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alimentos
Artículo
Control innovador de las biopelículas en superficies de acero
inoxidable utilizando agua electrolizada en la industria
láctea
Rodrigo Jiménez-Pichardo 1 , Iriana Hernández-Martínez 2, Carlos Regalado-González 2 , José Santos-Cruz 2 ,
Yunny Meas-Vong 3, María del Carmen Wacher-Rodarte 4, Julián Carrillo-Reyes 5, Irais Sánchez-Ortega 6
y Blanca Estela García-Almendárez 2,*
comprobar ror
Actualiza
Cita: Jiménez-Pichardo, R.;
Herná ndez-Martínez, I.;
Regalado-González, C.; Santos-Cruz, J.;
Meas-Vong, Y.; Wacher-Rodarte, M.d.C.;
Carrillo-Reyes, J.; Sá nchez-Ortega, I.;
García-Almendárez, B.E. Control
innovador de biopelículas en
superficies de acero inoxidable
mediante agua electrolizada en la
industria lá ctea. Alimentos 2021, 10,
103. https://doi.org/10.3390/
alimentos10010103
Recibido: 17 de diciembre de 2020
Aceptado: 31 de diciembre de 2020
Publicado: 6 de enero de 2021
Nota del editor: MDPI se mantiene
neutral con respecto a las cláusulas
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Copyright: © 2021 por los autores.
Li- censee MDPI, Basilea, Suiza. Este
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Creative Commons At- tribution (CC
BY) (https://
creativecommons.org/licenses/by/
4.0/).
1Universidad Tecnoló gica de Mineral de la Reforma, Camino Providencia-La Calera 1000, Colonia Paseos
de Chavarría, Mineral de Reforma, Hidalgo 42186, México; rodrigo.jimenez@utmir.edu.mx
2DIPA, PROPAC, Facultad de Química, Universidad Autó noma de Queré taro. C.U., Cerro de las Campanas
Col. Las Campanas s/n, Queré taro Qro. 76010, Mé xico; irianahm@live.com.mx (I.H.-M.);
regcarlos@gmail.com (C.R.-G.); jsantos@uaq.edu.mx (J.S.-C.)
3Centro
de Investigació n y Desarrollo en Electroquímica, CIDETEQ, Parque Tecnoló gico Queré taro
Sanfandila, Pedro Escobedo, Queré taro 76703, Mé xico; yunnymeas@cideteq.mx
4Departamento de Alimentos y Biotecnología, Facultad de Química, Universidad Nacional Autó noma de Mé xico,
Av. Universidad 3000, Circuito Exterior s/n, Delegació n Coyoacá n CDMX 04510, Mé xico;
wacher@unam.mx
5Unidad Académica Juriquilla, Instituto de Ingeniería, Universidad Nacional Autó noma de Mé xico, Blvd. Juriquilla
3001, Juriquilla, Queré taro 76230, Mé xico; JCarrilloR@ii.unam.mx
6Instituto de Ciencias Bá sicas e Ingeniería, Universidad Autó noma del Estado de Hidalgo, Ciudad del Conocimiento,
Carr. Pachuca-Tulancingo Km 4.5, Col. Carboneras, Mineral de la Reforma Hidalgo 42184, Mé xico;
irais_sanchez5498@uaeh.edu.mx
*Correspondencia: blancag31@gmail.com; Tel: +52-442-1921307
Resumen: Las biopelículas en las superficies en contacto con los alimentos pueden provocar una
contaminació n recurrente. Este trabajo tuvo como objetivo estudiar el proceso de formació n de
biofilms en placas de acero inoxidable utilizadas en la industria lá ctea: 304 acabado superficial 2B
y electropulido; y el efecto de un proceso de limpieza y desinfecció n mediante agua electrolizada
alcalina (AEW) y neutra (NEW). El ensuciamiento de la leche durante el tratamiento térmico puede
dar lugar a depó sitos de tipo A o B, cuya composició n, energía superficial, grosor y rugosidad se
analizaron, mientras que se investigó el papel de la microbiota de la leche cruda en el desarrollo de la
biopelícula. Se detectaron bacterias, levaduras y bacterias lá cticas utilizando las sondas EUB-338,
PF2 y Str-493, respectivamente, mientras que la sonda Lis-637 detectó Listeria sp. La complejidad
genética y la diversidad de las biopelículas variaron segú n el día de maduració n de la biopelícula,
segú n se evaluó mediante la secuencia del gen 16S rRNA, la electroforesis en gel de gradiente
desnaturalizante y la microscopía de hibridació n in situ por fluorescencia. A partir del aná lisis de
los diseñ os experimentales, una etapa de limpieza con 50 mg/L de NaOH de AEW a 30 ◦C durante
10 min, seguida de una desinfecció n con 50 mg/L de cloro total disponible de NEW a 20 ◦C
durante 5 min es un proceso alternativo sostenible para prevenir la formació n de biopelículas. Se
utilizó la microscopía de fluorescencia para visualizar la eficacia de este proceso.
Palabras clave: biopelículas; agua electrolizada; acero inoxidable
1. Introducción
Los componentes de la leche -principalmente proteínas, grasas, minerales e hidratos de
carbono- sufren cambios estructurales durante el tratamiento té rmico en la industria
lá ctea. El ensuciamiento de la leche durante el tratamiento té rmico puede clasificarse en
depó sitos de tipo A (proteína) que tienen lugar a temperaturas entre 75 y 110 ◦C, y de
tipo B (mineral) a temperaturas superiores a 110 ◦C [1]. El biofouling implica la formació n
de biofilms en superficies que han sido acondicionadas con depó sitos. Las biopelículas
en las superficies que entran en contacto con los alimentos pueden acarrear graves
problemas para la industria, como la reducció n de la eficacia del intercambio de calor, la
reducció n del diá metro de las tuberías, el aumento de la presió n interna, la energía
necesaria para el procesamiento, la retenció n de olores, la corrosió n de la superficie y la
contaminació n La interacció n de las biomolé culas de la leche y con la superficie, que da lugar a los
recurrente [2]. depó sitos, puede verse afectada por características superficiales como la composició n
química, la rugosidad y

Alimentos 2021, 10, 103. https://doi.org/10.3390/foods10010103 https://www.mdpi.com/journal/foods

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energía libre de la superficie, entre otros [3,4]. La presencia de depó sitos puede favorecer la
adhesió n de microorganismos y la posible formació n de estructuras resistentes como las
biopelículas. Las biopelículas son formas genéticamente diferenciadas de bacterias
adheridas a la superficie mediante la síntesis de sustancias polimé ricas extracelulares
(EPS), que proporcionan una mayor resistencia contra los agentes de limpieza y
desinfecció n. Esta matriz tridimensional protege a la comunidad contra los agentes
antimicrobianos, las condiciones ambientales adversas, como la sequía, y las altas
temperaturas o la alta presió n, y puede servir como fuente de nutrientes bacterianos
[5-7].
La microbiota de la leche cruda puede ser muy compleja y comprende bacterias
lá cticas, bacterias deteriorantes y pató genas, y levaduras y mohos, y en condiciones
adecuadas pueden desarrollar biofilms mixtos. El aná lisis de las biopelículas mixtas
requiere la identificació n y la abundancia relativa de las diferentes especies dentro de la
comunidad. Este proceso puede ser complicado, ya que aproximadamente el 99,9% de los
microorganismos incrustados en las biopelículas no son cultivables [8,9]. Este problema
puede superarse utilizando herramientas moleculares como la secuencia del gen 16S
rRNA para las bacterias y el gen 23S rRNA para las levaduras. La electroforesis en gel de
gradiente desnaturalizante (DGGE) utiliza productos amplificados de la reacció n en
cadena de la polimerasa (PCR) que pueden extraerse del gel y utilizarse para la
secuenciació n. Ademá s, la microscopía de hibridació n fluorescente in situ (FISH) es una
té cnica de imagen utilizada para estudiar la composició n, el crecimiento y el desarrollo
de los microorganismos en las biopelículas [10,11].
En la industria alimentaria, la limpieza de tuberías y equipos de producció n puede
realizarse mediante el proceso de limpieza in situ (CIP). É ste implica el uso secuencial
de hidró xido de sodio (NaOH) y á cido nítrico (HNO3) empleando diferentes etapas de
lavado, y la aplicació n de desinfectantes; sin embargo, estos productos químicos son
perjudiciales para el medio ambiente. El agua electrolizada neutra (NEW) está ganando
importancia en la industria alimentaria debido principalmente a su eficaz actividad
antimicrobiana, su cará cter no corrosivo, sus propiedades respetuosas con el medio
ambiente, su producció n in situ y su manipulació n segura [12,13]. El NEW se obtiene a
partir de un proceso electrolítico que genera especies mixtas con alta capacidad
antimicrobiana, como el á cido hipocloroso
(HClO), iones de hipoclorito (ClO-), dió xido de cloro (ClO2) y ozono (O3). Durante la
elec-
En la electró lisis, se producen dos tipos de agua, el agua electrolizada á cida (AcEW) y el agua
electrolizada alcalina (AEW). La fracció n á cida se produce en el ánodo y tiene un pH de 2,3-
2,7, potencial de oxidació n-reducció n (ORP) >1000 mV, mientras que el AEW se produce en
el cá todo con un pH de 10-11,5, y un ORP bajo de 800 a 900 mV [14,15]. El NEW se obtiene
utilizando una tecnología monocelular, —−presentando un pH cercano a la neutralidad (6,0-
7,0), con la ventaja de evitar la corrosió n del equipo, y un ORP de 750 mV [16,17]. El
equilibrio HClO/ClO- depende del pH, y a pH 6,5 el á cido hipocloroso es la molécula
principal en el sistema NEW.
La Agencia de Protecció n Medioambiental (EPA, EE.UU.) permite hasta 200 ppm de
á cido hipocloroso como desinfectante de las superficies en contacto con los alimentos,
el equipo de procesamiento de productos lá cteos y el equipo de procesamiento de
alimentos [18]. Se ha sugerido que el lavado con AEW y AcEW puede producir una mejor
desinfecció n que el uso de soluciones de hipoclorito para la carne, los productos frescos o
los utensilios utilizados en el procesamiento de alimentos [19]. Un informe afirma que
el coste de la limpieza en el lugar (CIP) utilizando agua electrolizada es un 25% menor
que el sistema CIP convencional [20]. Se ha informado del uso eficaz de NEW contra las
células libres de L. monocytogenes y en las biopelículas [21]. Este estudio demostró que
los depó sitos tipo A y tipo B de leche cruda sobre placas de acero inoxidable 304
acabado 2B (SSP) y electropulido (ELP), mostraban una composició n diferente dando
lugar a superficies má s hidrofílicas. La rugosidad media de cualquier tipo de depó sito en
ambas placas de acero inoxidable era mayor que sin depó sitos y permitía el desarrollo
del biofilm. Las té cnicas moleculares permitieron estudiar la diversidad y complejidad
de la població n del biofilm, que variaba con la maduració n del mismo. La diversidad
bacteriana de las biopelículas cambió con el tiempo los gé neros má s predominantes en
funció n del tipo de depó sitos sobre la SSP. A partir de los diseñ os experimentales, se
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propone un proceso alternativo sostenible para prevenir la formació n de biofilms utilizando
una etapa de limpieza con AEW, seguida de desinfecció n con NEW, sin etapas de
enjuague.
El objetivo de este trabajo fue estudiar el proceso de formació n de biopelículas en
superficies de acero inoxidable utilizadas en la industria lá ctea, y el efecto de un
proceso de limpieza y desinfecció n con alcalinos y NEW.
2. Materiales y métodos
2.1. Suministros
Se utilizó leche cruda de una granja local (Querétaro, México) para favorecer la
adhesió n de la microbiota asociada así como la formació n de biopelículas. El agua
electrolizada comercial fue un regalo de RusEco (Ciudad de Mé xico, Mé xico), AEW
(Limmy) contenía 340-355 mg de NaOH/L activado, pH 11,9-12 y potencial redox de
750 a 770 mV; NEW (Desy) contenía 230-245 ppm de cloro —− total disponible (TAC), pH
6,7-7,0, y potencial redox de 800-900 mV, ambas muestras se almacenaron bajo
refrigeració n (4 ◦C) en contenedores
× oscuros. Las placas de acero inoxidable 304 (2,5 2,5
cm) acabado superficial 2B (SSP), y electropulido (ELP) se obtuvieron de un proveedor
local (Queré taro, México). La albú mina de suero bovino, el cloruro de sodio (NaCl), el
á cido fosfó rico, el hidró xido de sodio, el etilenglicol y el glicerol se compraron a Sigma-
Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.). El agar para recuento de placas, el agar nutritivo (NA) y
el agar papa dextrosa (PDA) se adquirieron de Bioxon (Cuatitlá n, Mé xico), mientras que
el agar de Man, Rogosa y Sharpe (MRS) y el agar selectivo Oxford eran de Oxoid
(Basingstoke, Inglaterra). La Taq ADN polimerasa, el Tris y la agarosa se compraron a
Invitrogen (Carlsbad, CA, EE.UU.). El kit Live/Dead BacLight era de Molecular Probes
(OR, EE.UU.), mientras que las sondas EUB 338, Strc-493, PF2 y Lis-637 se obtuvieron de
probeBase [22].

2.2. Preparación de placas de acero inoxidable

Las placas SSP y ELP se lavaron siguiendo tres pasos: (1) Inmersió n en detergente
neutro (Hyclin-plus, Hycel, Ciudad de México, México) a 65 ◦C, durante 5 min, (2) Aclarado
con agua destilada en las mismas condiciones, y (3) Aclarado con agua destilada a
temperatura ambiente durante 5 min. Luego, las placas se esterilizaron por calor seco a 180
◦C
durante 2 h [23], y se colocaron en un desecador hasta peso constante.

2.2.1. Depó sitos tipo A y B

Todas las placas se sumergieron en 100 mL de leche cruda, y se calentaron a
◦C
70 durante 15 min en un bañ o de agua constante (Shel-lab, VWR International,
Cornelius, OR, USA), para promover la desnaturalizació n de las proteínas y la adhesió n a
la superficie. Para los depó sitos de tipo A se aumentó la temperatura a 90 ◦C, y se mantuvo
durante 30 min; los depó sitos de tipo B se obtuvieron aumentando la temperatura a 121 ◦C
durante 5 min, utilizando un bañ o de aceite. A continuació n, las placas se colocaron en
un desecador y se registró la diferencia de peso [24,25].

2.2.2. Aná lisis de proteínas y minerales de los depó sitos

Las proteínas y los minerales se determinaron en ELP y SSP con depó sitos de tipo A y B
[26]. Las placas se lavaron con 10 mL de á cido fosfó rico al 1% (v/v) a 50 ◦C durante 30
min, seguido de un lavado con 10 mL de NaOH al 1% (p/v) en las mismas condiciones. Las
soluciones de lavado se mezclaron y a continuació n se procedió a la determinació n de las
cenizas totales (AOAC, 2005), y del contenido proteico utilizando la albú mina de suero
bovino (BSA) como está ndar [27].

2.2.3. Determinació n del á ngulo de contacto y de la energía superficial libre (FSE)

El á ngulo de contacto se determinó utilizando tres líquidos de referencia (agua
desionizada, etilenglicol y glicerol), ademá s de la leche cruda. Se colocó una gota (7 µL)
de cada líquido sobre la superficie de la placa, previamente limpiada y desengrasada,
utilizando un analizador en forma de gota (Mod. DSA30, Krü ss, Alemania), y el software
DSA4 (Krü ss, V1.1-02). La energía libre superficial de las placas SSP y ELP con y sin
depó sitos se evaluó ajustando los datos al modelo de Owens-Wendt-Rabel-Kaelble
(OWRK) [28,29]. Segú n estos autores, la FSE de un determinado material puede
calcularse utilizando los componentes individuales de la tensió n superficial de las
entidades que interactú an, segú n la ecuació n de Young (1):

γs - γSL = γLV cos θ(1)

donde γS es la tensió n superficial, γSL es la tensió n interfacial só lido-líquido, γLV es la
tensió n interfacial líquido-vapor y θ es el á ngulo de contacto del líquido. La tensió n
superficial y la FSE pueden dividirse en fuerzas de dispersió n o de Van der Waals e
interacciones polares (dipolo-dipolo y enlaces de hidró geno, entre otras). Esta interacció n
puede expresarse como la ecuació n (2):

γT = γD + γP (2)

donde γT es la FSE total, γD es la tensió n superficial de la fase dispersa y γP es la

tensió n superficial de la fase polar. El modelo OWRK es una ecuació n lineal en la que la
pendiente y la ordenada vienen dadas por la raíz cuadrada de las fases polar y dispersa
que componen el FSE, respectivamente [30] (ecuació n (3)):
s γPq
q P D
γLV (1 + cos θ) (3)
2q γ
γ L
=γs V +γs
D D
L LV
V
2.2.4. Rugosidad y espesor de los depó sitos
La rugosidad a nivel micromé trico de las placas SSP o ELP con y sin depó sitos se
determinó a lo largo de una línea en la superficie (~2 cm) utilizando un perfiló metro (Veeco
Dektak 6M, San Diego, CA, USA) y un software (Dektak, V.8.30.005). Para la medició n de
espesores se calibró el voladizo del equipo para hacer un recorrido de alrededor de 1
cm, dejando el espesor de los depó sitos en la mitad de esta distancia. Las mediciones se
realizaron en la zona má s estable de la parcela.

2.2.5. Aná lisis elemental y espectroscopia Raman

Se realizaron aná lisis elementales para complementar la informació n obtenida de
los aná lisis de proteínas y minerales. Este aná lisis se realizó en un espectró metro de
fluorescencia de rayos X secuencial (Lab Center XRF-1800, Shimadzu, Japó n). Los
elementos analizados fueron el níquel (Ni), el cromo (Cr) y el hierro (Fe) como principales
componentes del acero; el carbono (C), el oxígeno (O) y el nitró geno (N) como componentes
de las proteínas de la leche, mientras que el fó sforo (P) y el calcio (Ca) como componentes
de los minerales de la leche.
La espectroscopia Raman puede identificar el tipo de interacciones de los grupos
funcionales de las biomoléculas en la superficie de las placas. Estas interacciones pueden
ser de tipo van der Waals, polares, y enlaces de hidró geno, entre otras que favorecen la
atracció n o repulsió n de molé culas o cé lulas [31]. El aná lisis espectroscó pico en SSP y
ELP con y sin depó sitos de tipo A o B, se realizó utilizando un espectró metro Raman
(DXR780, Thermo Fisher Scientific, Waltham,
MA, EE.UU.) acoplado a un lá ser de 14 mV a 780 ± 0,2 nm. La apertura era de 50 µm, y el
rango de longitudes de onda era de 3000 cm-1 a 100 cm-1. El aná lisis de los espectros se
llevó a cabo utilizando el
Software OMNIC™ Specta (v. 1.0.1591, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA).

2.3. Análisis del agua electrolizada

La determinació n de TAC en NEW (pH 6,5) se llevó a cabo utilizando la N, N- dietil-
p-fenilendiamina, usando un colorímetro de mano (Hanna Instruments, Smithfield, RI,
USA), la concentració n se expresó en mg TAC/L.
La determinació n del NaOH (mg/L) en el AEW se realizó por titulació n con HCl 0,1
N, utilizando fenolftaleína al 1% como indicador.
El potencial de oxidació n-reducció n (ORP) se determinó utilizando un potenció metro
Orion Star (A211, Thermo Fisher Scientific, Marietta, OH, USA) equipado con un electrodo de
Ag/AgCl (Orion, Thermo Scientific).

2.4. Formación de biopelículas

Para la formació n de la biopelícula, se colocaron placas estériles en un recipiente
sellado a una humedad relativa >90%, bajo condiciones asépticas en una cabina de flujo
laminar (Thermo Fisher Scientific, Marietta, OH, EE.UU.). Cada placa se inoculó con 100 µl
de leche cruda, se colocó asépticamente en el recipiente y se incubó a 37 ◦C (Felisa FE-
132AD, Jalisco, México) durante 5 d. Cada
La placa se lavó diariamente con 10 mL de tampó n fosfato 50 mM, pH 7 para eliminar
las cé lulas no adheridas. Tras el lavado, las placas se inocularon con el mismo volumen
de leche para favorecer la maduració n del biofilm, y se devolvieron al mismo recipiente.
La recuperació n de las cé lulas adheridas a la superficie se realizó el quinto día. Las
placas se introdujeron en un tubo có nico de 50 mL con 10 mL del tampó n de fosfato, y
se mezclaron mediante vó rtex (Daigger Scientific, Hamilton, NJ, EE.UU.) durante 2,5
minutos a má xima velocidad. Se realizaron diluciones decimales en serie de la
suspensió n microbiana en NaCl al 0,85% (p/v) y se inocularon en diferentes medios de
cultivo utilizando el método de la placa de vertido. La població n aeró bica mesó fila se
determinó incubando en agar de recuento en placa a 30 ◦C durante 24-48 h, mientras
que las bacterias lá cticas (BL) se determinaron utilizando agar MRS a 37 ◦C, durante 48
h. La població n de levaduras y mohos se realizó utilizando PDA a 30 ◦C, durante 72 h,
mientras que Listeria sp. se enumeró utilizando el agar selectivo Oxford a 37 ◦C durante
24 h [32].

Viabilidad celular de las biopelículas

Las placas SSP y ELP con depó sitos de tipo A o B en los que se desarrollaron
biopelículas, se analizaron en busca de bacterias viables utilizando el kit de viabilidad
bacteriana Live/Dead Baclight. Este kit se compone de una mezcla de dos fluorocromos,
SYTO 9 (6 µM) y yoduro de propidio (PI, 30 µM), ambos fluorocromos se mezclaron 1:1
(v/v) hasta alcanzar 100 µL, y se utilizaron para cubrir las placas el quinto día de la
formació n de las biopelículas, y se dejaron reposar durante 15 min en la oscuridad.
Cuando se expone a la longitud de onda de excitació n de 480/500 nm, la emisió n que
muestra el color verde fluorescente se atribuye a las membranas celulares intactas,
mientras que el color rojo fluorescente se asocia a las membranas celulares dañ adas [33].
Se utilizaron placas sin biopelículas como control, seguido de la observació n bajo un
microscopio de fluorescencia (Zeiss, Axioskop 40, filtro FICT, Gö ttingen, Alemania),
equipado con una cá mara (Axio CamMRc, Zeiss), y el software de imagen digital Zeiss
ZEN pro 2012 (v. 1.1.2.0.).

2.5. Estudios moleculares de las biopelículas

2.5.1. Microscopía de hibridació n in situ fluorescente (FISH)
Una vez establecidas las biopelículas en las placas, se lavaron dos veces con
tampó n fosfato 50 mM, pH 7,2, y se fijaron sumergiendo las placas en so- lució n de
formaldehído al 3,7% a 4 ◦C, durante 12 h. Las cé lulas se deshidrataron con sucesivas
inmersiones en diferentes concentraciones de etanol (50, 80 y 95% v/v) durante 3 min
cada una.
Las sondas utilizadas fueron EUB 338 [34], Strc-493 [35], PF2 [36] y Lis-637 [37]
(Tabla 1). Se preparó una dilució n 1:8 (v/v) de cada sonda por separado en tampó n de
hibridació n (0,9 M NaCl, 0,1 M Tris [pH 7,2], 0,1% (p/v) de dodecil sulfato de sodio (SDS), y
se incubó durante 2 h a 46 ◦C. Despué s de la hibridació n, las placas se lavaron con una
solució n Oether (4 M NaCl, 0,1 M Tris [pH 8,0], 0,5 M EDTA, 10% [p/v] SDS) a 46 ◦C; las
placas se secaron con papel secante y se colocaron en el microscopio de fluorescencia
(Zeiss), filtro FICT, a una longitud de onda de 530 nm [38].

Tabla 1. Características de las sondas utilizadas para la microscopía FISH.

ProbeEUB338PF2Strc-493Lis-637
Especificidad90% de las bacteriasTodas Listeria spp, excepto
spp.
las levadurasStreptococcus L. grayi
Lactococcus spp.
Objetivo Gen16S rRNA18S rRNA16S rRNA
Posició n338-355618-636493-511 637–657

Secuencia 5′- GCT GCC 5′- CTC TGG 5′- GTT AGC 5′- CAC TCC AGT
TCC CGT AGG CTT CAC CCT CGT CCC TTT CTT CCA GTT
AGT -3′ ATT C -3′ CTG G -3′ TCC-3′
Fluoró foroFluoresceínaRojo de TexasCy3Fluoresceína
2.5.2. Extracció n de ADN y electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE)
En este estudio, se utilizaron ú nicamente placas SSP, con dimensiones de 10 cm x 10
cm que presentaban depó sitos de tipo A o B, ademá s de biofilms formados a 1, 3 y 5 días. El
ADN se extrajo de cada placa utilizando el kit de aislamiento de ADN del suelo (Mo Bio
Laboratories, Carlbad, CA,
 USA) siguiendo el protocolo del fabricante, con modificaciones. La calidad y la
concentració n del ADN se midieron con el espectrofotó metro nanoDrop 1000 (Thermo
Fisher Scientific, Marietta, OH, EE.UU.), mientras que la integridad se observó utilizando
un gel de agarosa al 1% (p/v). La amplificació n del ADNr 16S bacteriano se llevó a cabo
mediante una PCR anidada utilizando la ADN polimerasa Taq. Los cebadores utilizados en
la primera ronda fueron 27F (5′-GTTGATCCTGCTCAG-3′) y 1492R (5′-
ACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′), las condiciones de reacció n fueron: 94 ◦C durante
3 min; 35 ciclos de 94 ◦C durante 60 s, 45◦C durante 60 s, 72 ◦C durante 1 min, y
finalmente 72 ◦C durante 10 min. Los cebadores de la segunda ronda fueron 357F-GC
(5′GC-clamp-CCTACGGAGGCAG-3′) y 907R (5′-CCGTCAATTCMTTTGAGTTT-3′), las
condiciones de PCR de toque fueron 96 ◦C durante 4 min; 10 ciclos de 94 ◦C durante 30
s, 61 ◦C durante 1 min, disminuyendo 1 ◦C por cada ciclo de recocido hasta 56 ◦C, y
luego 72 ◦C durante 1 min; má s 20 ciclos a temperatura de recocido constante de 56
◦C
, y finalmente 72 ◦C durante 7 min [39]. Para obtener una concentració n suficiente de
amplicones se mezcló todo el ADN y se purificó utilizando el kit de limpieza de gel y PCR
Wizard® SV (Promega,
Madison, WI, USA), eluyendo el ADN purificado en 35 µl de agua libre de nucleasas.
La DGGE se realizó con el sistema universal de detecció n de mutaciones DCode (Bio-
Rad,
Hercules, CA, USA). Los productos de la PCR se separaron en geles de poliacrilamida al
8% (1 mm de espesor) en tampó n TAE 0,5X con un gradiente de desnaturalizació n lineal
(urea-formamida) del 30% al 60% (p/v). La electroforesis se realizó a 60 ◦C, 70 V, durante 16
h. Las bandas de DGGE se revelaron con AgNO3 [39]. Las bandas del gel se
digitalizaron (sistema GelDoc Imaging, Bio-Rad) y se analizaron con el software
Quantity One (Bio-Rad), generando una matriz con la intensidad de cada banda
detectada. Se calcularon los índices de Shannon-Wiener (H′) y de Equitabilidad (J′) para
obtener la intensidad relativa de cada banda [40] (ecuaciones (4) y (5)):

H′ = − i=n
∑ pi ln pi (4)
i=1

donde pi es la proporció n de la intensidad de la banda i con respecto a la intensidad total

de las bandas. Este índice abarca desde 1 cuando todas las especies está n igualmente
representadas, hasta 0 cuando hay una especie dominante.
J′ =H′
(5)
Hm′
ax

donde H′max = ln S; S = nú mero de bandas de gel

El aná lisis se calculó con el software R, utilizando los paquetes "vegan" y
"cluster". Cada banda se extirpó del gel y el ADN se eluyó en 35 µL de agua
-
desionizada, y luego se aplicó un proceso de congelació n-descongelació n ( 20 ◦C durante
2 h, y luego calentamiento a −
60 ◦C durante 30 min, tres veces) antes de almacenar a 4 ◦C. El ADN eluido se
reamplificó por PCR utilizando los cebadores 357F sin GC-clamp, y 907R. Los productos
de la PCR se enviaron para su secuenciació n a RTL Genomics (Lubbock, TX, EEUU).

2.6. Proceso de limpieza y desinfección

El proceso completo de limpieza y desinfecció n consistió en tres pasos; enjuague
con tampó n de fosfato (pH 7) despué s de 5 días de maduració n de la biopelícula, luego
limpieza con AEW, y finalmente desinfecció n con NEW, en condiciones está ticas para
simular zonas de bajo flujo en el equipo.
Se utilizó un diseñ o factorial completo de 23 con cuatro puntos centrales (Tabla S1) para
determinar
las mejores condiciones para la etapa de limpieza (utilizando AEW). Sin embargo, la
població n microbiana fue similar para todas las concentraciones de AEW probadas
(Tabla S2), por lo que se realizó una evaluació n adicional empleando un diseñ o
unifactorial utilizando AEW a concentraciones <300 mg/L de NaOH, manteniendo
constante el proceso de desinfecció n final de 200 ppm de NEW, a 20 ◦C durante 5 min.
Ademá s, una vez encontrado el paso de limpieza adecuado se utilizó otro diseñ o
unifactorial, para determinar si concentraciones má s bajas de NEW eran adecuadas para la
desinfecció n. Para todos los tratamientos, la variable de respuesta fue la població n
microbiana por recuento en placa en agar durante 24 h a 30 ◦C.
2.7. Análisis estadístico
Todos los experimentos se realizaron por triplicado y todos los datos se expresaron
± como la media de la desviació n está ndar. Los diseñ os experimentales se analizaron
utilizando el software JMP v.8 (SAS Institute, Charlotte, NC, USA). Los pará metros de
ajuste se compararon mediante el aná lisis de la varianza (ANOVA), y la diferencia
significativa entre los tratamientos se realizó mediante el
Prueba de Tukey con p < 0,05.

3. Resultados y discusión
3.1. Composición de los depósitos
Los depó sitos de tipo A estaban compuestos principalmente por proteínas (50-70%),
± mayoritariamente en los depó sitos de tipo B
mientras que los minerales se encontraban
(72,6 3,3%, p/p). Se observó una composició n similar para el ELP y el SSP, siendo las
proteínas el principal componente de los depó sitos de tipo A, y los minerales de los
depó sitos de tipo B (Tabla 2). Entre las proteínas de la leche, la β-lactoglobulina es la má s
importante para la formació n de depó sitos porque es altamente termolá bil, y cuando se
desnaturaliza puede interactuar con otros componentes de la leche formando
agregados que posteriormente precipitan, y forman depó sitos o interactú an
directamente con la superficie. Las capas posteriores se forman favorecidas por un mayor
nú mero de posibles interacciones de proteínas y minerales agregados [1].

Tabla 2. Composició n de los depó sitos de tipo A y B en las placas de acero inoxidable con acabado
superficial 2B (SSP), y electropulido (ELP).

DepósitosProteína
Minerale
(% p/p) s (% p/p)
Tipo A (SSP) 48,0 ± 3,5 a44,0 ± 6,6 b
Tipo B (SSP) 27,0 ± 3,6 b72,0 ± 3,3 a
Tipo A (ELP) 55,0 ± 4,7 a35,0 ± 3,0 b
Tipo B (ELP) 28,0 ± 1,2 b70,0 ± 1,2 a
Letras diferentes en la misma columna indican una diferencia significativa (p < 0,05).

3.2. Análisis elemental de los depósitos

El aná lisis elemental demostró que no había diferencias significativas en la
composició n de las SSP y ELP con y sin depó sitos, con cerca±±
de 70 1% (p/p) de hierro, 18 1%
(p/p) de cromo,±±8 0,5% (p/p) de níquel y 0,05 0,01% de fó sforo, de acuerdo con la norma
ASTM
Norma A276-06 [41]
Elementos como el manganeso, el azufre y el silicio no fueron detectados por el equipo
utilizado, debido a su muy baja penetració n. Ademá s, la presencia de una capa de ó xido
de cromo en la superficie dificulta la penetració n de los rayos X, lo que explica que no se
detectara el carbono.
Los elementos de las proteínas y los minerales só lo se analizaron en los depó sitos de la
superficie SSP. Los principales elementos que componen las proteínas, es decir, el
carbono, el oxígeno y el nitró geno, no mostraron diferencias significativas (p < 0,05)
entre los depó sitos de tipo A y B, mientras que la concentració n de fó sforo y calcio
reveló un contenido significativamente mayor (p < 0,05) de los depó sitos de tipo B
(Figura 1), debido a su mayor composició n mineral (Tabla 2).
Figura 1. Componentes orgá nicos de las proteínas (C, O, N) y minerales (P, Ca) de los depó sitos tipo A y
B en las placas SSP.

3.3. Caracterización de la superficie de las placas con y sin depósitos

3.3.1. Á ngulo de contacto y FSE
El acero inoxidable puede considerarse una superficie parcialmente hidrofó bica, ya
que los á ngulos de contacto son relativamente altos (>50◦) para todos los líquidos
ensayados (Tabla 3). Estos resultados concuerdan con [1] (p. 30), quien menciona que la
presencia de la capa pasivada en esta superficie reduce la posibilidad de interacciones
polares o electrostá ticas que favorezcan la atracció n molecular. Las placas con depó sitos de
tipo A muestran un á ngulo de contacto relativamente menor que las de tipo B, debido a que
las primeras está n compuestas mayoritariamente por proteínas, que tienen mayor nú mero
de grupos de cadena lateral capaces de interactuar con otras moléculas.

Tabla 3. Á ngulo de contacto de diferentes modelos de líquidos sobre SSP y ELP con y sin depó sitos.

SuperficieAguaEtilenoGlicerolRojo
Glicol Lech
SSP52 ,7 ± 1,1 a59,9 ± 0,6 a66,5 ± 0,6 b48,2 ± 0,9 a
Tipo A24 ,2 ± 0,9 b40,6 ± 1,2 b66,2 ± 1,8 b23,4 ± 1,7 b
Tipo B23 ,1 ± 1,2 b46,2 ± 0,3 b74,2 ± 1,6 a26,1 ± 0,9 b
ELP76 ,2 ± 0,9 a51,0± 0,4 a76,6± 0,4 a67,3 ± 0,5 a
Tipo A25 ,5± 1,8 c42,1± 1,1 b72,2 ± 0,8 b22,6 ± 1,2 c
Tipo B38 ,2 ± 1,2 b47,6± 0,8 b77,7 ± 0,9 a41,9 ± 1,4 b
Las columnas con letras diferentes (a-c), indican diferencias significativas respecto a las placas sin depó sitos (p <
0,05).

El á ngulo de contacto entre un líquido y una superficie permite determinar si el

líquido puede mojar la superficie con la que está en contacto. La superficie será
hidrofílica cuando el ángulo de contacto sea <90◦ lo que representa una mayor interacció n
del líquido con la superficie. Por el contrario, si este valor es >90◦ hay menos interacció n
entre el líquido y la superficie, lo que da lugar a una superficie hidrofó bica.
En resumen, las superficies má s hidró filas fueron las que presentaban depó sitos de
tipo A, seguidas de las que tenían depó sitos de tipo B y, por ú ltimo, las placas sin
depó sitos, para ambos tipos de acero inoxidable (Tabla 3).
Existen diferentes mé todos para determinar la FSE, y es importante no utilizar un
ú nico mé todo para tener suficiente informació n y obtener conclusiones má s fiables. En
este caso, se utilizó la ecuació n de estado, que só lo considera el á ngulo de contacto de
un líquido de tensió n superficial conocida. Por otro lado, el método OWRK utiliza los
á ngulos de contacto obtenidos con líquidos polares y no polares para separar las fases
dispersa y polar de la FSE, donde la parte polar determina la hidrofilia de la superficie, e
influye sobre todo en
la mojabilidad [30]. Los resultados obtenidos con el método OWRK coincidieron con los
determinados a partir de la ecuació n de estado.
Como se esperaba, la energía libre de las placas con tipo A o B fue significativamente
mayor (p < 0,05)
se observó que las placas sin depó sitos (Tabla 4). Estos resultados se atribuyen a la
presencia de biomolé culas y minerales en la superficie de las placas, que aumentan la
hidrofilia debido al mayor nú mero de grupos reactivos que interactú an con otras
molé culas [4]. De acuerdo con la ecuació n de estado, se puede considerar que las placas
con depó sitos adheridos son significativamente (p < 0,05) má s hidrofílicas que las placas
sin depó sitos, y esto puede promover la adhesió n microbiana.

Tabla 4. Energía libre superficial (mN/m) de las placas SSP y ELP, con y sin depó sitos de tipo A o B.

Ecuaci Total Fracci Fracción

Superfi ón de OWRK * ón dispersa
Estado polar
SSP49 ,1 ± 3,6 b55,7 ± 1,6 b1,0 ± 0,1 c54,7 ± 1,5 b
Tipo A62 ,2 ± 5,9 a122 ,5 ± 12,5 a4 ,6 ± 0,6 b117 ,9 ± 11,9 a
Tipo B61 ,9 ± 0,3 a125 ,5 ± 12,9 a12 ,4 ± 0,4 a113 ,1 ± 12,0 a
ELP36 ,7 ± 0,9 c46,4 ± 4,4 c33,7 ± 1,9 a12,7 ± 2,5 c
Tipo A62 ,1 ± 1,5 a153,2 ± 5,2 a18,8 ± 3,4 b134,4 ± 1,8 a
Tipo B54 ,7 ± 2,3 b108,9 ± 3,6 b1,9 ± 0,1 c107,0 ± 3,5 b
OWRK: Owens-Wendt-Rabel-Kaelble. Las columnas con letras diferentes (a-c) indican una diferencia
significativa con respecto a las placas sin depó sitos (p < 0,05).

La diferencia entre los valores de energía libre de SSP y ELP puede deberse a la
composició n de los depó sitos formados en las placas, como se muestra en la Tabla 2. El
autor de la publicació n [42] (p. 246), mencionó que el componente polar de la energía libre
contribuye a aumentar la humectabilidad, lo que indica que los depó sitos de tipo A o B de
SSP tienen un mayor nú mero de grupos orgá nicos para posibles interacciones. Sin embargo,
la fracció n polar de la ELP disminuyó , especialmente para los depó sitos de tipo B, lo que
puede explicarse por la alta composició n mineral y la baja composició n proteica (Tabla 2).
La fracció n dispersa mostró valores significativamente mayores (p < 0,05) para ambos
depó sitos
en SSP y ELP, que se refiere a los grupos capaces de formar interacciones dé biles de van
der Waals. Así, un aumento de esta fracció n indica má s interacciones dipolo inducido-
dipolo, dipolo-dipolo y dipolo inducido-dipolo [43].

3.3.2. Topografía de superficies y AFM

La rugosidad puede describirse mediante pará metros como Ra (altura media
aritmética), Rms (rugosidad media cuadrá tica) y Rt (diferencia entre el pico má s alto y el
valle má s profundo, a travé s del á rea de exploració n), entre otros. La rugosidad media
(Ra) de las SSP con depó sitos de tipo A o B fue significativamente mayor (p < 0,05) que
la de las placas±sin depó sitos (30,7 0,06 µm). Del mismo modo, la rugosidad de ELP para
ambos tipos de depó sitos fue mayor que ± la de las placas sin depó sitos (0,11 0,01 nm)
(Tabla 5). Como era de esperar, el valor Ra de ELP fue 279 veces menor que el de SSP. Por
otra parte, es evidente que el grosor de cualquier tipo de depó sitos en las ELP altamente
lisas era mucho má s fino que el de las SSP (Tabla 5). La rugosidad de la superficie
representa un aumento de la superficie disponible y puede promover la adhesió n de
macromoléculas y microbios, ademá s de proporcionar protecció n contra el cizallamiento
[44]. Un estudio ha informado de una correlació n positiva entre la adhesió n y la rugosidad
de la superficie [45], mientras que otros informes afirman que no existe tal correlació n
[46,47].
Tabla 5. Rugosidad superficial de las placas SSP y ELP con y sin depó sitos de tipo A y B.

Superficie Ra (nm) Rms (nm) Espesor (nm)

SSP 30.70 ± 0.06 c 41.30 ± 0.01 c ND
Tipo A 63,10 ± 0,08 a84,60 ± 0,02 a 100,50 ± 0,01 a
Tipo B 42.20 ± 0.20 b 56.10 ± 0.6 b 80,50 ± 0,03 b
ELP 0.11 ± 0.01 c 0.15 ± 0.02 c ND 14,83
Tipo A 13,15 ± 0,15 a16,83 ± 0,13 a ± 2,17 a
Tipo B 4.03 ± 0.13 b 5.26 ± 0.21 b 8.66 ± 1.64 b
Ra: rugosidad media aritmé tica. Rms: rugosidad media cuadrá tica. Letras diferentes (a-c) en la misma
columna para cada placa indican una diferencia significativa (p < 0,05).

El aspecto de los depó sitos de tipo A en la SSP era blanco, blando y esponjoso debido a
la agregació n de proteínas desnaturalizadas y a la formació n de gel, al que pueden
difundirse los minerales de la leche y otros componentes (Figura 2A), y coincide con otros
informes [31,48]. Las SSP con depó sitos de tipo B muestran una baja concentració n de
só lidos, que segú n la Tabla 2 se atribuyó a la composició n mineral predominante, Figura 2B.
La topografía de cualquier superficie puede ser representada por series de picos y valles
que varían en perfil y uniformidad que se visualizan para las SSP con depó sitos de tipo A y B
en la Figura 2a,b, mientras que la Figura 2c muestra las SSP sin depó sitos.

Figura 2. Aspecto de las SSP con depó sitos tipo (A) (panel A), y tipo (B) (panel B). Micrografías
de AFM de las placas SSP: (a) depó sitos de tipo A; (b) depó sitos de tipo B; (c) SSP sin depó sitos.

3.3.3. Espectroscopia Raman de depó sitos

El aná lisis de los espectros Raman de los depó sitos de leche en la superficie de las
placas se realizó comparando los picos indicados por [49]. Los picos por debajo de 3000 cm-
1 coinciden con los mostrados por las proteínas, los á cidos grasos y la lactosa. Los picos a
2900 cm-1 y 1450 cm-1 corresponden a la caseína, mientras que el pico a 1350 cm-1
corresponde a los á cidos grasos observados en ambos tipos de depó sitos de SSP y ELP
(Figura 3a,b).
Figura 3. Espectros Raman obtenidos del aná lisis del SSP (a), y del ELP (b) con depó sitos tipo A (línea
azul) o tipo B (línea roja).

Las señ ales estrechas a 1100 cm-1 corresponden a los enlaces C-C, C-O y C-CH3 de
la lactosa, que só lo se observaron en ambos tipos de depó sitos de SSP (Figura 3a).
Las señ ales visibles en los 1000 cm-1, 560 cm-1 y 420 cm-1 corresponden al calcio
fosfato [50] (p. 917), y [51] (p. 12226); pero só lo se observó la señ al a 560 cm-1 para el
depó sito de tipo B en SSP, lo que se atribuyó a la alta concentració n mineral de este
depó sito (Figura 3a). La señ al de calcio (200 cm-1) fue mayor para el depó sito de tipo B en
SSP que para cualquiera de los depó sitos en ELP (Figura 3a,b).
Los espectros Raman obtenidos para los depó sitos de tipo A (línea roja) y de tipo B
(línea azul) sobre ELP se muestran en la figura 3b. Los espectros de ambos tipos de
depó sitos sobre SSP y ELP eran similares. Sin embargo, ambos tipos de depó sitos sobre ELP
mostraron un ruido menor que produjo picos má s definidos, debido a la menor
concentració n de materia orgá nica que conduce a una baja interferencia [52].

3.4. Biofilms
3.4.1. Formació n de biofilms en SSP y ELP
Las biopelículas de la microbiota de la leche se desarrollaron en depó sitos de tipo
A y B de SSP y ELP. La població n microbiana recuperada de las placas que mostraban el
depó sito de tipo A fue mayor para cualquiera de los tres medios de cultivo probados
(NA, MRS y PDA) que las placas con depó sitos de tipo B o sin depó sitos (Figura 4a,b). Las
BAL (cultivadas en MRS) y las levaduras (cultivadas en PDA) alcanzaron una mayor
població n en SSP que en ELP. Este efecto puede asociarse a las características
superficiales de las placas de acero, el ELP tiene una superficie má s suave, pero tras la
formació n de depó sitos la rugosidad aumentó má s de 30 veces para cualquier tipo de
depó sito, y se volvió má s hidrofílica, lo que puede haber favorecido la adhesió n
microbiana.
Figura 4. Població n microbiana recuperada a partir de biopelículas de 5 días formadas en la
superficie de SSP liso y con depó sitos de tipo A o B (a), y ELP liso y con depó sitos de tipo A o B
(b). NA = agar nutritivo, MRS = agar de Man Rogosa Sharpe, PDA = agar papa dextrosa.

3.4.2. Viabilidad de las cé lulas dentro de las biopelículas

La transición de la adhesió n reversible a la irreversible de los microorganismos en las
biopelículas está relacionada con la síntesis de sustancias poliméricas extracelulares que no só lo
ayudan en el proceso de adhesió n sino que también protegen a las células de las
fluctuaciones ambientales [53,54]. Esto conduce a la formació n de microcolonias, que se
unen para formar una biopelícula madura. Las micrografías de biofilms sobre SSP con
depó sitos de tipo A muestran má s fluorescencia verde (Figura 5a,b) que los depó sitos de
tipo B (Figura 5c,d), lo que indica un mayor nú mero de células viables en el biofilm maduro
[55]. Esto puede estar asociado a una mayor superficie y a una mayor concentració n de
proteínas que pueden soportar el crecimiento microbiano durante má s tiempo. En
relació n con el ELP con depó sitos de tipo A, las células viables se visualizaron como
pequeñ os grupos de células dañ adas dispersas por la superficie de la placa, lo que sugiere
una pérdida de viabilidad debido al entorno con nutrientes agotados (Figura 5e,f).
La morfología de la matriz de la biopelícula puede visualizarse mediante la
intensidad de la fluorescencia mostrada en la Figura 5 (panel b, panel d y panel f), lo
que indica que hay má s cé lulas dañ adas en la capa externa de la biopelícula. Las
bacterias pueden abandonar la biopelícula utilizando al menos tres vías: desorció n,
desprendimiento y dispersió n. Los dos primeros mecanismos son una liberació n pasiva
de las cé lulas, mientras que la dispersió n es un cambio fenotípico activo que les permite
abandonar el biofilm. Las cé lulas perciben señ ales que se transducen a través de redes
reguladoras que facilitan la liberació n celular, que puede ser nativa o ambiental [56]. Los
microorganismos de las biopelículas maduras pueden desprenderse debido, entre otros,
a factores de perturbació n, lo que conduce a una contaminació n recurrente del entorno
alimentario [6].
Figura 5. Micrografías de SSP con biofilms en depó sitos de tipo A (a,b) y de tipo B (c,d); ELP con
biofilms en depó sitos de tipo A (e,f). La fluorescencia verde indica células viables, mientras que la
fluorescencia roja indica células dañ adas. Los paneles (a,c,e) muestran un aumento de 40X; los
paneles (b,d,f) muestran la intensidad de la fluorescencia.

3.4.3. Microscopía de hibridació n fluorescente in situ (FISH)

Esta té cnica de microscopía permite comprender la complejidad de los
microorganismos presentes en las biopelículas. Las bacterias se identificaron con la
sonda EUB338 y mostraron morfologías de cocos y bacilos en las placas SSP con
depó sitos de tipo A (Figura 6a), mientras que en los depó sitos de tipo B se observaron
células dispersas (Figura 6b), lo que coincide con la població n bacteriana indicada en la
Figura 4a.
La forma característica alargada y ovoide de las células de levadura en SSP se observó
como fluorescencia roja utilizando la sonda PF2, rodeada de un material extracelular difuso
para los depó sitos de tipo A (Figura 6c), y de tipo B (Figura 6d). Las BAL son uno de los
grupos má s representativos presentes en la microbiota de la leche, que hibridaron para
ambos tipos de depó sitos con la sonda Strc493 específica para Streptococcus spp. y
Lactococcus spp., mostrando fluorescencia verde (Figura 6e,f). Listeria spp. en ambos tipos
de depó sitos en las placas SSP, representan un peligro potencial para la salud de las
biopelículas en la industria lá ctea, que fue identificado por la sonda Lis-637 (Figura 6g,h).
Figura 6. Micrografías FISH (40X) de placas SSP con biofilms en depó sitos tipo A (paneles a,d,e,g) y B
(paneles b,d,f,h), hibridizadas con las sondas EUB338 (a,b); PF2 (c,d); Strc493 (e,f) y Lis-637 (g,h).

Este hallazgo pone de manifiesto la importancia de llevar a cabo un proceso adecuado

de limpieza y desinfecció n de los equipos y utensilios utilizados en la industria lá ctea, para
prevenir las enfermedades transmitidas por los alimentos que también pueden representar
grandes pérdidas econó micas [57,58]. Entre las cepas listeriales, se ha informado de que L.
monocytogenes es altamente competitiva contra la microflora comú n de la leche [59]. Por lo
tanto, estos resultados muestran la complejidad de las biopelículas que surgen de la
microbiota de la leche.
3.4.4. Electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE)
La biodiversidad gené tica se determinó mediante el aná lisis DGGE de los
productos de PCR del ADN ribosó mico 16S utilizando cebadores específicos para el
dominio bacteriano. La DGGE es una té cnica molecular que se utiliza para estudiar la
biodiversidad microbiana de las biopelículas; las bandas del gel pueden extraerse y
secuenciarse para identificar a los miembros de la comunidad. Tras la purificació n, la
concentració n de ADN era de unos 60 ng/µL, mientras que los valores A260/A280 oscilaban
entre 1,70 y
2,0 para los días 1-5 de los depó sitos de tipo A y B. Los productos de la PCR se
sometieron a DGGE
y se eliminaron todas las bandas (resultados no mostrados). El aná lisis de la secuencia
reveló un consorcio diverso que comprendía hasta 27 géneros que cambiaban segú n el día
de maduració n de la biopelícula en SSP (Figura 7). Se calculó la abundancia relativa de cada
grupo microbiano para obtener el índice de Shannon-Wiener (H') y el índice de equidad (J′)
(Tabla 6). Los valores de H' entre 1 y 3 indican una baja diversidad, mientras que los valores
>3 indican una alta diversidad; ademá s, J′ = 0 indica la dominancia de una o má s especies,
mientras que J′ = 1 indica que todas las especies está n igualmente representadas.

Figura 7. Abundancia relativa de especies en el gel DGGE a diferentes tiempos de maduració n de la

biopelícula y tipo de depó sito en SSP. Depó sitos tipo A en el día 1 (D1A), día 3 (D3A), día 5 (D5A).
Depó sitos tipo B en el día 1 (D1B), día 3 (D3B), día 5 (D5B).

La diversidad bacteriana de las biopelículas en los depó sitos de tipo A disminuyó de los
días 1 a 5 segú n el índice de Shannon-Wiener, y se confirmó por la reducció n del índice de
equidad. Las biopelículas de los días 3 y 5 mostraron un predominio del género
Pseudomonas (Figura 7), y una reducció n de la diversidad, como indican los valores J′ (Tabla
6). Las Pseudomonas se encuentran comú nmente en las plantas lecheras y muchos aislados
pueden formar biofilms [60] como se muestra aquí. En particular, las biopelículas de
Pseudomonas aeruginosa de origen lá cteo han mostrado una resistencia mú ltiple al
tratamiento químico [61]. Por otro lado, las biopelículas en depó sitos de tipo B mostraron
una menor biodiversidad
cambia con el tiempo de maduració n. En los días 3 y 5 tres géneros fueron dominantes,
siendo el má s abundante Pseudomonas, seguido de Streptococcus y Providencia, mientras que la
equitatividad se mantuvo constante (Tabla 6, Figura 7). Este hallazgo confirma que las
biopelículas comprenden poblaciones bacterianas mixtas, mientras que los grupos má s
predominantes son los mejor adaptados a las condiciones ambientales. Existen informes
que muestran la importancia del desarrollo de biofilms durante el almacenamiento y la
manipulació n de la leche cruda, los géneros implicados y su influencia en la calidad y la
seguridad de los productos finales [62,63].

Tabla 6. Índices de Shannon y de Equitabilidad de los gé neros de la secuencia en las biopelículas

de los depó sitos de tipo A y B en SSP.

Índice D1A D3A D5A D1B D3B D5B

Shannon-Wiener (H′) 1.72 0.72 0.69 1.67 1.30 1.31
Equidad (J′) 0.52 0.21 0.21 0.50 0.39 0.39
D1A, D3A, D5A = Biopelículas en depó sitos de tipo A a 1, 3 y 5 días de maduració n. D1B, D3B, D5B =
Biopelículas en depó sitos de tipo B a 1, 3 y 5 días de maduració n.

3.5. Proceso de limpieza y desinfección

Se obtuvo una reducció n similar de la població n en todos los tratamientos del
diseñ o experimental factorial (Tabla S2). Sin embargo, la concentració n de AEW fue el
factor con mayor influencia en la població n microbiana, mostrando p = 0,1086 (Tabla
S3). Dada la similar reducció n de la població n, se utilizaron menores niveles de AEW
para la limpieza, aplicando un diseñ o unifactorial (50, 100 y 200 mg/L de NaOH) (Tabla
7). El tiempo y la temperatura se mantuvieron constantes en el nivel má s bajo (10 min y 30
◦C
±
) (Tabla S1), y la etapa de desinfecció n en 200 ppm de NEW. La població n microbiana
inicial recuperada de la biopelícula madura fue de 6,97 0,03 log UFC/cm2, y se utilizó agua
destilada esté ril como control. La reducció n de la població n fue significativamente
diferente del control (p < 0,05), con R2 = 0,99, pero la prueba de Tukey no indicó
ninguna diferencia significativa (p > 0,05) entre los tratamientos (Tabla 7).
Para probar el efecto de concentraciones má s bajas de NEW en la etapa de
desinfecció n, se realizó otro diseñ o unifac- torial, fijando la etapa de limpieza en la
concentració n má s baja de AEW de 50 mg/L de NaOH (Tabla 8), mientras que la
concentració n de TAC de NEW osciló entre 50 y 200 mg/L (Tabla 8). El tiempo y la
temperatura fueron los definidos anteriormente (Secció n 2.6), y la ±població n
microbiana inicial recuperada de la biopelícula madura fue de 5,67 0,11 log UFC/cm2,
utilizando agua destilada como control.

Tabla 7. Diseñ o unifactorial de AEW como agente limpiador, durante 10

min a 30 ◦C.
Reducción
AEW (log UFC/cm2)
Tratamien
(mg NaOH/L)
1505 .97 ± 0.03 a
21005 .97 ± 0.04 a
32005 .97 ± 0.01 a
4control3 ,52 ± 0,10 b
Letras diferentes en la columna indican diferencias significativas (p < 0,05).

Tabla 8. Diseñ o unifactorial en el proceso de desinfecció n con NEW a 20 ◦C durante 5 min.

Concentración de Reducción
Tratamien NEW (mg (log UFC/cm2)
TAC/L)
1504 .53 ± 0.24 a
21004 .30 ± 0.41 a
32004 .67 ± 0.01 a
4control2 ,63 ± 0,33 b
Letras diferentes (a-b) en la columna indican diferencias significativas (p <
0,05).
 El NaOH generado electroquímicamente a partir de AEW tiene enlaces hidrogénicos
má s simétricos y débiles [64], y muestra un efecto tensioactivo debido a la disociació n de las
moléculas de agua que forman complejos inestables que se encuentran en un estado
metaestable que los hace altamente reactivos [65]. Segú n la prueba de Tukey, todos los
tratamientos fueron similares (p > 0,05), mostrando una reducció n de la població n
microbiana cercana a 5 log (Tabla 8), tras las etapas de limpieza y desinfecció n secuenciales.
Por lo tanto, a partir de estos resultados se propone una etapa de limpieza de 50 mg
NaOH/L de AEW a 30 ◦C durante 10 min, seguida de una desinfecció n utilizando 50 mg/L de
TAC de NEW a 20 ◦C durante 5 min, sin ninguna etapa de enjuague. La eficacia de este
proceso se visualizó utilizando
microscopía de fluorescencia (Figura 8).

Figura 8. Micrografías de SSP con biofilms en depó sitos de tipo A. Los paneles (a,b) muestran
biofilms de 5 días. Los paneles (c,d) muestran la etapa de limpieza de 50 mg NaOH/L de AEW a
30 ◦C durante 10 min, ú nicamente. Los paneles (e), f muestran la desinfecció n utilizando 50 mg/L
de cloro total disponible de NEW a 20 ◦C durante 5 min, solamente. Los paneles (g,h) muestran
etapas de limpieza seguidas de desinfecció n. La fluorescencia verde indica cé lulas viables,
mientras que la fluorescencia roja indica células dañ adas. Los paneles (a,c,e,g) muestran un
aumento de 40X; los paneles (b,d,f,h) muestran la intensidad de la fluorescencia.
 Las biopelículas maduras (5 días) mostraron una elevada població n viable observada
principalmente como fluorescencia verde (Figura 8a,b). Ninguna de las etapas individuales
de limpieza o desinfecció n por sí sola fue tan eficiente como las etapas secuenciales
combinadas (Figura 8g,h), donde se puede visualizar menos fluorescencia y una amplia
destrucció n de la estructura celular tridimensional.

4. Conclusiones
Los depó sitos de tipo A y B de leche cruda en condiciones está ticas sobre SSP y ELP
mostraron una composició n diferente, dando lugar a superficies má s hidrofílicas. La
rugosidad media de cualquier tipo de depó sito en ambas placas de acero inoxidable era
mayor que sin depó sitos, y permitía el desarrollo de biofilms. Las técnicas moleculares
permitieron estudiar la diversidad y complejidad de la població n del biofilm, que variaba
con la maduració n del mismo. Se encontró Listeria sp. en ambos tipos de depó sitos en
placas SSP. La diversidad bacteriana de las biopelículas cambió con el tiempo hacia
gé neros má s predominantes segú n el tipo de depó sitos sobre SSP. A partir de los
diseñ os experimentales, se propone un proceso alternativo sostenible para prevenir la
formació n de biofilms utilizando una etapa de limpieza con 50 mg/L de NaOH de AEW a
30 ◦C durante 10 min, seguida de una desinfecció n con 50 mg/L de TAC de NEW a 20 ◦C
durante 5 min, sin ninguna etapa de enjuague.

Materiales suplementarios: Los siguientes está n disponibles en línea en

https://www.mdpi.com/2304-815 8/10/1/103/s1, Tabla S1: Diseñ o factorial completo 23 con 4
puntos centrales para la limpieza de SSP utilizando AEW, Tabla S2: Poblaciones microbianas de cada
tratamiento del diseñ o factorial 23 con 4 puntos centrales, Tabla S3: Interacciones del diseñ o factorial
23.
Contribuciones de los autores: Conceptualizació n, B.E.G.-A.; Metodología, R.J.-P., Y.M.-V.;
Investigació n, J.C.-R., J.S.-C.; M.d.C.W.-R., Y.M.-V.; Redacció n-borrador original, R.J.-P., I.H.-M., e I.S.-
O.; Redacció n-revisió n y edició n, B.E.G.-A., C.R.-G. Todos los autores han leído y aceptado la
versió n publicada del manuscrito.
Financiación: Esta investigació n no recibió financiació n externa.
Declaración de la Junta de Revisión Institucional: No aplicable.
Declaració n de consentimiento informado: No procede.
Declaración de disponibilidad de datos: Los datos moleculares está n disponibles bajo petició n.
Agradecimientos: Los autores agradecen a la empresa RusEco por proporcionar las muestras de agua
electrolizada. Se agradece al Consejo Mexicano de Ciencia y Tecnología CONACYT, por la beca a R.J.-P.
y la beca de maestría a I.H.-M.
Conflictos de intereses: Los autores declaran no tener ningú n conflicto de intereses.

Referencias
1. Bansal, B.; Chen, X.D. A critical review of milk fouling in heat exchangers. Compr. Food Sci. Food Safety 2006, 5, 27-33.
[CrossRef]
2. Mogha, K.V.; Shah, N.P.; Prajapati, J.B.; Chaudhari, A.R. Biofilm-A threat to dairy industry. Indian J. Dairy Sci. 2014, 67, 459-
466. [CrossRef]
3. Srey, S.; Jahid, I.K.; Ha, S. Formació n de biofilms en las industrias alimentarias: Un problema de seguridad alimentaria. Food Control
2013, 31, 572-585. [CrossRef]
4. Goode, K.R.; Asteriadou, K.; Robbins, P.T.; Fryer, P.J. Estudios de ensuciamiento y limpieza en la industria alimentaria y de bebidas
clasificados por tipo de limpieza. Compr. Rev. Food Sci. Food Saf. 2013, 12, 121–143. [CrossRef]
5. Phillips, C.A. Bacterial biofilms in food processing environments: A review of recent developments in chemical and biological
control. Int. J. Food Sci. Technol. 2016, 51, 1731–1743. [CrossRef]
6. Zhao, X.; Zhao, F.; Wang, J.; Zhong, N. Formació n de biofilms y estrategias de control de pató genos transmitidos por los alimentos:
Perspectivas de seguridad alimentaria.
RSC Adv. 2017, 7, 36670-36683. [CrossRef]
7. Galié , S.; García-Gutierrez, C.; Miguélez, E.M.; Villar, C.J. Biofilms en la industria alimentaria: Aspectos sanitarios y mé todos de
control.
Front. Microbiol. 2018, 9, 898. [CrossRef]
8. Manuzon, M.Y.; Wang, H.H. Mixed Culture Biofilms. En Biofilms in the Food Environment; Blascheck, H.P., Wang, H.H., Agle,
M.E., Eds.; Blackwell Publishing and the IFT Press: Ames, IA, USA, 2007; pp. 105-125.
9. Trevors, J.T. Bacterias viables pero no cultivables (VBNC): Expresió n de genes en cé lulas planctó nicas y de biofilm. J.
Microbiol. Methods
2011, 86, 266–273. [CrossRef]
10. Santos, R.S.; Guimarã es, N.; Madureira, P.; Azevedo, N.F. Optimizació n de un método de hibridació n fluorescente in situ de ácidos
nucleicos peptídicos (PNA-FISH) para la detecció n de bacterias y revelació n de un efecto formamida. J. Biotechnol. 2014, 187, 16–24.
[CrossRef]
11. Rohde, A.; Hammerl, J.A.; Appel, B.; Dieckmann, R.; Al Dahouk, S. FISHing for bacteria in food-A promising tool for the
reliabledetection of pathogenic bacteria? Food Microbiol. 2015, 46, 395–407. [CrossRef]
12. Jimé nez-Pichardo, R.; Regalado, C.; Castañ o-Tostado, E.; Meas-Vong, Y.; Santos-Cruz, J.; García-Almendá rez, B.E. Evaluació n
del agua electrolizada como agente de limpieza y desinfecció n en acero inoxidable como superficie modelo en la industria lá ctea.
Food Control 2016, 60, 320-328. [CrossRef]
13. Wang, X.; Demirci, A.; Puri, V.M.; Graves, R.E. Evaluació n de la técnica de limpieza in situ (CIP) basada en agua oxidada mezclada
utilizando un sistema de ordeñ o a escala de laboratorio. Trans. ASABE 2016, 59, 359-370. [CrossRef]
14. Huang, Y.R.; Hung, Y.C.; Hsu, S.Y.; Huang, Y.W.; Hwang, D.F. Aplicació n del agua electrolizada en la industria alimentaria.
Control de los alimentos
2008, 19, 329–345. [CrossRef]
15. Herná ndez-Pimentel, V.M.; Regalado-Gonzá lez, C.; Nava-Morales, G.M.; Meas-Vong, Y.; Castañ eda-Serrano, M.P.; García-
Almendá rez, B.E. Efecto del agua electrolizada neutra como tratamiento de intervenció n antimicrobiana de la carne de pollo
y sobre la formació n de tri-halometanos. J. Appl. Poult. Res. 2020, 29, 622-635. [CrossRef]
16. Deza, M.A.; Araujo, M.; Garrido, M.J. Inactivació n de Escherichia coli O157:H7, Salmonella enteritidis y Listeria monocytogenes en la
superficie de tomates mediante agua electrolizada neutra. Lett. Appl. Microbiol. 2003, 37, 482–487. [CrossRef]
17. Wang, X.; Puri, V.M.; Demirci, A.; Graves, R.E. Limpieza in situ en un solo paso para sistemas de ordeñ o y modelizació n
matemá tica para la eliminació n de depó sitos en tuberías de acero inoxidable utilizando agua oxidante electrolizada
mezclada. Trans. ASABE 2016, 59, 1893-1904. [CrossRef]
18. EPA. Agencia de Protecció n Ambiental, Secció n 180.940, Exenciones de tolerancia para ingredientes activos e inertes para
uso en formulaciones antimicrobianas (Soluciones de desinfecció n de superficies en contacto con alimentos). Disponible en
línea: https://www.govinfo.gov/app/ details/CFR-2012-title40-vol25/CFR-2012-title40-vol25-sec180-940 (consultado el
12 de febrero de 2019).
19. Al-Haq, M.I.; Sugiyama, J.; Isobe, S. Applications of electrolyzed water in agriculture & food industries. Food Sci. Technol. Res.
2005, 11, 135–150. [CrossRef]
20. Wang, H.; Ding, S.; Wang, G.; Xu, X.; Zhou, G. Caracterizació n y aná lisis in situ de la formació n de biopelículas de Salmonella en
entornos de procesamiento de carne mediante un enfoque combinado de microscopía y espectroscopía. Int. J. Food Microbiol.
2013, 167, 293–302. [CrossRef]
21. Aré valos-Sá nchez, M.; Regalado, C.; Martín, S.E.; Meas-Vong, Y.; Cadena-Moreno, E.; García-Almendá rez, B.E. Efecto del agua
electrolizada neutra sobre las biopelículas de Listeria monocytogenes EGDe marcadas con lux adheridas al acero inoxidable y
visualizació n con té cnicas de microscopía destructiva y no destructiva. Food Control 2013, 34, 472-477. [CrossRef]
22. probeBase. Un recurso en línea para sondas de oligonucleó tidos dirigidas al ARNr. Disponible en línea:
http://probebase.csb.univie.ac.at/ (consultado el 3 de marzo de 2019).
23. Rosmaninho, R.; Santos, O.; Nylander, T.; Paulsson, M.; Beuf, M.; Benezech, T.; Yiantsios, S.; Andritsos, N.; Karabelas, A.; Rizzo,
G.; et al. Modified stainless steel surfaces targeted to reduce fouling-Evaluation of fouling by milk components. J. Food Eng. 2007,
80, 1176-1187. [CrossRef]
24. Rosmaninho, R.; Rizzo, G.; Mü ller-Steinhagen, H.; Melo, L.F. Deposició n de la solució n mineral de la leche en nuevas
superficies de transferencia de calor en condiciones de flujo turbulento. J. Food Eng. 2018, 85, 29-41. [CrossRef]
25. Fickak, A.; Al-Raisi, A.; Chen, X.D. Effect of whey protein concentration on the fouling and cleaning of a heat transfer surface. J. Food
Eng. 2011, 104, 323-331. [CrossRef]
26. Boxler, C.; Augustin, W.; Scholl, S. Composició n de los depó sitos de suciedad de la leche en un intercambiador de calor de
placas en condiciones de flujo pulsado.
J. Food Eng. 2014, 121, 1-8. [CrossRef]
27. Bradford, M.M. Un mé todo rá pido y sensible para la cuantificació n de cantidades de microgramos de proteína utilizando el
principio de unió n proteína-tinte. Anal. Biochem. 1976, 72, 248–254. [CrossRef]
28. Owens, D.K.; Wendt, R.C. Estimació n de la energía libre superficial de los polímeros. J. Appl. Polym. Sci. 1969, 13, 1741-1747.
[CrossRef]
29. Kaelble, D.H. Dispersion-Polar Surface Tension Properties of Organic Solids. J. Adhes. 1970, 2, 66–81. [CrossRef]
30. Cappelletti, G.; Ardizzone, S.; Meroni, D.; Soliveri, G.; Ceotto, M.; Biaggi, C.; Benaglia, M.; Raimondi, L. Wettability of bare and
fluorinated silanes: Un enfoque combinado basado en evaluaciones de la energía libre superficial y cá lculos del momento
dipolar. J. Colloid Interface Sci. 2013, 389, 284-291. [CrossRef]
31. Blanpain-Avet, P.; Hé doux, A.; Guinet, Y.; Paccou, L.; Petit, J.; Six, T.; Delaplace, G. Analysis by Raman spectroscopy of the
conformational structure of whey proteins constituting fouling deposits during the processing in a heat exchanger. J. Food
Eng. 2012, 110, 86-94. [CrossRef]
32. Caixeta, D.S.; Scarpa, T.H.; Brugnera, D.F.; Freire, D.O.; Alves, E.; De Abreu, L.R.; Piccoli, R.H. Desinfectantes químicos para
controlar las biopelículas formadas por dos especies de Pseudomonas en superficies de acero inoxidable. Food Sci. Technol. 2012, 32,
142–150. [CrossRef]
33. Liato, V.; Labrie, S.; Aïder, M. Estudio de la actividad antibacteriana de soluciones electroactivadas de sales de á cidos
orgá nicos débiles sobre Salmonella enterica, Staphylococcus aureus y Listeria monocytogenes. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2017,
44, 23–33. [CrossRef]
34. Amann, R.I.; Binder, B.J.; Olson, R.J.; Chisholm, S.W.; Devereux, R.; Stahl, D.A. Combinació n de sondas de oligonucleó tidos dirigidas al
ARNr 16S con citometría de flujo para analizar poblaciones microbianas mixtas. Appl. Environ. Microbiol. 1990, 56, 1919–1925.
[CrossRef] [PubMed]
35. Franks, A.H.; Harmsen, H.J.M.; Raangs, G.C.; Jansen, G.J.; Schut, F.; Welling, G.W. Variaciones de las poblaciones bacterianas en las
heces humanas medidas mediante hibridació n fluorescente in situ con sondas de oligonucleó tidos dirigidas al ARNr 16S específicas
de grupo. Appl. Environ. Microbiol. 1998, 64, 3336–3345. [CrossRef]
36. Kempf, V.A.J.; Trebesius, K.; Autenrieth, I.B. La hibridació n fluorescente in situ permite la identificació n rá pida de
microorganismos encultivos de sangre. J. Clin. Microbiol. 2000, 38, 830–838. [CrossRef]
37. Schmid, M.; Walcher, M.; Bubert, A.; Wagner, M.; Wagner, M.; Schleifer, K.H. Detecció n de Listeria spp. y genotipos de L.
monocytogenes basada en el ácido nucleico e independiente del cultivo. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2003, 35, 215–225.
[CrossRef]
38. Aré valos-Sá nchez, M.; Regalado, C.; Martín, S.E.; Domínguez-Domínguez, J.; García-Almendá rez, B.E. Efecto del agua
elec- tralizada neutra y la nisina sobre las biopelículas de Listeria monocytogenes, y sobre la actividad de la listeriolisina O.
Food Control 2012, 24, 116-122. [CrossRef]
39. Carrillo-Reyes, J.; Celis, L.B.; Alatriste-Mondragó n, F.; Montoya, L.; Razo-Flores, E. Estrategias para hacer frente a los
metanó genos en reactores UASB productores de hidró geno: Diná mica de la comunidad. Int. J. Hydrogen Energy 2014, 39,
11423-11432. [CrossRef]
40. Simpson, E.H. Medició n de la diversidad. Nature 1949, 163, 688. [CrossRef]
41. ASTM A276-06, Standard Specification for Stainless Steel Bars and Shapes; ASTM International: West Conshohocken, PA, USA, 2006.
[CrossRef]
42. Li, M.; Nan, L.; Xu, D.; Ren, G.; Yang, K. Antibacterial performance of a Cu-bearing stainless steel against microorganisms in
tap water. J. Mater. Sci. Technol. 2015, 31, 243–251. [CrossRef]
43. Araú jo, E.A.; de Andrade, N.J.; da Silva, L.H.M.; de Carvallo, A.F.; Sá Silva, C.A.; Ramos, A.M. Control de la adhesió n microbiana
como estrategia para la tecnología de alimentos y bioprocesos. Food Bioprocess Technol. 2010, 3, 321–332. [CrossRef]
44. Wickens, D.; Lynch, S.; West, G.; Kelly, P.; Verran, J.; Whitehead, K.A. Quantifying the pattern of microbial cell dispersion, density and
clustering on surfaces of differing chemistries and topographies using multifractal analysis. J. Microbiol. Methods 2014, 104, 101-
108. [CrossRef]
45. Jullien, C.; Bénézech, T.; Carpentier, B.; Lebret, V.; Faille, C. Identificació n de las características superficiales relevantes para el
estado higiénico del acero inoxidable para la industria alimentaria. J. Food Eng. 2003, 56, 77-87. [CrossRef]
46. Medilanski, E.; Kaufmann, K.; Wick, L.Y.; Wanner, O.; Harms, H. Influencia de la topografía superficial del acero inoxidable en la
adhesió n bacteriana. Biofouling 2002, 18, 193-203. [CrossRef]
47. Hilbert, L.R.; Bagge-Ravn, D.; Kold, J.; Gram, L. Influencia de la rugosidad superficial del acero inoxidable en la adhesió n
microbiana y la resistencia a la corrosió n. Int. Biodeterior. Biodegrad. 2003, 52, 175–185. [CrossRef]
48. Young-Min, B.; Seung-Youb, B.; Sun-Young, L. Resistencia de las bacterias pató genas en la superficie del acero inoxidable en
funció n de la forma de adhesió n y la eficacia de los desinfectantes químicos. Int. J. Food Microbiol. 2012, 153, 465–473.
[CrossRef]
49. Mazurek, S.; Szostak, R.; Czaja, T.; Zachwieja, A. Aná lisis de la leche mediante espectroscopia FT-Raman. Talanta 2015, 138,
285-289.
[CrossRef] [PubMed]
50. De Aza, P.N.; Guitiá n, F.; Santos, C.; De Aza, S.; Cuscó , R.; Artú s, L. Propiedades vibracionales de compuestos de fosfato de
calcio. II. Comparació n entre la hidroxiapatita y el β-fosfato tricá lcico. Chem. Mater. 1997, 9, 916–922. [CrossRef]
51. Arifin, M.; Swedlund, P.J.; Hemar, Y.; Mckinnon, I.R. Fosfatos de calcio en la leche enriquecida con Ca2+: Identificació n de fases
y
cuantificació n por espectroscopia Raman. J. Agric. Food Chem. 2014, 62, 12223–12228. [CrossRef]
52. McGoverin, C.M.; Clark, A.S.S.; Holroyd, S.E.; Gordon, K.C. Cuantificació n espectroscó pica Raman de los componentes de la leche
en polvo.
Anal. Chim. Acta 2010, 673, 26-32. [CrossRef]
53. Verderosa, A.D.; Totsika, M.; Fairfull-Smith, K.E. Agentes de erradicació n de biopelículas bacterianas: Una revisió n actual. Front.
Chem. 2019, 7, 1–17. [CrossRef]
54. Satpathy, S.; Sen, S.K.; Pattanaik, S.; Raut, S. Review on bacteria biofilm: Una causa universal de contaminació n. Biocatal.
Agric. Biotechnol. 2016, 7, 56–66. [CrossRef]
55. Ercolini, D.; La Storia, A.; Villani, F.; Mauriello, G. Effect of a bacteriocin-activated polythene film on Listeria monocytogenes as
evaluated by viable staining and epifluorescence microscopy. J. Appl. Microbiol. 2006, 4, 765–772. [CrossRef] [PubMed]
56. Petrova, O.E.; Sauer, K. Escapar de la biopelícula de má s de una manera: Desorció n, desprendimiento o dispersió n. Curr. Opin.
Microbiol.
2016, 30, 67–78. [CrossRef] [PubMed]
57. Carpentier, B.; Cerf, O. Review-Peristence of Listeria monocytogenes in food industry equipment and premises. Int. J. Food Microbiol.
2011, 145, 1–8. [CrossRef] [PubMed]
58. Campdepadró s, M.; Stchigel, A.M.; Romeu, M.; Quilez, J.; Solà , R. Efectividad de dos procedimientos de higienizació n para
disminuir los niveles de contaminació n microbiana (incluyendo Listeria monocytogenes) en las superficies en contacto con los
alimentos y sin contacto con los alimentos en una fá brica de postres. Food Control 2012, 23, 26-31. [CrossRef]
59. Weilier, C.; Ifland, A.; Nauman, A.; Kleta, S.; Noll, M. Incorporació n de cepas de Listeria monocytogenes en biofilms de leche cruda.
Int. J. Food Microbiol. 2013, 161, 61–68. [CrossRef] [PubMed]
60. Rossi, C.; Chavez-Lopez, C.; Serio, A.; Goffredo, E.; Cenci Goba, B.T.; Paparella, A. Influencia de las condiciones de incubació n
en la formació n de biopelículas por Pseudomonas fluorescens aisladas de productos lá cteos y de plantas de fabricació n de
productos lá cteos. Ital. J. Food Saf. 2016, 5, 154–157. [CrossRef]
61. Padegar, A.; Singh, J. Evaluation of antibiofilm effect of benzalkonium chloride, iodophore and sodium hypochlorite against
biofilm of Pseudomonas aeruginosa of dairy origin. J. Food Sci. Technol. 2015, 52, 5317–5322. [CrossRef]
62. Flint, S.; Bremer, P.; Brooks, J.; Palmer, J.; Sadiq, F.A.; Seale, B.; Teh, K.H.; Wu, S.; Md Zain, S.N. Bacterial fouling in dairy
processing. Int. Dairy J. 2020, 101, 1-16. [CrossRef]
63. Yuan, L.; Burmolle, M.; Sadiq, F.A.; Wang, N.; He, G. Variació n entre especies en la capacidad de formació n de biopelículas de
aislados bacterianos psicrotró ficos de la leche cruda china. Food Control 2018, 91, 47-57. [CrossRef]
64. Pastukhov, V.I.; Morozov, V.P. Dispersió n Raman de la luz por el agua electroactivada. Opt. Spectrosc 2000, 8, 35-37. [CrossRef]
65. Aider, M.; Gnatko, E.; Benali, M.; Plutakhin, G.; Kastyuchik, A. Soluciones acuosas electroactivadas: Theory and application in
the food industry and biotechnology. Innov. Food Sci Emerg. 2012, 15, 38-49. [CrossRef]