PROTEÍNAS Y TRANSPORTE DE MEMBRANA

MARIANA ÁLVAREZ RESTREPO

LORENA DAVID PEREIRA
LUIS FELIPE GIRALDO GUZMÁN

DOCENTE:
LAURA INES PINILLA MENDOZA

FACULTAD DE INGENIERÍA
INGENIERÍA BIOQUÍMICA
BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR
UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA

APARTADÓ, ANTIOQUIA
09 DE ABRIL 2021
 Proteínas y Transporte de Membrana

Transporte de membrana ( 50 puntos)

1. La unidad estructural básica de las biomembranas es la bicapa fosfolipídica.

El ácido acético y el etanol están compuestos cada uno de dos carbonos H y
O, y ambos entran en las células por difusión pasiva. A pH 7 uno es más
permeable a la membrana que otro. ¿Cuál es más permeable y por qué?
Explique cómo la permeabilidad de cada uno es alterada cuando el pH es
reducido a 1, un valor típico del estómago. (20 puntos)

Ácido acético

Etanol

Difusión pasiva: pasa de una zona de alta concentración a una de baja

concentración.

Para determinar la permeabilidad nos basaremos en la que tenga mayor velocidad

de difusión, para ellos utilizaremos ; menor tamaño + Menor polaridad y menor
carga = MAYOR VELOCIDAD.

● Primero vamos a analizar la polaridad y las cargas de las dos moléculas.

Para el Ácido acético dado que tiene un grupo polar (-COOH) y uno apolar (-CH 3)
en su composición molecular, se trata de una sustancia ambigua respecto a sus
disolventes, por lo tanto tiene presencia de cargas.

● Por otro lado, el etanol Sustancia polar con enlaces O-H. Presenta Fuerzas
de Dispersión entre los dipolos transitorios, Fuerzas Dipolo-Dipolo y Puentes
de Hidrógeno. con menos presencia de carga que el ácido acético.

Ahora analizaremos el tamaño de las dos partículas con su peso molecular

la molar del etanol es
 46.07 g/mol
la masa molar del ácido acético es :
60.05 g/mol

En conclusión el etanol es más permeable debido a que entra con mayor rapidez a
la célula gracias a que es más pequeño molecularmente, tiene menor polaridad y
menos carga que el ácido acético.

Si alteramos el pH a 1 esto quiere decir que tenemos una concentración ácida lo

cual favorece el transporte del etanol, mejorando la permeabilidad del etanol ya que
la diferencia de concentraciones en el interior y el exterior de la célula es
fundamental para la ejecución de sus funciones, y entre mayor sea esa diferencia
además mejor es la fuerza es generada por el gradiente de concentración.
El ácido acético mejora sus condiciones de permeabilidad debido también a la
diferencia de concentración.

2. Nombre las tres clases de transportadores. Explique cuál de estas clases es

capaz de mover glucosa o bicarbonato en contra del gradiente electroquímico.
(10 puntos)
Transporte pasivo inespecífico o difusión simple: Es la que se da impulsada por el
gradiente electroquímico (Fuerza generada por el voltaje de la membrana) y de
concentración.
Transporte pasivo específico o difusión facilitada: Es donde el ingreso de la proteína
a la célula se da por medio de la ayuda de una proteína.
Transporte activo: en contra de un gradiente electroquímico.

La glucosa es una molécula que cumple con un cotransporte, ya que requiere de

difusión facilitada por medio de una proteína específica y además transporte activo
ya que viaja en contra del gradiente de concentración mediante el impulso del
movimiento de un ion cotransportado por su gradiente. La difusión simple es la única
que no puede mover la glucosa o bicarbonato en contra de su gradiente
electroquímico.

3. Nombre las 4 clases de bombas impulsadas por ATP que producen un

transporte activo de iones y moléculas. Indique cuál de estas clases
transporta solo iones y cual transporta principalmente moléculas pequeñas.
(10 puntos)

4. Cuál es la composición de la membrana plasmática y cuál es su función.

(5 puntos)
La membrana plasmática está constituida básicamente por lípidos (Fosfolípidos,
colesterol), proteínas y carbohidratos. Los lípidos se encuentran en el interior de la
membrana formando dos capas de fosfolípidos con sus colas hacia dentro este
arreglo recibe el nombre de bicapa fosfolipídica. El colesterol se encuentra
incrustado entre las colas hidrofóbicas de los fosfolípidos. Por otro lado hay dos
tipos de proteínas que componen la membrana estas son las integrales y las
periféricas, las integrales se encuentran incrustadas en la bicapa fosfolipídica
mientras que las periféricas se encuentran en la superficie interna (debajo de la
célula) o externa (arriba de la célula) pero no instrustradas en su interior hidrofóbico.
Por último los carbohidratos se encuentran unidos a proteínas o lípidos en la
superficie extracelular de la membrana es decir en el exterior de esta, formando
glicoproteínas y glicolípidos. Todos estos componentes mencionados presentan
movilidad permitiendo a la membrana un cierto grado de fluidez dicho aspecto hace
que tenga similitud a la de una mosaico fluido.
La membrana plasmática tiene como función:
-Limita el medio intracelular y extracelular de la célula.
-Divide los compartimentos intracelulares donde se realizan funciones
indispensables para la célula.
-Protege a la célula permitiendo transportar nutrientes hacia su interior y expulsar
las sustancia tóxicas fuera de la célula, proporcionando así una estabilidad dentro
de la célula.
-Controla el flujo de información entre la célula y su entorno debido a que la
conforman proteínas que actúan como receptoras.

5. Porque la bicapa lipídica es impermeable a los iones? (5 puntos)

El orden de las llamadas cabezas hidrofílicas y las colas hidrofóbicas de la bicapa

lipídica impide que solutos polares, como aminoácidos, ácidos nucleicos,
carbohidratos, proteínas e iones, difundan a través de la membrana, pero
generalmente permite la difusión pasiva de las moléculas hidrofóbicas.

Proteínas (50 puntos)

1.) La estructura tridimensional de una proteína está determinada por sus

estructuras primaria, secundaria y terciaria. Defina estas estructuras. (15
puntos)
● Estructura primaria: La estructura primaria está determinada por la
secuencia de las aminas en la cadena de la proteína , es decir, el número de
ácidos presentes y el orden en el que están enlazados. El nivel primario es
prácticamente ilimitado.Como en casi todas las proteínas hay diferentes
aminoácidos , el número de estructuras posibles es por las variaciones
repetidas de 20 elementos tomados de n en n, donde n es el número de
ácidos que componen la molécula de proteína.
Debido al enlace peptídico establecido entre los diferentes aminoácidos que
forman la columna vertebral de la proteína o la "columna vertebral" provienen
de la aparición de las cadenas laterales de aminoácidos. Los átomos que
componen la cadena. La parte principal de la proteína es el amino N
(condensado con el aminoácido anterior), C = (de donde aparece la cadena
 lateral) y C (condensación) del grupo carboxilo con el siguiente aminoácido).
Por lo tanto, apareció en la principal cadena de proteínas: (-NH-C = -CO-).
Conocer la estructura primaria de una proteína no solo es correcto para
comprender su función (porque depende de la secuencia de aminoácidos y
de la forma que adopten), ya que también se puede utilizar en el estudio de
enfermedades genéticas. El origen de las enfermedades genéticas puede
estar en la secuencia anormal. Esta anomalía, si es muy grave, puede hacer
que la función de la proteína no funcione con normalidad, o incluso que no
funcione con normalidad.
La secuencia de aminoácidos está especificada por la secuencia de
nucleótidos en el ADN. Existe un sistema de conversión, llamado código
genético, que puede usarse para inferir el primero del segundo. Sin embargo,
ciertas modificaciones en el proceso de transcripción del ADN no siempre
permiten esta conversión directamente.
Generalmente, la cantidad de aminoácidos que componen una proteína está
entre 80 y 300. Los enlaces implicados en la estructura primaria de las
proteínas son enlaces covalentes: son enlaces peptídicos.
● Estructura secundaria: La estructura secundaria de una proteína es el
plegamiento de la cadena. Los polipéptidos se utilizan debido a la formación
de enlaces de hidrógeno entre átomos que forman enlaces peptídicos. El
enlace de hidrógeno se establece entre los grupos -CO- y -NH- del enlace
peptídico (el primero actúa como aceptor de H, el segundo actúa como
donante de H). De esta forma, la cadena polipeptídica puede adoptar una
conformación de energía libre más baja y, por tanto, es más estable.
● Estructura terciaria: La estructura terciaria es la disposición tridimensional
de todos los átomos que componen una proteína, concepto comparable a la
conformación absoluta en otras moléculas. La estructura terciaria de las
proteínas es directamente responsable de sus propiedades biológicas,
porque la disposición espacial de diferentes grupos funcionales determina su
interacción con varios ligandos. Para proteínas compuestas por una sola
cadena polipeptídica (falta de estructura cuaternaria), la estructura de tercer
nivel es la información de estructura máxima que se puede obtener.
a.) ¿Cuáles son las estructuras secundarias más comunes?
● Hélice alfa: En esta estructura de la cadena. Esta estructura se mantiene
debido al enlace de hidrógeno intracadena formado entre el grupo -NH del
enlace peptídico y el grupo -C = O del cuarto aminoácido subsiguiente.
Cuando la cadena polipeptídica se enrolla en una hélice sobre sí misma
debido a la rotación producida alrededor del carbono alfa de cada
aminoácido, se adopta una conformación llamada hélice alfa. La estructura es
periódica y cada enlace peptídico puede establecer dos enlaces de
hidrógeno. Se forma un enlace de hidrógeno entre el grupo -NH- del enlace
peptídico del aminoácido en la posición ny el grupo -CO- del enlace peptídico
del péptido . El aminoácido en la posición n-4. Otro enlace de hidrógeno se
forma entre el grupo -CO- del enlace peptídico AA en la posición ny el grupo
 -NH- del enlace peptídico AA en la posición n + 4. Cada vuelta de la espiral
tiene un paso de 0,54 nm.
Las cadenas laterales de aminoácidos se encuentran en el exterior de la
hélice, evitando el problema del impedimento estérico. Por lo tanto, la
estructura puede acomodar cualquier aminoácido, excepto prolina, porque
está integrado en un anillo heterocíclico y su calcio no tiene libertad de
rotación. Por lo tanto, la prolina a menudo causa una ruptura en la
conformación helicoidal α. Los aminoácidos altamente polares (Lys, Glu)
también pueden destruir la estabilidad de la hélice, porque el enlace de
hidrógeno pierde importancia a la interacción electrostática de atracción o
repulsión. Por tanto, a valores de pH sin grupos ionizantes, domina la
estructura α-helicoidal.

● Hoja beta: Cuando la cadena principal de un polipéptido se extiende hasta la

longitud máxima permitida por su enlace covalente, se adopta una
configuración espacial llamada estructura β, que generalmente se indica con
una flecha. En esta estructura, las cadenas laterales de aminoácidos se
ubican alternativamente a la derecha e izquierda de la cadena principal de la
cadena polipeptídica. Las estructuras β de diferentes cadenas polipeptídicas
o las estructuras β de diferentes regiones de la misma cadena polipeptídica
pueden interactuar entre sí a través de enlaces de hidrógeno, formando una
estructura en capas llamada hoja plegada o hoja beta debido a su forma.
 Cuando la estructura β tiene el mismo significado, la hoja β resultante es si la
estructura β tiene la dirección opuesta, la hoja doblada resultante es
antiparalela.

● Giros beta: Las secuencias de cadenas polipeptídicas que tienen una

estructura α o β están normalmente conectadas entre sí mediante los
llamados giros β. Son secuencias cortas y tienen una conformación
característica que impone un giro brusco de 180 grados en la cadena
principal del polipéptido.Aminoácidos, como Asn, Gly y Pro (en tipo α o β) a
menudo aparecen en este tipo de estructura. La conformación de giro β
generalmente se estabiliza mediante enlaces de hidrógeno entre los residuos
1 y 4 de giro β.

● Hélice de colágeno:Es una variante especial de la estructura secundaria del

colágeno. El colágeno es una proteína fibrosa importante que se encuentra
en los tendones y tejidos conectivos y tiene funciones estructurales
especiales porque es particularmente duro. Proporciona una secuencia típica
que consta de repeticiones periódicas de un grupo que consta de tres
 aminoácidos. El primer aminoácido de cada grupo es Gly, los otros dos son
Pro (o hidroxiprolina) y cualquier aminoácido: - (G-P-X) -
La frecuencia periódica de la prolina limita el rizado especial de la forma de
hélice izquierda del colágeno. La glicina sin cadenas laterales permite la
aproximación entre diferentes hélices, de modo que tres hélices zurdas se
asocian para formar una hélice derecha.

● Láminas beta o láminas plegadas: Son regiones de proteínas que adoptan

una estructura en zigzag y se asocian entre sí, y los enlaces se establecen
mediante enlaces de hidrógeno entre cadenas. Todos los enlaces peptídicos
participan en estos enlaces cruzados, lo que otorga a la estructura una gran
estabilidad. La forma beta es una conformación simple que consta de dos o
más cadenas polipeptídicas paralelas (funcionamiento inverso) o
antiparalelas (funcionamiento inverso), que están organizadas a través de
enlaces de hidrógeno y radicales de aminoácidos. Esta configuración tiene
una estructura en capas y plegada en forma de acordeón.

b.) ¿Cuáles son las fuerzas que mantienen unidas las estructuras secundarias
y terciarias?
En el caso de las estructuras secundarias la fuerza que mantiene la unión son los
puentes de hidrógeno que se forman entre el oxígeno del grupo carbonilo de un
aminoácido y el hidrógeno del grupo amino de otro. Para el caso de las estructuras
terciarias la fuerza que las mantienen unidas son los puentes de disulfuro este
enlace es el enlace más fuerte, a pesar de que hayan otros presentes como por
ejemplo los puentes de hidrógeno, enlaces iónicos entre otros.

c.) ¿Qué es la estructura cuaternaria?

Cuando una proteína se compone de más de una cadena polipeptídica, es decir
Cuando se trata de proteína oligomérica, decimos que tiene una estructura
cuaternaria.
Se debe considerar la estructura de cuatro niveles:
° El número y la naturaleza de diferentes subunidades o monómeros que
constituyen los oligómeros, y
° La forma en que se asocian en el espacio para producir oligómeros.
La estructura cuaternaria se deriva de la combinación de varias cadenas de
péptidos, estas cadenas de péptidos se asocian con un multímero, cuyas
propiedades son diferentes de las propiedades de sus monómeros constituyentes.
Las subunidades están asociadas entre sí a través de interacciones no covalentes
como enlaces de hidrógeno, interacciones hidrofóbicas o puentes salinos. Si la
proteína está compuesta por dos monómeros, el dímero (si los monómeros
constituyentes son los mismos) puede ser un homodímero, de lo contrario puede ser
un heterodímero. Con respecto a los enlaces covalentes, también pueden existir
enlaces disulfuro entre residuos. Las cisteínas se encuentran en diferentes cadenas.

2.) El plegado correcto de las proteínas es esencial para la actividad biológica.

Describa el papel de las chaperonas y de las chaperonas moleculares en el
plegado de las proteínas.(5 puntos)

Las proteínas chaperonas están presentes en todas las células, su papel es

favorecer la función de otras proteínas, por ejemplo ayudando a su plegamiento de
forma correcta ya que en caso contrario la proteína no será funcional y la célula se
encargará de desecharla. Estas chaperonas no forman parte de la estructura
primaria de la proteína funcional, sino que sólo se unen a ella para ayudar en su
plegamiento, ensamblaje y transporte celular a otra parte de la célula donde la
proteína realiza su función y además contribuyen en su degradación.

El papel de las chaperonas moleculares es reconocer y seleccionar su unión a

péptidos de nueva síntesis que esperan alcanzar su conformación nativa, formando
complejos relativamente estables. Las chaperonas previenen la agregación de
conformaciones no nativas y mantienen a las proteínas en las pautas necesarias
para su plegamiento adecuado. Este proceso se da gracias a que las proteínas
interaccionan con alguna chaperona en alguna etapa de su plegamiento, de este
modo la importancia de las chaperonas moleculares radica en la necesidad de
prevenir la agregación durante el plegamiento de cadenas polipeptídicas recién
formadas, prevenir interacciones no deseadas con otros componentes así mismo
dirigir el ensamblaje de proteínas de gran tamaño y durante situaciones bajo estrés,
sin dejar de potenciar el plegamiento de numerosas proteínas.

3.) Las proteínas son degradadas en la célula. (10 puntos)

a.) ¿Qué es la ubicuitina y qué papel cumple en el marcado de las proteínas de

degradación?
La ubiquitina es una pequeña proteína que se encuentra en todo el organismo y
está formada por 76 aminoácidos. Cuando varias moléculas de ubiquitina en una
conformación determinada se unen a la proteína que tiene que ser eliminada, el
proteasoma -gran complejo multiproteico responsable de la degradación-, la
identifica como “desechable” e inicia una cadena de reacciones que terminan con la
destrucción de la misma.

Degradación de proteínas, regulación del crecimiento celular, reparación del ADN,

degeneración neuronal y muscular y respuesta al estrés son sólo algunas funciones
que regulan la ubiquitina, una proteína pequeña que se encuentra en todas las
células del organismo.

b.) ¿Cuál es la función de los proteosomas en la degradación de la proteína?

Su principal función es la degradación enzimática de proteínas. La proteasoma

degrada las proteínas hasta el nivel de pequeños péptidos de 7 a 9 aminoácidos;
éstos son hidrolizados hasta aminoácidos por proteasas citosólicas inespecíficas.
En la degradación de proteínas, cada aminoácido se degrada, a su vez, mediante
una serie de reacciones en cadena, formando vías metabólicas, de manera que
cada aminoácido tiene su propia vía para formarse y para degradarse
convirtiéndose en energía.

4.) La cromatografía es un método analítico utilizado para separar las

proteínas. Describa los principios para separar proteínas mediante filtración
en gel, intercambio iónico y cromatografía de afinidad. (10 puntos)

-Separación de proteínas mediante filtración en gel:

Está técnica es una de las más sencillas empleadas en la separación de proteínas,
se realiza en columnas cilíndricas que contienen algunos geles que se fabrican con
el fin de separar. Como por ejemplo, agarosa, poliacrilamida, etc. Todos estos geles
cumplen el papel de fase estacionaria y están compuestos por gránulos de un
material esponjoso hidratado que contiene poros de un tamaño determinado.
Cuando se hace pasar una mezcla de moléculas de distinto tamaño por una
filtración en gel, solo aquellas partículas que son de menor tamaño entran en los
poros que presenta el gel esto conlleva a que la velocidad del flujo sea menor a
diferencia de las moléculas de mayor tamaño estas son incapaces de entrar en los
poros del gel por lo tanto, se mueven más fácil entre ellas lo que permite que la
velocidad del flujo sea mayor debido a que la técnica se fundamenta en que las
moléculas de mayor peso molecular son eluidas antes que las de menor peso
molecular.
Ilustración del proceso:

Las mallas del gel permiten el ingreso selectivo de las partículas de menor masa
molecular, por esto las partículas de mayor masa molecular saldrán primero.

-Separación de proteínas mediante cromatografía de intercambio iónico:

Las proteínas tienen variedades de grupos funcionales que tienen tanto cargas
positivas como negativas. La cromatografía de intercambio iónico consiste en
separar las proteínas en función de su carga eléctrica en lugar de hacerlo por su
tamaño como en el caso anterior.
La separación se hace por medio de una fase estacionaria con sustituyentes
ionizables que tienen como función retener las proteínas cargadas negativamente
(rojo) con el fin de que solo las que están cargadas positivamente y las neutras
puedan pasar libremente a través de la fase y eluir por la columna.
Dicho proceso se ilustra en la siguiente imagen:
-Separación de proteínas por cromatografía de afinidad:
La cromatografía de afinidad consiste en separar una sustancia de una mezcla
utilizando interacciones altamente específicas reversibles como por ejemplo la alta
especificidad de las reacciones biológicas del tipo antígeno-anticuerpo, hormona-
receptor, etc.
Su principio se basa en que la fase estacionaria es un sólido con una molécula que
tenga alta afinidad y selectividad (ligando) por la sustancia o proteína que queremos
separar que está presente en la fase móvil (sustancia diana), dicha fase móvil casi
siempre está en forma líquida para así poder transportar la sustancia de interés por
la fase estacionaria.
En este recorrido las sustancias que tengan afinidad con el ligando quedan
retenidas en la columna y el resto de sustancias no afines con el ligando pasan y se
recogen al final de la columna.
Posteriormente las sustancias que quedaron retenidas por afinidad se liberan
haciendo cambios fisicoquímicos como cambiar el pH, aumentar la fuerza iónica,
entre otros. De este modo se consigue que la interacción se debilite.
Ilustración del proceso:
5.) Se han desarrollado diversos métodos para detectar proteínas. Describa
cómo pueden utilizarse radioisótopos y la autorradiografía para marcar
proteínas. ¿En qué consiste la técnica de Western-blot? (10 puntos)

Radiomarcaje
Radiomarcaje de células vivas: además de las proteínas de marcaje radiactivo en
solución, se han incorporado radioisótopos en proteínas citosólicas y / o de
membrana celular de células vivas. Se ha utilizado lactoperoxidasa o yodógeno
insoluble para radioyodar las proteínas accesibles de la membrana celular,
basándose en el principio de que el agente marcador no puede penetrar la
membrana celular. Diez millones de linfocitos proporcionan aproximadamente 5 a 10
μg de proteína de membrana , de los cuales 0,5 a 5 ng podrían ser de una especie
en particular. El radiomarcaje, en combinación con procedimientos inmunoquímicos,
facilita la identificación molecular rápida de proteínas de membrana individuales.
Por ejemplo, las células radio yodadas se lisan con detergentes no iónicos o de
sales biliares y las proteínas radiomarcadas se inmunoprecipitan con anticuerpo.
Estos procedimientos permiten el aislamiento e identificación de tan solo un 0,1% de
las proteínas marcadas radiactivamente. Una vez aisladas, las proteínas marcadas
radiactivamente se analizan mediante procedimientos microquímicos estándar,
como geles de poliacrilamida y autorradiografía . La radio yodación de la superficie
celular ha identificado las propiedades moleculares de los receptores de antígenos
de las células B y T , las principales glicoproteínas del complejo de
histocompatibilidad y los antígenos de diferenciación . Las glicoproteínas de la
membrana celular también se pueden marcar vectorialmente con 3H-NaBH 4
después de la oxidación de restos de carbohidratos. Además, las proteínas
celulares pueden marcarse mediante la incorporación biosintética de precursores de
proteínas de aminoácidos marcados con 3 H, 14 C o 35 S o azúcares 3 H, 14 C
como precursores de carbohidratos. Algunas proteínas también pueden marcarse
mediante la incorporación de 32 P catalizadas por varias quinasas.

Después de que estas células se marcan biosinteticamente, las proteínas

radiomarcadas se aíslan inmunoquímicamente y su estructura se determina
mediante procedimientos microanalíticos. Además, la pérdida de proteínas de
membrana marcadas vectorialmente por las células cultivadas y el aumento de
proteínas marcadas radiactivamente biosinteticamente pueden tomarse como una

medida del recambio de proteínas citosólicas o de membrana .

El radiomarcaje es uno de los métodos experimentales más útiles para el estudio de

la adsorción de proteínas en interfaces de solución sólida. Se incorpora un nucleido
radiactivo (generalmente 125 I) a la estructura molecular de la proteína que se va a
estudiar. El aumento de la radiactividad de la muestra después del contacto con una
solución que contiene la proteína marcada permite calcular la cantidad de proteína
adsorbida. Esta técnica se puede utilizar para estudiar no solo la adsorción de un
solo componente, sino también la adsorción competitiva de una mezcla de proteínas
(es decir, sangre o plasma). De los métodos actualmente disponibles, el
radiomarcaje es probablemente el método más sensible y preciso para cuantificar la
cantidad de proteína adsorbida. Una concentración de proteína tan baja como 0.05
ng / cm 2 puede ser detectada. Sin embargo, este método no proporciona
información sobre la conformación y el estado biológico de la proteína adsorbida

Autorradiografía

La autorradiografía es un método fotográfico utilizado para detectar materiales

radiactivos, entre ellos proteínas radiomarcadas que se resuelven con 2-DE , ya que
la energía de autorradiografía puede penetrar a través del gel y sobre la película
fotográfica. La autorradiografía se puede emplear en diferentes estudios, entre ellos,
los relacionados con la visualización y cuantificación de proteínas radiomarcadas o
ADN separado por PAGE, así como el análisis de imágenes para cuantificar la
concentración de fármaco proteico radiomarcado en suero para estudios
farmacocinéticos .
¿En qué consiste la técnica de Western-blot?

El Western blot se utiliza a menudo en la investigación para separar e identificar

proteínas. En esta técnica se separa una mezcla de proteínas en función del peso
molecular y, por tanto, por tipo, mediante electroforesis en gel. Estos resultados
luego se transfieren a una membrana que produce una banda para cada proteína. A
continuación, la membrana se incuba con anticuerpos marcados específicos de la
proteína de interés.

El anticuerpo no unido se elimina por lavado dejando solo el anticuerpo unido a la

proteína de interés. A continuación, los anticuerpos unidos se detectan revelando la
película. Como los anticuerpos sólo se unen a la proteína de interés, solo debe ser
visible una banda. El grosor de la banda corresponde a la cantidad de proteína
presente; por tanto, hacer un estándar puede indicar la cantidad de proteína
presente. El artículo describe primero el protocolo para Western Blot, acompañado
de imágenes para ayudar al lector y a la teoría a racionalizar el protocolo. A esto le
seguirá la explicación teórica del procedimiento y, en la sección posterior,
sugerencias para la resolución de problemas comunes.
Técnica
Lisis celular para extraer proteínas. Las proteínas pueden extraerse de diferentes
tipos de muestras, como tejidos o células. A continuación, se presenta el protocolo
para extraer proteínas de células adherentes.
Células adherentes:

1. Lavar las células en el matraz o placa de cultivo de tejidos añadiendo

solución salina tamponada con fosfato (PBS) fría y agitando suavemente.
Deseche el PBS. (Consejo: Mantenga la placa de cultivo de tejidos en hielo
durante todo el proceso).

2. Añadir PBS y utilizar un rascador celular para desalojar las células. Pipetear
la mezcla en tubos de microcentrífuga.

3. Centrifugar a 1500 RPM durante 5 minutos y desechar el sobrenadante.

4. Añadir 180 μL de tampón de lisis celular helado con 20 μL de cóctel de

inhibidores de proteasas fresco. (Consejo: Si la concentración de proteínas
no es lo suficientemente alta al final, se aconseja repetir el procedimiento con
una mayor proporción de cóctel de inhibidores de proteasa).

5. Incubar durante 30 minutos en hielo y, a continuación, clarificar el lisado

haciéndolo girar durante 10 minutos a 12.000 RPM, a 4°C.
 6. Transferir el sobrenadante (o la mezcla de proteínas) a un tubo nuevo y
almacenar en hielo o congelado a -20°C o -80°C.

7. Medir la concentración de proteínas con un espectrofotómetro.

Preparación de la muestra:

1.
determinar el volumen de extracto de proteína para asegurar 50 μg en cada
pocillo.
2. Añadir 5 l de tampón de muestra a la muestra, y hacer que el volumen en
cada carril esté ecualizado usando destilada H2O (dd H 2 O). Mezclar bien.
(Consejo: se sugiere un volumen total de 15 μL por carril).
3. Calentar las muestras con placa seca durante 5 minutos a 100 ° C.

Preparación de gel

1. Después de preparar la solución de gel de apilamiento al 10%, monte el

bastidor para solidificar el gel. (Consejo: 10% AP y TEMED solidifican la
solución; por lo tanto, ambos geles se pueden preparar al mismo tiempo, si
los reactivos antes mencionados no se agregan hasta el final).
2. Cubra el gel de apilamiento con el gel separador, después de eliminar el
agua. (Consejo: es mejor inclinar el aparato y utilizar una toalla de papel para
eliminar el agua).
3. Inserte el peine, asegurándose de que no haya burbujas de aire.
4. Espere hasta que el gel se solidifique. (Consejo: la solidificación se puede
comprobar fácilmente dejando un poco de solución de gel en un tubo).
 Referencias bibliográficas

● Luque Guillén, M. ESTRUCTURA Y PROPIEDADES DE LAS PROTEÍNAS.

Retrieved from https://www.uv.es/tunon/pdf_doc/proteinas_09.pdf
● Julia Máxima Uriarte ."Membrana Celular".
Membrana Celular: características, funciones y estructura
● Juan Manuel González Mañas, ESTRUCTURA TERCIARIA DE LAS
PROTEÍNAS
http://www.ehu.eus/biomoleculas/proteinas/prot43.htm#:~:text=Prote
%C3%ADna%20 globular%3A%20 mioglobina,(Figura%20de%20la%20
derecha).
● DeepL Translate. Retrieved from https://www.deepl.com/translator
● “Proteins (Proteínas)”, de OpenStax College, Biología
http://cnx.org/contents/185cbf87-c72e-48f5-b51e-
f14f21b5eabd@9.85:13/Biology.
● SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS POR CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN,
recuperado de https://bioquibi.webs.ull.es/practicas/6.pdf
● Robert E. Smith CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO recuperado
de Cromatografía de intercambio iónico - Wikipedia, la enciclopedia libre
● Enrique castaños, CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD recuperado de
https://cienciadelux.com/2015/08/16/cromatografia-por-afinidad/
● Isotope Labeling - an overview | ScienceDirect Topics. (2011). Retrieved from
https://www.sciencedirect.com/topics/biochemistry-genetics-and-molecular-
biology/isotope-labeling
● Autorradiografía: una descripción general | Temas de ScienceDirect. (2004).
Obtenido de https://www.sciencedirect.com/topics/chemistry/autoradiography