PRÁCTICA Nº 2

CULTIVO DE HONGOS

 COMPETENCIA

 Verificar el crecimiento en un cultivo de un microorganismo y pueda

realizar los cálculos a partir de ellos loa parámetros cinéticos: velocidad específica,
rendimiento y tiempo de duplicación.

 FUNDAMENTO

 Todo microorganismo dependiendo del medio de cultivo en que se

encuentra se desarrollan en función de factores nutricionales y ambientales.

I. INTRODUCCIÓN

La cinética microbiana se encarga de entender todas las manifestaciones y

reacciones de la vida microbiana: crecimiento, supervivencia, muerte, adaptaciones,
formación de producto, ciclos celulares e interacciones con el medio ambiente. En los
procesos fermentativos industriales es muy importante estudiar el comportamiento
cinético del microorganismo ya que de él depende el rendimiento del producto de interés,
entre otras variables. Además, es de suma importancia ya que representa la pérdida o
ganancia económica de los procesos. La finalidad de esta práctica es describir y resaltar
la necesidad que presentan los microorganismos para su crecimiento, procesos
metabólicos y algunos factores que influyen en su crecimiento.

Se define crecimiento como un aumento en la cantidad de constituyentes y

estructuras celulares, cuando hay crecimiento en ausencia de división celular hay
aumento en el tamaño y peso de la célula. Mientras que cuando el crecimiento es
seguido de división celular hay un aumento en el número de células.

Es importante distinguir entre el crecimiento de células individuales y el crecimiento

de poblaciones, ya que en los microorganismos debido a su pequeño tamaño no se
hacen estudios de crecimiento individual sino estudios de crecimiento de poblaciones.

El crecimiento de una población es el aumento del número de células como

consecuencia de un crecimiento individual y posterior división. El crecimiento de una
población ocurre de una manera exponencial. El crecimiento exponencial es una
consecuencia del hecho de que cada célula s e divide dando dos (2) células hijas, las
cuales al dividirse darán cada una dos células hijas, así es que en cada período de
división la población se duplica.

La velocidad de crecimiento exponencial se expresa como tiempo de generación

(G) y este se define como el tiempo que tarda una población en duplicarse. Los tiempos
de generación varían ampliamente entre los microorganismos, algunos crecen
rápidamente y presentan tiempos de generación de unos 30 minutos y otros tienen
tiempos de generación de varias horas o incluso días.

En la siguiente tabla se presenta u n experimento de crecimiento partiendo de una

célula, que tiene un tiempo de generación de 30 minutos.

BIOQUÍMICA – 2021 Mg. JUAN CARLOS WOOLCOTT HURTADO PÁGINA 1

 Tiempo Número de Log del núme
(horas) células de células

0 1 0
0,5 2 0,301
1 4 0,602
1,5 8 0,903
2 16 1,204
2,5 32 1,505
3 64 1,806
3,5 128 2,107
4 256 2,408
4,5 512 2,709
5 1024 3,0103
. . .
. . .
10 1048576 6,021
En un gráfico de los resultados del número de células tanto en escala aritmética como en
escala logarítmica en función del tiempo transcurrido, podemos observar que en el gráfico
aritmético se obtiene una curva con una pendiente que crece constantemente, mientras
que si transformamos el número de células en logaritmo y se grafican estos valores en
escala logarítmica y el tiempo en escala aritmética se obtiene una línea recta.

Este tipo de gráfica semilogarítmica es la forma más simple para determinar el tiempo de
generación por el método gráfico, como podemos observar en la gráfica siguiente.

Cuando un microorganismo es inoculado en un medio de cultivo líquido experimental

un periodo de adaptación al medio y condiciones ambientales que inciden en su
desarrollo describiendo una curva, denominada curva de crecimiento.
Luego de la adición del m.o. se observa:
 Fase lag: Los m.o. se adaptan al nuevo ambiente, aún no se dividen
 Fase de aceleración: Empieza la división celular
 Fase exponencial: Velocidad máxima de crecimiento bajo condiciones particulares,
tiempo de generación mínimo
 Fase estacionaria: Sin crecimiento neto, vc=0.
cuando: vc=vm (vel. crecimiento es igual a la de muerte)
 Nutrientes limitantes, pero suficientes para mantener la actividad
BIOQUÍMICA – 2021 Mg. JUAN CARLOS WOOLCOTT HURTADO PÁGINA 2
  Acumulación de desechos, inhibición del crecimiento
 Fase de desaceleración: La división celular va cesando.
 Fase de muerte: Velocidad de muerte celular > velocidad de división celular

CRECIMIENTO EXPONENCIAL

Cuando se inocula una bacteria en un medio y ha transcurrido el tiempo de

generación d e este microorganismo, se forman dos células, después de otra generación
cuatro células después d e la tercera generación ocho células. Es decir, en cada
generación sucesiva se duplica la población. La relación que existe entre el número de
células y las generaciones de un cultivo creciendo en forma exponencial, puede
deducirse matemáticamente de la manera siguiente:

Se designa como:

x Nº de microorganismos al tiempo 0 y Nº de M.O. al tiempo t

t = tiempo en crecimiento exponencial

Al tiempo 0 y = x

Después de: 1 generación y x.2

2
2 generaciones y = (x.2) 2 =2 x
2 3
3 generaciones y = (2 x) 2= 2 x
n
n generaciones y = 2 x (1) Para calcular n = (número de

generaciones) Resolviendo la ecuación (1) para n se tiene:

log y = log x + n log 2

logy -logx
n=
log2

Si se sustituye en la ecuación anterior log 2 por su valor 0.3010, se tiene que 1/0.3010 =

3.3 n = 3.3 log y/x

Por consiguiente, aplicando la ecuación anterior puede calcularse el número de

generaciones que han tenido lugar, siempre que se conozca la población inicial x, y la
población y después del tiempo t.

El tiempo de generación G es igual a t (tiempo transcurrido en fase exponencial para

llegar de x a y) dividido por el número de generaciones n, o sea:

G= t/n
Ejemplo
Se tienen 1000 M.= en un medio de cultivo óptimo y después de 4 horas de incubación,
creciendo exponencialmente, se obtienen 100.000 bacterias. Calcule el tiempo de
generación.

x = 1000
BIOQUÍMICA – 2021 Mg. JUAN CARLOS WOOLCOTT HURTADO PÁGINA 3
 y = 100.000
T = 4 horas
G =?

n = 3.3 log y/x n = 3.3 log 100.000/1000 = 6.6 generaciones

G =T / n
G = 240 / 6.6 = 36,36 minutos

Los hongos pueden reproducirse por procesos asexuales y procesos sexuales.

Reproducción asexual

Los procesos asexuales implican división de los núcleos y formación de

nuevos hongos sin participación de gametos y sin fusión nuclear.
Se conocen 3 mecanismos de reproducción asexual:

1. Esporulación seguida de germinación de las esporas.

2. Gemación.
3. Fragmentación de hifas.

1. Esporas asexuales

No presentan latencia, es decir ellas pueden germinar cuando dispongan de hume-

dad aún en ausencia de nutrientes. Existen varios tipos de esporas asexuales:

a. Clamidosporas: sporas esféricas u ovoides de pared gruesa que se forman

dentro de las hifas somáticas. Son más resistentes al calor y a la desecación que
las otras esporas asexuales.
b. Conidiosporas: Son esporas delgadas que se encuentran en grupos o solas
sobre hifas especializadas llamadas conidióforos. Algunos autores llaman
conidiosporas a todas las esporas asexuales.
c. Esporangiosporas: Son esporas que se forman dentro de una estructura en
forma de saco denominada esporangio. La hifa que porta el esporangio se
denomina esporangióforo.
d. Astrosporas: Son esporas de paredes delgadas que se forman por fragmen-
tación de las hifas.
e. Blastosporas: Son esporas que se forman por gemación.

BIOQUÍMICA – 2021 Mg. JUAN CARLOS WOOLCOTT HURTADO PÁGINA 4

 Clamidosporas Conidiosporas Esporangiosporas

2. Gemación

Es e l proceso de reproducción asexual que prevalece en las levaduras, aunque

algunas especies se dividen por fisión.

3. Fragmentación de hifas

Los fragmentos de hifas son capaces también de dar nuevas colonias.

Reproducción sexual

Los hongos que tienen reproducción sexual la hacen a través de los siguientes pasos:

1. Un núcleo haploide de una célula donante (macho) penetra e l citoplasma de una célula
receptora (hembra).
2. Se fusionan los núcleos para formar un núcleo zigótico diploide.
3. Por m e i o s i s e l n ú c l e o d i p l o i d e o r i g i n a c u a t r o n ú c l e o s haploides,
a l g u n o s de los cuales pueden ser recombinantes genéticos.
De este proceso de reproducción sexual resultan las esporas sexuales, las cuales son
usualmente más resistentes al calor que las esporas asexuales, pero sin llegar a tener la
extremada resistencia al calor que presentan las endosporas bacterianas y presentan
latencia es decir ellas sólo germinan cuando son activadas ya sea por un calentamiento
suave o por ciertas sustancias químicas.
Existen varios tipos de esporas sexuales:

a. Zygosporas: Son esporas grandes de pared gruesa que resultan de la fusión de

2 gametos similares.
b. Ascosporas: Se producen en una estructura en forma de saco, llamada asca, des-
pués de la unión de 2 núcleos. Generalmente hay 8 ascosporas dentro de cada asca.
c. Basidiosporas: Resultan de la unión de 2 núcleos sobre una estructura
e s p e c i a l i z a d a en forma de maza conocida como basidio. Generalmente hay 4
por basidio.
d. Oosporas: Estas se forman dentro de una estructura femenina denominada oogonio.

II. MATERIALES

o Microorganismo: Saccharomyces cerevisiae mantenido en agar extracto de malta

en plano inclinado.
o Erlenmeyer de 250, 500 y 2000 mL
o Pipetas de 1 y 10 mL estériles
o Mechero
o Asa de siembra
o Tubos de ensayo de 13X100 y de 15x150 mm
o Cámara de Neubauer
o Agitador magnético con calefacción
BIOQUÍMICA – 2021 Mg. JUAN CARLOS WOOLCOTT HURTADO PÁGINA 5
 o Magneto
o Microscopio
o Papel pH
o Algodón
o Papel aluminio
o Pipetas Pasteur
o Alcohol
o Laminas y laminillas
o Encendedor
o Tapón de jebe N° 8 con dos horadaciones
o Solución de ácido clorhídrico e hidróxido de sodio 0.1N

III. PROCEDIMIENTO

1. Preparar 25 mL de cultivo (semilla), en un erlenmeyer de 250 mL conteniendo:

Glucosa 1%, peptona de caseína 0,5%, extracto de levadura 0,3%, sulfato de amonio
0,3%, fosfato dipotásico 0,3%, pH 5 - 5.5, esterilizar e inocular con dos o tres azadas
del cultivo puro de Saccharomyces cerevisiae e incubar a 28 - 30ºC por 24 a 48
horas. (Prepararlo con 72 horas de anticipación)
2. Preparar 225 mL de caldo de cultivo en un matraz de 2 L, conteniendo, Glucosa 2%,
sulfato de amonio 0.5%, fosfato dipotásico 0.25%, ajustar el pH 5.0 - 5.5, esterilizar
en autoclave, enfriar e inocular con los 25 mL del cultivo anterior e incubar a 28 -
30ºC
3. Extraer cada 2 horas muestras de 10 mL del cultivo en condiciones estériles, para
determinar peso seco, número de microorganismos en cámara de Neubauer y
determinar azúcares reductores.
4. Para la determinación de peso seco tomar 5 mL, colocar en un tubo de centrifuga y
centrifugar a 3000 rpm por 15 minutos, descartar el sobre nadante y re disolver el
pellet, realizar dos veces más el proceso.
5. Depositar el pellet en placas Petri de 70X70 mm y dejar en la estufa overnight a
120°C, colocar en desecadora y pesar hasta pesos constantes.
6. Determinar el número de microorganismos en la cámara de Neubauer.
7. Determinar los azúcares por el método del ácido 3,5 dinitrosalicílico.
8. Con los datos obtenidos proceda a determinar los parámetros cinéticos: velocidad
especifica de crecimiento, tiempo de generación y rendimiento. celular
9. Discusión sobre los resultados de la práctica.

CUADRO DE RESULTADOS

TIEMPO PESO SECO g/L UFC/mL SUSTRATO g/L

0

10

12

BIOQUÍMICA – 2021 Mg. JUAN CARLOS WOOLCOTT HURTADO PÁGINA 6

CINETICA COMPLETA:
UFC o N son esporas viables:

T(horas) Peso seco (G/L) X Nºcel/ml (N) Glucosa (g/L) Cristales

0 0.167 1.8x106 20.20 0
2 0.233 4.8x106 19.40 0
4 0.420 1.2x107 16.35 0
6 0.914 4.5x107 13.70 0
8 1.700 2.4x108 10.60 12
10 3.500 6.2x108 7.60 17
12 4.950 3.0x109 3.2 32
14 5.270 4.2x109 1.25 33
24 5.140 4.1x109 0.80 42
26 5.220 4.0x109 0.27 35
30 5.250 4.0 x109 0.02 37
Con estos datos calcular velocidad especifica de crecimiento u; velocidad máxima de
crecimiento um ; rendimiento Yx/s y tiempo de generación.

IV. CUESTIONARIO

1. ¿Qué características presentan las células observadas?

2. ¿Qué otros métodos se usan para determinar los azúcares reductores?
3. ¿Cuál o cuáles cree usted son las razones para trabajar en condiciones asépticas?
¿Fundamente?
4. ¿De qué dependerá que la fase lag, pueda ser corta o prolongada? ¿Fundamente?

V. BIBLIOGRAFÍA
1. Davis, Dulbecco, Eisen and Ginsberg. 1990. Microbiology. Fourth Edition. J. B.
Lippincott Company.
2. Madigan M.T, Martingo J. M. y Jack Parker. 2004. Décima Edición. Brock
Biología de losMicroorganismos Prentice Hall
3. Prescott, L.; Harley, J.; Klein D. 1999. Microbiología. Cuarta edición.
McGraw-Hill Interamericana.
na
4. Tortora G. J., B. R. Funke and Ch. L. Case 2007. Introducción a la Microbiología 9
Edición. Editorial Médica Panamericana.
5. Wistreich and Lechtman. Microbiology. Fifth Edition. 1998. Macmillan Publishing..

CONSIDERACIONES GENERALES FINALES

1) Los residuos biológicos deben ser esterilizados previamente y disponerse en bolsas para
ser desechados a la basura.
2) Dé cuenta inmediatamente al profesor de cualquier accidente tal como cortaduras, que
maduras o derramamiento de cultivos. Tomé las precauciones para evitar los accidentes.
3) Debido a que algunos microorganismos con que se trabajan son patógenos en potencia
es necesario desarrollar técnicas de asepsia al manejarlos y transferirlos. Todos los
materiales de desecho que hayan entrado en contacto con microorganismos (como
pipetas usadas, placas petri o tubos), deben colocarse en bolsas de autoclave preparadas
para tal efecto y proceder posteriormente a su esterilización. Las pipetas, pipetas Pasteur,
láminas y laminillas usados se colocarán en un recipiente conteniendo un antiséptico.
4) Nunca deben sustraerse cultivos de microorganismos del laboratorio.
5) No abrir las placas conteniendo hongos, siempre en presencia del mechero, para evitar la
propagación de las esporas.
6) Antes de retirarse de laboratorio los alumnos deben lavarse las manos con jabón
carbólico o desinfectarse con alcohol y dejar todo en orden.

BIOQUÍMICA – 2021 Mg. JUAN CARLOS WOOLCOTT HURTADO PÁGINA 7

7) Cerrar todos los mecheros y grifos de agua antes de apagar las luces y retirarse.

BIOQUÍMICA – 2021 Mg. JUAN CARLOS WOOLCOTT HURTADO PÁGINA 8