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Mtodos para la inactivacin

de esporas en alimentos
L. C. Huesca-Espitia1*, J.L. Snchez-Salas2 y E. R. Bandala1
Departamento de Ingeniera Qumica, Alimentos y Ambiental, Universidad de las Amricas Puebla.
1

Ex hacienda Sta. Catarina Mrtir S/N, San Andrs Cholula, Puebla. C.P.72810. Mxico.
2
Departamento de Ciencias Qumico-Biolgicas, Universidad de las Amricas Puebla.
Ex hacienda Sta. Catarina Mrtir S/N, San Andrs Cholula, Puebla. C.P.72810. Mxico.

RESUMEN
Los microorganismos, en especial los formadores de esporas, presentan un gran reto para la
industria de los alimentos en su continua preocupacin de producir alimentos inocuos. Para
tratar de eliminar a los microorganismos se han desarrollado diferentes metodologas para
su procesamiento; por ejemplo, los tratamientos trmicos, aquellos basados en factores qu-
micos como la acidificacin, o la combinacin de ambos, las tecnologas emergentes como el
plasma y los procesos avanzados de oxidacin. Sin embargo, no todos ellos son eficientes en
la eliminacin de esporas debido a las caractersticas morfolgicas de stas, que les propor-
cionan resistencia ante condiciones adversas y adems, a que la poblacin es heterognea en
cuanto a tiempos de germinacin, que pueden ser desde das hasta perodos de tiempo muy
prolongados como es el caso de las esporas superlatentes. En este trabajo se analizan los aspec-
tos ms relevantes en la microbiologa de alimentos y tratamientos asociados al procesado de
stos. Se enfocar en presentar los procesos o mtodos aplicados hasta el momento sobre la
inactivacin de esporas de microorganismos que afectan el deterioro de los alimentos o que
causan dao a la salud de los consumidores.
Palabras clave: microorganismos, esporas, superlatentes, tecnologas emergentes.

ABSTRACT
Microorganisms, especially spore-forming bacteria, are a big challenge for the food industry in
its continuing concern to produce safe and high quality food. Different processing methodolo-
gies have been developed trying to eliminate these microorganisms, such as heat treatments,
those based on chemical factors such as acidification, or the combination of them, as well as
emerging technologies such as plasma and advanced oxidation processes. However, not all of
them are efficient in removing spores due to the morphological characteristics which provide
resistance to adverse conditions and also because of the population heterogeneity in terms
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of germination time, that can be from days to very long periods of time like in superdormant
en Ciencia de Alimentos
spores. In this work the most important in food microbiology and treatments associated with
Tel.: +52 222 229 2126
the processing of these aspects are analyzed. It will focus on presenting the processes or meth-
Fax: +52 222 229 2727
ods used so far on the inactivation of spores of microorganisms affect food spoilage or cause
Direccin electrnica:
damage to the health of consumers. luz.huescaea@udlap.mx
Keywords: microorganisms, spores, superdormant, emerging technologies.

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Introduccin la produccin de cambios enzimticos que originan modifi-


caciones del sabor debido a la degradacin o sntesis de algu-
En el mundo actual y con el acelerado ritmo de vida que carac- nos compuestos. En el caso de los microorganismos patgenos
teriza al siglo xxi, tanto la produccin y el consumo de alimen- podemos decir que la mayora de los alimentos pueden ser-
tos procesados tienen un impacto econmico positivo para vir para desarrollar o para actuar como vehculos de estos mi-
todos los pases, como aquellos en desarrollo incluido el nues- croorganismos, debido a esto, es necesario evitar su contacto
tro, que han aumentado su tasa de produccin, ya sea para y proliferacin, as como lograr su eliminacin durante el pro-
sustentar su consumo interno o para exportar. Sin embargo, un cesamiento (Floros et al., 2010).
impacto negativo de grandes dimensiones puede ocurrir si se
presentan brotes de enfermedades transmitidas por alimentos 1.1. Tipos de microorganismos contaminantes de
o un deterioro de los alimentos de exportacin a gran escala. alimentos y agua
En el caso de la industria de jugos de frutas, se han reportado La mayora de los microorganismos que contaminan a los ali-
en los ltimos 20 aos brotes de patgenos como Escherichia mentos y al agua son bacterias mesoflicas (crecen entre 20 y
coli O157:H7, Salmonella spp y Crystosporidium parvum (cdc, 42oC) (tabla I), de las cuales un alto porcentaje son patgenas
1996, 1999, 2006, 2007), as como microorganismos deteriorati- en estas condiciones de temperatura, tambin estn presen-
vos como Alicyclobacillus acidoterrestris (Chang y Kang, 2004). tes otros tipos de microorganismos como levaduras, mohos y
Todo esto ha impuesto grandes retos no slo a la industria ali- virus. Los alimentos se descomponen por accin microbiana a
mentaria sino a los investigadores en ciencia de alimentos en temperatura ambiente, por lo que es necesario procesarlos y
el desarrollo de metodologas con una alta eficiencia en la eli- mantenerlos a temperaturas extremas, ya sea calientes o fros,
minacin o inactivacin de los microorganismos causantes de para evitar la proliferacin de los microorganismos. Aproxima-
enfermedades. Por otra parte, se han tratado de entender los damente a -10oC cesa por completo la tasa metablica de los
mecanismos por los cuales los microorganismos son, en algu- microorganismos y entran en un estado de latencia y cuando
nas ocasiones, resistentes a los procesos convencionales. La las condiciones son nuevamente propicias, los microorganis-
microbiologa de los alimentos ha experimentado un desarro- mos activan sus procesos metablicos y comienzan de nuevo
llo considerable en los ltimos aos debido, en gran parte, a la a reproducirse. Por otra parte, muy pocas bacterias sobrevi-
modelacin predictiva (McMeekin et al., 2008) y a la evalua- ven a temperaturas superiores a los 90oC, las que lo hacen se
cin de riesgos (Hoornstra y Notermans, 2001). A pesar de esto, les denomina termoflicas (45-100oC). Entre las bacterias que
su aplicacin en diversas reas de la industria alimentaria para sobreviven a altas temperaturas se encuentran aquellas cuyo
mejorar la seguridad y calidad microbiolgica de los alimentos ciclo de vida incluye la produccin de esporas, por ejemplo los
an es limitada. gneros Clostridium y Bacillus. Las esporas son estructuras que
En este trabajo se analizan los aspectos ms relevantes resisten temperaturas de ms de 100oC durante largos perodos
en la microbiologa de alimentos y tratamientos asociados al de tiempo (de hasta 20 minutos), sin ser destruidas. Algunas es-
procesado de stos. Se enfocar en presentar los procesos o pecies producen toxinas que pueden o no resistir el tratamien-
mtodos aplicados hasta el momento sobre la inactivacin de to trmico. La bacteria Clostridium botulinum adems genera
esporas de microorganismos que afectan el deterioro de los toxinas muy poderosas que vuelven txicos a los alimentos ge-
alimentos o que causan dao a la salud de los consumidores. nerando la enfermedad llamada botulismo (Frazier y Westhoff,
1991; Adams y Moss, 1997; Jay, 2000).

1.2. Bacterias que forman esporas


Revisin bibliogrfica Las bacterias tienen muchas estrategias para sobrevivir al am-
biente. Estas estrategias implican con frecuencia los cambios
1. Problemtica de la contaminacin rpidos en la expresin de genes que alteran temporalmente el
microbiolgica de los alimentos y agua fenotipo de una clula y le permiten sobrevivir. Un ejemplo so-
En la mayora de los casos, los microorganismos utilizan a los fisticado de la respuesta al estrs es la formacin de esporas, o
alimentos como fuente de nutrientes, dando lugar al deterioro esporulacin, en el que el genoma bacteriano es conservado en
de stos. Esto se debe no slo a la presencia de microorganis- un lugar seguro (la espora) hasta que mejoran las condiciones
mos y a la utilizacin de sustancias nutritivas, sino tambin a ambientales, y es entonces cuando la espora germina y vuelve

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Tabla I. Bacterias deteriorativas en alimentos y de aplicacin en la industria alimentaria.


Tipo de Microorganismos Importancia en la microbiologa
Caractersticas
Familia Gnero Especie de los alimentos

Bacilos no Esporulados Gram - ne-


Crecen sobre la superficie de los alimentos
gativos Uso de diversas fuentes de
Pseudomonadaceae Pseudomonas produciendo muclagos y diversos pigmen-
carbono principalmente aerobia
tos
protolticas lipolticas
Oxidan etanol, producen viscosidad
Gluconobacter G. oxydans
en la cerveza
Alteraciones de color en alimentos como en
Halobacteriaceae Halobacterium H. salinarium Halfilas obligadas cromgenas
pescados cocinados
Vibrionaceae Photobacterium Cocobacilos y bacilos luminiscentes Presentes en carnes y pescados
Presentes en agua salada y dulce,
Vibrio suelo y tracto digestivo de mam- Patgenas
feros
Enterobacteriaceae Escherichia E. coli Bacilo Gram-, coliforme
Enterobacter coliforme
Produce coloraciones rojizas en la superfi-
Serratia S. marcescens
cie de alimentos
Patgenas de vegetales lesionan frutas y
Erwinia
hortalizas
Causa la peste en el hombre, alteraciones
Yersinia Y. pestis de carnes, productos del mar y huevos pro-
duciendo toxiinfecciones alimentarias
Proteus
Producen disenterias bacilares, patologas
Shigella del tracto respiratorio e intestinal en el hu-
mano como la neumona bacteriana
Klebsiella Presencia de cpsula
Salmonella entricas Producen infecciones alimentarias
Temperatura ptima de crecimiento est
entre los 25 y 30oC, pueden desarrollarse en
Cocos, Gram+, aerobias, termodri-
Micrococcaceae Micrococcus salmueras, termodricos, algunos dan colo-
cos
raciones a los alimentos e incluso algunos
crecen a temperatura de refrigeracin
Muchas de las cepas son patgenas y produ-
Staphylococcus S. aureus Gram+ cen una enterotoxina que causa intoxica-
ciones alimentarias
Bacilos largos y delgados, microae-
Importancia en la industria lctea para la
Lactobacillaceae Lactobacillus roflicos, Gram+, fermentan azcares
produccin de productos fermentados
dando cido lctico
Origina en la especie humana faringitis sp-
Streptococcaceae Streptococcus S. pyogenes Homofermentativos tica, escalatina y otras enfermedades,
se encuentra en la leche
Elaboracin de quesos y en ciertas leches
S. thermophilus
fermentadas
S. bovis Termodricos En leches pasterizadas
S. lactisy S. Se emplean como fermentos para el queso,

cremoris mantequilla

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Tabla I (continuacin). Bacterias deteriorativas en alimentos y de aplicacin en la industria alimen-



taria.
Tipo de Microorganismos Importancia en la microbiologa
Caractersticas
Familia Gnero Especie de los alimentos

Toleran hasta 6.5% de sal, crecen a pH de


S. feacalis, S.fae-
Termodricos 9.6 y su rango de temperatura de crecimien-
cium
to va desde 5 hasta 50oC
Salmueras, bebidas alcohlicas como la
Pediococcus Gram-negativos tolerantes a la sal
cerveza donde producen diacetilo
Fermentan el cido ctrico de la leche y
Leuconostoc Heterofermetativos
producen diacetilo
Formadores de endoesporas, cuenta Alteran los alimentos vegetales enlatados,
Bacillaceae Bacillus B. subtilis
con especies mesfilas y termfilas pan, lcteos y pastas
C. putrefaciens,
Anaerobias o microaeroflicas, pue- Alteracin gaseosa de las conservas vege-
Clostridium C.perfringensy
den ser mesfilos o termfilos tales
C.butyricum
(A partir de Frazier y Westhoff, 1991; Adams y Moss, 1997)

al estado vegetativo rpidamente. Las endosporas se forman en el que las esporas que resisten la coccin germinan y degra-
y nutren completamente dentro de una clula madre, la cual dan la estructura interna de la hogaza produciendo una muco-
debe romper su membrana para liberar la espora al medio am- sidad pegajosa. Sin embargo, este defecto del pan no siempre
biente (McKenney, Driks y Eichenberger, 2013). Este proceso se impide que las personas se lo coman, por lo cual puede actuar
revisar con detalle ms adelante. como medio de transmisin de enfermedades (Frazier y Wes-
Los gneros Bacillus, Clostridium, Sporolactobacillus, thoff, 1991; Adams y Moss, 1997; Jay, 2000).
Sporosarcina y Desulfotomaculum son capaces de formar Otro microorganismo importante es Clostridium frigidi-
endoesporas. Para la microbiologa de los alimentos los dos carnis el cual se ha aislado de carne de res en descomposicin
primeros tienen un inters especial debido a los problemas o que ha sido envasada al vaco. Este pertenece a un grupo de
causados por algunas especies que forman parte de estos g- clostridios asociados con el deterioro de la carne roja refrige-
neros. Actualmente se sabe que B. cereus es responsable de rada. Su crecimiento ptimo se produce entre 30 y 38.5oC (Bro-
dos tipos distintos de enfermedad transmitida por alimentos: da, Lawson, Bell y Musgrave, 1999). Los clostridios entran en las
un sndrome diarreico, de aparicin relativamente tarda y un plantas de procesamiento de carne, como esporas provenien-
sndrome emtico de aparicin rpida. No slo esta especie de tes del suelo, la materia fecal, o de las pieles de los animales y
Bacillus se relaciona con enfermedades transmitidas por ali- son transferidos a la superficie de la carne durante la matanza
mentos, se han aislado algunas otras especies como B. subtilis, y su procesamiento (Broda, Bell, Boerema y Musgrave, 2002;
B. licheniformis y B. pumilus que han cobrado gran importan- Boerema, Broda y Bell, 2003). La formacin de endosporas que
cia debido al tipo de patologa que producen (Scheldeman, son muy resistentes es una caracterstica de C. frigidicarnis y
Herman, Foster y Heyndrickx, 2006). Todas estas especies se otros clostridios, lo cual hace de su eliminacin una tarea muy
encuentran ampliamente difundidas en suelo, agua y vegeta- difcil. Una estrategia potencial utilizada para tratar de elimi-
les as como tambin se han identificado como componentes narlas es hacer germinar la endospora y luego aplicar algn
habituales de la microbiota temporal del intestino de las per- mtodo de procesamiento sobre la clula vegetativa, la cual es
sonas (Frazier y Westhoff, 1991; Adams y Moss, 1997; Jay, 2000). ms sensible (Peck, 2009; Peck, Stringer, y Carter, 2011).
Las hierbas secas y las especias que se utilizan en la condi- Clostridium difficile, miembro del mismo gnero, es la cau-
mentacin pueden ser un origen importante de B. cereus. Los sa principal de las infecciones intestinales nosocomiales en el
jugos y carne son vehculos de los dems bacilos causantes de Reino Unido. La infeccin por Clostridium difficile se produce
intoxicaciones alimentarias. Productos horneados tales como en pacientes susceptibles tras la ingestin de esporas presen-
el pan y los bollos blandos han sido implicados en varios bro- tes en un alimento contaminado, despus de lo cual, el proceso
tes de intoxicacin alimentaria por B. subtilis. Esta ltima es- irreversible de la germinacin de las esporas se produce en el
pecie es responsable del defecto conocido como pan viscoso, intestino delgado dando lugar a la formas vegetativas metab-

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licamente activas, las cuales producen las exotoxinas asocia- 2. Las esporas
das con la enfermedad (Poutanen y Simor, 2004; Moir, 2006).
De gran importancia tambin es el Clostridium botu- 2.1. Proceso de esporulacin
linum, un grupo de cuatro clostridios relacionados fisiolgica El proceso de esporulacin se divide en siete estadios (McDon-
y filogenticamente, que comparten en comn la funcin de nell, 2007; Douglas y Dworkin, 2012) y es bsicamente idntico
producir la neurotoxina botulnica considerada la toxina ms entre los gneros Bacillus y Clostridium (Fig. 1). Un crecimien-
potente conocida (Lund y Peck, 2000; Peck, 2009). Estos mi- to celular vegetativo normal se puede definir como fase cero
croorganismos son los responsables de la transmisin alimen- con respecto a la esporulacin, y es seguida por las etapas I/II,
taria del botulismo, una intoxicacin en la que el consumo de donde la clula vegetal inicia la divisin celular asimtrica y
alimentos que contengan tan poco como 30 ng de neurotoxi- por tanto la formacin de dos compartimentos separados por
na preformada, puede resultar en una enfermedad muy grave, un tabique, el ms pequeo de los cuales es denominado la
y representan un peligro particular para la produccin segura preespora. La etapa II corresponde a la presentacin del adn
de alimentos mnimamente tratados mediante procesos tr- de la clula como un filamento axial (Errington, 1993). Duran-
micos o refrigerados (Peck, 2009; Peck, Stringer, y Carter, 2011). te el estadio III, la preespora es endocitada por la clula madre
El tratamiento trmico aplicado a estos alimentos logra la eli- para formar una clula distinta rodeada por las membranas
minacin de las clulas vegetativas, pero no las esporas bacte- interior y exterior. En la etapa IV se lleva a cabo la sntesis de la
rianas (Lund y Peck, 2000). corteza de la espora, compuesta por peptidoglicano, entre las

Preespora
Septum Cubierta

Crecimiento
Clula
madre Capa
Membrana externa

Divisin asimtrica Corteza


Endocitosis
Ciclo Etapa I/II Etapa III Membrana interna
vegetativo
ADN Esporulacin
Etapa 0 Etapa IV/V/VI

Fisin
Binaria

Germinacin Fase tardia de


la esporulacin

Lisis de la clula
madre Etapa VII

Fig. 1. La esporulacin y el ciclo de germinacin en Bacillus subtilis.


(Adaptado de McKenney, Peter, Driks y Eichenberger, 2012)

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membranas interior y exterior de la preespora, y es seguida de germinacin, la espora ya no puede volver a su estado inac-
la etapa V durante la cual se lleva a cabo la formacin de la capa tivo (Foster y Johnstone 1990; Setlow 2003). La germinacin,
de la espora. Durante las etapas IV a VI, la clula madre tam- como ya se trat en apartados anteriores, puede iniciarse en
bin sintetiza una molcula especfica de la espora que es muy respuesta a diversos estmulos, que varan dependiendo de la
abundante, cido piridina-2,6dicarboxlico [cido dipicolni- especie. Estos incluyen, pero no estn limitados a nutrientes
co (dpa)]. Esta se acumula en la preespora y est acompaada metabolizables, tales como aminocidos y azcares especfi-
por una reduccin de su contenido de agua. La maduracin de cos, como algunas especies inicas, tensoactivos catinicos y
la espora se lleva a cabo durante esta etapa, y se caracteriza quelatos (en particular Ca+2 y dpa) y algunos tratamientos fsi-
porque el material de la capa se vuelve ms denso en aparien- cos tales como altas presiones (Setlow, 2008).
cia. En la etapa final (VII) se realiza la lisis de la clula madre y El crecimiento se define como todos los eventos de desa-
la liberacin de la estructura de la espora madura. La estructura rrollo que tienen lugar despus de la germinacin, incluyendo
de la espora madura protege a los microorganismos inactivos la iniciacin del metabolismo y sntesis macromolecular (hin-
de las condiciones desfavorables externas hasta que, una vez chazn de la espora), la emergencia (donde se desprenden las
ms, se vuelven favorables para el crecimiento celular vegeta- capas exteriores de las esporas) y el crecimiento de la nueva
tivo. La espora latente es entonces reactivada y se somete a la clula. Todo esto representa un retorno de la espora al cre-
germinacin y el crecimiento vegetativo (Leggett, McDonnell, cimiento de las clulas vegetativas (Foster y Johnstone 1990;
Denyer1, Setlow, y Maillard, 2012; Higgins y Dworkin, 2012). Setlow 2003).

2.2. Proceso de germinacin 2.3. Caractersticas de resistencia de las esporas


Las esporas de las especies de Bacillus pueden permanecer la- Como ya se ha hablado antes, las endosporas bacterianas so-
tentes por mucho tiempo y son extremadamente resistentes breviven en condiciones extremas, por ejemplo, de calor y de-
a una gran variedad de condiciones ambientales (Setlow y Jo- secacin debido al estado deshidratado del ncleo de la espo-
hnson, 2007). La germinacin de las esporas se ha relaciona- ra lo cual es debido, en gran parte, a la corteza. Esta estructura
do con la presencia de molculas especficas en el ambiente se compone de una forma de peptidoglicano que es similar,
denominadas germinantes (Foster y Johnstone, 1990; Setlow, aunque no idntico, al peptidoglicano de las clulas vegeta-
2003). Los germinantes especficos que desencadenan la ger- tivas, adems cuenta con la presencia de residuos de cido
minacin de esporas varan entre las especies y son a menudo -lactmico murmico, resultantes en menos cadenas latera-
nutrientes necesarios para el crecimiento y la divisin celular les de pptido y una reduccin en el entrecruzamiento de las
(Adam, Brunt, Brightwell, Flint, y Peck, 2011). De tal forma que cadenas de glicanos (Higgins y Dworkin, 2012). La espora posee
en condiciones apropiadas, cuando existe la unin de nutrien- dos membranas distintas, separadas por la pared de la clula
tes especficos a los receptores de nutrientes germinantes de germinal y una capa muy fina de peptidoglicano que rodea la
las esporas, por sus siglas en ingls grs, las esporas pueden preespora. El ensamblaje del peptidoglicano de la espora se
iniciar de nuevo un crecimiento activo a travs de un proce- produce entonces en el espacio entre los dos membranas, esto
so llamado germinacin, seguido del crecimiento vegetativo como resultado de la accin de los genes expresados en el com-
(Paidhungat y Setlow, 2000; Paidhungat y Setlow, 2001; Setlow, partimento de la clula madre, incluida una codificacin para
2003; Setlow y Johnson, 2007). la forma, el alargamiento, la divisin y la esporulacin (Setlow,
La transicin de la espora a clula vegetativa implica tres 2006; Higgins y Dworkin, 2012).
fases distintas: la activacin, la germinacin y el crecimiento. Se ha reportado que las esporas inactivas de diversas es-
La activacin puede ser provocada por condiciones de calor, pecies de Bacillus contienen una gran cantidad (10-20% del
el pH o la exposicin a sustancias qumicas y hace que la es- total de las protenas de la espora) de protenas pequeas so-
pora entre en el proceso de germinacin, por lo tanto rompe lubles en cido, llamadas sasp por sus siglas en ingls, en su
su estado de latencia (Leggett et al., 2012). La activacin es un ncleo (Driks y Setlow, 2000). Estas sasp son de tres tipos ,
proceso reversible que no necesariamente compromete a la y . Estas protenas se asocian con el adn de las esporas, pro-
espora en seguir con la germinacin y el crecimiento, de tal tegindolo de diversos tipos de daos (Setlow, 2000). Diversos
forma que las esporas activadas conservan la mayora de las estudios han demostrado que las sasp de los tipos y son
propiedades que poseen las latentes (Foster y Johnstone 1990; factores importantes en la resistencia de las esporas ante va-
Setlow 2003). En contraste, una vez que las esporas inician la rios agentes, incluyendo la radiacin uv, formaldehdo, cido

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nitroso y el calor seco y adems, contribuyen significativamen- al principio del ciclo de formacin de la espora rodeaba a la
te a la resistencia de las esporas al calor hmedo y al perxi- preespora, ahora rodea el ncleo y la corteza rica en peptido-
do de hidrgeno, as como la osmorresistencia (Setlow, 2000; glicano rodea esta membrana. Alrededor de la corteza, la capa
Tovar-Rojo, Cabrera-Martinez, Setlow y Setlow, 2003). Adems, de la espora consta de aproximadamente 80 protenas depo-
todas las sasp juegan un papel en el inicio del crecimiento de sitadas por la clula madre dispuestas en dos capas: interior y
las esporas por que proporcionan aminocidos por su degra- exterior (Fig. 2). En algunas especies formadoras de esporas, ex-
dacin temprana durante la germinacin y la espora utiliza cepto B. subtilis, la espora est rodeada de estructuras adicio-
estos aminocidos en el desarrollo de la clula para el meta- nales, tales como el exosporium y la capa S (Ghosh et al., 2008).
bolismo y la sntesis de protenas (Setlow, 1998; Setlow, 2000). Ya que la estructura y composicin qumica de la espora de-
De acuerdo con Setlow (2006), los factores importantes termina su resistencia es importante revisar con detenimiento
que confieren la resistencia qumica de la espora varan de estos aspectos. El exosporium es una gran estructura holgada
acuerdo con el producto qumico, pero en general incluyen: encontrada sobre las esporas de algunas especies, en partic-
(i) las protenas de la cubierta de la espora que probablemen- ular las del grupo de Bacillus cereus (Driks 2002; Waller, Fox,
te reaccionan con los agentes qumicos, (ii) la relativa imper- Fox, Fox, y Price, 2004.) Sin embargo, las esporas de muchas
meabilidad de la membrana interna de la espora que restringe otras especies, incluyendo B. subtilis, o bien no contienen un
el acceso de productos qumicos exgenos al ncleo, (iii) la exosporium, o si lo hacen, se reduce en tamao. La capa de la
proteccin de adn de la espora por su saturacin con prote- espora es una estructura compleja compuesta de varias ca-
nas del tipo sasp y (iv) la activacin de mecanismos de repa- pas y contiene aproximadamente 50 protenas en B. subtilis
racin del adn ante los agentes que matan a la espora produ- (Driks 2002; Lai et al. 2003). La cubierta es importante en la
ciendo daos al adn. resistencia de las esporas de algunos productos qumicos, a
las enzimas lticas exgenas que pueden degradar la corteza de
2.4. Estructura morfolgica de las esporas las esporas y a la depredacin por protozoos, pero tiene poco
La espora de B. subtilis es una estructura compleja (Fig. 2). El o ningn papel en la resistencia de las esporas al calor, a la
ncleo de la espora contiene el adn cromosmico que se man- radiacin u otros productos qumicos (Nicholson, Munakata,
tiene en un estado compactado con las sasp. La membrana que Horneck, Melosh, y Setlow, 2000; Setlow, 2000).

DNA

Ncleo

Membrana interior

Corteza

Membrana exterior

Cubierta

Capa interna

Capa externa

Exosporium

Fig. 2. Estructura morfolgica de la espora.


(Adaptado de McKenney, Peter, Driks y Eichenberger, 2012)

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La funcin precisa de la membrana externa, que se encuen- 2.5. Tipos de esporas segn su resistencia
tra bajo la cubierta de la espora, no est clara, aunque esta Como ya se ha discutido en apartados anteriores, las esporas
membrana es una estructura esencial en la formacin de las pueden permanecer en un estado inactivo, siendo resistentes
esporas. De hecho, la eliminacin de la membrana exterior as durante largos perodos de tiempo y puede volver a la vida r-
como de protenas de la cubierta de la espora no tiene ningn pidamente a travs del proceso de la germinacin. Durante la
efecto notable sobre la resistencia de las esporas al calor, la ra- germinacin la latencia de la espora y la resistencia extrema se
diacin y algunos productos qumicos (Nicholson et al., 2000; pierden. Ya que los microorganismos son mucho ms fciles
Setlow, 2000). de eliminar, despus de que hayan germinado, es ventajoso
La corteza se compone de peptidoglicano con una estructura desencadenar la germinacin de las esporas en los alimentos o
similar a la de la clula vegetativa, pero con varias modifica- el ambiente y, a continuacin inactivar fcilmente las clulas
ciones especficas de la espora. La corteza es esencial para la vegetativas mucho ms sensibles (Setlow, 2000).
formacin de una espora latente y para la reduccin del con- Sin embargo, esta simple estrategia ha sido anulada en
tenido de agua de su ncleo. Sin embargo, el mecanismo por gran parte porque la germinacin de las poblaciones de es-
el que la corteza de la espora logra esta ltima proteccin no poras es heterognea. En general existen normoesporas, cuyo
se conoce an. En contraste, con la membrana externa de la tiempo de germinacin es normal y otras, denominadas su-
espora, la membrana interior es una barrera contra la permea- perlatentes, que germinan demasiado lento y potencialmente
bilidad y desempea un papel importante en la resistencia de pueden volver a la vida despus de que los tratamientos para
la espora a muchos productos qumicos, en particular, los que inactivar esporas germinadas se han aplicado, incluso despus
cruzan esta membrana para daar al adn. Dicha membrana de das y hasta meses (Gosh y Setlow, 2009). Las poblaciones de
interior est formada por molculas de lpidos (Nicholson et esporas superlatentes se han aislado recientemente a partir
al., 2000; Setlow 2000). de tres especies de Bacillus, y se han caracterizado sus propie-
La parte ms interna de la espora es el ncleo o core. El dades de germinacin (Gosh y Setlow, 2009; 2010). Casi todos
ncleo contiene la mayor parte de las enzimas de la espora, los trabajos sobre los aspectos especficos de la germinacin
as como adn, ribosomas y arnt. En casi todos los casos, las de las esporas de especies de Bacillus se ha centrado en la ma-
enzimas de la espora y cidos nuclicos son idnticos a los de yor parte de la poblacin de las esporas y se ha prestado poca
las clulas en crecimiento, aunque hay algunas macromolcu- atencin a la minora que, o bien no logran germinar o germi-
las nicas en el ncleo. Tambin hay tres pequeas molculas nan muy lentamente (Ghosh y Setlow, 2009).
cuyos niveles en el ncleo son importantes en la resistencia Aunque las esporas superlatentes han sido, durante mu-
de las esporas. La primera es el agua, la cual es slo el 27-55 % cho tiempo, uno de los principales temas de preocupacin en
del peso hmedo del ncleo de la espora, dependiendo de la la industria de los alimentos, hasta hace poco haba un esca-
especie (Gerhardt y Marquis, 1989). La cantidad de agua libre so conocimiento de los factores especficos que determinan si
en el ncleo de la espora es extremadamente baja, de tal for- una espora es superlatente y sus propiedades de germinacin
ma que el movimiento macromolecular est muy restringido (Gosh y Setlow, 2010; Wei et al., 2010). Segn estudios recien-
y es probablemente el factor ms importante en la latencia tes, Gosh y Setlow (2009) reportaron que estas esporas super-
enzimtica de la espora, as como tambin determina la resis- latentes germinan muy mal con los germinantes originales,
tencia de la espora ante el calor hmedo (Gerhardt y Marquis, sin embargo, germinan razonablemente bien con mezclas de
1989). La segunda molcula es DPA. Esta molcula comprende nutrientes que se dirigen a mltiples receptores de germinan-
el 5-15 % del peso seco de la espora en las especies de Baci- tes. En estudios realizados por estos investigadores, las esporas
llus y Clostridium y se encuentra slo en el ncleo, donde est superlatentes se hicieron germinar con DPA o dodecilamina
quelado con cationes divalentes, en gran parte de Ca2+ (Ger- de Ca2+, aunque segn sus resultados, no lograron germinar
hardt y Marquis, 1989). El enorme depsito de DPA en el n- con altos niveles de nutrientes que activan uno o dos recep-
cleo de la espora es responsable de la reduccin del contenido tores, sino con una mezcla de nutrientes que activan ms re-
de agua en esta parte durante la esporulacin y juega un papel ceptores. Debido a estas caractersticas es muy poco probable
importante en la fotoqumica de luz uv del adn de la espora. que durante el procesado de los alimentos pueda dispararse
El tercer tipo de molcula es un grupo de protenas pequeas la germinacin de las esporas superlatentes, permaneciendo
solubles en cido (sasp) cuya funcin ya se ha tratado en el entonces de esta forma en los productos y pudiendo generar
apartado anterior (Setlow, 1998). daos a los productos o a los consumidores.

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3. Mtodos de inactivacin pondientes como efectos letales, un efecto letal acumulativo


de esporas en alimentos dependiente del nivel de presin aplicado podra generarse.
Debido a las amplias necesidades de producir alimentos segu-
ros se ha desarrollado una gran variedad de mtodos para su 3.1.2. Irradiacin
procesamiento. En general podemos hablar de tres tipos: fsi- Las fuentes comunes de radiacin ionizante son utilizando haz
cos, qumicos y otros dentro de los cuales podemos mencionar de electrones, infrarroja (ir), ultravioleta (uv), rayos X o ra-
a las tecnologas emergentes. yos gamma (). Estos tratamientos generalmente funcionan
al daar el adn de los organismos. Sin embargo, los efectos
3.1. Fsicos de la irradiacin pueden afectar la calidad nutricional de los
Se consideran mtodos fsicos de inactivacin de microorga- alimentos y varan dependiendo de los nutrientes, alimentos
nismos a aquellos que se basan en el uso de temperaturas y y condiciones de irradiacin (dosificacin, temperatura y con-
presiones modificadas para alterar alguna estructura de las c- diciones atmosfricas). La seguridad de los alimentos irradia-
lulas o las biomolculas esenciales para su metabolismo. En dos, ha sido ampliamente probada. Sin embargo, slo en los
la tecnologa de alimentos los mtodos ms utilizados son los alimentos sometidos a las dosis ms altas se ha reportado que
trmicos con calor hmedo, altas presiones y la deshidratacin pueden inactivarse esporas (Morehouse y Komolprasert, 2004).
(Jay, 2000). Sin embargo, de estos mtodos los nicos que re- Se ha estudiado que el efecto de la radiacin infrarroja en
portan una inactivacin de esporas son los de altas presiones e la inactivacin de esporas es debido a que la radiacin IR se
irradiacin, por lo cual nos centraremos en los estudios reali- convierte rpidamente en calor, lo cual resulta en un calen-
zados con estas tecnologas. tamiento local intenso de las esporas (Mamouni, Tang, Wu,
Vlahovic y Yang, 2011). Estos autores postulan la posibilidad
3.1.1. Procesamiento de alta presin de que el calor local extremo, en estrecho contacto con las es-
El procesamiento de alta presin parece tener un futuro pro- poras, dae algunos de sus componentes y por lo tanto mejore
metedor para la conservacin de alimentos, debido a las re- la actividad antimicrobiana y dispare la germinacin. La posi-
ducciones en las poblaciones microbianas que se puede lograr ble razn del crecimiento de clulas vegetativas despus de
sin elevacin significativa de la temperatura del producto. El tratamientos de IR aplicados a las esporas fue que los daos
uso de presiones que se acercan a 100,000 libras por pulgada fsicos parciales en las paredes de las esporas pueden desen-
cuadrada para tiempos de unos pocos minutos, produce un cadenar la germinacin. Adems, el calentamiento local sobre
alimento procesado con el sabor, color y textura similar al fres- las esporas puede producir una abrasin mecnica provocan-
co (Snchez-Moreno, De Ancos, Plaza, Elez-Martnez y Cano, do la germinacin por la activacin de las enzimas lticas de la
2009). Zhang y Mittal (2008) reportan diversas condiciones con corteza llamadas CwlJ y SleB (Dong, Tang, Wu, Vlahovic y Yang,
este tratamiento para la inactivacin de esporas de diversas es- 2013). Estas enzimas estn presentes en la espora en una for-
pecies. Sin embargo, Kalchayanad, Dunneb, Sikes y Ray (2004) ma activa, pero no actan hasta que son activados por el dao
reportan que en jugos no se elimina a las esporas en condicio- mecnico a las esporas o por estmulos de germinacin como
nes de operacin y segn Lund y Peck (2000) tambin afirman Ca2+ - dpa para la enzima CwlJ o algn otro estmulo para la
que si bien no las elimina, las hace germinar por lo que seran enzima SleB. De tal forma que pueden daar parcialmente la
susceptibles de otros tratamientos que podran ser aplicados capa de la espora, por lo que es ms permeable. Exmenes a
posteriormente. nivel molecular mostraron que el tratamiento con IR alter la
Algunos estudios reportan que la presin a temperatura expresin de los genes relacionados con la virulencia de B. an-
constante durante cierto tiempo puede desencadenar la ac- thracis, los cuales regulan la germinacin (incluyendo la libe-
tividad de la enzima ltica de la corteza (cle) y causar la des- racin de dpa) (Dong et al., 2013).
activacin de esta enzima (Heinz y Knorr, 1998). Las reaccio- Por otra parte, tanto los rayos uv como la radiacin con ra-
nes de germinacin se inician por la apertura de los canales yos , matan a las esporas mediante la generacin de daos en
de dpa (Paidhungat et al., 2002) a presiones superiores a 500 el adn. El mecanismo de resistencia de las esporas a estas ra-
MPa. A presiones mayores a 500 MPa una rehidratacin parcial diaciones no se ha estudiado ampliamente, pero los estudios
del ncleo sin actividad de la cle (Setlow, 2003) podra inducir existentes reportan que no es debido a la unin de las sasp de
un efecto letal adicional. Uniendo todas las reacciones corres- los tipos y , por el contrario, la resistencia de las esporas a

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ciertos tratamientos con radiacin uv es en gran parte, debi- no que logran mutaciones en las clulas vegetativas, pero no
do a una alteracin en la fotoqumica del adn causado por la lo hacen en las esporas (Setlow et al., 1998; Tennen et al., 2000;
unin de SASP de los tipos y al adn, y en menor medida a Cortezzo y Setlow, 2005).
la accin fotosensibilizante del ncleo de la espora por su de- Para algunos agentes qumicos, incluyendo aldehdos
psito de DPA (Setlow, 2006). Debido a su falta de accin enzi- grandes tales como glutaraldehdo y orto-ftalaldehdo, el me-
mtica y del metabolismo, la espora latente no puede reparar canismo por el que se eliminan las esporas an no est claro,
el dao a macromolculas como el adn o las protenas. Por lo aunque se sabe que estos dos productos qumicos no matan
que la reparacin del dao en el adn se llevar a cabo cuando a las esporas por daos en el adn (Tennen et al., 2000; Cabre-
la espora vuelve a la vida en el proceso de la germinacin y el ra-Martnez, Setlow y Setlow, 2002). Tratamientos con cidos
crecimiento, cuando la actividad metablica se reanuda (Set- fuertes matan a las esporas probablemente por la ruptura de
low, 2003). Sin embargo, si el dao que se ha acumulado en la membrana interior la cual es una barrera de permeabilidad
las esporas durante la latencia es demasiado, este dao puede (Setlow et al., 2002). Este tambin puede ser el mecanismo
desbordar la capacidad de los sistemas de reparacin y dar lu- para matar esporas por disolventes orgnicos a temperaturas
gar a la muerte de la espora germinada (Setlow y Setlow, 1996; elevadas. Por el contrario, el tratamiento con un lcali fuerte,
Tennen, Setlow, Davis, Loshon y Setlow, 2000). el cual se pensaba poda causar la muerte de las esporas, no
las mata, ya que pueden ser reactivadas con un tratamiento
3.2. Qumicos adecuado con lisozima (Setlow et al., 2002). El lcali parece
Debido a que los procesos fsicos utilizados en la tecnologa inactivar a las enzimas lticas necesarias para la hidrlisis de la
de alimentos para la inactivacin de microorganismos pueden corteza de las esporas durante su germinacin. Esta inactiva-
deteriorar la estructura del alimento, se ha recurrido al uso de cin puede deberse a que estas enzimas se encuentran en las
agentes qumicos para alterar o destruir a los microorganismos capas exteriores de la espora donde se considera que son ms
contaminantes de los alimentos y as evitar la produccin de sensibles a los lcalis que otros componentes de la espora si-
esporas. Dentro de los procesos qumicos los ms utilizados tuados en las capas ms internas (Setlow et al., 2002).
son la acidificacin y el ahumado. Dichos procesos pueden
generar un valor agregado al producto al modificar de mane- 3.3. Tecnologas emergentes
ra favorable las caractersticas sensoriales del producto final.
Sin embargo, estos tratamientos no son efectivos en la elimi- 3.3.1. Plasma
nacin de esporas. Por estas razones se est buscando algunos Este mtodo se ha reportado que inactiva tanto clulas vegeta-
otros qumicos que pudieran lograr este objetivo sin modificar tivas como endosporas bacterianas. Tres mecanismos bsicos
las caractersticas sensoriales de los alimentos o ms an, con- se han atribuido a la inactivacin de las esporas. Estos incluyen
tribuir de manera positiva a ellas. la destruccin de adn por irradiacin uv, la volatilizacin de
Las esporas son extremadamente resistentes a una varie- compuestos de la superficie de esporas por los fotones uv, y la
dad de productos qumicos, incluyendo cidos, bases, agen- erosin de la superficie de las esporas por la adsorcin de es-
tes oxidantes, agentes alquilantes, aldehdos y disolventes pecies reactivas como los radicales libres (Philip et al., 2002).
orgnicos. Como consecuencia, las esporas son a menudo los Efectos sinrgicos entre estos posibles mecanismos de inacti-
organismos ms resistentes a los productos qumicos des- vacin se puede esperar, dependiendo de las condiciones ope-
contaminantes diseados para eliminar microorganismos. rativas y el diseo del generador de plasma.
Afortunadamente, las esporas pueden destruirse por algunos Investigaciones recientes incluyen la evaluacin de la in-
tratamientos qumicos. En algunos casos (por ejemplo, for- activacin de los patgenos transmitidos por alimentos sem-
maldehdo, cido nitroso, agentes alquilantes) el mecanismo bradas en pelculas delgadas de agar, las cuales se tratan con
de la muerte de esporas es posible a travs de mltiples daos una descarga luminiscente de plasma (Kayes et al., 2007) y
en el adn, debido a que los supervivientes acumulan muta- tambin se pulveriza sobre la superficie de lminas de tere-
ciones en diversos genes sensibilizando a las esporas ante es- ftalato de polietileno termo-sensible (pet), expuesto a una
tos agentes. Sin embargo, esto slo es cierto para unos pocos descarga de barrera dielctrica (Muranyi, Wunderlich y Heise,
productos qumicos genotxicos a ciertas concentraciones y 2007). Yu et al. (2006) han informado que altas cargas de Es-
algunos agentes oxidantes tales como el perxido de hidrge- cherichia coli en membranas de policarbonato se ven afecta-

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das adversamente con la penetracin de especies en plasma y Conclusiones y comentarios finales


una alta eficacia de la inactivacin microbiana se obtiene con
este mtodo. Se puede concluir que el plasma de baja tempe- Desde los tratamientos trmicos, que fueron de las primeras
ratura (ltp) puede ser muy efectivo contra las clulas micro- tecnologas de conservacin en los alimentos, hasta las actua-
bianas y esporas en las superficies y por otra parte se puede les tecnologas emergentes tienen como objetivo el producir
utilizar para la pasteurizacin no trmica y la esterilizacin alimentos de alta calidad de inocuidad. Sin embargo, algunos
de los alimentos segn reportan Deng et al. (2007). El uso de microorganismos como los esporulados son resistentes a mu-
la radiacin con luz ultravioleta pulsante como un medio de chos de estos tratamientos. La mayora de los tratamientos
inactivacin microbiana es una tecnologa madura que tiene trmicos como la pasteurizacin han demostrado ser comple-
aplicacin comercial en la desinfeccin de superficies de em- tamente ineficientes para la eliminacin de esporas al igual
balaje de materiales (Anon, 2006), pero muestra limitaciones que los procesos de deshidratacin y algunos qumicos como la
debido a los efectos secundarios en los productos alimenticios acidificacin. Por el contrario, existen reportes en tecnologas
como prdida de algunas caractersticas sensoriales (Gmez emergentes como altas presiones, irradiacin y procesos avan-
Lpez, Ragaert, Debevere y Devlieghere, 2007). zados de oxidacin que demuestran su efectividad sobre es-
poras de algunos microorganismos como B. subtilis ya sea por
3.3.2. Procesos avanzados de oxidacin lograr eliminarlas o por disparar la germinacin para despus
Estos procesos se basan en la generacin de radicales hidroxil eliminarlas ms fcilmente como clulas vegetativas por otros
e incluyen luz uv/perxido de hidrgeno, luz uv/ozono, rayos mtodos. Algunos de los mtodos que reportan la eliminacin
de electrones, sonlisis, fotocatlisis con dixido de titanio y de esporas de algunas especies de bacterias como B. subtilis
Reactivo de Fenton. Todos estos tratamientos se han reporta- y C. botulinum, muestran limitaciones en cuanto a su uso en
do como altamente eficientes en la eliminacin de microor- diferentes tipos de alimentos (slidos o lquidos) y debern
ganismos (Bandala, Castillo, Gonzlez y Sanchez-Salas, 2011), probarse an para verificar el impacto del proceso en cuanto
en especial, se ha probado la reaccin de Fenton para la elimi- a la manera en que se afectan el contenido de nutrientes y la
nacin de esporas en agua con resultados favorables (Bandala calidad sensorial de stos. Por tales motivos, se debe continuar
et al., 2008). Sin embargo, los estudios para establecer si estos la investigacin en esta rea para tratar de comprender los me-
procesos pueden utilizarse ampliamente en otros alimentos, canismos que generan la resistencia de los microorganismos
sin un posible cambio en las caractersticas sensoriales, an con el fin de desarrollar o adaptar las metodologas para lograr
estn en desarrollo. su eliminacin efectiva de los alimentos.
La mayora de los agentes oxidantes eliminan a las espo-
ras por causar algn tipo de dao a sus capas externas, prin-
cipalmente a la membrana interna de la espora, de manera
que cuando las esporas tratadas germinan, estas rupturas en Agradecimientos
la membrana dan como resultado su muerte (Young y Setlow,
2004a; Young y Setlow, 2004b; Shapiro, Setlow y Setlow, 2004). La autora Luz del Carmen Huesca Espitia agradece al Consejo
El tratamiento semiletal de las esporas con diversos agentes Nacional de Ciencia y Tecnologa (conacyt) y a la Universidad
oxidantes tambin sensibiliza a las supervivientes para un tra- de las Amricas Puebla (udlap) por el apoyo brindado para sus
tamiento posterior (por ejemplo calor hmedo), ya que una estudios de doctorado.
membrana interior en buen estado le dara la resistencia com-
pleta a las esporas (Cortezzo, Koziol-Dube, Setlow y Setlow,
2004). Sin embargo, la naturaleza precisa de los daos de la
membrana interna causada por agentes oxidantes an no se Referencias Bibliogrficas
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