Loxosceles reclusa

Loxosceles reclusa sphingomyelinase

D precursor, mRNA, complete cds

Systrophia eatoni
El envenenamiento por la araña reclusa parda (Loxosceles reclusa) puede causar
dermonecrosis locales y, en raras ocasiones, coagulopatías, insuficiencia renal y
muerte. Fosfolipasa A del veneno, SMaseD (esfingomielinasa D), es responsable de las
manifestaciones patológicas de envenenamiento. Recientemente, el SMaseD
recombinantes de Loxosceles laeta se demostró que hidrolizan LPC (lisofosfatidilcolina)
para producir LPA (ácido lisofosfatídico) y colina. Por lo tanto, la activación de vías de
señalización LPA puede estar involucrada en algunas manifestaciones de
envenenamiento por Loxosceles. Para comenzar a investigar esta idea, se clona un
cDNA que codifica de larga duración L. reclusa SMaseD. La secuencia de 305
aminoácidos de la enzima L. reclusa es de 87, 85 y 60% idénticos a los de L. arizonica,
intermedia L. laeta y L. respectivamente. La enzima recombinante expresado en
bacterias habían amplia especificidad de sustrato. El lisofosfolípidos LPC, LPI (18:01-1-
oleyol lysophosphatidylinositol), LPS, LPG (18:01-1-oleoil-lysophosphatidylglycerol),
LBPA (18:01-1-oleoil-lysobisphosphatidic ácido) (todos con diferentes cadenas de acilo
), liso-factor activador de plaquetas (C16: 0), ácido fosfatídico cíclica y la esfingomielina
se hidroliza, mientras que sphingosylphosphorylcholine, PC (fosfatidilcolina, C22: 6,
C20: 4 y C6: 0), se oxida PCs y PAF (activador de plaquetas factor, C16: 0) no se
hidroliza. El análogo de PAF, edelfosine, inhibe la actividad enzimática. Enzima
recombinante más LPC (C18: 1) inducida por la migración de las células del melanoma
A2058, y esta actividad fue bloqueada por el antagonista de los receptores LPA,
VPC32183. La enzima recombinante se araña hemolítica, pero esta actividad estaba
ausente de H37N catalíticamente inactiva (His37 → Asn) y mutantes H73N. los
resultados demuestran que Loxosceles fosfolipasa D hidroliza una amplia gama de
lisofosfolípidos lo que se pensaba, y por lo tanto el término "SMaseD" es muy limitada
en la descripción de esta enzima.
El envenenamiento por la araña reclusa parda (Loxosceles reclusa) puede inducir
dermonecrosis locales, así como la hemólisis de eritrocitos sistémica, agregación
plaquetaria y la insuficiencia renal que, en casos raros, puede conducir a la muerte.
Aunque el veneno contiene varias proteínas, el PLD (fosfolipasa D) SMaseD
(esfingomielinasa D) es responsable de dermonecrosis y dependiente del
complemento hemólisis, la sangre y daño a los vasos fibrinogenolysis , así como los
neutrófilos desregulación de la célula endotelial dependiente activación.
Uno de los productos de SMaseD Loxosceles es C1P (ceramida-1-fosfato), que es
conocido por ser uno de los componentes de la bicapa lipídica, pero obviamente no es
una molécula de señalización. Sin embargo, C1P es una molécula de lípido bioactivo
capaz de estimular la proliferación celular mediante el aumento de la síntesis de ADN,
inhibiendo directamente la esfingomielinasa ácida y la síntesis de la ceramida y el
bloqueo de la apoptosis, y, activando directamente la fosfolipasa A2, que induce la
síntesis de prostanoides en las células. Recientemente, el grupo Moolenaar mostró
que la SMaseD recombinante de L. laeta escinde LPC (lisofosfatidilcolina) para LPA
(ácido lisofosfatídico) y colina. LPA se sabe que induce diversas respuestas biológicas y
patológicas como la agregación plaquetaria, la hiperpermeabilidad endotelial y las
respuestas pro-inflamatorias por la señalización a través de tres G-receptores
acoplados a proteínas. Así, algunas de las patologías asociadas con el envenenamiento
por la araña reclusa parda pueden ser debido a la producción aberrante LPA y la
señalización.
Para iniciar un estudio de la función de producción y LPA LPA vías de señalización en
las manifestaciones de envenenamiento por especies de Loxosceles,se clona SMaseD
de L. reclusa y caracterizado el recombinante SMaseD especificidad en relación con
sustrato y función de la enzima. La secuencia de L. reclusa PLD cDNA se ha depositado
en GenBank . (AY862486).
Loxosceles reclusa

Taxonomy ID: 6921

Genbank common name: brown recluse
Inherited blast name: spiders
Rank: species

Clasificacion taxonomica:

Clasificación científica
Reino: Animalia
Filo: Arthropoda
Clase: Arachnida
Orden: Araneae
Familia: Sicariidae
Género: Loxosceles
Especie: L. reclusa

ESFINGOMIELINA FOSFODIESTERASA O ESFINGOMIELINASA

Función catalítica: es una enzima

fosfodiesterasa (es decir, una enzima que
cataliza la ruptura de los enlaces
fosfodiéster) que actúa sobre la
esfingomielina.

Formas: Están descritas seis formas

 SMPD1 - á cida
 SMPD2 - neutra
 SMPD3 - neutra
 SMPD4 - neutra
 SMPD13A - ácida
 SMPD3B - á cida
Estructura de Esfingomielina fosfodiesterasa o
esfingomielinasa
En el laboratorio, se extrae una determinada secuencia (un marcador) porque se desea obtener una
secuencia codificante para hacer una proteína, para ello se selecciona un tejido donde la proteína de
interés se esté expresando.

Se extrae el RNAm que codifica la proteína de interés (Una vez de haber identificado el tejido a partir del
cual vamos a tomar la població n de RNAm), el ADN complementario o ADNc (ADN de cadena sencilla) se
sintetiza a partir de una hebra simple de ARNm maduro y luego se busca el gen.

Con la técnica PCR (Reacció n en cadena de la polimerasa) se obtienen secuencias concenso (secuencia
resumen), con este ú ltimo se elabora primers a cada lado formando un familia de RNAm que son
parecidos y que pertenecen a la misma proteína, isomorfas o familias de proteínas.

Una vez obtenido el ARN Y ADNc de interés se procede a obtener una secuencia nucleotídica y hacer el
aná lisis que se realizará en dicho trabajo.

En el caso de no saber con certeza si la proteína en el cual estamos interesados es la que se ha

capturado del RNAm.

Se trabajará a partir del DNAc y la secuencia la obtendremos de la Bases de datos NCBI

secuencia ( acepta los datos del genoma de los proyectos de secuenciació n de todo el mundo y
sirve como la piedra angular de la investigació n bioinformá tica)
Para ello, se ingresa al portal de la pá gina NCBI, luego se procede a escribir el có digo respectivo :
AY862486.

S e muestra al organismo que estamos analizando Loxosceles reclusa con ARNm y la secuencia
codificante completa
Ingresamos a Blastx el cual es un algoritmo que nos permite comparar los productos conceptuales de
nuestra secuencia de nucleó tidos contra una base de datos de secuencia de proteínas

Copiamos nuestra secuencia de nucleótidos en formato FASTA para luego pegarlo en el algoritmo BLAST
Dicha secuencia nucleotídica que se recibe de la base de datos del NCBI todavía no la
hemos identificado, para ello se realiza un alineamiento, una comparació n con otras
secuencias.

Se procede a copiar dicha secuencia nucleotídica e inmediatamente nos dirigimos a la

opció n BLAST y de las 5 opciones que se nos presenta se elige la opció n blastx , cuya
funció n es ingresar una secuencia de nucleó tidos , traducirlo en software y compararlo con
la base de datos de proteínas.
El siguiente esquema representa en color rojo las secuencias de correalinamientos mayor a 200 y,
ademá s la posició n de la barra me indica donde ocurre la cobertura de la secuencia de bases de
dato encontrada con nuestra secuencia de datos problema
La proteína con el có digo POCE79.1 que nos proporcionó la base de datos del NCBI se
asemeja a nuestra proteína en un 100% y es con la cual se va a trabajar.
Al dirigirnos

Se observa
de la secue
copiaremos
Ingresamos a Uniprot que es una base de datos completa de libre acceso de la secuencia de la
proteína. Contiene una gran cantidad de informació n acerca de la funció n bioló gica de las proteínas
De todos los 250 resultados reportados, se elige el primero pues el cará cter de similitud con la de
nuestra proteína es en un 100%.

Debido a eso se copia el có digo para poder evaluarlo mediante el programa Expasy
ExPASy es el nuevo Portal de Recursos Bioinformá tica SIB que proporciona acceso a bases de datos
científicas y herramientas de software en diferentes á reas de ciencias de la vida, incluida la
proteó mica, la genó mica, filogenia, biología de sistemas, la genética de poblaciones, la
transcriptó mica, etc. En este portal trabajaremos con la categoría PROTEÓ MICA.
Dentro de dicha categoría nos dirigiremos a SWISS-MODEL Repositorio que nos brindará una base de
datos de modelos de proteínas homologas de estructura, generada por la canalizació n de modelos
totalmente automatizado SWISS-MODEL.

De lo realizado anteriormente, se pega el có digo elegido de la proteína con mayor similitud: P0CE79
 Y se obtiene los siguientes detalles del modelo:

Ingresamos al enlace InterPro:

Seleccionamos IPR017946 :
Modelo de evaluació n de la calidad
Ingresamos a EXPASY (Sistema Experto análisis de las proteínas) es un servidor de proteómica que analiza las
secuencias de proteínas y estructuras de dos dimensiones electroforesis en gel (2-D electroforesis )
Nos dirigimos a PROSITE y pegamos nuestra secuencia aminoacidica que se encuentra en formato
FASTA

PROSITE es una base de datos de proteínas. Se trata de entradas que describen las familias de
proteínas, dominios y sitios funcionales, así como los patrones de aminoá cidos, las firmas y los
perfiles en ellas.Incluye la identificació n de las posibles funciones de las proteínas recién descubierto
y el análisis de proteína conocida por su actividad previamente determinada
Esta vista muestra los resultados ScanProsite junto con ProRule basado previsto dentro de la función de
dominio
 Ingresamos a ABIM para conocer en que parte de la célula se encuentra la proteína

Copiamos nuestra secuencia nucleotidica e ingresamos a ESLpred (SVM método basado en la localización
subcelular de las proteínas eucariotas con la composición de di péptido
Para obtener una información adicional como calcular el punto isoeléctrico de una proteína
Copiamos la secuencia aminoacidica en formato FASTA para luego pegarla en la venta principal que nos
calculara el punto isoeléctrico de nuestra proteína es decir e l pH en el que la concentración de Zwitterión es
máxima (el aminoácido no presenta carga neta). 
IEP of from 1 to 305
Isoelectric Point = 6.7149
También deseamos determinar la predicción de cristalización de la proteína Proceso mediante el cual las
moléculas se ordenan de un modo natural formando un retículo repetitivo que denominamos cristal con la
intención de reducir la solubilidad de la proteína y generar una precipitación controlada de la misma

También deseamos determinar la predicción de cristalización de la proteína Proceso mediante el cual las
moléculas se ordenan de un modo natural formando un retículo repetitivo que denominamos cristal con la
intención de reducir la solubilidad de la proteína y generar una precipitación controlada de la misma
Comparación de las características de destino con las distribuciones de probabilidades de cristalización
obtenidas asi como también las clases de cristalización que se diferencia por el color
Después de haber utilizado la base de datos de los siguientes programas: NCBI,
EXPASY, SWISS-MODEL Repositorio ,ABIM, ESLPred, Prosite, se infiere lo
siguiente:
 La Estructura tridimensional de proteínas son cruciales para comprender la
funció n de proteínas a nivel molecular. En los ú ltimos añ os, un enorme
progreso en las técnicas experimentales a gran escala la determinació n de la
estructura de proteínas por cristalografía de rayos X y RMN se ha logrado.

Se encontró que nuestra proteína está ubicada en el nú cleo y tiene

actividad catalítica.

En el veneno de Loxoseles reclusa se encuentra la esfingomielinasa D el cual

coincide con la esfingomielina fosfodiesterasa ya que se el porcentaje de
similitud fue de 100% y por ende presenta una homología heteroespecifica.

RECOMENDACIONES

Debido a que la base de datos que nos proporcionó el NCBI no se reportó el

swissprot se utilizó herramientas del EXPASY como el SWISS-MODEL
Repositorio para poder obtener el modelado de la estructura de proteínas y
la evaluació n.