Fluorometría de Inducción - Relajación

LHCII = Pigmentos antena

(Light-Harvesting Complexes)
Fotosíntesis asociados al Fotosistema II
QA = Plastoquinona A
QB = Plastoquinona B
PQ = Pool de Plastoquinonas
PQH2= Plastoquinonas
Cyt b6f = Citocromo b6f
PC = Platocianina
LHCI = Pigmentos antena
asociados al Fotosistema II
FD = Ferrodoxina
 3. Los electrones se extraen del agua y se 5. Al llegar a los centros de reacción de PSI, los electrones son propulsados ​por otro
1. Luz transfieren a las 2 moléculas de clorofila que proceso de absorción de luz hacia la ferredoxina. A partir de ahí, los electrones se
absorbida por componen el complejo P680+, lo que da redistribuyen entre las vías de fijación de carbono , el carbono de los electrones cíclicos
pigmentos como resultado la separación del oxígeno del alrededor del PSI y, en el caso de los organismos
fotosintéticos agua y la acumulación de protones en el fijadores de nitrógeno, hacia la nitrogenasa.
(LHCII) tilacoide.

4. La reducción de QA (al reducirse a plastoquinol) inicia un proceso

de transporte de electrones de PSII a PSI, mediado por una serie de
portadores de electrones (QB [Plastoquinona B] acepta los electrones
2. Energía de excitación al mismo tiempo y los transfiere en 1ms al citocromo, PQ Pool [pool
absorbida transferida a de Plastoquinonas], cyt b6f [Citocromo B] y Plastocianina).
los RC del PSII se
transfiere al centro de
reacción de PSII, lo que
promueve la separación
de carga, lo que da
como resultado la
oxidación del donante
de electrones, P680+
(un par de moléculas de
clorofila), y la reducción
del primer aceptor de
electrones, la El tiempo de reoxidación de QA se modula por el nivel de reducción del grupo QB y PQ, que varía desde ~ 150 μs con el
Plastoquinona A (QA) grupo QB y PQ oxidado, hasta 20 ms con el grupo PQ reducido. Con QA en un estado reducido (o "cerrado"), el centro de
que acepta 2 e- por reacción no puede aceptar la excitación entrante y la energía absorbida se disipa, aumentando el rendimiento de
separado en un tiempo fluorescencia observado, aproximadamente en proporción al nivel de actividad fotosintética.
variable entre 200 y 600
μs. La Fluorescencia activa manipula mediante la aplicación de destellos cortos de luz de ~ 1μs (“flashlets") la fluorescencia que
se produce al activar el aparato fotosintético y registrar los cambios en el rendimiento de la fluorescencia resultante y así
cuantificar la actividad fotosintética.
Fluorescencia producida
(unidades arbitrarias)

Destello STF (Single Turnover Flash)
o Destello QA Destello fuerte, con una
potencia de excitación alta para reducir QA
dentro de 200-800 µs – con flujo de
transferencia de e- a la PQ mínima (menos
del 10%) al conjunto de PQ.
Tiempo
Destello MTF (Multiple Turnover Flash) o Destello PQ
Destello débil, con una potencia de excitación baja durante un período de
tiempo más prolongado (50 ms) para reducir progresivamente el grupo de
PQ, con la subsiguiente reducción de QA.
Intensidad del destello (unidades arbitrarias)

Pulso de Saturación

Pulsos débiles

Adaptación a oscuridad Fase de Excitación (rápida) Fase de Relajación (lenta)

Tiempo
 En la secuencia de saturación (SQA), los destellos (flashlets) se aplican
Secuencia de saturación de la QA con una intensidad muy alta, de forma que la tasa de suministro de
(SQA) Secuencia de relajación de la QA (RQA) energía de excitación al centro de reacción PSII supera con creces la
capacidad de transporte de electrones fotosintéticos. Como resultado,
la señal de fluorescencia observada aumenta en proporción al nivel de
reducción de QA a medida que el transporte de electrones se satura en
Fluorescencia 200-600 μs. La pendiente inicial de la fluorescencia transitoria está
controlada por el tamaño de la antena de absorción de luz, por la
eficiencia de la transferencia de excitación desde la antena al centro de
reacción PSII y por el rendimiento de la separación de carga. El nivel de
saturación de la señal de fluorescencia se define por el equilibrio entre
las tasas de suministro de energía de excitación y las tasas concurrentes
de reoxidación de QA. Con una potencia de excitación típica de
Excitación 15.000 a 60.000 μE m-2 s-1), el nivel de
saturación de la fluorescencia transitoria
se aproxima al 90-95% de la
fluorescencia máxima, Fm, con un nivel
Chl Antena Fotosíntesis similar de reducción de QA. La secuencia
de saturación es seguida por la
secuencia de relajación (RQA), donde el
intervalo de tiempo entre flashlets
aumenta exponencialmente.
La potencia de excitación promedio disminuye y el equilibrio entre las tasas de
Calor suministro de excitación y el transporte de electrones se desplaza hacia este
último. La señal de fluorescencia disminuye con un patrón de relajación definido
por la cinética del transporte de electrones fotosintéticos de PSII a PSI.
 QA se una al PSII aceptando dos electrones por separado en un
tiempo variable entre 200 y 600 μs. La transferencia de
electrones de QA a QB se realiza gracias a cambios de pH.

Fluorescencia QB, tiene la capacidad de unirse y desunirse del fotosistema II,

acepta los electrones al mismo tiempo y los transfiere en 1ms
al citocromo.

Excitación

Chl Antena Fotosíntesis

Calor
 Fluorescencia

Excitación

Fotosíntesis
Chl Antena

Calor
 Fluorescencia

Excitación

Fotosíntesis
Chl Antena

Calor
 Fluorescencia

Excitación

Fotosíntesis
Chl Antena

Calor
 Fluorescencia

Excitación

Chl Antena Fotosíntesis

Calor
 Fluorescencia

Excitación

Chl Antena

Calor
Espera para que se reabran una porción de RC

Chl Antena
 Fluorescencia

Excitación

Chl Antena Fotosíntesis

Calor
 Espera de nuevo

Chl Antena
 Fluorescencia

Excitación

Chl Antena
Fotosíntesis

Calor
 Espera de nuevo

Chl Antena
 Fluorescencia transitoria procesada

σ PSII = Sección transversal de absorción

funcional del fotosistema II. Define la
eficiencia de la utilización de luz
fotosintética (EPU) por el PSII.

Chl Antena Fotosíntesis

 Fluorescencia producida
(unidades arbitrarias)

Tiempo
Parámetros fotosintéticos

1. Sección transversal de absorción funcional del fotosistema II (σPSII). [Functional Absorption Cross Section of
Photosystem II (σPSII)] = eficiencia de la utilización de luz por el PSII en la fotosíntesis.
σPSII =
2. Rendimiento (o eficacia) de la separación de carga (ΦPSII). [Yield of Charge Separation (Φ PSII), o Quantum Yield of
fluorescence] = tasa de separación de carga por unidad de cuantos de excitación que llegan al centro de reacción
de PSII. Fv/Fm gives a robust indicator of the maximum quantum yield of PSII chemistry.

Fv/Fm = Δøm
3. Quenching fotoquímico

The steady-state level of fluorescence in the light is termed, F′

Maximal fluorescence in the light-adapted state, termed Fm′ (Fm′ < Fm (dark-adapted) due to NPQ).
Operating efficiency of PSII photochemistry φPSII (or ΔF/Fm′) = Fq′/Fm′= (Fm′–F′)/Fm′ (does not require a dark-
adapted measurement).
𝐹𝐹𝑚𝑚′ − 𝐹𝐹
𝑞𝑞𝑃𝑃 = ′
𝐹𝐹𝑚𝑚 − 𝐹𝐹𝑜𝑜′
4. Quenching No Fotoquímico NPQ )non photochemical quenching)

5. Velocidad del flujo de electrones fotosintéticos a través de un centro de reacción

∆∅𝑚𝑚
𝑃𝑃𝑓𝑓 = 𝑞𝑞 𝐸𝐸𝜎𝜎
0.65 𝑃𝑃 𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃

(en adaptación a oscuridad, cuando todos los centros del PSII están abiertos y no hay NPQ)
1. Sección transversal de absorción funcional del fotosistema II (σPSII).

Define la eficiencia de la utilización de luz por el PSII en la fotosíntesis y corresponde a la

está determinado por:

1. El tamaño de la antena, los pigmentos recolectores de luz asociados con PSII, o más precisamente, por el
número total de moléculas de clorofila que proporcionan energía al centro de reacción de PSII. (A este
parámetro se denomina generalmente "sección transversal de absorción óptica de PSII", αPSII).
2. Composición espectral de los pigmentos captadores de luz. Generalmente, σ PSII depende de la longitud de
onda.
3. Eficiencia de la transferencia de excitación de los pigmentos al centro de reacción del PSII, Θtr. Este parámetro
está controlado por la arquitectura y organización de diversos grupos de complejos de captación de luz, por el
estado de fosforilación de algunos de estos complejos y por el estado de epoxidación de algunos carotenoides
dentro de estos complejos.
4. Rendimiento de la separación de carga en el centro de reacción del fotosistema II (ΦPSII): una relación entre los
eventos de separación de carga estable y el número de cuantos de excitación que llegan al centro de reacción.
Teóricamente el σPSII (la sección transversal de absorción
funcional) se puede estimar a partir de la velocidad de
separación de carga normalizada al flujo de luz (cuantos) en
condiciones de bajo nivel de iluminación.

Como las tasas de separación de carga son difíciles de medir

bajo iluminación estable, la técnica de fluorescencia activa
produce la señal de excitación como una serie de flashes de alta
frecuencia, de forma que el σPSII se calcula a partir de la
curvatura de la fluorescencia transitoria observada.

Este parámetro puede aproximarse, en un primer grado, a partir de la pendiente inicial de la fluorescencia transitoria
frente a la energía de excitación, normalizada a fluorescencia variable, Fv. Esta aproximación, sin embargo, solo es válida
en condiciones de transporte de electrones bloqueado entre el PSII y el PSI, y en ausencia de transferencia de energía
entre unidades del PSII. Estas condiciones no se pueden satisfacer in vivo y por eso, en su lugar, calculamos el σPSII
ajustando toda la curva de fluorescencia transitoria a un modelo descrito por Kolber et. al, 1998. Este enfoque
proporciona una evaluación simultánea de la cinética del transporte de electrones entre PSII y PSI, y cuantifica el grado
de transferencia de energía entre las unidades de PSII. La pendiente inicial del transitorio de fluorescencia es
"aproximadamente" proporcional a la sección transversal de absorción funcional calculada.
2. Rendimiento (o eficacia) de la separación de carga
(ΦPSII)

El rendimiento de la separación de carga alcanza un valor

máximo (ΦPSII, max) cuando el nivel inicial de la señal de
fluorescencia, Fo, se mide en condiciones de QA
completamente oxidada, y la señal Fm se mide en condiciones
de QA completamente reducida. Estas condiciones no se
pueden cumplir experimentalmente: la medida de la
fluorescencia requiere la aplicación de una señal de excitación,
lo que invariablemente da como resultado algún nivel de
reducción de QA. Además, la reducción completa de QA es
inalcanzable in vivo debido a un cierto nivel de transporte de
electrones desde QA a PSII. No obstante, aplicando excitación
de baja intensidad para medir Fo y una señal de excitación
fuerte para medir Fm, se puede obtener una aproximación
bastante buena de las señales verdaderas de Fo y Fm.

Tanto Fo como Fm se calculan ajustando la fluorescencia transitoria a un modelo que describe la relación
entre la fluorescencia y la señal de excitación.
3. Cinética del transporte de electrones o
Tasa del Transporte de Electrones (ETR)
Generalmente se expresa en términos de velocidad o tiempo
de transporte de electrones desde el PSII al PSI a través de
una serie de portadores. Hemos decidido utilizar constantes
de tiempo, ya que reflejan mejor la dinámica y las escalas de
tiempo del transporte de electrones fotosintéticos.

Una vez que se completa la parte SQA del protocolo de

excitación, el intervalo de tiempo entre flashlets se incrementa
de manera exponencial para observar la cinética de la
reoxidación QA (la parte RQA de QA flash). Esta cinética define
la forma de la curva de relajación de la fluorescencia y refleja
un transporte secuencial de electrones de varias etapas:

QA → QB → PQ pool → PSI.

𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸 = 𝐸𝐸 σ𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃 𝑞𝑞𝑃𝑃 = 𝐸𝐸 σ𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃 (Δ𝐹𝐹 ′ ⁄𝐹𝐹𝐹𝐹𝐹)⁄(𝐹𝐹𝐹𝐹⁄𝐹𝐹𝐹𝐹)

donde Δ𝐹𝐹 ′ ⁄𝐹𝐹𝑚𝑚′ es una variable dependiente de E

4. Probabilidad de la transferencia de energía

Describe la probabilidad de que la energía de excitación se

pueda compartir entre los centros de reacción.

Permite que la energía de excitación adquirida por el

pigmento de antena asociada con un centro de reacción
actualmente cerrado se transfiera a otro centro de reacción
aún abierto e inicie la separación de carga allí. La presencia
de transferencia de energía aumenta la eficiencia de la
utilización de la luz fotosintética a niveles de irradiancia de
bajos a moderados.

La arquitectura entre los pigmento y los RCII no es simple ya que hay algunos complejos de captación de luz
estrechamente asociados con el núcleo de PSII (CP43, CP46), encerrados por complejos menos unidos (CP24, CP26 y
CP29) y finalmente por los complejos periféricos LHCII-M y LHCII.
Se asemeja funcionalmente a islas locales de pigmentos dispuestas para canalizar la energía de excitación hacia el centro
de reacción, sumergidas en un mar de complejos de pigmentos menos centrados en RCII, capaces de comunicarse, a su
vez con el RCII. Esto proporciona que la probabilidad resultante de transferencia de energía de los pigmentos al RCII sea
de baja a moderada (0,2-0,45).
Si no existiera transferencia de energía la cueva de saturación
del destello QA sería de primer orden, pero esta transferencia
hace que la curva se desvía hacia una sigmoidal, afectando al
cálculo de la extinción fotoquímica y la sección transversal de
absorción funcional, así como a la evaluación de la cinética del
transporte de electrones.

Las probabilidades observadas de transferencia de energía en

las hojas de las plantas superiores oscilan entre 0,2 y 0,4 a
niveles de irradiancia bajos, pero disminuyen con irradiancias
de moderadas a altas. Es muy probable que esta disminución
sea causada por el desarrollo de extinción no fotoquímica, NPQ
(Non Photochemical Quenching). Los valores altos de NPQ
promueven la pérdida térmica de estados excitados en la
antena a medida que atraviesan de un centro de reacción a
otro. Hipotéticamente, este fenómeno representa uno de los
mecanismos por los cuales NPQ reduce la presión de excitación
bajo niveles altos de irradiancia.
4. Tamaño de la porción oxidada del PQ pool (PQox)

El grupo de las Plastoquinonas (PQ) es un grupo móvil de plastoquinona dentro de la bicapa tilacoide que
media el transporte de electrones entre el componente QB de PSII y el complejo cyt bf mediante un
mecanismo de lanzadera de electrones de "larga distancia" (unos pocos cientos de nm). El tamaño de la
reserva de PQ varía de 5 a 10 quinonas por centro de reacción. El tiempo de este transporte de electrones, de
5 ms a 20 ms, definida por la tasa de difusión lateral PQH2, y la oxidación en el sitio Qo del cyt b6f representa
una limitación al tiempo de renovación de electrones. Tanto el tamaño de la porción oxidada de PQ como la
constante de tiempo de reoxidación de PQ se pueden calcular a partir de la cinética de relajación del
transitorio de fluorescencia.

Cuando los flashes se aplican en una secuencia rápida en condiciones de baja luz (menos de 1 μmol quanta m-2s-
1 de luz blanca) la amplitud de la señal de fluorescencia aumenta progresivamente, aproximadamente en
proporción al nivel de la reducción del PQ pool. En última instancia, a un nivel de reducción del conjunto de PQ
cercano al total, la amplitud de la señal de fluorescencia medida se aproxima a la observada en presencia de
DCMU (un inhibidor de la fotosíntesis). Debido a que en el último caso el nivel de reducción del conjunto de PQ
debe permanecer bajo, se hipotetiza que el nivel de ocupación del sitio QB en la proteína D1 es el factor final que
controla los cambios observados en la señal de fluorescencia. Con el aumento del nivel de reducción del grupo de
PQ, el equilibrio de quinona / hidroquinona en el grupo de PQ se desplaza hacia el último, la fracción de sitios QB
desocupados disminuye, el tiempo de residencia de electrones en QA aumenta y el rendimiento de fluorescencia
aumenta a un nivel observado en presencia de DCMU.
Aunque los mecanismos por los cuales la desocupación del sitio QB (o tiempo de residencia de electrones en QA)
produce hasta un 40% de aumento en la señal de fluorescencia (hasta un 100% de aumento en plantas terrestres)
siguen sin estar claros, es probable que este mecanismo también sea responsable de la modulación de la señal de
fluorescencia durante el flash PQ en comparación con la del flash.
Tabla de variables de salida FIRe

Proporcionado por /
Variable Valor Unidades
derivado de Ecuación
Fecha - 02/11/2016 reloj interno date
Hora - 25:22.1 reloj interno time
Presión - 43112 sensor presión Pascales (Presión/10000)
Profundidad - 4.3112 Presión Metros
FRU (Fluorescence Relative
Fo Fluorescencia mínima 2524.3591 flash débil
Units)
Fm Fluorescencia máxima 5624.2006 flash saturación FRU
Fv Fluorescencia variable 3099.8414 Fo y Fm FRU = (Fm-F0)
Fv/Fm Eficiencia Fotoquímica 0.5512 Fo y Fm - = (Fm–Fo)/Fm
del PSII – Δøm
Velocidad del flujo de 0.2352
F, Fo, Fm, PAR y FJ con e- RC-1 s-1
p Probabilidad de la transferencia de energía electrones a través de un centro de Pf=[∆∅m⁄0.65] qP E σPSII
flashes crecientes
reacción
Sección transversal de absorción funcional (de
σrel producción fotoquímica de oxígeno) del PSII para 4.47E-05 efecto Soret, σabs m2 quanta-1
cianobacterias

Sección transversal de absorción funcional (de F, Fo, Fm, iteraciones con (∆∅_((J)))/(∆∅_m )= 1-
σabs 9.39E-04 m2 quanta-1
producción fotoquímica de oxígeno) del PSII flashes (Δø(J)) e^(σ_PSII J)

LED light PAR 56287.75 sensor intensidad flash µE m-2 s-1

Tasa de renovación del transporte fotosintético
de e- F, Fo, Fm, iteraciones con
ETR 0.7381 s-1 τ=1/[EKσPSII ]
flashes (Δø(J))

Error normalizado 666.9958

PAR 2.6783 PAR µE m-2 s-1

Voltaje 11.7034 v