liquido de color trasparante .

9. ¿Qué apariencia presenta el sedimento después de la cuarta

centrifugación?

El sedimento presentó una apariencia blancuzca , muy denso.

10. ¿Cómo reaccionan las muestras de los diferentes tubos con el
reactivo de orcinol?

(Observar imagen 3)

Control negativo: Se añadió amortiguador salino al 0.15 M y reactivo de

orcinol, este dio un color amarillo - verdoso (tubo 2)

Muestra: En este ensayo se agregó el reactivo de orcinol , con la muestra de

los ácidos nucleicos reconstruidos , este dio positivo arrojando un color verde
oscuro , después de haber sido calentado. (tubo 1)

11. Qué aspecto presenta la solución de proteínas después de disolverlas

con la solución salina 0,15 M?

La solución de proteínas al disolverla con solución salina se evidencio de

manera más turbia, aunque no presentó un mayor cambio, esta solución salina
se utilizó como un amortiguador.

12. ¿Qué observan al realizar el ensayo con NaOH y CuSO4 con ambas
muestras?

(Observar imagen 4)

En esta prueba si hizo un control negativo con agua destilada, hidróxido de

sodio y sulfato de cobre, como se evidencia en el tubo de ensayo1, no tenia
proteinas por ende, se torno de color azul por el sulfato de cobre.

En el tubo de ensayo 2 se observa que tiene un color violeta, la cual da positivo

para proteínas, esta se da por las interacciones entre los iones de cobre del
reactivo y los grupos aminos del enlace peptídico de las proteínas.

13. ¿Qué otros aspectos desean destacar de la práctica realizada?

Se realizaron de todas la pruebas correspondientes obteniendo así los

resultados esperados y planteados en los objetivos de la práctica , obteniendo
una separación satisfactoria de los componentes el hongo,levadura
(Saccharomyces Cerevisiae) , se aprendió correctamente por medio del
método de separación liquido- liquido , solido -líquido por centrifugación.
 Conclusiones

● Según los resultados expuestos anteriormente, se determinó la

separación física y química de ácidos nucleicos, glucógeno y proteínas,
por el método de centrifugación obteniendo cada macromolécula
utilizada en las diferentes pruebas, esta identificación cualitativa de las
macromoléculas obtuvo óptimos resultados.

● Se identificó cuantitativamente polisacáridos , proteínas y glucosa ,

realizando diferentes tratamientos a las muestras tales como: Cambios
de temperaturas , cambios en el pH, añadiendo sales a

● Al realizar todas las pruebas se obtuvieron resultados positivos ,

evidenciando así que la levadura tenía cada una de las macromoléculas
estudiadas en la práctica , comprendiendo así como funcionan cada una
de estas pruebas.

ANEXO (Preguntas de la guía)

1. Reactivos

Sustancia Propiedades Peligros para la Peligro de Precaucion Otros

Química Físicas Salud Incendio es Peligros

Aspecto: Sólido Nocivo en caso de Llevar

Ácido Color: incoloro ingestión,Puede Inflamable guantes,
tricloroacético Solubilidad:Solu irritar las vías grado bata y gafas
al 5% ble en agua respiratorias ,Muy severo de
Naturaleza: tóxico para los protección
Orgánico organismos
acuáticos,Provoca
quemaduras

Alcohol Etílico Aspecto: líquido LÍQUIDO Llevar

Color: incoloro INFLAMABLE, guantes,
Solubilidad: CORROSIÓN Inflamable bata y gafas
Soluble en agua /IRRITACIÓN de
Naturaleza: CUTÁNEA: protección
Orgánico

cloruro de Aspecto:Sólido No es necesario

sodio al 10% Color: incoloro
 Solubilidad:Solu
ble en agua
Naturaleza:Inorg
ánico

Aspecto:Sólido(p Nocivo en caso de Llevar

olvo) ingestión,Provoca guantes,
Sulfato de Color: gris claro irritación cutánea bata y gafas
cobre 0.1 M Solubilidad:Solu ,Provoca irritación inflamable de
ble en agua ocular grave ,Muy protección y
Naturaleza:Inorg tóxico para los estar en un
ánico organismos lugar
acuáticos ventilado

Aspecto:Sólido Puede ser Inflamable Llevar

Hidróxido de Color: corrosivo para los grado guantes,
sodio 10 M Translúcido metales, Provoca leve, bata y gafas
Solubilidad:Solu quemaduras explosivo de
ble en agua graves en la piel y protección,
Naturaleza:Orgá lesiones oculares Mantener el
nico graves recipiente
herméticame
nte cerrado.

irrita la piel y Llevar

citrato de Aspecto:sólido mucosas . No guantes,
sodio 0.015 M Color: Blanco Inflamable bata y gafas
Naturaleza:Orgá de
nico protección

Aspecto:Sólido irritación ocular Inflamable Llevar

Color: Beige grave ,Nocivo en guantes,
Orcinol Solubilidad:Solu caso de ingestión bata y gafas
monohidrato ble en agua Provoca irritación de
Naturaleza:inorg cutánea, Puede protección
ánico irritar las vías
respiratorias

Aspecto:Sólido irritación ocular Inflamable Llevar

Color: Blanco grave ,Nocivo en guantes,
Biuret Solubilidad:Solu caso de ingestión bata y gafas
ble en agua Provoca irritación de
Naturaleza:Orgá cutánea, Puede protección
nico irritar las vías
respiratorias
Bibliografías:

1. Guarnizo A, Martínez P, Experimentos de Química Orgánica con

enfoque en ciencias de la vida, Universidad del Quindío 2008, pp
170-185.

2. Morrison R, Boyd R. Química Orgánica, Ed. 5 Pearson, pp 940-947

3. Propiedades de ácidos nucleicos. [Página web]: ácidos nucleicos,

[Consultado: 15 de octubre 2021] Disponible en :
https://www.acidosnucleicos.org/propiedades/

4. Lehninger N. D, Cox M. M, Principios de bioquímica, Ed. 5, pp 9-66

5. Análisis de carbohidratos. [Página web]:química fácil, [Consultado: 15

octubre 2021]. Disponible en :
https://quimicafacil.net/manual-de-laboratorio/analisis-de-carbohidratos/