FACULTAD DE INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

SECCIÒN DE LABORATORIO
CICLO 2021-1

UNIVERSIDAD NACIONAL
SANTIAGO ANTÙNEZ DE MAYOLO

LABORATORIO DE TECNOLOGÌA DE LA LECHE

Hoja de Reporte Técnico
Séptimo Laboratorio

Tema: Determinación de la Carga Microbiana de la Leche

GRUP
APELLIDO, NOMBRE (CÓDIGO)
O
MILLA LOPEZ Rocio Alexandra 151.0204.301
7
DOCENTE DE NOTA
PRÁCTICA Rosario Tarazona Minaya HORARIO 11:00 -13:00

NOTA: Para la calificación se tomará en cuenta el criterio técnico sobre el tema,

redacción/ortografía de sus respuestas y presentación del archivo.
Hoja de Reporte Técnico

I. Datos Generales:

 Fecha de realización de la práctica

22 de Octubre del 2021
 Objetivos
 Determinar la calidad higiénica de la muestra de leche.
 Cuantificar el tiempo de decoloración del azul de metileno “TRAM” en le-
che fresca.
 Comprender los fundamentos de la medida del tiempo de reducción del azul
de metileno o prueba de la reductasa bacteriana en una muestra de leche.
 Interpretar los resultados obtenidos y relacionarlos con la presencia de mi-
croorganismos y la calidad higiénica de la leche en función al fundamento
del método empleado.

 Material y Equipo
Material:
 Pipeta de 10 ml.
 Pipeta de 1ml.
 Tubos de ensayos con tapa

Página 1 de 10
FACULTAD DE INDUSTRIAS ALIMENTARIAS
SECCIÒN DE LABORATORIO
CICLO 2021-1
 Vaso beaker 250 ml.
 Gradilla
Equipos
 Vortex (mezclador)
 Equipo de baño maría o Baño Termostático
 Estufa

Reactivos:
 Azul de metileno diluida (Solución acuosa de alcohol saturado)

 Muestra y Presentación
Para este laboratorio utilizaremos 100 ml de 4 diferentes muestras de leche que
son la leche cruda entera fresca, leche entera fresca refrigerada, leche
pasteurizada y leche UHT.
 Fundamento:

 Prueba de azul de metileno:

Es una prueba rápida, simple y económica mediante la cual se puede evaluar

de forma indirecta la densidad bacteriana de la leche (Espejo, 1987).

Se utiliza como indicador de óxido-reducción al azul de metileno, el

potencial (Eh) redox se mide en milivoltios o voltios, el potencial de óxido-
reducción (Eh) de la leche fresca aireada es de +0,35 a +0,40 voltios (350 a
450 milivoltios), el cual se debe principalmente al contenido de oxígeno
disuelto en el producto. Si por cualquier causa ese oxígeno es separado, el
Eh disminuye. Esto ocurre cuando los microorganismos crecen en la leche y
consumen el oxígeno. Si el número de microorganismo es muy elevado, el
consumo de oxígeno será mayor y por consiguiente el Eh. caerá
rápidamente; por el contrario, el número de microorganismos es pequeño, el
Eh disminuirá lentamente (Universidad del Zulia, 2003)

El azul de metileno se presenta de color azul en su forma oxidada y es

incoloro en su forma reducida. El tiempo en horas que tarda en pasar el azul
de metileno de su forma oxidada (azul) a la reducida (incolora) bajo
condiciones controladas es proporcional a la calidad sanitaria de la leche y
aunque no es posible establecer con exactitud el número de

Página 2 de 10
FACULTAD DE INDUSTRIAS ALIMENTARIAS
SECCIÒN DE LABORATORIO
CICLO 2021-1
microorganismos, es factible clasificar el producto dentro de ciertos grados
aceptables o no aceptables (Malina, 2009). En general se admite que la
decoloración es más rápida cuanto mayor es el número de microorganismos
en la leche. Sin embargo, las bacterias presentan distinta habilidad para
reducir el azul de metileno, así el Lactococcus /actis, el más activo en su
actividad reductora que Streptococcus agalactiae, Baciflus subtilis y los
termodúricos entre ellos tenemos los siguientes géneros: Arthrobacter,
Alcaligenes, Microccocus, Microbacterium, Pseudomonas, Streptococcus,
Lactobaciflus, Corynebacterium y Actinomycetos (Universidad del Zulia,
2003). También se reporta la capacidad reductiva de: Escherichía coli,
Staphylococcus aureus, Streptococcus. agalactíae, Streptococcus
dysgalactiae, Streptococcus uberis, Streptococcus pyogenes y Bacíl/us
subtilís. Las células somáticas presentes en la leche también influyen mucho
en la velocidad de decoloración (Grass y Zambrano, 2008).

Esta prueba no es muy apropiada para la evaluación de la calidad higiénica

de las leches refrigeradas, porque· se ha visto que cuando la leche se
almacena durante varias horas a temperatura de 4 oc, el tiempo de
incubación se alarga considerablemente, como consecuencia del letargo
fisiológico que se produce en las bacterias a dicha temperatura y para ello se
recomienda hacer una preincubación de 18 horas a 13°C antes de la Prueba.
Además, debido a que en leches refrigeradas se relaciona con el recuento de
19 bacterias mesófilas, pero no con las psicrótrofas, psicrofílicas y
termodúricas (Cubillos y col., 2005). El potencial oxido-reducción es más
alto en verano que e invierno, lo que estimula el crecimiento de
·determinadas bacterias responsables en el queso, de ciertas reacciones
bioquímicas (Malina, 2009).

Posibles mecanismos de acción que ·inciden en la reducción del Azul de

metileno:

 Lactosa: Es un azúcar reductor y podría recibir alguna consideración

como agente que contribuye en la reducción de los colorantes que se
utilizan para evaluar a la leche (Grass y Zambrano, 2008).

Página 3 de 10
FACULTAD DE INDUSTRIAS ALIMENTARIAS
SECCIÒN DE LABORATORIO
CICLO 2021-1
 La xantina oxidasa o xantina deshidrasa (enzima de la leche): Es una
deshidrogenasa fija los dos H+ al azul de Metileno transformándolo en Azul
de Leucometileno (Grass y Zambrano, 2008).

 Cisteína (metabolito): Proveniente del Glutation, sobre la reducción del

Azul de Metileno. Al adicionar una parte de Cisteína a 1000 partes de leche
los resultados establecen caídas súbitas del potencial redox en la leche,
alcanzado una decoloración completa del Azul de Metileno (Grass y
Zambrano, 2008).

 La leche está constituida por diversos sistemas biológicos de reducción

propios de ella como las enzimas, y otros, influenciados por el crecimiento
de los microorganismos. Ambos contribuyen al descenso del potencial,
debido a formación de iones H+ por la presencia de sustratos donadores 20
de Hidrógeno para las enzimas y metabolitos secundarios por la acción de
las bacterias (Grass y Zambrano, 2008).

 El Azul de Metileno es una sal básica, es un indicador de óxido

reducción, que cuando se incorpora al medio denota cambios en el potencial
de óxido reducción. Ciertos microorganismos pueden utilizar el oxígeno
disuelto en un medio y en consecuencia pueden reducir el potencial de
óxido reducción; la reducción es catalizada por la enzima reductasa, una
enzima involucrada como un sustrato de la bacteria. Cuando se agrega el
Azul de Metileno al medio que contiene microorganismos metabolizantes,
los electrones producidos a partir de un sustrato oxidable se desvían en su
metabólica normal (así se produce reductasa) y son utilizados para reducir el
colorante. La reductasa se clasifica como una deshidrogenasa ya que se
transfiere dos hidrógenos de su sustrato normal al aceptar de electrones
artificial Azul de metileno (MacFaddin, 2003).

Tiempo de reducción del azul de metileno.

Reducción del azul metileno, el método mide en intervalo de tiempo

requerido, la decoloración producto del cambio de estado del colorante azul
de metileno (azul estado oxidado a blanco estado reducido) por acción de
actividad microbiana. La mayoría de los gérmenes de la leche cuando se
multiplican elaboran enzimas reductasas que modifican el potencial de

Página 4 de 10
FACULTAD DE INDUSTRIAS ALIMENTARIAS
SECCIÒN DE LABORATORIO
CICLO 2021-1
óxido-reducción de la misma. Para demostrar ese fenómeno basta añadir a la
leche una sustancia que se decolore al pasar de la forma oxidada a la forma
reducida. La rapidez con que cambia de color está en función de la población
bacteriana y, por ello, puede ser un índice del grado de contaminación de la
leche. El colorante más empleado en la industria láctea para realizar esta
prueba es el azul de metileno, pero también se pueden utilizar la resazurina y
el cloruro de 2, 3, 5, trifenil-tetrazolium, ya que son colorantes fácilmente
absorbibles por las células vivas y se decoloran a una velocidad proporcional
a la actividad de las reductasas microbianas.
Procedimiento:

• En un tubo de ensayo de boca ancha (30 - 40mm) estéril se vierten 40

ml de leche previamente tratada (tener en cuenta la preparación de la
muestra), tratando de no mojar las paredes interiores del tubo.
• Se agrega con una pipeta estéril 1 ml de la solución de azul de meti-
leno. Con precauciones asépticas, se tapona el tubo con un tapón o una
torunda de algodón estéril. Mezclar mediante rotación hasta obtener
perfecta distribución del colorante y la leche (observe un color homo-
géneo en todo el tubo).
• Se coloca el tubo de la muestra de color homogéneo en un baño de
agua termostatizado a 37 – 38 °C, cuidando que el nivel del agua del
baño exceda al de la leche en el tubo y al abrigo de la luz (especial-
mente la luz solar directa).
• El ítem anterior también puede sustituirse colocando el tubo de la
muestra a una estufa a 37-380 C, hasta que el azul de metileno quede re-
ducido (cambio de color de la muestra del color del azul de metileno a
blanco como la muestra testigo). Se puede dar resultados a 2/3 del total
del volumen del tubo respectivo.
• Obsérvese el tiempo necesario para que se produzca la decoloración
(tiempo en que se decolora la totalidad de la leche del tubo o bien
como se indicó el cambio a los 2/3 del total del volumen del tubo res-
pectivo, o también se considera el tiempo en que se decolora hasta
unos 5 mm de la superficie).
• Las trazas de color que suelen producirse en el fondo del tubo de ensa-

Página 5 de 10
FACULTAD DE INDUSTRIAS ALIMENTARIAS
SECCIÒN DE LABORATORIO
CICLO 2021-1
yo, pueden ser ignoradas mientras no se extiendan hacia arriba más de
5 mm.
• Como criterio de comparación que indique cuando puede considerarse
completa la decoloración se utiliza para ello un tubo de control (mues-
tra testigo UHT) o patrón (leche sin indicador).
• El tubo control puede prepararse sumergiendo en agua hirviendo du-
rante 3 min, un tubo de ensayo del tipo utilizado en la prueba conte-
niendo 40 ml de leche UHT.
• Contar el tiempo de reducción (decoloración) y observar su color fre-
cuentemente durante la primera media hora, sin agitarlos. Una muestra
se considera reducida cuando presenta 4/5 decolorada.
• Si la muestra se decolora durante un periodo de incubación de 30 mi-
nutos, registrar el resultado “tiempo de reducción 30 minutos”
• Seguidamente pueden observarse el color de los tubos e intervalos de 1
hora, pero se registran los resultados en horas enteras: así, por ejemplo:
si a las 2½ horas se observa la decoloración, el resultado se registra
“tiempo de reducción den 2 horas”.
En base al tiempo transcurrido hasta la decoloración, se puede concluir
sobre el estado de conservación y pureza de la muestra:
 LECHE MUY MALA: si no se conserva el color por más de 20
min.
 LECHE MALA: Si el color se conserva de 20 min a 2 h.
 LECHE MEDIOCRE: Si el color se conserva de 2 a 5 ½ h.
 LECHE BUENA: Si el color se conserva por más de 5 ½ h.
Por otro lado, también se tiene la Tabla 1.

Tabla 1. Calidad Higiénica de la Leche

TRAM (horas) Calidad

Más de 5 Muy Buena
De 3-5 Buena
De 2-3 Regular
De 1-2 Mala
Menos de 1 Pésima
Fuente: Fundación Ecuatoriana de Desarrollo.

Página 6 de 10
FACULTAD DE INDUSTRIAS ALIMENTARIAS
SECCIÒN DE LABORATORIO
CICLO 2021-1

Tabla 2. Calidad Higiénica de la Leche

TRAM (horas) Calidad

Mayor a 5 Muy Buena
De 3-5 Buena
De 1-3 Regular
1 Mala
Menos de 30 minutos Muy Mala
Fuente: Instituto Nicaragüense de Apoyo a la Agencia de Cooperación
Pequeña y Mediana Empresa (INPYME)

Tabla 3. Numero de Bacterias por Mililitro de Leche

Tiempo(minutos) Numero de Bacterias/ ml

< 30 minutos 20 a 30 millones

30 minutos a 2 horas 4 a 20 millones
2 a 6 horas 0,5 a 4 millones
> 6 horas < 0,5 millones
 Responsable(S)
Milla Lopez Rocio Alexandra

Página 7 de 10
FACULTAD DE INDUSTRIAS ALIMENTARIAS
SECCIÒN DE LABORATORIO
CICLO 2021-1

II. Resultados:
Tabla 4. Datos de evaluación del cambio de color del azul de metileno en
función al tiempo.
Tiempos 25 min 2 hr 4 hr 5 hr 5<Xhr
Muestra
Muestra 1 Se Se Cambio el
mantiene mantiene el color los 2/3
el color color del tubo
Muestra 2 Se Se Se mantiene Se Se
mantiene mantiene el el color mantiene mantiene
el color color el color el color
Muestra 3 Se Se Cambio
mantiene mantiene el total del
el color color color
Muestra 4 Se Se Se mantiene Se
mantiene mantiene el el color mantiene
el color color el color
en 2/3
del tubo
Fuente: Datos otorgados por la docente

Tabla 5. Cuadro completo de evaluación del cambio de color del azul de

metileno en función al tiempo.
Tiempos 25 min 2 hr 4 hr 5 hr 5<Xhr
Muestra
Muestra 1 Se Se Cambio el Cambio
mantiene mantiene el color los 2/3 total del
el color color del tubo tubo
Muestra 2 Se Se Se mantiene Se Se
mantiene mantiene el el color mantiene mantiene
el color color el color el color
Muestra 3 Se Se Cambio
mantiene mantiene el total del
el color color color
Muestra 4 Se Se Se mantiene Se Cambio
mantiene mantiene el el color mantiene total del
el color color el color tubo
en 2/3
del tubo
Fuente: Elaboración propia

Página 8 de 10
FACULTAD DE INDUSTRIAS ALIMENTARIAS
SECCIÒN DE LABORATORIO
CICLO 2021-1
La muestra 1 podemos inducir que es una leche cruda fresca refrigerada ya que
al observar hay un cambio en 2/3 del color a las 4 horas. Por ende, podemos
decir que la calidad higiénica de esta leche es Buena, ya que su cambio de color
ocurre a partir de 4 horas en baño maría. También que el numero de bacterias
presentes dentro de esta deben estar entre 0.5 a 4 millones/ ml.
La muestra 2 podemos inducir que es una leche UHT ya que al observar que no
hay un cambio del color. Por ende, podemos decir que la calidad higiénica de
esta leche es MUY Buena, ya que no ocurre cambio de color. También que el
número de bacterias presentes dentro de esta deben ser menor a 0.5 millones/
ml.
La muestra 3 podemos inducir que es una leche cruda fresca a temperatura de
ambiente ya que al observar hay un cambio total del color a las 4 horas. Por
ende, podemos decir que la calidad higiénica de esta leche es Buena, ya que su
cambio de color ocurre a las 4 horas en baño maría. También que el número de
bacterias presentes dentro de esta deben estar entre 0.5 a 4 millones/ ml.
La muestra 4 podemos inducir que es una leche pasteurizada ya que al observar
hay un cambio en 1/3 del color a las 5 horas. Por ende, podemos decir que la
calidad higiénica de esta leche es Buena, ya que su cambio de color ocurre a
partir de 5 horas en baño maría. También que el numero de bacterias presentes
dentro de esta deben estar entre 0.5 a 4 millones/ ml.

III. Conclusiones y Recomendaciones

Página 9 de 10
FACULTAD DE INDUSTRIAS ALIMENTARIAS
SECCIÒN DE LABORATORIO
CICLO 2021-1

Huaraz, octubre del 2021

Elaborado por Rosario Tarazona Minaya

Docente de Laboratorio

Página 10 de 10