Método para la determinación de Staphylococcus aureus en

alimentos.

OBJETIVOS

Realizar adecuadamente la cuantificación de Staphylococcus aureus en alimentos,

mediante la técnica descrita en la Norma Oficial Mexicana.
Explicar el fundamento de todas las etapas del método de detección de
Staphylococcus aureus en alimentos.

GENERALIDADES

Los estafilococos son cocos anaerobios facultativos, son Gram positivos y se presentan
solos, en pares o racimos, no son móviles, ni esporulados; algunos biotipos son
capaces de producir una toxina altamente termoestable, así por ejemplo,
Staphylococcus aureus produce 5 toxinas, que pueden provocar severas intoxicaciones
en el hombre.

Su metabolismo es oxidativo/fermentativo, es catalasa-positivo y puede metabolizar una

gran variedad de carbohidratos en condiciones aeróbicas, con la subsecuente liberación
de ácido, principalmente ácido acético con pequeñas cantidades de bióxido de carbono;
en condiciones anaerobias, el producto principal de la fermentación es el ácido láctico.

Las tres condiciones necesarias para su óptimo desarrollo son: pH cercano a la

neutralidad, temperatura alrededor de 30ºC y ausencia de microorganismos
competitivos. Este último punto es importante, ya que Staphylococcus aureus no es
competitivo en presencia de otros microorganismos.

Staphylococcus se puede encontrar en a) medio ambiente como puede ser: aire, polvo,
superficies en donde se manejan alimentos, agua, agua residual, b) en alimentos: por
ejemplo los que presentan un alto contenido proteico, como puede ser la leche y
derivados lácteos, también se desarrolla en aquellos alimentos que presentan altas
concentraciones de sal, uno de ellos sería el jamón; otro factor importante en los
alimentos es el pH, así tenemos en el caso de la mayonesa, ésta tiene un pH lo
suficientemente bajo para inhibir el desarrollo de S. aureus, sin embargo, al diluirse y
neutralizarse en una ensalada por ejemplo, el pH asciende lo suficiente como para
permitir el desarrollo de este microorganismo enterotoxigénico y finalmente c) también
se puede localizar en personas y animales. Estos últimos, los animales y las personas
son los principales reservorios de estos microorganismos.

Con respecto a las condiciones ambientales, los alimentos son susceptibles a una
contaminación postproceso con tipos enterotoxigénicos de Staphylococcus aureus, por
ejemplo, si son sometidos a un inadecuado manejo o bien a temperaturas de
conservación inapropiadas; este problema se acentúa por la ausencia de flora
competitiva, que normalmente restringe el desarrollo de este microorganismo

El crecimiento de Staphylococcus aureus en alimentos, tiene gran importancia por

tratarse de un microorganismo capaz de producir una poderosa enterotoxina, que al
ingerirse causa intoxicaciones severas al hombre. Como se mencionó con anterioridad
son 5 enterotoxinas: A, B, C, D y E, siendo la “A” la más nociva

La cantidad de Staphylococcus aureus necesaria para producir suficiente toxina (1.0

microgramo), para causar intoxicación, es de 106 UFC/g de alimento, de acuerdo con la
Norma Oficial Mexicana, sin embargo Jablonski et al, comentan que el FDA, establece
que una cantidad de Staphylococcus aureus patógeno, en el que se encuentren 105
UFC/g de alimento, provoca intoxicaciones y que un nivel basal de aproximadamente
un nanogramo de toxina estafilocóccica por gramo de alimento, es suficiente para
causar síntomas asociados con la intoxicación antes mencionada. También es
importante observar, que en la mayoría de los brotes de intoxicación causados por este
microorganismo, se han detectado niveles de uno a cinco microgramos de toxina
ingerida, aunque en algunos casos las concentraciones de toxina han sido aún más
bajas, del orden de 0.01 microgramo, suficientes para provocar una intoxicación en el
hombre.

Los alimentos contaminados con esta cantidad de bacterias, no presentan ninguna

diferencia perceptible en cuanto a su apariencia, sabor y olor, por lo que no se
distinguen de los alimentos que no están contaminados con este microorganismo, por
esta razón el peligro de ingerir alimentos contaminados con Staphylococcus aureus sin
darse cuenta es alto. Los alimentos sometidos a intensa manipulación durante su
preparación y que se mantienen a temperaturas de riesgo (por encima de 7.2° C y por
debajo de 60° C) después de su preparación, son los alimentos más involucrados en la
intoxicación estafilocóccica.

Los alimentos perecederos tales como carnes crudas y procesadas, ensaladas,

productos de pastelería, como pasteles rellenos con crema, pies de crema, coberturas
de chocolate, leche y sus derivados, rellenos para sándwiches y papas, son los más
comúnmente asociados con intoxicaciones estafilocóccicas.

En los humanos, las cepas de Staphylococcus habitan en forma específica en el tracto

nasofaríngeo, cabello y piel del 50% o más de los individuos, sin causar daño aparente
(portadores asintomáticos), pudiendo transferirse de los dedos y manos a los alimentos
y desarrollarse con rapidez en ellos.

La especie aureus, es la considerada patógena dentro del género Staphylococcus y

está comúnmente asociado a casos de artritis, osteomielitis, meningitis, neumonía y en
algunos casos puede llegar a ocasionar pérdida del conocimiento. Las cepas de este
microorganismo que producen enzimas extracelulares y toxinas, son las más
importantes por ser causante de intoxicaciones alimentarias.
El establecimiento de los síntomas de la intoxicación, por lo general se presentan
rápidamente y en muchos casos de forma aguda, aunque depende de: la
susceptibilidad de la persona hacia la toxina, la cantidad consumida del alimento
contaminado, la cantidad de toxina en el mismo y en general la salud del individuo. Los
síntomas más comunes de intoxicación consisten en náusea, vómito, dolor o espasmos
abdominales y postración. Sin embargo, existen algunos individuos que pueden no
manifestar todos estos síntomas asociados a la enfermedad. En casos más severos, se
puede presentar dolor de cabeza, calambres musculares así como cambios
intermitentes en la presión sanguínea y pulso. La recuperación parcial se alcanza a los
2 días, sin embargo la recuperación completa puede durar más días en casos muy
severos.

El término Staphylococcus coagulasa-positivo se utiliza para describir aquellas cepas

que secretan una enzima que provoca coagulación del fibrinógeno sanguíneo,
utilizando el microorganismo esta capacidad contra la fagocitosis y otros mecanismos
de defensa del huésped. Esta reacción se utiliza in vitro para la identificación de cepas
de Staphylococcus productoras de toxinas, mediante el uso de plasma.

Algunas razones para determinar Staphylococcus aureus son:

Confirmar la presencia de este microorganismo como agente causal de

intoxicaciones.
Determinar si un alimento o ingrediente de los mismos, es fuente potencial de este
microorganismo enterotoxigénico.
Demostrar la contaminación postproceso, la cual es usualmente debida a contacto
humano o con superficies inadecuadamente sanitizadas.

FUNDAMENTO

La presente técnica para la detección de Staphylococcus aureus, consiste en los

siguientes pasos:

1. Aislamiento selectivo, se utiliza un medio selectivo sólido, el cual inhibe el desarrollo

de géneros diferentes al Staphylococcus, pero además permite reconocer el
desarrollo característico del microorganismo buscado.
2. Recuperación de la cepa, este paso permite restaurar las células dañadas de
Staphylococcus aureus.
3. Identificación bioquímica, en este punto se identifica el género y especie de
Staphylococcus aureus enterotoxigénico.

Estas pruebas bioquímicas (de acuerdo a la Norma Oficial) son: presencia de la enzima
coagulasa y presencia de la enzima termonucleasa. La caracterización bioquímica de
Staphylococcus aureus toxigénico en estas pruebas es la siguiente:
Presencia de coagulasa positiva
Presencia de termonucleasa positiva
La determinación del Staphylococcus aureus mediante extensión del inóculo en
superficie, es adecuado para el análisis de alimentos en los que se espere encontrar
más de 100 células de Staphylococcus aureus/g ó 10 células de Staphylococcus
aureus/ mL de alimento.

El aspecto cuantitativo en la investigación de Staphylococcus aureus es de suma

importancia, no sólo desde el punto de vista económico, sino en el de salud pública; la
Norma establece un límite máximo de 106 UFC/g de alimento para que éste pueda ser
consumido. Desde este punto de vista y de acuerdo con la técnica mencionada, la
sensibilidad mínima de detección en el recuento en placa, utilizando el método de
extensión de superficie es de: 100 UFC/g de alimento para muestras sólidas ó 10
UFC/mL para alimentos líquidos.

NOTA

La sensibilidad se podrá aumentar a 10 UFC/g ó 1 UFC/mL, solamente si se coloca 1.0

mL de la primer dilución del alimento, distribuido en tres placas de agar Baird Parker,
esto representa una cantidad aproximada de inóculo de 0.33 mL por caja.

MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES

4 cajas de Petri con 20.0 mL de agar Baird Parker a.

7 tubos de 13 x 100 mm con 3.0 mL de caldo infusión cerebro corazón (BHI) b.
1 caja de Petri con 20.0 mL de agar DNA c.
7 tubos de 13 x 100 mm con 3.0 mL cada uno de caldo manitol c. (opcional)
1 matraz Erlenmeyer de 250 mL de capacidad conteniendo 90.0 mL de agua
peptonada al 0.1% o una solución amortiguadora de fosfatos 0.1 M de pH 7.2 a.
3 tubos 16 x 150 mm conteniendo 9.0 mL de agua peptonada al 0.1% o una solución
amortiguadora de fosfatos 0.1 M de pH 7.2 a.

SOLUCIONES, REACTIVOS E INDICADORES

Colorantes para Tinción de Gram b

Parafina o aceite mineral estérilc. (sólo si se siembra en caldo manitol)
Colorante azul de orto-toluidina 0.1M, (solamente que el medio de cultivo no
contenga este indicador) d.
HCl 1N, en caso de no contar con la orto toluidina d.

BIOLÓGICOS

Plasma de conejo c.
MATERIAL Y EQUIPO

Pipetas graduadas estériles de 1 mL con tapón de algodón a, c. (se debe utilizar una
pipeta para cada dilución)
Pipetas Pasteur estériles a, b. c. d.
Pipetas graduadas estériles de 10 mL con tapón de algodón . a. (en caso que la
muestra sea líquida.
Propipeta. a, b, c, d
Varillas de vidrio de 3.5 mm de diámetro aproximadamente y 20 cm. de largo,
dobladas en ángulo recto (forma de “L”), estériles (se debe utilizar una por dilución). a
Utensilios estériles para manipular las muestras: cuchillos, cucharas, pinzas, tijeras,
espátulas y separador de huevo. a
Vaso de licuadora estéril o Bolsa para Stomacher a.
Motor para licuadora o Stomacher a.
Asa bacteriológicab.
Portaobjetosb.
Microscopio óptico b.
Balanza granataria a.
Horno para esterilizar material de vidrio.
Autoclave
Baño de agua a ebulliciónd
Incubadora a 35 ± 2°Cd

NOTAS
a
Material necesario al inicio de la práctica.
b
Material necesario a las 48 h de iniciada la práctica.
c
Material necesario a las 72 h de iniciada la práctica.
d
Material necesario a las 96 h de iniciada la práctica.
 DETERMINACIÓN DE Staphylococcus aureus EN ALIMENTOS

Realizar diluciones decimales empleando tubos

Homogenizar con 90.0 mL de
con 9.0 mL de solución diluyente
diluyente

1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL

Pesar 10.0 g 10-1 10-2 10-3 10-4

de muestra en 0.1 mL
condiciones de
asepsia

10-2 10-3 10-4 10-5

Depositar por duplicado 0.1 mL de cada dilución
en cajas petri con agar Baird Parker.

Incubar 24 - 48 h a 37°C

Distribuir la muestra con Contar aquellas colonias

una varilla de vidrio negras con hidrólisis de
estéril lecitina

Coagulasa

Incubar 24 h
37°C

Siembra de colonias
Fermentación Plasma DNAsa termoestable Realizar pruebas típicas en tubos con
del manitol más bioquímicas a caldo BHI. Consultar
desarrollo cada tubo Cuadro 1
en BHI
PROCEDIMIENTO

1. Aislamiento selectivo.

1. Pesar 10.0 g de muestra en una caja de Petri estéril.

2. Transferir la muestra pesada a una bolsa de Stomacher o vaso de licuadora
estéril.
3. Adicionar 90.0 mL de agua peptonada estéril al 0.1% o solución amortiguadora
de fosfatos 0.1M de pH 7.2.
4. Homogeneizar 30 segundos en Stomacher a velocidad media o 10 segundos
en licuadora a velocidad mínima.
5. Realizar diluciones decimales hasta 10-4 (el número de diluciones está en
función de la procedencia de la muestra) en tubos de 16 x 150 mm
conteniendo cada tubo 9.0 mL del mismo diluyente.
6. Transferir 0.1 mL de las diluciones 10-1, 10-2, 10-3 y 10-4 a cajas de Petri con
agar Baird Parker.
7. Extender el volumen inoculado a cada una de las cajas de Petri con una varilla
de vidrio estéril, en forma de “L”, iniciando a partir de la mayor dilución (Método
de inoculación por extensión en superficie).
8. Mantener las placas en su posición hasta que el inóculo sea absorbido por el
agar, entre 5 y 10 minutos aproximadamente.
9. Invertir las placas e incubar a 35 ± 1º C. durante 45 a 48 h.
10. Después de incubar, observar las colonias características de este
microorganismo en el agar Baird Parker (BP). Éstas se presentan como:
colonias negras, circulares, brillantes, convexas, lisas con diámetro de 1 a 2
mm, muestran una zona circular opaca y un halo claro alrededor de la colonia.

2. Recuperación de la cepa.

1. Seleccionar las placas que contengan entre 15 y 150 colonias típicas de S.

aureus, si no es posible, seleccionar las placas que contienen
concentraciones de la muestra más diluidas, no obstante que contengan
más de 150 colonias.
2. Cuando las placas contengan menos de 15 colonias típicas, también
pueden ser utilizadas y al reportar se deberá agregar la nota de “valor
estimado”.
3. Con ayuda del cuadro 1, determinar el número de colonias a evaluar,
tomando en cuenta el número de colonias típicas de S. aureus obtenidas en
el agar Baird-Parker: Así mismo seleccionar las colonias para realizar las
pruebas cuantitativas y cualitativas; dentro de estas últimas están
comprendidas la coagulasa y la termonucleasa.
4. Reinocular cada una de las colonias aisladas y seleccionadas, que son
características de este microorganismo, utilizando asa bacteriológica recta
estéril, en caldo infusión cerebro corazón.
5. Incubar a 35 1 C durante 24 h.
 6. Inocular e incubar en la misma forma, cepas tipo de S. aureus ATCC 6538 y
S. epidermidis ATCC 12228, como controles positivo y negativo
respectivamente de las pruebas bioquímicas.

CUADRO 1. Número de colonias a evaluar de S. aureus.

Cuenta total de colonias sospechosas Colonias sospechosas a caracterizar
en una caja representativa bioquímicamente
Menos de 50 UFC 3
51-100 UFC 5
101-150 UFC 7

3. Pruebas bioquímicas.

1. Realizar la confirmación bioquímica del microorganismo, haciendo las pruebas

de presencia de las enzimas: coagulasa y termonucleasa.

3.1 Prueba de la presencia de la enzima coagulasa.

1. Con una pipeta estéril de 1 mL, tomar 0.2 mL de la suspensión del

microorganismo que desarrolló en el caldo infusión cerebro corazón, adicionar
0.2 mL de plasma de conejo. Dicho plasma previamente diluido volumen a
volumen con solución salina estéril.
2. Incubar en baño María o en incubadora, entre 35 y 37º C y observar durante 6
h. en intervalos de 1 hora; en caso de no presentarse formación de coágulo,
prolongar el período de observación hasta por 24 h.
3. Para comprobar la coagulabilidad del plasma de conejo, tomar 0.5 mL de
plasma reconstituido y depositarlo en un tubo de 13 X 100 mm, posteriormente
añadir una gota de cloruro de calcio al 5%; se debe formar un coágulo entre 10
a 15 segundos.

NOTA

Analizar la consistencia del coágulo y registrar ésta, de acuerdo con los valores
del cuadro 2.

Considerar la prueba positiva solamente si hay formación de coágulo con un valor

igual o superior a 2 cruces.

CUADRO 2. Interpretación de las reacciones en la prueba de la coagulasa

VALOR CARACTERÍSTICA
negativa No se observa formación de coágulo.
Formación de coágulos pequeños
1+ (positiva)
desorganizados.
2+ (positiva) Formación de coágulo pequeño organizado
3+ (positiva) Formación de un gran coágulo organizado
 Todo el contenido del tubo está coagulado.
4+ (positiva) Al invertir el tubo este coágulo se mantiene
en el fondo del mismo.

3.2 Prueba de la enzima termonucleasa.

1. Calentar 0.3 mL de la suspensión del microorganismo que creció en caldo

infusión cerebro corazón durante 15 minutos en baño de agua hirviendo.
2. Hacer orificios circulares en el agar DNA y colocar una gota de la suspensión
bacteriana, del punto anterior, con ayuda de una pipeta Pasteur estéril. Es
recomendable incluir testigos tanto positivos (S. aureus ATCC 6538), como
negativos (S. epidermidis ATCC 12228).
3. Incubar a 35 2 C en cámara húmeda, durante 4 a 24 h.
4. Después de incubar, adicionar el colorante azul de orto-toluidina 0.1M a los
orificios hechos en el agar DNA. (Existe un agar DNA que ya contiene el
indicador de orto-toluidina).
5. La formación de un color rosa brillante extendido por lo menos un milímetro
alrededor del orificio, en donde se inoculó, indicará que el microorganismo
posee la enzima termonucleasa.
6. En el caso de no contar con orto toluidina, se puede utilizar HCl 1.0N como
indicador. De encontrarse esta enzima, se observa un halo transparente
alrededor de la colonia, seguido de un precipitado blanco.

NOTA

Si se utiliza el medio de cultivo comercial, generalmente ya tiene el indicador de

orto toluidina, por lo que después de la incubación se podrá observar la coloración
rosa en donde se inoculó, en caso de encontrarse dicha enzima.

Opcionalmente se pueden realizar otras dos pruebas bioquímicas: la fermentación

de manitol en anaerobiosis y la prueba para detectar la presencia de la enzima
catalasa; cuando ambas pruebas son positivas, quiere decir que el
microorganismo fermenta el manitol y produce ácido en condiciones anaeróbicas y
además contiene la enzima catalasa.

3.3 Prueba de fermentación de manitol en anaerobiosis (opcional, no lo exige

la norma).

1. Inocular 2 asadas en caldo manitol, de la suspensión del microorganismo que

desarrollado en el medio infusión cerebro corazón.
2. Adicionar a cada tubo de caldo manitol que ha sido inoculado, entre 0.3 y 0.5
mL de parafina o aceite mineral estéril.
3. Incubar a 35C 2 C por 24 h. y observar los resultados.
4. Considerar la prueba como positiva, si se presenta desarrollo y vira el
indicador. Si el medio contiene como indicador el rojo de fenol, el medio debe
virar a color amarillo por la producción de acidez.

3.4 Prueba de la catalasa (opcional, no lo exige la norma).

1. Con una asa bacteriológica, tomar un inóculo del caldo infusión cerebro
corazón después de su incubación, y colocarlo sobre un portaobjetos,
2. Adicionar una o dos gotas de peróxido de hidrógeno al 30%, mezclar
perfectamente bien y observar los resultados.
3. Si se presenta formación de burbujas, se considera positiva la prueba, esto es
que sí contiene la enzima catalasa. En caso de no formarse burbujas la prueba
se interpretará como ausencia de esta enzima.

CÁLCULOS Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS

Para determinar el número de S. aureus enterotoxigénico presentes en 1.0 g de

alimento se deben de considerar: a) el número total de colonias sospechosas y
caracterizadas en el agar Baird Parker y b) el número de colonias que resultaron
positivas en las pruebas bioquímicas efectuadas.

Ejemplo: Al analizar una torta de quesillo de acuerdo con esta metodología, se

encontró que la caja Petri representativa estadísticamente, contenía 70 UFC
sospechosas de S. aureus (negras, brillantes con halo y precipitado blanco). Éstas
se localizaban en la caja Petri sembrada con la dilución 10-3 (0.001g/mL), como en
este método se inoculan 0.1 mL el factor que hay que aplicar es 10 -4 (0.0001g)
para este caso. Tomando en cuenta el cuadro número uno, se tomaron 5 colonias
para caracterizarlas bioquímicamente.
De estas 5 colonias analizadas, solamente 2 resultaron positivas para las pruebas
de la enzima coagulasa y de la enzima termonucleasa.
Para conocer ¿Cuántas UFC/g de S. auresus toxigénico, se encuentran en este
alimento? y ¿se puede consumir el alimento?, el razonamiento es el siguiente:

a) determinar el porcentaje de colonias de S. aureus toxigénico.

Cinco colonias representan el 100% de UFC muestreadas, dos colonias positivas,

¿a qué porcentaje corresponden?, expresado en forma aritmética es:

5 UFC 100%
2 UFC X
X= 40%

El total de colonias sospechosas es 70 X 104 UFC/g puesto que se encontraron 70

UFC en la caja sembrada con 0.1 mL de dilución 10-3:
 70 UFC 0.0001 g (10 -4g)
X 1g
X= 700,000 UFC/g de alimento.

De las 700,000 UFC/g de alimento, solamente el 40% son toxigénicas (tomando

en cuenta el primer cálculo) entonces ¿cuántas UFC toxigénicas por gramo se
encuentran en este alimento?

700,000 UFC/g 100%

X 40%
X=280,000 UFC/g

Tomando en cuenta solamente 2 dígitos y potencias de 10, la forma correcta de

expresar el resultado es:

Staphylococcus aureus enterotoxigénico= 28X104 UFC/g

Estas 280,000 UFC/g de alimento (28X104UFC/g), de acuerdo con lo que estupula

la Norma Oficial Mexicana, el alimento se encuentra escasamente dentro de las
especificaciones, sin embargo en la legislación estadounidense de acuerdo con lo
que estipula la FDA (Jablonski, 2001) presentan riesgo para la salud pública; por
lo que no se debe consumir.

NOTA

No olvidar que la metodología empleada es por extensión en superficie y que

solamente números de unidades formadoras de colonias de S. aureus toxigénico
superiores a 1x105 son potencialmente riesgosas y pueden causar intoxicación
alimentaria. Sin embargo deben consultarse las especificaciones sanitarias
concretas del alimento estudiado, para determinar la aceptabilidad o rechazo del
alimento en función del número de UFC/g de alimento del microorganismo
estudiado. No obstante debe hacerse notar que no existen especificaciones para
todos los alimentos en forma específica, pero se deben desarrollar criterios a partir
de las normas vigentes para otros alimentos similares que permitan aceptar o
rechazar un alimento.

Para elaborar un informe de resultados, se sugiere seguir las indicaciones que a

continuación se expresan:

Cuando las UFC encontradas en una caja Petri, están dentro del rango
estadístico (de 15 a 150 UFC/caja), se reporta como en el ejemplo antes
descrito.
Si se está en el valor estimado, esto es que no existen colonias típicas, se debe
reportar la sensibilidad del método, en este caso será de 100 UFC/g para
muestras sólidas y 10 UFC/mL en caso de muestras líquidas.
 Cuando todas las pruebas bioquímicas son negativas, se informará:
< 10 UFC/mL en muestras líquidas de la dilución 1:10
< 100 UFC/g para muestras sólidas de la dilución 1:10

BIBLIOGRAFÍA.

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