MICROBIOLOGIA AGRICOLA

Practica 7

Ciclo del Nitrógeno

Microorganismos nitrificantes y desnitrificantes

Preparado por JS Montaña y M Franco

CICLOS BIOGEOQUÍMICOS

Un ciclo biogeoquímico se define como el movimiento o ciclaje de la materia a través del sistema, es decir es la
ruta que toma un compuesto químico para transportarse a través de los componentes bióticos (biosfera) o
abióticos (litósfera, atmósfera o hidrósfera) en el planeta Tierra. Es una serie de cambios donde el punto final se
convierte en el punto inicial de la transformación, para volverse a repetir. Entre los ciclos biogeoquímicos se
encuentran el ciclo del nitrógeno, del carbono, del fósforo, del azufre y otros microelementos.

CICLO DEL NITROGENO

El nitrógeno es un nutriente esencial en la vida en el planeta Tierra. El nitrógeno es el nutriente más limitante en
el crecimiento de las plantas en el ecosistema terrestre. El ciclo del nitrógeno cuando es desbalanceado puede
acarrear graves problemas ambientales, de ahí su importancia en todos los ambientes.

El nitrógeno está presente en varias formas: nitrógeno molecular o dinitrógeno (N2), nitrógeno orgánico (en
plantas, animales, biomasa microbiana y materia orgánica del suelo), iones amonio (NH4+) y iones de nitrato
(NO3-). Los procesos mediados por los microorganismos transforman el nitrógeno de una forma a otra. Algunas
bacterias pueden transformar el nitrógeno molecular a amoniaco por un proceso conocido como fijación de
nitrógeno. Los procesos de amonificación/inmovilización, nitrificación y denitrificación son responsables del
movimiento del nitrógeno fijado de una forma a otra en suelo y agua (Sylvia et al. 2005).

El ciclo del nitrógeno se puede dividir en tres subciclos:

1. ELEMENTAL. Reacciones de óxido-reducción que generan las diferentes formas químicas de N

2. FOTOTRÓFICO. Enfocado en la absorción por las plantas de las formas en que esta lo puede involucrar en
sus procesos fotosintéticos.

3. HETEROTRÓFICO. Procesos de descomposición de la materia orgánica llevada a cabo por meso y

1
microfauna.

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Las proteínas son macromoléculas biológicas, fuera de la célula a un pH ácido o en presencia de enzimas sucede
la degradación de la proteína, tanto en ambientes aeróbicos como anaeróbicos. El proceso enzimático que libera
NH3 se llama amonificación. En este proceso se da la proteólisis y la degradación de ácidos nucléicos, urea y
aminoazúcares como la quitina y N-acetilglucosamina (Stevenson y Cole, 1999).

Cuando el oxígeno es añadido al nitrógeno, el átomo de nitrógeno es oxidado, es decir sucede un proceso de
pérdida de electrones. La oxidación del nitrógeno conlleva a un aumento de la carga negativa dada por la
pérdida de los electrones. La nitrificación es el proceso de transformación del NH 3 formado en la amonificación a
NO3-. Este proceso es aerobio, y es llevado a cabo por bacterias Gram negativas quimioautótrofas de la familia
Nitrobacteriaceae. La transformación de NH 3 hasta NO2- es realizada por bacterias del grupo nitroso, entre ellas
Nitrosomonas sp., Nitrosospira sp., Nitrosovibrio sp., que se ven inhibidas por pH ácido. En este proceso
interviene la enzima Amonio Monooxigenasa (AMO) que actúa a pH neutro, y la enzima Hidroxilamina Oxidasa
(HAO), que se encuentra en el periplasma celular (Sylvia et al., 2005).

NH3 + O2 + 2e- + 2H+ AMO NH2OH + H2O

NH2OH + H2O NO2- + 4H+ + 4e-

HAO
La transformación del nitrito hasta nitrato la llevan a cabo las bacterias del grupo nitro, conocidas como
bacterias oxidantes del nitrito. En este grupo se encuentran géneros como Nitrobacter sp., Nitrospira sp. y
Nitrococcus sp., que se ven inhibidas a pH alcalino. En el proceso interviene la Nitrito Oxidasa (NO), que se
encuentra en el citoplasma y libera hidrogeniones y electrones como productos.

NO2- + H2O NO3- + 2H+ + 2e-

NO
Cuando el oxígeno es removido del nitrógeno, el átomo de nitrógeno lleva a cabo un proceso de reducción; esto
significa que los electrones retornan al nitrógeno o que el átomo de nitrógeno gana electrones. La reducción del
nitrógeno resulta en la disminución de la carga positiva dado por la ganancia de electrones. Esta transformación
del nitrógeno es la desnitrificación o reducción del nitrato, llevada a cabo bajo condiciones de anaerobiosis, en
pH de 6 – 6.5, y en temperaturas desde 2 a 65ºC. Microorganismos como Alcaligenes sp., Bacillus sp.,
Pseudomonas sp., Thiobacillus denitrificans y Azospirillum sp. pueden realizar este proceso. Se puede llevar a
cabo de forma asimilativa, un proceso independiente del oxígeno (cuando el nitrato es utilizado para la síntesis
de compuestos orgánicos) o desasimilativa (cuando el nitrato es utilizado como aceptor final de electrones). En 2
el primer caso, el producto es amonio, mientras que en el segundo, el producto es nitrógeno molecular o dióxido
de nitrógeno.

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 Reducción asimilativa:
NO3- + 2e- NO2- + 6e- NH2OH NH4
1 2 3

1. Nitrato reductasa asimilativa.

2. Nitrito reductasa.
3. Hidroxilamina oxidoreductasa.

 Reducción desasimilativa:

NO3- NO2- NO N2O N2

1 2 3 4

1. Nitrato reductasa desasimilatoria (NAR).

2. Nitrito reductasa (NIR).
3. Reductasa del óxido nitrico (NOR).
4. Reductasa del oxido nitroso (NOS).

Estas transformaciones del nitrógeno pueden evidenciarse mediante la utilización de medios de cultivo que
contienen sustratos para las enzimas implicadas en el proceso de nitrificación y desnitrificación. Los caldos
amonio y nitrito son muy frecuentemente usados, junto con pruebas químicas que facilitan la detección de
nitratos, nitritos y amonio. Estas pruebas químicas son Griess y Nessler.

Para la detección del NH4+ se utiliza el reactivo de Nessler, con la obtención de un color amarillo con presencia
de precipitación roja para un resultado positivo. Si no se observa un cambio de coloración en el medio el
resultado es negativo. El reactivo de Nessler es una solución alcalina compuesta por yoduro de potasio y yoduro
de mercurio que reacciona con los iones amonio. Los iones amonio forman un compuesto pardo amarillento
llamado yodomercurinato de potasio alcalino (Islam et al., 2008).

Para la detección del nitrito se utiliza el reactivo de Griess, aunque no se debe descartar la presencia de nitratos
y nitrógeno molecular, participantes en el ciclo. Esta prueba se realiza con: ácido sulfanílico, ácido acético,
dimetil-α-naftilamina y ácido acético (Islam et al., 2008).

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OBJETIVO

Determinar de una muestra la presencia de microorganismos nitrificantes y desnitrificantes

MATERIALES
- frasco 200 mL con 100 mL de caldo amonio - 2 pipetas de 5 ml
- 1 frasco 200 mL con 100 mL de caldo nitrito - 2 pipetas de 1 mL
- 1 caja con agar amonio - 4 tubos tapón algodón
- 1 caja con agar nitrito - Polvo de zinc
- 50 g de muestra de suelo o lodo - Reactivo de Griess
- Reactivo de Nessler

PROCEDIMIENTO

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RESULTADOS Y DISCUSION

En la práctica se espera determinar si en el suelo muestreado hay presencia de bacterias nitrificantes y

denitrificantes, por lo que la prueba de Nessler realizada al caldo amonio deberá arrojar resultados negativos,
indicando la ausencia de amonio y sugiriendo su transformación por bacterias nitrificantes. En la prueba de
Griess realizada al mismo caldo se esperan resultados negativos en la primera fase, por lo que tras la adición de
polvo de zinc, se puede obtener cualquier resultado, pues un resultado positivo indicaría la presencia de nitratos
y la ausencia de nitritos (presencia de bacterias del grupo nitro), mientras que un resultado negativo indicaría
que hubo proceso de desnitrificación desasimilatoria al suponer que todo fue transformado en nitrógeno
molecular.

El caldo nitrito, por otro lado, al arrojar resultados negativos en la prueba de Nessler demuestra que hay
ausencia de amonio, lo que podría indicar que hubo desnitrificación desasimilatoria y por lo tanto todo el nitrito
fue transformado en N2. Si se obtienen resultados positivos, indicará que hay presencia de amonio y,
consecuentemente, reducción asimilativa.

En cuanto a la prueba de Griess, se espera obtener resultados negativos en la primera fase, que indique que el
nitrito del medio fue transformado completamente. La segunda fase también debería arrojar resultados
negativos que demuestren que el nitrito fue transformado a nitrógeno molecular, y no únicamente utilizó el
nitrato.

Después de realizar las pruebas químicas se deben leer las siembras realizadas en agar amonio y agar nitrito,
donde se espera encontrar crecimiento de microorganismos Gram negativos y Gram positivos, ya que las
bacterias involucradas en la nitrificación son Gram negativas únicamente, mientras que en la denitrificación
intervienen todo tipo de bacterias. Pueden encontrarse diferentes morfologías pertenecientes a diferentes
géneros, aunque se descarta la posibilidad de encontrar algunos de estos microorganismos por sus
requerimientos ambientales.

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CUESTIONARIO

1. Realizar una tabla para microorganismos nitrificantes y desnitrificantes que contenga:

GRUPO GENERO ESPECIE INFORME DE LA COLORACION DE GRAM

BIBLIOGRAFIA

Islam A., Chen D., White R., Weatherley A. 2008. Chemical decomposition and fixation of nitrite in acidic pasture soils and implications for
measuremen of nitrificaction. Soil Biology and Biochemistry. 40:262-265
Mac Faddin, J. 2003. Pruebas bioquímicas para la Identificación de Bacterias de Importancia clínica. Editorial Mérica Panamericana. Tercera
edición. Capítulo 30 Pág 326 – 338.
Martínez M., Pedroza A., Gutiérrez V. 2010. Métodos Microbiológicos, Físicos y Químicos con aplicación ambiental. Capítulo IV. Pág 59-61
Merck, 2000. <http:www.merck.com>. Fecha de consulta: Febrero 17 de 2014.
Reactivos, 2003. <http:infoleg.mecan.gov.ar/txtnormalatto.htm>. Fecha de consulta: Febrero 17 de 2014.
Stevenson F., & Cole M. 1999. Cycles of soil: carbon, Nitrogen, Phosporus, Sulfur, Micronutrients. Jhon Wiley & Sons Inc. United States of
America.
Sylvia D., Fuhrmann J., Hartel P., Zuberer D. 2005. Principles and applications os Soil Microbiology. Prentice may. United.

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