Protocolo para medir actividad de la enzima Nitrato Reductasa

Medición de la actividad de la enzima NR in vitro en raíces de trigo.

Se molieron las raíces en mortero con N2 líquido. Las raíces que usamos eran las que llamábamos
el “resto”, no la más larga. Ya que la más larga de cada tratamiento fue colocada en el tubo con
FAA para hacer otros análisis y mediciones (ver aparte) Cuando quedaron pulverizadas en tubos
eppendorfs se puso aproximadamente 100 mg de ese polvo y se conservaron en el freezer.
Aproximadamente 200 mg del polvo se colocaron en viales para analizar el contenido de P en raíz
(ver aparte). El remanente de raíz se colocó en otros tubos eppendorf.

1) Homogeneizar aproximadamente 100 mg del polvo de raíz (sacamos los eppendorfs del
freezer). Tomamos un mortero, lo colocamos en hielo, lo secamos y lo taramos. En el mortero
tarado ponemos entre 100-150 mg de raíz. Y lo homogeneizamos con 300 ul del buffer de
homogeneización (que se lo deja en hielo, tiene que estar frío).

2) Luego ese homogenato se lo toma con una pipeta (cortar el tip para tomarlo mejor) y se lo
coloca en otros eppendorfs de 1,5 ml rotulados; los eppendorfs mantenerlos en hielo.

3) Centrifugamos estos tubos durante 15 minutos a 15.000 g a 4 °C. Recordar que la centrífuga que
usamos es la del otro laboratorio (no la del C, porque la del C no tiene para regular la
temperatura). Se abre la centrífuga con el botón “open”, se saca la tapita y los tubos se colocan
enfrentados de tal manera que quede la misma cantidad de agujeros vacíos de un lado que del
otro. Se pone de nuevo la tapa hasta que haga un clic. Elegir las g (en este caso 15.000g, elegir g y
no rpm) y seleccionar el tiempo indicado. Luego cerrar la centrífuga, apretar START y nunca irse
hasta que no empiece a andar y suba a las gravedades indicadas, porque si llega a haber algún
problema enseguida se debe apretar STOP.

4) Rotulamos otros tubos eppendorfs de 1,5 ml que digan: muestra número x, fecha, número de
experimento, qué material vegetal es (raíz, vástago? En este caso es raíz). Y otros eppendorfs que
digan todo lo mismo pero también BLANCO. Cada reacción tiene su respectico blanco. Los blanco
se hacen por el NO2 endógeno que puede haber.

5) Cuando salen de la centrífuga se toma el sobrenadante con una pipeta. Sacarlo con mucho
cuidado, siempre empezando de arriba y asegurarte de que no te estás llevando el pellet (lo
sólido). Sólo nos tenemos que llevar lo líquido. Este sobrenadante se pone en los tubos del punto
4).

6) Hacemos la reacción