Cuantificación de Oligonucleótidos y Ácidos Nucleicos por Espectroscopía

de UV

Los ácidos nucleicos absorben eficientemente luz ultravioleta debido a la presencia de

bases aromáticas nitrogenadas a lo largo de las cadenas de DNA. La absorción de Uv de
DNA es una característica de la molécula, que es usada eficientemente para determinar
su concentración. Cada una de las bases tiene su propio y único espectro de absorción y
por lo tanto contribuye de manera diferente a la propiedad total de absorción de UV de
una molécula de DNA. Para muchas aplicaciones, el porcentaje de contribución de cada
una de las bases al espectro de absorción de UV de una molécula de DNA de doble
cadena de alto peso molecular (dsDNA) puede ser ignorado . Sin embargo, esas
contribuciones son más significativas cuando se trata de oligonucleótidos y deben ser
consideradas si se requiere determinar correctamente la concentración.
Concentración de Oligonucleótido en pmol/µl
Los ácidos nucleicos tienen un máximo de absorción a una longitud de onda de 260nm. A
esta longitud, por lo tanto, la absorción es proporcional a la concentración.
C (pmol/µl)= (A260 * 100 * Factor de dilución) / (1.54*nA + 0.75*nC + 1.17*nG + 0.92*nT)

En la fórmula:
   C, es la concentración calculada en picomolas por microlitro (pmol/µl).
   A260 es la absorbancia a 260nm.
   El denominador consiste en la suma de los coeficientes de cada base multiplicados por
el número de veces que aparece en el oligonucleótido.
   El factor de dilución es igual a él volumen final de la dilución dividido entre la cantidad
alicuotada para la dilución.

Protocolo para medir la absorbancia de un oligonucleótido.

1. Encender 20 min la lámpara de UV en el espectrofotómetro para su calentamiento

y seleccionar la longitud de onda a 230 y 260nm
2. Usar agua bidestilada en una celda de cuarzo y utilizarla como blanco de
referencia (una celda de plástico no trasmite eficientemente la luz ultravioleta y por
lo tanto NO debe utilizarse para este procedimiento).
3. A 990 µl de agua bidestilada en un tubo de 1.5ml, agregar 10µl de solución de
oligonucleótido, mezclar bien y transferir a la celda de cuarzo que se utilizó para el
blanco.
4. Leer la absorbancia a 230 y 260nm de la muestra

NOTA:
   - A 260nm, el DNA debe mostrar una absorbancia máxima.
   - El valor de la lectura a 230nm (longitud de onda mínima) está influenciado por la
cantidad de sales presentes en la muestra.
 

Ejemplo.
 Se tiene un 21mero con la secuencia 5' CCT CCT GGC CAG GAC TTA TTG A3' . El
oligo se diluyó 10µl + 990µl de agua.  Las lecturas de absrbancia a 230nm= 0.132003; 
260nm= 0.285736. ¿Cúal es la concentración del oligo?

C = 0.286 x 100 x (1000/10) / (1.54 x 4) + (0.74 x 6) + (1.15 x 5) + (0.87 x 6)  

C = 286/21.57
C = 13.26pmol/µl

      Si se conoce la concentración del oligo en microgramos, se tiene entonces que :

C (picomol) = (microgramos * 1,000,000) / (longitud * 308)

Concentración de Oligonucleótido en Unidades de Densidad Optica (O.D.'s)

    La cantidad de oligonucleótido tambien se expresa como Unidades de Densidad Optica

(O.D.); esto es, la cantidad de Oligo disuelto en 1ml de agua con un valor de A 260 igual a
1.00 en una celda de 1cm de longitud, y se calcula por la ecuación:

Unidades O.D.= A260 X volumen del stock X factor de dilución

Para el ejemplo anterior tenemos que la solución stock es de 1.2ml.
Unidades O.D.= 0.286 x 1.2ml x (1000/10µl) = 34.32 O.D.'s

Concentración de Oligonucleotido en µg/ml

   El valor de A260se convierte a µg/ml usando el coeficiente de extinción para ssDNA la
cual es 1ml/33µg para una celda de 1cm  de longitud. Por lo tanto, para un valor de O.D.
de 1.0, en principio la muestra contine 33µg de ssDNA por ml o en la ecuación:

   1unidad de O.D. de ssDNA=33µg

Nuevamente para el ejemplo anterior:

33µg/ml/1.0 O.D. = µg/ml/0.286 = 9.43µg/ml/

Multiplicando por el factor de dilución la concentración en la solución stock
9.43µg/ml/ x (1000µl/10µl) = 943µg/ml

Concentración en µg/ml de ssDNA de Alto Peso Molecular.

    La concentración de ssDNA de alto peso molecular puede expresarse como pmol/µl,
tomando en cuenta el promedio del peso molecular de un nucleotido en la molecula de
DNA. que para ssDNA es 330 daltons.  (el termino "d alton" es una unidad definida como
1/12 de la masa atomica del 12C. El cual es utilizado como peso molecular expresado
cuantitativamente como  g/mol).

Ejemplo:

El Bacteriofago de ssDNA M13mp18 consiste de 7250nucleotidos. Para expresar esto

como µg/pmol:

Si diluyes tu stock de ss DNA M13mp18 a razon de 10µl/1000µl y da una lectura de A260

= 0.163, la concentración es:

(xµg/µl) / (0.163) = (33µg/µl) / (1.0 OD)   x= 5.38 µg/µl   multiplicando por (1000 µl/10 µl)
= 538 µg ssDNA/ml 

Para convertir a pmol / µl:

(538µg / ml ) (1pmol / 2.39µg )( 1ml / 1000µl ) = 0.225 pmol/µl

Concentración en µg/ml de dsDNA de Alto Peso Molecular.

    Para determinar  la concentración de ssDNA de Alto Peso Molecular, plasmidos o

productos de PCR, se realizan mediciones a 260 y 280 nm. Concentraciones tan bajas
como 2.5µg/ml pueden ser detectadas. A pH neutro, una solución de DNA a 1 mg/ml tiene
una absorción máxima a 260nm de 20 cuando se lee en una celda de 1cm. (este valor es
para moléculas de dsDNA con un contenido G+C de 50%. Sin embargo para muchas apli
caciones en Biologia Molecular el contenido de G+C no es nescesario considerarlo a
menos que sea muy extremo). En principio una soluciòn de dsDNA con una
concentración de 50 µg /ml debe tener una A260 i gual a1.0.

  1 (A260) unidad de dsDNA=50 µg /ml

Ejemplo:  de una solución del plasmido pUC19 se diluyo una alicuota  a razon de 5µl /
1000µl en agua, las lecturas de absorbancia son: 260 = 0.789;  280 = 0.4475

(xµg/ml) / (0.789) = (50µg / ml) / (1.0 OD)  x= 19.74 µg/ml   multiplicando por (1000 µl / 5
µl) = 3948µg dsDNA/ ml

La relación A260 /A280 del dsDNA  es 0.789 / 0.447 = 1.76

    Las proteínas tienen un máximo de absorción a A280 (principalmente por residuos de

triptófano) las lecturas a esta longitud pueden mostrar si existe algún contaminante
proteico. El cálculo de la relación A260 /A280 es una manera común para expresar la pureza
del DNA. Dependiendo de la composición nucleica, un valor de 1.65 a 1.9 indican una
muestra pura.

    Debido a otros contaminantes una muestra con una relación alta de A260 /A280 puede no
necesariamente producir buenos datos de secuencia. A veces también, una muestra con
una  baja relación A260 /A280 puede secuenciarse bien.

    El método más común de purificación de DNA es extrayendo la preparación con fenol
para remover la proteína contaminante. El fenol tiene una absorción máxima a 270nm.
Las preparaciones que contienen residuos de fenol pueden dar lecturas artificiales altas a
A260  y la concentración de DNA será sobrestimada.

    La concentración de RNA  de determina por el mismo protocolo que el utilizado para la
medición de DNA. Sin embargo, se aplica la siguiente relación:

 1 unidad A260 de ssRNA = Las preparaciones puras de RNA tienen una relación
40µg / ml  A260 /A280 de 2.0