HIDRLISIS ENZIMTICA

DEL ALMIDN POR

AMILASA

ndice
2015 B

Introduccin
Fundamento Terico
Objetivos
Materiales y Mtodos
Resultado

Discusin

20

Conclusiones

21

Cuestionario

22

Bibliografa

25

INTRODUCCIN
La transformacin de almidones en compuestos ms livianos como los
azcares se puede lograr mediante la hidrlisis enzimtica, dichos
azcares pueden ser aprovechados en la produccin de alcohol etlico
para diferentes propsitos como la produccin de bebidas alcohlicas ya
que esta hidrlisis es la reaccin en donde el agua acta como principal
reactivo, el almidn es la reserva alimenticia de las plantas, pero las
clulas para la obtencin de energa no pueden metabolizarlo, sino que es
necesario que lo degraden por hidrlisis hasta sus constituyentes
monosacridos o glucosas, para que estos puedan metabolizarse en los
caminos energticos. Las clulas llevan a cabo la hidrlisis a travs de
procesos enzimticos.

I. FUNDAMENTO TERICO
La hidrlisis industrial del almidn comprende 3 etapas sucesivas:
Gelatinizacin: Cuando el almidn es calentado en agua en exceso, este
cae en una fase de transicin; esta fase est asociada con una difusin de
agua dentro del grnulo y posterior regin amorfa, hidratacin e
hinchazn radial, prdida de birrefringencia, prdida del orden de regin
cristalina y lixiviacin de la amilosa y amilopectina.
La licuefaccin o dextrinizacin: es el proceso mediante el cual a partir
de un almidn gelatinizado se obtiene una rpida disminucin de la
viscosidad en virtud de una hidrlisis parcial. En esta etapa se producen
polisacridos de longitud intermedia (maltodextrinas con 5 a 10 unidades
de glucosa) y pequeas cantidades de polisacridos de alto peso
molecular, como tambin algunos de bajo peso molecular (glucosa,
maltosa entre otros).
Sacarificacin: a partir de las maltodextrinas de la etapa anterior se
completa la hidrlisis total del almidn a glucosa. En la digestibilidad de
almidones como materia prima, muchos factores como el tamao de
particular, relacin de amilosa: amilopectina, extensin de la asociacin
molecular entre los componentes del almidn, grado de cristalinidad,
longitud de la cadena de amilosa y presencia de complejos lpidosamilosa, juegan un papel importante en la degradacin hidroltica.
La catlisis enzimtica solamente afecta el almidn gelatinizado.
Mediante estudios de SEM, Gallant et al demostr que el grnulo de
almidn tiene una capa delgada de bloques que impide la accin de la
enzima y reduce la velocidad de hidrlisis. Adems de esto, los grnulos
de almidn podran estar atrapados en una pared celular residual, y
protegerlos de los ataques enzimticos. De esta forma, se puede concluir
que tanto la resistencia por forma y encapsulado de los grnulos de
almidn pueden ser los responsables de la baja digestibilidad y resistencia
al ataque enzimtico, requiriendo ser gelatinizados para poder ser
degradados por enzimas.
Los principales almidones comerciales, como el almidn de maz, son
hidrolizados por enzimas (amilasas) las cuales acceden al interior del
grnulo por medio de canales. Los almidones que no contienen poros,
tales como los de la papa y ame, sufren una erosin de la superficie del
grnulo. Los almidones del banano se encuentran en esta ltima
categora. Enzimas El proceso de conversin de almidn gelatinizado a un

jarabe glucosado generalmente

licuefaccin y sacarificacin.

est

representado

en

etapas:

La licuefaccin se presenta cuando se emplea la enzima -amilasa

(durante o despus de gelatinizar el almidn), cortando las cadenas de los
polmeros amilosa y amilopectina en cadenas de tamao regular, dando
como resultado dextrinas, maltosa, malto triosa y malto pentosa. Para la
produccin de glucosa, se requiere de una segunda etapa consecutiva a la
licuefaccin
denominada
sacarificacin,
adicionando
la
enzima
amiloglucosidasa (AMG) dando como principal producto la glucosa.
Alfamilasa La -amilasa, tambin conocida como -1,4glucanohidrolasa;
es una glucanasa endoactiva que catalizan la hidrlisis al azar de los
enlaces -(1,4) glicosdicos de la regin central de las cadenas de amilosa
y amilopectina excepto en las proximidades de los puntos de ramificacin.
Suckling et al report que la velocidad de hidrlisis es ms lenta en los
enlaces cercanos a los puntos de ramificacin. La hidrlisis de la
amilopectina por esta enzima produce glucosa, maltosa y una serie de
dextrinas que contienen enlaces ramificados conformados por 4 o ms
residuos de molculas de glucosa que presentan enlaces -1,6
provenientes de las uniones glucosidicas de la estructura original.
Los productos obtenidos en mayor concentracin son maltosa, maltotriosa
y maltopentosa, hidrolizando completamente la maltohexosa. El peso
molecular reportado para las -amilasas provenientes de Bacillus
Licheniformis se encuentra alrededor de los 60kDa. Pululanasa Tambin
conocida como pulalan 6 glucanohidrolasa, hidroliza los enlaces
glucosdicos -1,6 en el pululan y tiene como producto principal la
maltotriosa y maltosa e hidroliza el almidn para dar como producto
principal maltosa. Esta es usada como enzima complementaria para la
hidrlisis de amilopectina junto con la -amilasa. Existen dos tipos de
pululanasas.
La pululanasa de tipo I nicamente hidroliza los enlaces -1,6 del pululan
y la pululanasa de tipo II que hidrolizan los enlaces -1,6 en el pululan
como tambin los enlaces -1,4 de otros polisacridos. Las pululanasas
tienen un peso molecular que flucta entre 70 y 110kDa.
Amiloglucosidasa AMG Conocida como glucoamilasa o amiloglucosidasa
es empleada en la produccin de jarabes glucosados, ya que tiene la
capacidad de hidrolizar los enlaces - 1,4 de extremos no reductores de
polisacridos para la formacin de glucosa. Esta enzima tambin posee la
capacidad de hidrolizar enlaces -1,6 a ms baja velocidad, pudindose
completar la hidrlisis de almidn con la combinacin de las tres enzimas

- amilasa, pululanasa y AMG de manera completa. El peso molecular de

la AMG puede variar dependiendo de su fuente. Existen dos tipos de AMG,
tipo I y II. Las AMG tipo II tienden a tener un peso molecular mayor a los
100kDa. Las AMG tipo 1 poseen pesos moleculares cercanos a 60kDa. El
peso molecular de las AMG fngicas tambin depende de la fuente. Para
AMG formadas a partir de Aspergillus niger, su peso molecular se
encuentra entre 60 y 70kDa. Purificacin de enzimas En general, las
enzimas comerciales se encuentran formando parte un complejo de
mezclas de actividades, formando parte de agregados moleculares,
protenas inertes, cidos nucleicos, polisacridos o lpidos. Para estudiar
una en particular, es necesario un proceso de purificacin. Por muchos
aos, enzimas a partir de Aspergillus niger y Bacillus Licheniformis han
sido sujetas a estudio con el fin de entender sus propiedades, procesos de
sntesis, secrecin y produccin. Sus propiedades catalticas especficas
han sido deducidas a travs de la purificacin y separacin mediante
tcnicas de cromatografa liquida de protenas y caracterizadas con
electroforesis.

II. OBJETIVOS

Observar y explicar la hidrlisis enzimtica del almidn en la

arracacha.
Comprobar y entender el papel que desempean diferentes enzimas
asociadas a los contenidos de almidn en la arracacha.

III. MATERIALES Y MTODOS:

1era semana
Extraccin del almidn.
1. Primero se tuvo que lavar la arracacha.

2. Luego la llevamos a pesare en una balanza electrnica.

3. Con ayuda de un cuchillo, pelamos la arracacha.

4. La arracacha se volvi a pesar y luego pesamos la cscara.

5. Luego la arracacha se cort en trozos largos.

6. Con mucho cuidado se rall la arracacha y la pusimos en bowls.

7. La arracacha se llev al horno a una temperatura de 60C, este

procedimiento se hizo para un buen secado ya que la arracacha es
un alimento muy hmedo. Este secado se llev a cabo hasta el da
siguiente.

8. Luego se procedi a moler la arracacha hasta que se form en

harina. Luego se empac en un frasco de vidrio seco y hermtico.

 2da semana
Hidrlisis enzimtica
1. Se pes la cantidad de harina de arracacha que se obtuvo en la
balanza electrnica.

2. Se prepar una solucin de agua destilada al 30%, con el peso que

se obtuvo de la arracacha.

3. Se coloc la solucin en un agitador magntico durante 5 minutos

para que el almidn se homogenice correctamente. Se midi el
grado Brix en el refractmetro y el pH inicial.

10

4. A continuacin se coloc en bao mara el vaso de precipitado con

la solucin a una temperatura de 60C por 10 minutos para que la
mezcla pueda gelatinizar permitiendo el hinchamiento de los
grnulos de almidn. Durante este proceso se utiliz la bagueta
para evitar la formacin de grumos.

5. Aparte se prepar la disolucin de la enzima alfa amilasa, para la

cual se pes un equivalente del 1, 2 y 3% del volumen de la
disolucin del almidn.

11

6. Luego se disolvi a la enzima en 45 ml de agua destilada y para

homogenizarlos se colocaron en el agitador magntico durante 3
minutos cada uno.

12

7. Luego de la gelatinizacin del almidn se agreg las soluciones

preparadas y se volvi a agitar con el agitador magntico durante 5
minutos cada uno.

13

8. Se continu con el calentamiento en bao mara (50C) para una

temperatura ptima de actividad enzimtica de la enzima. Se midi
los pH, grados Brix y se realiz la prueba de Lugol de los mismos en
los tiempos de 20 min, 40min y 60 min.
14

9. Al final de este laboratorio se realiz la prueba de benedict de las 3

mezclas.

15

16

 3ra semana
Determinacin de azucares reductores:
1. Se utiliz una alcuota de 25ml para colocarla en un matraz de
100ml.
2. Luego se coloca en una fiola de 250ml: 5ml de la solucin de
Fehiling A 5ml de Fehiling B.

3. Se aade 2 o 3 gotas de la solucin de Azul de metileno.

4. Se diluyo en 20ml de agua destilada y se agreg perlas de vidrio.
5. Se llev a ebullicin la solucin y luego se prosigui a titular.

6. Hallamos la determinacin de azcares totales:

7. En un vaso precipitado de 100ml, se coloc una alcuota de 25ml de
solucin clarificada.

17

8. Se agreg 5ml de HCl (1:1) con mucho cuidado con la pipeta y se

calent a 70C durante 5 minutos.
9. Se enfri a temperatura ambiente y con la ayuda del potencimetro
se llev a un pH de 8.2 utilizando una solucin de 6N de NaOH.

10.
Ya cuando se alcanz el pH deseado se pas la solucin a un
matraz de 100ml se afor con agua, se mezcl y se coloc la
solucin en una bureta.
11.
Se coloc en una fiola de 25ml 5ml de Fehiling A y 5ml
Fehiling B.
12.
Se aadi 2 o 3 gotas de azul de metileno.
13.
Se diluy con 20ml de agua destilada y se agreg perlas de
vidrio luego se llev a ebullicin y la titulacin.

18

IV. RESULTADOS Y DISCUSIONES

Peso de la cscara
Datos Iniciales de la Arracacha

354,14 g

Prueba de humedad
Inicial
1er control (1
h)
2do control (2
h)

Muestra 1
10 g
8,80 g

Muestra 2
10 g
8,67 g

Muestra 3
10 g
8,55 g

8,09 g

8,28 g

8,10 g

Controles con -amilasa al 1%, 2% y 3%

-amilasa al 1%
Tiempo
pH
Brix

20
6,5
21,5

40
6,5
21,2

60
6,5
24

20
6,5
20,5

40
6,5
21,2

60
6,5
22

20
6,5
23,9

40
6,5
21,4

60
6,5
25,5

-amilasa al 2%
Tiempo
pH
Brix
-amilasa al 3%
Tiempo
pH
Brix

Azcar Reductor y Azcares Totales

Muestra de 2% de -amilasa a 60 minutos
pH

Brix

22

Azcares
Reductores
23

19

Azcares
Totales
155

Muestra de 3% de -amilasa a 40 minutos

pH

Brix

21,4

Azcares
Reductores
30

Azcares
Totales
39

Discusin

El anlisis qumico al almidn de arracacha (Arracacia xianthorrizia)

realizado determin su contenido de humedad, protena, azucares

disponibles y contenido de amilasa. Dando a conocer la composicin
de la materia prima y de estandarizacin del proceso de obtencin
de almidn. Con el producto obtenido se realiz control de pH,
grados Brix, temperatura y nivel de amilasa durante la primera,
segunda hora y el da siguiente, todos los datos fueron consignados
y analizados.
Al inicio del laboratorio se procedi a pesarla materia prima,

obteniendo tanto el peso de la arracacha pelada como de la cscara

de la misma. Despus de procedi al respectivo control de humedad
para 3 muestras de arracacha de 10 gramos cada una, llevadas a
una estufa, se observ que durante el control de una hora, stas
perdieron aproximadamente casi 1 gramo por parte de las 3
muestras, en el control de la segunda hora se vio que la reduccin
del peso era de aproximadamente 0,40 gramos.
Posteriormente, para ver la presencia del almidn, se procedi a

secar la muestra en una estufa a 60 grados por un tiempo

prolongado para despus dividirla en 3 muestras e hidratarlas,
adicionando a cada muestra la enzima -amilasa en 1, 2 y 3%,
dichas muestras, controladas a 20, 40 y 60 minutos cada una
tuvieron un pH estable, sin embargo hubieron ligeras diferencias al
momento de medir los grados Brix de cada una, siendo aquella
muestra con 3% de -amilasa aquella que presentaba mayor
cantidad de grados Brix.
Tratamos de usar aquellas muestras con la mayor cantidad posible
para todas las pruebas, ya que se necesitaba de un volumen
considerable para ello, en base a esos requisitos pudimos
seleccionar la muestra de 2% de -amilasa a 60 minutos (en la cual
se obtuvo una cifra de 23 en azcares reductores y 155 en azcares
totales) y la muestra de 3% de -amilasa a 40 minutos (en la cual se
obtuvo una cifra de azcares reductores de 30 y 39 en azcares
totales).

20

V.

CONCLUSIONES

Luego de observar podemos afirmar que la hidrolisis de la arracacha

pasa por 3 etapas: gelatinizacin, licuefaccin y sacarificacin,

todas estas etapas, tiene el fin de convertir almidn a glucosa.
La amilopectina, grado de cristalinidad, longitud de la cadena de
amilosa y presencia de complejos lpidos-amilosa, juegan un papel
importante en la degradacin hidroltica.

21

VI. CUESTIONARIO
1. Defina:
Azcar Invertido:
El azcar invertido es la disgregacin por hidrolizacin de la sacarosa en
glucosa y fructosa. Su nombre hace referencia a que el poder rotatorio de
la solucin frente a la luz polarizada es invertido por el proceso de
hidrlisis que separar la sacarosa en sus dos subunidades.
https://es.wikipedia.org/wiki/Az%C3%BAcar_invertido
Zimgeno:
Un zimgeno o proenzima es un precursor enzimtico inactivo, es decir,
no cataliza ninguna reaccin como hacen las enzimas. Para activarse,
necesita de un cambio bioqumico en su estructura que le lleve a
conformar un centro activo donde pueda realizar la catlisis. En ese
momento, el zimgeno pasa a ser una enzima activa. El cambio
bioqumico suele ocurrir en un lisosoma, donde una parte especfica de la
enzima precursora se escinde del resto para activarla. La cadena de
aminocidos que se libera por la activacin se llama pptido de
activacin.
http://lexicoon.org/es/zimogeno
Azucar reductor:
Los azcares reductores son aquellos azcares que poseen su grupo
carbonilo (grupo funcional) intacto, y que a travs del mismo pueden
reaccionar como reductores con otras molculas.
Los azcares reductores provocan la alteracin de las protenas mediante
la reaccin de glucosilacin no enzimtica tambin denominada reaccin
de Maillard o glicacin.
Esta reaccin se produce en varias etapas: las iniciales son reversibles y
se completan en tiempos relativamente cortos, mientras que las
posteriores transcurren ms lentamente y son irreversibles. Se postula
que tanto las etapas iniciales como las finales de la glucosilacin estn
implicadas en los procesos de envejecimiento celular y en el desarrollo de
las complicaciones crnicas de la diabetes.
https://es.wikipedia.org/wiki/Az%C3%BAcar_reductor

22

Celobiosa:
Beta glucopiranosil (1-4) glucopiranosa.
La celobiosa es un azcar doble formado por dos glucosas unidad por los
grupos hidroxilo del carbono 1 en posicin beta de una glucosa y del
carbono de la 4 otra glucosa. Estas se unen porque desprende de una
molcula de agua y ambas glucosas quedan unidas mediante un oxgeno
monocarbonilo que acta como puente.
Es un disacrido, sea un glcido, que posee poder reductor y aparece en
la hidrlisis de la celulosa, su principal funcin en los organismos vivos es
brindarle energa velozmente al ser consumida por dicho organismo. La
celobiosa es un derivado de la celulosa que es la molcula ms abundante
de los seres vivos, la celobiosa no existe como tan en la naturaleza y se
obtiene a partir de la hidrlisis de la celulosa. Sabiendo esto podemos
decir que se encuentra en a celulosa, es decir que los organismos en los
que se encuentra son los mismos que en la celulosa, organismos
vegetales, en su corteza o estructura principal. Debido a esto podemos
decir que se debe de encontrar en algunos vegetales comestibles o es
sustancias derivadas de vegetales.
https://www.clubensayos.com/Ciencia/Celobiosa/265391.html
Fructugrucoronoxidasa
Tambin llamada azcar de la remolacha. Es una variedad de la
remolacha comn (beta vulgaris) de donde se obtiene azcar de forma
industrial, existiendo otras variedades como la acelga, la remolacha
hortcola y la remolacha forrajera.
http://www.buenastareas.com/ensayos/Peru/51889403.html

2. Regulacin enzimtica de la acumulacin de sacarosa en las

plantas.
Invertasas son enzimas que regulan la acumulacin de sacarosa en el
parnquima de almacenaje del tallo de caa de azcar (Sacher et al.,
1963; Gayler y Glasziou, 1972a). La invertasa neutra (IN) est en el
citoplasma o en los compartimentos metablicos de las clulas. En las
variedades que acumulan altos contenidos de sacarosa, las actividades de
IN son bajas en las clulas meristemticas, pero se incrementan
concomitantemente al aumentar la acumulacin de sacarosa en el tejido
de almacenaje. La actividad de la invertasa cida soluble (IAS) es alta en
23

tejidos de crecimiento rpido, como los cultivos de clulas y tejidos,

pices de raz y entrenudos inmaduros. IAS se ubica principalmente en las
vacuolas de las clulas del parnquima de almacenaje, pero tambin
ocurre en el espacio apoplstico de la pared celular, ya sea como enzima
soluble o enlazada a la pared celular
http://www.colpos.mx/agrocien/Bimestral/2002/jul-ago/art-2.pdf

3. Explique la determinacin de las estructuras enzimticas por

difraccin de rayos X. de ejemplos y enzimas estudiadas.
El anlisis por difraccin de rayos X indica que la celulosa presenta una
estructura cristalina altamente ordenada, constituyendo fibras
elementales o microfibras de 500 a 1000 angstroms de longitud. Algunas
zonas de la fibra elemental contienen porciones de celulosa "amorfa" que
es fcilmente hidrolizable. Las molculas de celulosa estn adems
organizadas en haces de cadenas paralelas que forman fibrillas. Aunque la
celulosa posee elevada afinidad por el agua, es completamente insoluble
en ella.
http://sisbib.unmsm.edu.pe/bibvirtual/tesis/basic/vilches_p_l/introducci
%C3%B3n.htm

4. Explique las enzimas que se utilizan en la industria

productora de vinos.
La fermentacin tiene como principal objetivo la transformacin de los
azucares del mosto (zumo) en alcohol etlico. Adicin de enzimas en el
vino las enzimas utilizadas en enologa son de dos tipos:
Las enzimas pectolticas o pectinasas
Beta-glucanasas. Fermentacin La fermentacin ocurre en recipientes y
pasa por cuatro fases. Fase de Demora Las levaduras se aclimatan a las
condiciones del mosto a las altas concentraciones de azucares, bajo valor
de pH (acidez) y temperatura.
https://prezi.com/dtdmt2xos0w-/produccion-de-vinos-fermentacion-deazucares-y-enzimas/

24

5. Buscar algn artculo de investigacin referente a

aplicaciones de enzimas de la industria alimentaria
publicado en revistas cientficas.

Enzimas Amilolticas Exgenas En La Alimentacin De Rumiantes

http://www.researchgate.net/profile/German_Mendoza2/publication/28263
859_Enzimas_amilolticas_exgenas_en_la_alimentacin_de_rumiantes/links/0
9e41512d181f1a00f000000.pdf/

VII.

BIBLIOGRAFA

25

VIII.

DIAGRAMAS DE FLUJO
-

EXTRACCIN DEL ALMIDN

HIDRLISIS ENZIMTICA pH

TITULACIN DETERMINACIN DE AZCARES REDUCTORE

INICIO
INICIO
INICIO
Peso=2085.99
INICIO

Arracacha
Harina de arracacha
MUESTRA

COLADO

MEZCLADO 30%
LAVADO

Agua

AGUA

P=36.02gr

PESADO
COMPRADO

Cscara

1MEZCLADO
MEDICIONES

PELADO

100%

COLADO

Brix
pH

Peso a= 1717.12
1MEZCLADO
-

Agua

FEHELING A
FEHELING B

Amilasa
- Agua

GELATINIZACI
N

PESADO
2MEZCLADO

PREP. ENZIMA

CORTADO

Peso c= 354.11
T=60
T=10

- 1%, 2%, 3%
-2MEZCLADO
V=45ml
- T=3

PREPARADO
-

2
MEZCLADO

RALLADO

AGUA
PERLA DEAgua
VIDRIO
AZUL DE METILENO

Lugol

HERVIDO
BAO
MARIA

PREPARADO
T = 60
T=50
T=20, 30, 60

HORNEADO
2
MEDICIONES

TITULACIN
MOLIDO
Benedic

T=5

P. BENEDIC

HERVIDO
Brix
pH
Lugol

- Vm=2ml
- Vb=1.5ml
TITULACIN
- T=80

FIN
FIN
FIN
26
FIN

TITULACIN - DETERMINACIN DE AZCARES TOTALES

MUESTRA

HCL
NaOH

FEHELING A
FEHELING B

AGUA
PERLA DE VIDRIO
AZUL DE METILENO

27