LABORATORIO VII FITOQUÍMICA II

CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA (CC)

Rosa Angélica Posada Usuga

Presentado a:
Fernando Agudelo Aguirre

Universidad del Quindío

Facultad de Ciencias Básicas y Tecnologías.
Programa de Química.

RESUMEN

En esta práctica de laboratorio se llevó a cabo una cromatografía de columna abierta flash, la cual es una técnica
que se utiliza para aislar o separar moléculas de mezclas complejas. Esta técnica utiliza gas comprimido, como
aire, nitrógeno, en algunos casos, una bomba en lugar de gas. Para el desarrollo de esta, se empleó una bomba de
inflar llantas de bicicleta, la cual permitió acelerar el procedimiento, moviendo el solvente a través de la columna.
El objetivo de esta práctica fue la separación de una mezcla de violeta cristal y naranja de metilo, utilizando para
este gel de sílice como adsorbente y etanol como eluyente. El primero en obtenerse fue el naranja de metilo, el
cual se recolectó en tres fracciones. Por último, con la ayuda de una mezcla de etanol/trietilamina en relación 9:1
se logró obtener el segundo colorante.
Palabras claves: Violeta cristal, naranja de metilo, etanol, trietilamina, sílice, adsorbente, eluyente.

INTRODUCCION.
Cromatografía en columna es una de las técnicas más útiles para purificar compuestos. Esta técnica utiliza una
fase estacionaria, que se embala en una columna, y una fase móvil que pasa a través de la columna. Esta técnica
aprovecha las diferencias de polaridad entre compuestos, permitiendo que las moléculas suelen estar
separado.  las dos fases estacionarias más comunes para cromatografía en columna son gel de sílice (SiO 2) y
alúmina (Al2O3), con más común utiliza fases móviles siendo solventes orgánicos. El o los solventes para la fase
móvil dependen de la polaridad de las moléculas de ser purificada. Más compuestos polares requieren típicamente
más disolventes polares con el fin de facilitar el paso de las moléculas a través de la fase estacionaria. Una vez
finalizado el proceso de purificación del solvente puede eliminarse de las fracciones recogidas utilizando un
evaporador rotatorio para producir el material aislado.

El método de cromatografía flash es esencialmente una versión acelerada de la cromatografía convencional. La

técnica puede considerarse como un método híbrido, que combina presión media y cromatografía en columna más
corta y utiliza presión de aire para acelerar el proceso y obtener los compuestos resultados de un periodo de
tiempo más corto. La cromatografía flash difiere de la cromatografía tradicional en columna básicamente por el
tamaño de las partículas del soporte, que es menor, y en la mayor contrapresión causada por las mismas que
obliga al uso de una fuente de presión para generar el caudal de fase móvil necesario en columna. El resultado
final en una separación rápida (flash) y de alta resolución.

La Cromatografía flash es una evolución de la cromatografía en columna que todavía es de uso general en los
laboratorios de síntesis orgánica. En general el compuesto de interés, separado por TLC, ha de tener un Rf de 0.15
a 0.20 con el soporte y fase móvil seleccionada. La fase móvil, en general, es binaria con uno de los dos solventes
de mayor polaridad para permitir ajustar fácilmente la polaridad media y optimizar la separación. En flash la fase

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estacionaria más usada es gel de sílice por lo que al aumentar la polaridad del solvente aumenta la velocidad de
elución de todos los componentes de la mezcla. Las fases móviles binarias de polaridad creciente más usuales son
cloruro de metileno/hexano, éter/hexano, hexano/etil acetato y cloruro de metileno/metanol. Estas fases móviles,
excepto hexano/etil acetato, obligan a trabajar en campana de seguridad. Una vez que la mezcla se ha introducido
en la parte superior de la columna, los compuestos con mayor solubilidad bajan por la columna a velocidades más
rápidas que aquellos con menor solubilidad. La gravedad facilita este movimiento, con compuestos más altamente
solubles, que se mueven hacia abajo más rápido que el flujo de la mezcla. Esto permite  recolectar estos
compuestos altamente solubles.

Fig.1 comparación de cromatografía en columna estándar y en columna rápida o flash.

Para preparar una columna, se introduce un absorbente sólido en un tubo cilíndrico de vidrio o plástico. El tamaño
de este tubo dependerá de la cantidad de compuesto que se aísla. La base del tubo contiene un filtro, ya sea un
tapón de algodón o lana de vidrio, o frita de vidrio que sujete la fase sólida. Un depósito de solvente puede fijarse
a la parte superior de la columna. Para el llenado de la columna, primero se prepara
una suspensión del eluyente con la fase estacionaria en polvo, que a continuación se vierte cuidadosamente en la
columna. La parte superior de la sílice debe ser plano, y puede protegerse mediante una capa de arena. El eluyente
se pasa lentamente a través de la columna para hacer avanzar el material orgánico.
Los componentes individuales son retenidos de formas distintas por la fase estacionaria, separándolos entre sí
mientras recorren la columna a distintas velocidades junto con el eluyente. Al final de la columna se van eluyendo
uno a uno. Durante todo el proceso de cromatografía el eluyente se colecta en una serie de  fracciones. Éstas
pueden recogerse automáticamente mediante un colector de fracciones. La "fase estacionaria" o "adsorbente"
usado en cromatografía en columna es un sólido. La fase estacionaria más común para la cromatografía en
columna es el gel de sílice, seguida por la alúmina. En el pasado era habitual usar polvo de celulosa. La "fase
móvil" o "eluyente" es un solvente o mezcla de solventes usados para mover los compuestos a través de la
columna. Se elige de tal forma que el valor del factor de retención del compuesto de interés sea aproximadamente
de entre 0.2 y 0.3, con el fin de minimizar el tiempo y cantidad de eluyente necesarios para realizar la
cromatografía. El eluyente debe también ser escogido de forma que los distintos compuestos puedan separarse de
manera efectiva. El eluyente se optimiza en pruebas preliminares a pequeña escala, a menudo mediante
una cromatografía en capa fina (CCF) con la misma fase estacionaria.

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Los alcaloides son sin duda uno de

los principios activos de mayor
interés en el estudio de la acción
medicinal de las plantas. Se tratan de
sustancias de origen
predominantemente vegetal (solo
existen
unos pocos y raros alcaloides en
el reino animal) que tienen una
reacción básica o alcalina.
Presentan una gran cantidad de
hidrogeno y disfrutan de una marcada
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acción medicinal.
La cafeína es un compuesto alcaloide
(del grupo de las xantinas) que actúa
como estimulante en los
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humanos. La cafeína es el mismo

compuesto químico que la guaranina
(llamada así por la guaraná),
la mateína (por el mate) y la teína
(por el té). Originalmente se pensaba
que estas sustancias tenían
diferencias químicas, pero después se
descubrió que son idénticas.
La cafeína se encuentra
principalmente en los frutos de la
planta de café, en la planta de té, en la
yerba mate, y en las bayas de
guaraná. En pequeñas cantidades se
puede encontrar en el cacao y en
la nuez de kola. En general, la cafeína
se encuentra en las semillas, hojas, y
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frutos de más de 60
plantas, en las que actúa como un
pesticida natural que paraliza y mata
ciertas clases de insecto
Los alcaloides son sin duda uno de
los principios activos de mayor
interés en el estudio de la acción
medicinal de las plantas. Se tratan de
sustancias de origen
predominantemente vegetal (solo
existen
unos pocos y raros alcaloides en
el reino animal) que tienen una
reacción básica o alcalina.
Presentan una gran cantidad de
hidrogeno y disfrutan de una marcada
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acción medicinal.
La cafeína es un compuesto alcaloide
(del grupo de las xantinas) que actúa
como estimulante en los
humanos. La cafeína es el mismo
compuesto químico que la guaranina
(llamada así por la guaraná),
la mateína (por el mate) y la teína
(por el té). Originalmente se pensaba
que estas sustancias tenían
diferencias químicas, pero después se
descubrió que son idénticas.
La cafeína se encuentra
principalmente en los frutos de la
planta de café, en la planta de té, en la

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yerba mate, y en las bayas de

guaraná. En pequeñas cantidades se
puede encontrar en el cacao y en
la nuez de kola. En general, la cafeína
se encuentra en las semillas, hojas, y
frutos de más de 60
plantas, en las que actúa como un
pesticida natural que paraliza y mata
ciertas clases de insecto
La cafeína es un compuesto alcaloide
(del grupo de las xantinas) que actúa
como estimulante en los
humanos. La cafeína es el mismo
compuesto químico que la guaranina
(llamada así por la guaraná),

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la mateína (por el mate) y la teína

(por el té). Originalmente se pensaba
que estas sustancias tenían
diferencias químicas, pero después se
descubrió que son idénticas.
La cafeína es un compuesto alcaloide
(del grupo de las xantinas) que actúa
como estimulante en los
humanos. La cafeína es el mismo
compuesto químico que la guaranina
(llamada así por la guaraná),
la mateína (por el mate) y la teína
(por el té). Originalmente se pensaba
que estas sustancias tenían
diferencias químicas, pero después se
descubrió que son idénticas
MATERIALES Y REACTIVOS:

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 1 columna cromatográfica de 10 mL (o bureta de 10 mL)  1 pipeta graduada de 5 mL

 2 pinzas pequeñas y sus nueves  Pera succionadora
 1 soporte universal  1 frasco lavador
 1 pesa sales  10 g. Algodón
 1 balanza de dos cifras decimales  1 barra de agitación delgada
 1 espátula metálica  7 mL de una solución de violeta
 1 embudo de gravedad pequeño de caña corta cristal-naranja de metilo 1:1
 1 probeta de 100 mL  2 litros de etanol 95%
 10 tubos de ensayo pequeños  100 mL dietilamina frasco almacén
 1 gradilla  30 g Silica gel
 1 Beaker 50 mL
 1 Beaker 150 mL
 Placas cromatográficas de sílica gel (previamente preparadas)
 Tubos capilares
 1 pipeta graduada de 1 mL

PROCEDIMIENTO

Como bien sabemos la

cromatografía se usa para la
separación de mezclas complejas
de acuerdo a su
polaridad o afinidad con ciertas
moleculas, iones, y solventes. La

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elección de la fase móvil es de

vital
importancia para asegurar la
separación de los compuestos
deseados, que se sospechan están
presentes
en la mezcla, ya que esta es la que
por semejanza en polaridad
arrastra los analitos presentes en la
Como bien sabemos la
cromatografía se usa para la
separación de mezclas complejas
de acuerdo a su
polaridad o afinidad con ciertas
moleculas, iones, y solventes. La
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elección de la fase móvil es de

vital
importancia para asegurar la
separación de los compuestos
deseados, que se sospechan están
presentes
en la mezcla, ya que esta es la que
por semejanza en polaridad
arrastra los analitos presentes en l
Para llevar a cabo esta práctica de laboratorio primero se lavó y se secó todo el material a utilizar, principalmente
se sujetó la columna, en posición vertical, a un soporte utilizando dos pinzas: una cerca de la llave y otra en la
parte superior, como esta en su parte inferior contenía una capa de cerámica no hubo la necesidad de introducir
algodón. Posteriormente se colocó un erlenmeyer debajo de la columna y un embudo en la parte superior para así
poder hacer el llenado de la columna. Por otro lado, en un vaso de precipitados se preparó una suspensión con
10,760g de gel de sílice (adsorbente) y 50 mL de etanol (eluyente) se añadió un poco de etanol a la columna
(figura 2) y luego se vertió la suspensión previamente preparada en su interior. Se abrió la llave, y se golpeó
suavemente las paredes de la columna mientras se daba la sedimentación del adsorbente para que este se
compactara adecuadamente procurando que no se formaran burbujas y evitando que se secara el gel de sílice
(figura 3). Se debe tener en cuenta la verificación de que la columna no gotee y este en buen estado.

El etanol que se fue recogiendo de la columna se incorporó al vaso donde se preparó la suspensión adsorbente-
eluyente para así recuperar el gel de sílice que hubiera podido quedar y se transvasó todo de nuevo a la columna.
Seguidamente se dejó que el eluyente bajara hasta una altura sobre el adsorbente de aproximadamente 1-2 mm, se
cerró la llave de la columna, se quitó el embudo y con una pipeta se añadió cuidadosamente 15 gotas de la
solución preparada de cristal violeta y naranja de metilo (figura 4). luego se añadió lenta y cuidadosamente el
eluyente (etanol) para no distorsionar el frente de la columna. Por último, se abrió la llave y se continuó
añadiendo etanol para desarrollar la columna hasta que se recoja el primer colorante, con la ayuda de mangueras y
de la bomba de aire, se agilizó el proceso, pero estando muy pendientes de no dejar secar el eluyente (figura 5).
Después se utilizó una mezcla de disolventes: etanol/trietilamina en proporción 9:1 como eluyente para el
segundo colorante (violeta cristal).
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Fig. 2 Llenado de la columna con el eluyente Fig.3 llenado de la columna con gel de sílice

Fig.4 Adición de solución naranja de metilo y violeta cristal. Fig.5 separación con ayuda de mangueras y bomba de aire.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Como bien sabemos la

cromatografía se usa para la
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separación de mezclas complejas

de acuerdo a su
polaridad o afinidad con ciertas
moleculas, iones, y solventes. La
elección de la fase móvil es de
vital
importancia para asegurar la
separación de los compuestos
deseados, que se sospechan están
presentes
en la mezcla, ya que esta es la que
por semejanza en polaridad
arrastra los analitos presentes en la
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cromatografía se usa para la
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de acuerdo a su
polaridad o afinidad con ciertas
moleculas, iones, y solventes. La
elección de la fase móvil es de
vital
importancia para asegurar la
separación de los compuestos
deseados, que se sospechan están
presentes
en la mezcla, ya que esta es la que
por semejanza en polaridad
arrastra los analitos presentes en la
Como bien sabemos la
cromatografía se usa para la
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de acuerdo a su
polaridad o afinidad con ciertas
moleculas, iones, y solventes. La
elección de la fase móvil es de
vital
importancia para asegurar la
separación de los compuestos
deseados, que se sospechan están
presentes
en la mezcla, ya que esta es la que
por semejanza en polaridad
arrastra los analitos presentes en la
Como bien sabemos la cromatografía se usa para la separación de mezclas complejas de acuerdo a su polaridad o
afinidad con determinadas moléculas, iones y solventes. La elección de la fase móvil es de vital importancia para
asegurar la separación de los compuestos. Las moléculas de soluto son absorbidas en la fase estacionaria y a
medida que se produce la elución, van siendo desplazadas por las moléculas de disolvente que constituyen la fase
móvil. La retención de un soluto que se puede justificar por la competencia que se establece entre el soluto y la
fase móvil por absorberse a los centros polares, es decir, depende de los valores de las constantes de los
equilibrios. La separación de la muestra problema se realizó con una solución de etanol y se observó como la fase
naranja de metilo fue la primera en ser extraída de la columna debido a su polaridad la cual es diferente de la parte
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de cristal violeta (figura 6 y 7), esto hace que se retenga mediante la polaridad de los compuestos orgánicos. En
este laboratorio se debe tener en cuenta que uno de los principios más importantes y evaluados es la velocidad de
arrastre de cada componente (naranja de metilo y cristal violeta) dependiendo de su grado de absorción en la fase
estacionaria y su afinidad por la fase móvil.

Fig. 6 y 7 separación de solución naranja de metilo y violeta cristal

Por medio de una bomba de aire, se logró dar una mayor presión a la columna, acelerando el flujo del eluyente y
haciendo rápido su paso por la fase estacionaria (gel de sílice). De lo anterior se deriva el nombre de
cromatografía flash, porque se logra separar rápidamente la solución de cristal violeta y naranja de metilo. Por
último, cabe resaltar que durante todo el proceso no se dejó secar la columna y se vertía constantemente el etanol
cuando este se iba acabando, para evitar el fraccionamiento en la columna y posibles daños en el proceso, así
mismo es de gran importancia a la hora de llenar la columna que esta no sea en seco, primeramente, se debe
impregnar con el eluyente para evitar burbujas y obtener una buena cromatografía.

Como comentario adicional se pudo evidenciar la separación de los dos compuestos en la columna debido a la
coloración que los caracterizan, pero si necesitamos hacer la separación de una mezcla de componentes con igual
coloración o traslucidas, para esto se empleara una lampara de luz ultravioleta y así poder evidenciar la separación
de los componentes de la misma.

CONCLUSIONES

 La cromatografía por columna se emplea para la separación de mezclas o purificación de sustancias,

reteniendo en su fase estacionaria algunos compuestos por su propiedad de adsorción, por la que atraves
de ella se hará pasar una corriente de disolvente o mezcla de solventes que arrastrarán a los compuestos
constituyentes de la mezcla, haciéndoles avanzar atraves de la columna. En este caso el primer compuesto
en separarse fue el naranja de metilo, debido a su polaridad y afinidad con el eluyente.

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CUESTIONARIO

1. ¿Qué debe hacerse para encontrar el eluyente adecuado para una sustancia en una cromatografía en
columna?

Si la sustancia es polar, el eluyente debe de ser un eluyente polar, pero si no es polar, se debe de utilizar un
eluyente no polar, con el fin de que se alcance la máxima solubilidad y que las fuerzas intermoleculares
ayuden a que el soluto pase a través de la columna. Si no se conoce la polaridad de las sustancias a separar, se
debe hacer TLC (cromatografía en capa delgada) y teniendo en cuenta el factor de retraso que debe estar entre
el 0,2 y 0,3 se dice que se ha escogido un buen solvente y se puede proceder a realizar la cromatografía en
columna.

2. Indique algunas de las aplicaciones de la cromatografía de adsorción en columna.

La cromatografía de adsorción es una técnica que esta particularmente bien adaptada para la separación de
polaridad baja y media, se utiliza muy comúnmente para:

 La eliminación de las impurezas de sustancias, en el aislamiento de metabolitos de líquidos biológicos, en

la determinación en alimentos de ácidos orgánicos perjudiciales, etc.

 Determinación del porcentaje de formación de una molécula de síntesis, en una planta de síntesis
orgánica.

 Determinación de porcentaje de solvente en un producto agroquímico terminado.

 Control de calidad de pureza de solventes, como alcohol etílico anhidro, tolueno, xileno, benceno, que
entran como materias primas a una planta.

 Determinación del contenido de principio activo de un medicamento.

 Control de calidad de la pureza de materias primas entrantes a bodega de una fábrica de productos
medicinales, tales como: alcohol etílico al 95%, propilenglicol, glicerina, alcohol isopropílico, o-
toluidina, paracetamol, butanol, octanol, benzaldehído, acetato de etilo, éter di etílico, alcanfor, y muchos
otros.

 En fábricas de adhesivos, pegamentos, pinturas, para controlar que el producto terminado lleve las
cantidades indicadas de solventes, humectantes, colorantes, gomas, resinas, poliuretanos, secantes,
rellenantes, esponjantes, suspensores, emulsificantes.

 En fábricas de alimentos, para control de calidad de producto terminado y materias primas, tales como
proteínas, aromatizantes, determinación de colorantes.

 En la industria petrolera, es un método indispensable, para analizar las composiciones de casi todos los
productos que van saliendo, del cracking, los tipos de gasolinas, los compuestos orgánicos destinados a
síntesis.

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3. Escriba una lista de eluyentes utilizados en cromatografía en columna en orden de polaridad decreciente
(anote su bibliografía).

La fase móvil consiste en un disolvente o mezcla de disolventes, seleccionado en base a su polaridad con el
fin de optimizar la separación de los componentes de la muestra en la columna. De forma orientativa se puede
establecer el siguiente orden de polaridades para los disolventes usados con mayor asiduidad:

 Agua
 Metanol
 Acetonitrilo
 Acetona
 Etanol
 MEK
 Isopropanol
 Acetato de etilo
 THF
 Diclorometano
 Éter
 Tolueno
 Hexano

(Eduardo Primo Yufera. Química orgánica básica y aplicada: De la molécula a la industria. Volumen 2. Pag
1228)

Otra forma de ordenar los eluyentes según la polaridad.

Éter de petróleo < tetracloruro de carbono < ciclohexano < éter etílico < acetona < benceno < acetato de etilo
< cloroformo < etanol < metanol < agua < piridina < ácido acético

4. Indique la toxicidad de las sustancias que utilizó y como se podrían desechar.

5. Presente algunos de los soportes más utilizados para cromatografía en columna
6. Explique los factores que influyen en una separación por cromatografía en columna.

REFERENCIAS
 Chicharro, M. 2005. Cromatografía, principios y aplicaciones. Análisis Químico.
http://www.uam.es/personal_pdi/ciencias/mo nchi/alim/traba3.pdf

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 Eduardo Primo Yufera. Química orgánica básica y aplicada: De la molécula a la industria. Volumen 2.
Pag 1228

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