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de laboratorio en infectología
M. Gijón Mediavilla, I. Durán Lorenzo, J. Ruiz Contreras
Servicio de Pediatría. Hospital 12 de Octubre, Madrid
Resumen Abstract
Las enfermedades infecciosas constituyen, todavía Infectious diseases are still an important part
hoy, una parte importante de la morbilidad global of overall morbidity in pediatrics, and rapid,
en Pediatría, y se hacen necesarias pruebas accurate and accessible complementary tests
complementarias rápidas, precisas y accesibles are needed to guide the diagnosis and direct
al clínico, para orientar el diagnóstico y dirigir el treatment in the early stages. There are multiple
tratamiento en las primeras fases. Existen múltiples laboratory tests that can be determined in
exámenes de laboratorio mediante muestras de sangre, samples of blood, urine and cerebrospinal fluid,
orina y líquido cefalorraquídeo, que pueden orientar which can guide the etiology and severity of
acerca de la etiología y la gravedad de la infección y que the infection and can be determined in the
pueden determinarse en las primeras horas de la misma. first hours. Although culture is still the gold
Aunque el cultivo sigue siendo, a día de hoy, la técnica standard technique for diagnosis of bacterial,
de elección para el diagnóstico definitivo de infecciones viral and fungal infections, the new nucleic
bacterianas, víricas y fúngicas, las nuevas técnicas acid amplification tests represent an important
moleculares de amplificación genética suponen un advance due to its increased sensitivity.
importante avance por su mayor sensibilidad y rapidez.
Palabras clave: Enfermedades infecciosas; Diagnóstico laboratorio; Cultivos bacterianos; Técnicas de amplificación
genética.
Key words: Infectious diseases; Laboratory diagnosis; Bacterial cultures; Genetic amplification techniques.
Introducción
la información disponible de las pruebas de los exámenes complementarios. Sería
E s indispensable establecer la
importancia de la orientación
inicial de las pruebas diagnósti
cas, dirigiéndolas hacia una sospecha
clínica basada en la anamnesis y en la
solicitadas.
Dado que, en los últimos años, se
ha producido un importante desarrollo
de diversas técnicas de estudio micro
biológico (1), en muchos casos no del
necesario, por lo tanto, establecer una
comunicación directa con otros espe
cialistas (infectólogos, microbiólogos y
técnicos de laboratorio) implicados en el
procesamiento y valoración de las mues
exploración, que fundamentará su inter todo conocidas por los especialistas tras remitidas, con el fin de asegurar
pretación y contextualización posterior. dedicados a la clínica, parece primor que estas son las idóneas para confirmar
Así mismo, es necesario interpretar y dial establecer líneas de comunicación nuestra sospecha diagnóstica y que su
analizar, de forma detallada, los resulta directas y equipos multidisciplinarios, envío se realiza en los medios más ade
dos obtenidos, tratando de extraer toda que faciliten la selección e interpretación cuados(2) (Tabla I).
ALT: alaninaminotransferasa; AST: aspartoaminotransferasa; TP: tiempo de protrombina; TTPA: tiempo de tromboplastina parcial
activada; SIRS: síndrome de respuesta inflamatoria sistémica.
se encuentran: la proteína C reactiva, la en Pediatría. A continuación se detallan sepsis. A veces, se altera en infeccio
procalcitonina, el fibrinógeno, la ferritina algunas de ellas: nes del tracto urinario que afecten
y otras menos conocidas y empleadas • LDH (lactato deshidrogenasa). Es al parénquima renal y debe ser, así
como: el amiloide, la protrombina o el una enzima intracelular ubicua en mismo, monitorizada.
plasminógeno(4,5). Entre las proteínas de el organismo, liberada al plasma en
fase aguda negativas, estarían la albú situaciones de destrucción celular. Su Examen de orina
mina, la transferrina o la antitrombina. elevación indica destrucción de hepa
La velocidad de sedimentación globular tocitos (hepatitis agudas) y hemólisis La combinación de la tira reactiva de
es una medida indirecta de las proteínas intra o extravascular, como la que se orina y estudio microscópico de la mues-
en plasma, que se altera cuando cambia produce en la malaria. Es importante, tra permiten alcanzar una sensibilidad muy
la proporción albumina/globulinas. según el contexto clínico, llevar a alta con una buena especificidad para el
• Proteína C reactiva: se trata de una cabo un diagnóstico diferencial con diagnóstico de infección urinaria.
proteína sintetizada en el hígado las enfermedades oncológicas.
en respuesta a diversas citoquinas • Transaminasas. Son enzimas intra Aunque el diagnóstico definitivo de
liberadas durante los procesos infla celulares presentes principalmente infección urinaria solo puede realizarse
matorios, especialmente la IL-6 y en los hepatocitos, se elevan en mediante un cultivo recogido en condi
la IL-1b. Su liberación induce, a su plasma en cuadros de destrucción ciones estériles (punción suprapúbica o
vez, la activación del complemento, celular hepática en el contexto de sondaje vesical), existen test que ayudan
la apoptosis celular y la amplifica infecciones agudas (hepatitis víricas, y orientan al diagnóstico precoz. La tira
ción de la señal inflamatoria. infección por virus de Epstein-Barr). reactiva (reacciones químicas con cam
Se eleva a las 12-14 horas de la agre Pueden indicar daño hepático secun bios de color) permite determinar la pre
sión y tiene un pico aproximado a las dario en infecciones graves (sepsis). sencia de estearasa leucocitaria (detecta
24-48 horas de su inicio. • Bilirrubina. Es un producto de la leucocituria) y nitritos (bacteriuria) en
• Procalcitonina: en situación basal, degradación de la hemoglobina y de orina, y el examen microscópico detecta
se trata de la proteína precursora la eliminación digestiva mediante la y cuantifica, mediante visión directa, la
de la calcitonina y se sintetiza en producción hepática de ácidos bilia presencia de leucocitos o bacterias en
la glándula tiroidea, en respuesta res. Puede elevarse en situaciones de orina, entre otros hallazgos.
principalmente a hipercalcemia. En hemólisis (en su fracción indirecta La combinación de tira reactiva y
situaciones de sepsis o estrés grave, o no conjugada), como las referidas estudio microscópico permite alcanzar
pasa a ser sintetizada por múltiples previamente. Puede traducir coles una sensibilidad del 99% (leucocituria o
tejidos y deja de escindirse en cal tasis intra o extrahepática en hepa nitrituria o bacteriuria) con una especi
citonina, respondiendo su síntesis titis agudas e infecciones del tracto ficidad del 80-90%(6,7) (Tabla II).
principalmente al estímulo de cito biliar (en su fracción directa), como
quinas como la IL-1, IL-6 y TNF. colecistitis o colangitis. Examen de líquido
Su función biológica no está del • Función rena l. S e deter m i na
todo bien establecida, pero parece mediante los productos de elimina cefalorraquídeo
estar implicada en la inducción de ción renal circulantes, como la crea El estudio citobioquímico y micro
la migración monocitaria. Puede tinina o la urea (e interpretada en el biológico del líquido cefalorraquídeo
detectarse en plasma en las 2-3 pri contexto clínico). Debe ser monito (LCR) es fundamental en todo paciente
meras horas tras la introducción de rizada en toda infección grave, pues con sospecha de infección del sistema
una endotoxina, y presenta un pico a el daño renal puede traducir una nervioso central. En las meningitis
las 12 horas del inicio de la infección. afectación multiorgánica precoz en bacterianas, es habitual un recuento
Su interés clínico radica en ser un el contexto de una respuesta infla leucocitario elevado y un predominio
marcador específico y precoz para matoria sistémica, como sucede en la de células polimorfonucleares (PMN)
infecciones bacterianas invasivas,
presentando, sin embargo, algunos
falsos positivos (periodo neonatal, Tabla II. Sensibilidad y especificidad de los datos del análisis de orina en el
distrés respiratorio agudo, malaria, diagnóstico de la infección urinaria
fungemia, traumatismo, postcirugía,
Prueba Sensibilidad (%) Especificidad (%)
quemaduras, parada cardiorrespirato
ria...) y negativos (infecciones locali Estearasa leucocitaria 83 (67-94) 78 (64-92)
zadas, endocarditis subaguda…)(3). Nitritos 53 (15-82) 98 (90-100)
E. leucocitaria o nitritos 93 (90-100) 72 (58-91)
Bioquímica
Sedimento: leucocitos 73 (32-100) 81 (45-98)
Múltiples determinaciones en el Sedimento: bacterias 81 (16-99) 83 (11-100)
laboratorio de bioquímica básica pue
E. leucocitaria o nitritos o 99,8 (99-100) 70 (60-92)
den aportar información y contribuir al leucocitos o bacterias
diagnóstico en enfermedades infecciosas
Tabla III. Características más habituales del LCR según la etiología de infección del SNC
mayor del 70%. Existen excepciones, ya micro-organismo no solo permite cono El hemocultivo es el método de
que un 10% de las meningitis bacteria cer la causa de infección, sino determi elección para diagnosticar las infeccio
nas presentan predominio de linfocitos nar la sensibilidad a los antibióticos de nes de la sangre y del endotelio, aunque
y monocitos, y en las meningitis causa la bacteria causal. algunas bacterias pueden no crecer en los
das por enterovirus (70-80% del total de El éxito del cultivo depende de medios de cultivo utilizados rutinaria
meningitis víricas) puede haber un pre muchos factores. Entre los más impor mente. Con los nuevos métodos automa
dominio de polimorfonucleares, hasta tantes se encuentran la selección, reco tizados, se puede detectar el crecimiento
en la mitad de los casos (Tabla III). gida, transporte, almacenamiento y pro del microorganismo en las primeras 24
Una cifra baja de glucosa en LCR cesamiento de la muestra. Es primordial horas y, en la mayoría de los casos, dispo
puede sugerir meningitis de origen bac una comunicación permanente entre los ner de la identificación completa en 48
teriano. El índice glucosa LCR/glucosa clínicos y el laboratorio de microbiolo horas. Para algunas bacterias, se necesi
plasma <0,4 tiene una sensibilidad del gía, para poder determinar el signifi tan periodos de incubación más largos(1).
80% y una especificidad del 98% para el cado real de los resultados. Candida sp, otros hongos levaduri
diagnóstico de meningitis bacteriana en A la hora de recoger algunas mues formes e incluso algunos hongos fila
niños fuera del periodo neonatal. En los tras, hay que tener en cuenta la micro mentosos pueden, también, crecer en los
recién nacidos pretérmino, se considera biota normal residente en el área de la medios de cultivo habituales.
alterado una ratio glucosa LCR/ glucosa toma (senos paranasales, tracto respira La toma correcta del hemocultivo
sérica ≤ 0,6(8) (Tabla III). torio, piel, etc.) que puede “ocultar” al es fundamental para evitar la conta
patógeno causal o complicar la inter minación por bacterias residentes en la
Laboratorio de microbiología pretación de los resultados del cultivo(1). piel como: Staphylococcus epidermidis,
En las heridas quirúrgicas o trau Streptococcus viridans, Bacillus sp y
Cultivos bacterianos máticas, es preferible intentar recoger difteroides. El aislamiento de estas bac
muestras del tejido, fluidos de la herida terias en el hemocultivo representa, casi
Los cultivos son el método definitivo y aspirados, más que obtener frotis de siempre, contaminación. Sin embargo,
para el diagnóstico de las infecciones la superficie de la misma, ya que el fro hay algunas circunstancias (endocardi
bacterianas, ya que permiten identificar el tis recoge microbios que colonizan la tis, estados de inmunosupresión, sujetos
agente causal y determinar su sensibilidad herida y, además, es difícil recuperar las portadores de catéteres venosos centra
a los antibióticos. bacterias y hongos desde las fibras de la les, prematuridad) en las que estos pató
torunda(1). genos tienen un papel causal(1).
Pese al desarrollo de nuevas técni En general, los frotis deberían reser La recogida correcta de la sangre
cas para detectar los microorganismos varse para el diagnóstico de las infeccio implica la desinfección del sitio de pun
patógenos, los cultivos siguen siendo nes nasofaríngeas y respiratorias. Siem ción, que se realiza con clorhexidina en
el método definitivo para identificar pre que sea posible, los cultivos deben los niños mayores de 2 meses; en los
el agente causal en la mayoría de las tomarse antes de iniciar el tratamiento menores de esta edad, se utiliza clor
infecciones producidas por bacterias antibiótico(1,9). hexidina acuosa.
y en algunas causadas por hongos (1). La cantidad de sangre para el hemo
La cantidad de sangre del hemocultivo
Debería intentarse su recogida siempre cultivo depende de la edad y del peso
depende de la edad y del peso del niño.
que sea posible, ya que el aislamiento del del niño, oscilando desde 2 ml en pre
maturos de 2.000 g de peso, 4 ml en los casos de Haemophilus influenzae y cultivo bacteriano (Gold standard para
RN > 2.000 gramos y lactantes de hasta meningococo y de menos del 50% en las el diagnóstico) en aquellos casos en los
13 kg, y 10 ml en los niños de >13 kg meningitis por bacilos gram negativos. que el test resulte negativo. Otros, sin
hasta 36 kg, y 20-30 ml en niños que La especificidad oscila entre el 95% y el embargo, sí que lo recomiendan, sobre
pesan más de 36 kg. Cuando se obtienen 100% para las tres bacterias(10). todo, en aquellos pacientes por encima
> 10 ml, la cantidad se reparte en dos de los 4 años(11,12) o en pacientes con
alícuotas para dos botellas con medio Detección de antígenos test rápido en los que sea necesario des
cultivo aerobio y anaerobio, pero si la bacterianos. Test rápido cartar la etiología estreptocócica, como
cantidad es menor puede optarse por de estreptococo historia familiar de fiebre reumática
hacer la siembra exclusivamente en Cuando el test rápido para detección y pacientes inmunodeprimidos o con
medios aerobios. Para aumentar la pro de antígeno de estreptococo A es negativo enfermedades subyacentes.
babilidad de aislamiento, se recomienda, en niños sanos, con sospecha de faringitis Aunque la detección del antígeno de
siempre que sea posible, hacer dos de esta etiología, no es necesario realizar neumococo en orina es de gran valor en
hemocultivos en momentos distintos cultivo faríngeo. los adultos para el diagnóstico de infec
separados por varios minutos u horas(1). ciones de neumocócicas, su uso no está
El cultivo del LCR no solo identi La mayor parte de las guías de prác aprobado en niños. Esto se debe a que
fica la bacteria causal, sino que permite tica clínica recomiendan la realización los niños son, con mucha frecuencia,
determinar su susceptibilidad a antibió de test rápidos de estreptococo solo en portadores de neumococo en la nasofa
ticos. En los pacientes que han recibido aquellos casos sugestivos de faringoa ringe, lo que da lugar a falsos positivos
una o dos dosis de antibióticos, el cultivo migdalitis estreptocócica, considerando del antígeno neumocócico urinario.
puede negativizarse, particularmente así a aquellos que presenten 3 o más
en el caso del meningococo, pero en un criterios de Centor modificados o de Diagnóstico serológico
porcentaje de pacientes persiste positivo. Mc Isaac (Tabla IV).
En los pacientes previamente tratados, Para la realización de la prueba, es Las técnicas inmunológicas permi
son especialmente útiles las técnicas de esencial una adecuada técnica de hiso ten detectar, identificar y cuantificar
amplificación de ácidos nucleicos (reac pado, siendo necesaria la recogida de antígenos, con el fin de evaluar la res
ción en cadena de la polimerasa o PCR). una cantidad suficiente de antígeno puesta humoral frente a la infección y
Esta técnica tiene una sensibilidad de para obtener un resultado positivo. Se los antecedentes de exposición a agentes
79-100%, 91-100% y 67-100% para neu recomienda obtener muestra de ambas infecciosos del paciente(13). Presentan
mococo, meningococo y Haemophilus amígdalas y también de la faringe poste diversos inconvenientes, entre los que
influenzae, respectivamente. Además rior, evitando el contacto con la mucosa destacan: la falta de respuesta de anti
del examen bioquímico del LCR, siem lingual y con la saliva. cuerpos en pacientes inmunocompro
pre debe realizarse una tinción de gram Un metaanálisis recientemente metidos, la respuesta tardía (un aumento
cuando se sospeche etiología bacteriana. publicado, sitúa la sensibilidad y espe significativo de anticuerpos puede no
En pacientes no tratados, la sensibili cificidad de este test en 0,86 y 0,96, res ser detectado hasta semanas o meses
dad de esta técnica es del 60-80% y del pectivamente. Basándose en estos datos, después de la manifestación inicial) y
40-60% en los que lo han sido. La etiolo junto con la baja incidencia de complica que la persistencia de anticuerpos puede
gía influye en la probabilidad de obtener ciones asociadas a las faringitis agudas dificultar la diferenciación entre una
un resultado positivo en el gram, del 90% estreptocócicas, algunas guías no con infección reciente y una pasada.
en los casos de neumococo, del 80% en sideran necesaria la realización de un
Conceptos
• Título: La mayor parte de las prue
Tabla IV. Criterios de Centor modificados o de Mc Isaac para el diagnóstico bas serológicos aportan un resultado
de faringoamigdalitis estreptocócica positivo o negativo. El título de un
Criterio Puntos
anticuerpo se define como la dilu
ción más baja en la que se obtiene
Fiebre (temperatura > 38ºC 1 un resultado positivo, permitiendo
Ausencia de tos 1 cuantificación de un anticuerpo.
• Seroconversión: En términos gene
Ganglios cervicales anteriores hinchados y dolorosos 1
rales, se produce una respuesta de
Hinchazón o exudado amigdalar 1 IgM en una fase temprana de la
Edad:
enfermedad, alcanzando normal
- 3 a 15 años 1 mente el máximo a la semana de la
- 15 a < 45 años 0 infección y desapareciendo en varias
- ≥ 45 años -1 semanas, pudiendo persistir en
algunos casos, como por ejemplo la
El riesgo de faringitis estreptocócica según la puntuación es:
Score 0 o negativo: riesgo de 1 -2,5%; Score 1: riesgo 5-10%;
hepatitis A, durante meses. La res
Score 2: riesgo 11-17%; Score 3: riesgo 28-35%; Score 4 o más: riesgo 51-53%. puesta de IgG alcanza un máximo
a las 4-6 semanas y con frecuencia
persiste de por vida. Al ser transito cada sustancia. En la zona en la - Análisis de transferencia de
ria la respuesta de IgM, su presencia que se alcanza la equivalencia, se Western: es una variante de la
se correlaciona, en la mayoría de los forma una línea visible de preci técnica ELISA. Inicialmente, se
casos, con infección reciente, aun pitación. Esta técnica se emplea transfieren proteínas víricas a un
que, en ocasiones, dura varios meses. para la detección de antígenos papel de filtro. Posteriormente, al
Sin embargo, los métodos para la micóticos (Histoplasma, Blas- exponerlo al suero del paciente,
detección de anticuerpos IgM son tomyces, coccidioimicosis). las proteínas víricas capturan los
difíciles de estandarizar y, en algu • Inmunoanálisis para antígenos anticuerpos antivíricos específi
nos casos se obtienen falsos posi asociados a células (inmunohisto- cos y se visualizan mediante anti
tivos. La presencia de anticuerpos logía): permite identificar antígenos cuerpos antihumanos conjugados
IgG puede indicar una nueva sero en la superficie o en el interior de con enzimas. Por su mayor espe
conversión o una exposición pasada. la célula. Se emplean para la deter cificidad, se emplea para confir
Para confirmar una nueva infección minación de antígenos víricos en mar los resultados del análisis
con empleo de pruebas de IgG, es biopsias (virus herpes simple, rabia). ELISA en sujetos con sospecha
esencial demostrar seroconversión o - Inmunof luorescencia directa: de infección por VIH.
un título de IgG en ascenso. una molécula fluorescente se une - Radioinmunoanálisis: en este
de forma covalente al antígeno. caso, los anticuerpos o antíge
Métodos de detección: - Inmunofluorescencia indirecta: nos son marcados con sondas
Los complejos antígeno-anticuerpo precisa de un segundo anti radioactivas.
se pueden detectar directamente por cuerpo f luorescente específico • Fijación del complemento: en esta
técnicas de precipitación o marcando el para el anticuerpo primario, para prueba, la muestra de suero del
anticuerpo con una sonda fluorescente, detectar el anticuerpo antivírico paciente reacciona con antígeno
enzimática o radioactiva, o directa primario y localizar el antígeno. del laboratorio y complemento
mente por la medición de una reacción El citómetro de flujo permite anali adicional. Los complejos antígeno-
frente al anticuerpo. A continuación, se zar la inmunofluorescencia de célu anticuerpo se unen y activan, consu
describen las características de algunas las en suspensión y es, especialmente miendo el complemento. Posterior
de las pruebas diagnósticas empleadas útil para identificar y cuantificar mente, se cuantifica el complemento
de forma habitual en la clínica. linfocitos (inmunofenotipificación). residual por medio de la lisis de eri
• Técnicas de precipitación e inmuno- Emplea un láser para excitar el anti trocitos recubiertos con anticuerpos.
difusión: se basan en que, dentro de cuerpo fluorescente unido a la célula Se emplea para la detección de anti
un intervalo concreto de concentra y determina el tamaño de esta, por cuerpos fúngicos y víricos.
ción de antígenos y de anticuerpos medio de determinaciones de la dis • Aglutinación con látex: se basa en
denominado zona de equivalencia, persión de luz. poner en contacto partículas de
se forma un complejo excesivamente • Inmunoanálisis para anticuerpos y látex recubiertas de antígenos con
grande que precipita. Por encima y antígenos solubles: anticuerpos específicos, induciendo
por debajo de esta concentración, los - Técnica ELISA (enzimoinmu- la aglutinación. También se realiza
complejos antígeno-anticuerpo son noanálisis de absorción): consis a la inversa, poniendo en contacto
solubles. ten en el empleo de un antígeno partículas recubiertas de anticuerpos
- Inmunodifusión radial simple: inmovilizado en una superficie, para detectar antígenos. Se emplea
permite detectar y cuantificar el con el objetivo de capturar y para la detección de factor reuma
antígeno. El antígeno se coloca separar un anticuerpo presente toide, antígenos fúngicos o antíge
en un pocillo y se permite que en el suero de un paciente. El nos estreptocócicos.
difunda a través de un agar anticuerpo f ijado se detecta
que contiene anticuerpo. De posteriormente por medio de un Diagnóstico molecular
esta forma, cuanto mayor sea la anticuerpo antihumano unido mediante amplificación
concentración del antígeno, más por un enlace covalente a una
lejos difundirá hasta alcanzar la enzima. Se cuantifica por espec
de ácidos nucleicos
zona de equivalencia con el anti trofotometría, en función de la El diagnóstico molecular, mediante la
cuerpo y precipitar. intensidad del color producido amplificación de ácidos nucleicos, permite
- In mu nod i f usión doble de como respuesta a la conversión el diagnóstico en un en un corto periodo de
Ouchterlony: permite determi de un sustrato adecuado por la tiempo de un gran número de infecciones
nar las relaciones entre diferen enzima. Las diversas modali víricas y de infecciones bacterianas difíci-
tes antígenos. En esta técnica, se dades de los análisis de ELISA les de cultivar.
sitúan dos soluciones diferentes, difieren en la forma en la que
una de antígeno y otra de anti capturan o detectan los anticuer El desa r rol lo del d iagnóstico
cuerpo, abiertas hacia un agar y pos o los antígenos. Empleada, molecular ha supuesto un avance en el
permitiendo que difundan uno por ejemplo, para la detección diagnóstico y presenta múltiples ven
hacia el otro para establecer los de antígeno de rotavirus o de tajas respecto a los cultivos y técnicas
gradientes de concentración de anticuerpos anti-VIH. tradicionales, entre las que se encuen
tran la mejora de la sensibilidad para una electroforesis en la que los distintos se pueden detectar por técnicas de
la detección de algunos patógenos(1) y, fragmentos emigran dependiendo de su amplif icación molecular práctica
también, la seguridad durante el pro longitud o carga. mente todos los virus. También son
cesamiento de la muestra. Debido a su Existen varias modificaciones o muy útiles para detectar las bacterias
sensibilidad, permiten detectar mues tipos de la reacción de la polimerasa en causantes de meningitis en individuos
tras muy diluidas de ADN, es decir, cadena. tratados, en los que el cultivo puede
poblaciones con un número muy bajo La PCR en tiempo real permite negativizarse. Otras bacterias que se
de patógenos. Permiten también, tipi conocer y medir los productos de ampli detectan mediante amplificación de
ficar y distinguir cepas basándose en ficación en cada ciclo del proceso más ácidos nucleicos son: Mycoplasma
las diferencias de los genotipos, siendo que el resultado final del mismo, utili pneumoniae, Bartonella henselae,
esto especialmente útil para distinguir zando una sonda unida a dos fluorófo Coxiella burnetii y otras(1).
cepas resistentes. ros, uno en cada extremo, que hibrida Uno de los usos más extendidos de
con una zona intermedia de la hebra de las técnicas de amplificación de ácidos
Reacción en cadena ADN problema. El fluoróforo denomi nucleicos en Pediatría son las infeccio
de la polimerasa (PCR) nado “reporter” emite a una longitud de nes respiratorias, en las que han despla
La reacción de la polimerasa en onda que es totalmente absorbida por el zado a los cultivos virales. La RT-PCR
cadena (PCR) consiste en la ampli otro fluoróforo “quencher”, de forma que tiene una mayor sensibilidad que los
ficación de una o muy pocas copias no se evidencia fluorescencia. Cuando la cultivos celulares y los test de detec
de ADN, generando millones de las elongación de la nueva cadena de ADN ción rápida de antígenos virales. El virus
mismas y facilitando así su detección. tiene lugar y llega al lugar de hibrida respiratorio sincitial (VRS), virus de la
Se basa en la capacidad de la ADN ción de la sonda, esta se rompe por la gripe, parainfluenza, metapneumovi
polimerasa para sintetizar una hebra acción de la actividad 5´nucleasa de la rus, rinovirus, adenovirus, coronavirus y
de ADN complementaria a otra hebra ADN polimerasa y se libera el fluoró enterovirus, pueden todos detectarse por
de ADN (templado), que actúa como foro “reporter”, que emite fluorescencia, RT-PCR. También se dispone de PCR
molde. Como la ADN polimerasa solo que es proporcional a la magnitud de múltiple en la que se utilizan varios
es capaz de unir nuevos nucleótidos a la amplificación que ha tenido lugar en cebadores, que permiten detectar con
un grupo 3´-OH preexistente, se nece ese ciclo. un solo test varias infecciones virales.
sita un oligonucleótido corto diseñado La PCR con transcriptasa inversa Para todos estos agentes, se utiliza como
en el laboratorio (“primer” o cebador) (RT-PCR) es una PCR que utiliza muestra, el exudado faríngeo, el aspi
complementario al ADN que se quiere ARN como molde inicial y, mediante rado nasofaríngeo y el aspirado nasal.
amplificar, al que se irán uniendo los una transcriptasa inversa, se sintetiza Algunas bacterias, como: Mycoplasma
nuevos nucleótidos. Al principio de una cadena de ADN complementario pneumoniae y Chlamydophila pneu-
la reacción, se aplican altas tempera (ADNc). A partir de aquí, se realiza una moniae pueden detectarse en el frotis
turas (94-96%) para separar las hebras amplificación habitual. faríngeo, en aspirados nasofaríngeos y
del ADN problema. Posteriormente, en muestras de lavado broncoalveolar.
se añaden los cebadores y ADN poli Para la detección de Legionella pneu
La RT-PCR múltiple permite el diag-
merasas termoestables (que resistan la mophila, se prefieren el esputo inducido
nóstico de varios virus respiratorios en una
temperatura de desnaturalización). Pos sola muestra de secreciones respiratorias.
o muestras de broncoscopia. El esputo
teriormente, la temperatura se dismi espontáneo o inducido y las muestras de
nuye para que tenga lugar la adición de broncoscopias son útiles para la detec
los nucleótidos al cebador hasta formar La RT-PCR es el método de elec ción de las micobacterias no tubercu
la cadena de ADN complementaria al ción para el diagnóstico de meningitis losas y Mycobacterium tuberculosis.
ADN problema., que se volverá a des por enterovirus y parechovirus, que En este último caso, la sensibilidad de
naturalizar, aumentando la temperatura son los agentes más frecuentes en la la PCR no parece ser mayor que la del
y repitiéndose el ciclo. meningitis vírica, mostrando sensi cultivo(1).
El proceso está automatizado bilidad y especificidad superiores al En las neumonías de pacientes
mediante un termociclador en el que se 95%. La detección del ADN de otros inmunodeprimidos, las técnicas de
coloca el ADN problema, los cebadores, virus del grupo herpes (herpes sim amplificación molecular son especial
los nucleótidos y la ADN polimerasa plex, varicela-zóster, citomegalovirus, mente útiles en la detección de Pneu-
termoestable. El termociclador lleva HHV-6 y HHV7 por PCR) es también mocystis jiroveci, citomegalovirus,
a cabo ciclos alternantes de calenta el método de elección en la actualidad. micobacterias atípicas y virus respira
miento y enfriamiento de los tubos de En la encefalitis herpética, la sensibili torios, en general.
los reactivos, facilitando las dos etapas dad y especificidad de la PCR es supe En los adolescentes sexualmente
de desnaturalización y elongación de rior al 95% y se utiliza no solo para activos con síntomas de enfermedades
la cadena complementaria de ADN, el diagnóstico, sino para monitorizar de transmisión sexual, las técnicas de
dando lugar a millones de copias de esta el éxito del tratamiento, ya que una amplificación de ácidos nucleicos son
última. Finalmente, para demostrar que PCR positiva tras el tratamiento con útiles para detectar virus herpes simples,
se ha producido la generación del frag aciclovir es indicación de continuar el papilomavirus humano, Chlamydia y
mento buscado de ADN, se recurre a tratamiento. De hecho, actualmente Trichomonas.
IHQ: Inmunohistoquímica; IFA: Inmunofluorescencia; PCR: reacción en cadena de la polimerasa ; RT-PCR: PCR con transcriptasa inversa.
Otros métodos moleculares de - Southern: hibridación de sonda son M, Buntinx F, Mant D. European
detección: ADN:ADN sobre un patrón de Research Network on Recognising Seri
restricción por endonucleasas, ous Infection investigators. Diagnostic
• Análisis electroforético del ADN y
value of clinical features at presentation
polimorfismo de longitud de frag- separado electroforéticamente a to identify serious infection in children in
mentos de restricción: las deno un filtro de nitrocelulosa. developed countries: a systematic review.
minadas enzimas de restricción, - Northern: igual al anterior, Lancet. 2010; 375: 834-45.
empleadas en este tipo de técnica, siendo, en este caso, la hibrida 6. American Academy of Pediatrics. Com
reconocen y escinden secuencias ción de sonda ARN: ADN. mittee on Quality Improvement. Subcom
concretas de ADN, dando lugar mittee on Urinary Tract Infection. Practice
a fragmentos diversos de ADN. En los últimos años, se han desarro parameter: the diagnosis, treatment, and
llado y comercializado pruebas múlti evaluation of the initial urinary tract infec
Las diferencias entre la longitud
ples para la detección de los patógenos tion in febrile infants and young children.
de fragmentos de ADN generados Pediatrics. 1999; 103: 843-52.
son diferentes entre las cepas de un más comunes de los tractos intestinal y
respiratorio (Tabla V). 7. Shaikh N, et al. Does this child have a
microorganismo específico, dando urinary tract infection? JAMA. 2007; 298:
lugar al denominado polimorfismo 2895-904.
de longitud de fragmentos de res- Bibliografía 8. Tebruegge M, Curtis N. Epidemiology,
tricción (PLFR). Los fragmentos de 1. Baron EJ, et al. A guide to utilization of the etiology, pathogenesis, and diagnosis
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• Sondas genéticas: se emplean de Capítulo 16: El clínico y el laboratorio de 11. Lean WL, Arnup S, Danchin M, Steer
forma similar a lo expuesto para microbiología. AC. Rapid diagnostic tests for group A
los anticuerpos, para detectar y 3. C a s a d o -F l o r e s J , B l a n c o - Q u i r ó s streptococcal pharyngitis: a meta-analysis.
cuantificar secuencias de ácidos A, Asensio J, Arranz E, Garrote JA, Nieto Pediatrics. 2014; 134: 771-81.
nucleicos específicos, a través de la M. Serum procalcitonin in Children with 12. C o h e n J F, B e r t i l l e N , C o h e n R ,
hibridación de la sonda de ADN a suspected sepsis: A comparison with Chalumeau M. Rapid antigen detection
la secuencia idéntica de la muestra. C-reactive protein and neutrophil count. test for group A streptococcus in children
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- Hibridación in situ: detección
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de secuencias genéticas espe
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cíficas en muestras de biopsia infection in infants under 3 months of age Collection and Processing Guidelines Fall,
fijadas. Permite, por ejemplo, la presenting with fever of unknown origin Does Anyone Hear Them? Pre-Analytical
detección de células infectadas Archives of Disease in Childhood. 2009; Conundrums in Clinical Microbiology.
por citomegalovirus o papiloma 94: 501-5. Clinical Microbiology Newsletter. 2014;
virus. 5. Van den Bruel A, Haj-Hassan T, Thomp 36: 105-14.
Los Cuestionarios de Acreditación de los temas de FC se pueden realizar en “on line” a través de la web: www.sepeap.org
y www.pediatriaintegral.es.
Para conseguir la acreditación de formación continuada del sistema de acreditación de los profesionales sanitarios de carácter
único para todo el sistema nacional de salud, deberá contestar correctamente al 85% de las preguntas. Se podrán realizar los
cuestionarios de acreditación de los diferentes números de la revista durante el periodo señalado en el cuestionario “on-line”.
Respuestas
1. Respuesta correcta: e. 6. Respuesta correcta: c.
2. Respuesta correcta: c. 7. Respuesta correcta: a.
3. Respuesta correcta: d. 8. Respuesta correcta: e.
4. Respuesta correcta: d. 9. Respuesta correcta: a.
5. Respuesta correcta: e. 10. Respuesta correcta: c.