PRUEBA DE FRAGILIDAD OSMOTICA

Método de Dacie

FINALIDAD:
1. Determinar con la mayor precisión posible la fragilidad osmótica de la
muestra de un paciente mediante el método de Dacie.
2. Graficar una curva de fragilidad osmótica con los datos obtenidos
durante la práctica.
3. Asociar resultados patológicos a patrones observables en una curva de
FO

INTRODUCCIÓN:
La fragilidad osmótica mide la habilidad de los glóbulos rojos de incrementar
su volumen cuando son sometidos a soluciones hipotónicas de cloruro de sodio
(NaCI) de concentraciones variables. Es la prueba más utilizada para el
diagnóstico de la Esferocitosis Hereditaria Y Talasemias. Los esferocitos tienen
una relación superficie-volumen disminuida, tienen una capacidad disminuida
para aumentar su volumen y se lisan a una concentración de sales más
elevada que las células normales. Estos glóbulos presentan un aumento en la
fragilidad osmótica: son más frágiles que lo normal, por lo contrario los
eritrocitos de individuos que sufren de talasemia, son menos frágiles que lo
normal por lo tanto la prueba esta disminuida.

PRINCIPIO:
En esta prueba cuando los eritrocitos son puestos en una serie de soluciones
hipotónicas de NaCl, el agua entra a las células hasta que alcanzan un
equilibrio. Mientras esto sucede la célula va incrementando su volumen hasta
que es lisada porque no puede contener el volumen.

La muestra es pipeteada en una serie de tubos con diferentes concentraciones

de solución salina y el sobrenadante de estos es medido. La concentración de
hemólisis en cada tubo es comparado contra rangos normales para su
diagnóstico.

La sensibilidad de esta prueba puede incrementarse con la preincubación de

las células. Se utiliza la misma metodología excepto, que la prueba es
efectuada con sangre estéril que ha sido incubada por 24 horas a 37 °C.

REACTIVOS:
1. Solución Stock de cloruro de sodio buferado, pH 7.4
a. 90 g de NaCl
b. 13.66 g de Fosfato de sodio dibásica (Na2HPO4.2H20)
 c. 2.43 g de Fosfato de sodio monobásico (NaH2PO4.2H2O)
Esto se disuelve en 1 L de agua destilada

2. Las soluciones de trabajo se obtienen colocando en un frasco

volumétrico de 100 ml los siguientes volúmenes de la solución stock y
diluyendo con agua destilada a 100 ml.

Concentración % ml de solución stock

0.10 1.0
0.20 2.0
0.30 3.0
0.35 3.5
0.40 4.0
0.45 4.5
0.50 5.0
0.55 5.5
0.60 6.0
0.65 6.5
0.70 7.0
0.75 7.5
0.80 8.0
0.85 8.5

-Rotule cada frasco con la debida concentración y guarde a 4 °C. Descarte

cuando se contamine.

MUESTRA:
3. Sangre venosa fresca con EDTA o Heparina
4. Sangre completa con EDTA o heparina pre-incubada 24 horas, preparada
de la siguiente manera: Homogenice bien la muestra y pipetee 2 ml de
sangre en un tubo plástico estéril. Selle el tubo e incúbelo en baño maría
durante 24 horas.

PROCEDIMIENTO:
1. Obtenga de 2-3 ml de sangre anticoagulada del paciente.
2. Rotule 14 tubos y agregue 5 ml de cada concentración del NaCl a cada
tubo.
3. Coloque 0.05 ml de sangre anticoagulada en cada tubo y mezcle.
4. Deje los tubos a temperatura ambiente por 30 minutos.
5. Resuspenda suavemente y centrifugue as 3,000 g / 10 minutos.
6. Lea en el espectrofotómetro el sobrenadante de cada tubo (540 nm
longitud de onda).
7. Use el sobrenadante del tubo 0.85% como blanco y el tubo de 0.1%
como el que representa el 100% de hemólisis.

CÁLCULOS:
 % Hemólisis = DO del sobrenadante de cada tubo X100
DO del tubo con 100% de hemólisis

Con los datos obtenidos se construye una curva, en el eje de las ¨x¨ el % de
NaCl y en ¨y¨ el % de hemólisis

Ejemplo de curva de fragilidad osmótica

VALORES DE REFERENCIA:
Un glóbulo rojo normal, bicóncavo comienza a mostrar hemólisis a una
concentración de 0.45 y su hemólisis se encuentra completa a 0.30.

Concentración de NaCI % de hemólisis a 25C % de hemólisis

incubada
0.20 100 91-00
0.30 97-100 80-100
0.35 90-99 72-100
0.40 50-90 65-100
0.45 5-45 54-96
0.50 0-5 36-88
0.55 0 05-70
0.60 0 00-40
0.65 0 00-19
0.70 0 00-09
0.85 0 00-00
INTERFERENCIAS
Otras enfermedades también resultan con fragilidad incrementada o
disminuída como ser: Hemoglobina S, Anemia hemolítica inmune, deficiencia
severa de hierro, Piropoiquilocitosis hereditaria, Estomatocitosis hereditaria y
otras condiciones que alteren el volumen del eritrocito como quemaduras.
BIBLIOGRAFÍA
1. Manual de Hematología II, Dra. Miriam Salgado
2. Hematology clinical principles and applications, Fourth edition, B. Rodak.
3. Clinical Hematology and Fundamentals of Hemostasis, Third Edition, D.
Harmening.
4. Hematology 1 and 2 Laboratory Manual, G. Fritsma.