Instituto Politécnico Nacional

Escuela Nacional de Ciencias

Biológicas
Departamento de Bioquímica
Laboratorio de Métodos de Análisis

Practica 4. Estudio de algunos factores que afectan el

establecimiento de un método espectrofotométrico

Alumno: Rosales Ocampo Iván

Grupo: 5QM2

Docente: Fernández López Francisco Carmelo

Objetivos
• Seleccionar tubos de laboratorio para ser utilizarlos como celdas para el
espectrofotómetro
• Estudiar distintos parámetros que intervienen para el establecimiento de un método
espectrofotométrico

Fundamento

Cuando un método se auxilia de la luz para llevar a cabo un análisis cuantitativo se le conoce
como método espectrofotométrico, el cual puede ser subclasificado dependiendo de la longitud
de onda que utilice para el análisis (espectrofotometría de absorción visible (colorimétrica),
ultravioleta e infrarrojo).

Para que un método espectrofotométrico sea considerado como cuantitativo, es necesario que
se cumplan las siguientes reglas:

• El método seleccionado debe ser específico para cuantificar un analito de interés

• El método debe estar libre de interferencias al momento de hacer la determinación. En
dado caso que esto no se pueda cumplir, se debe controlar lo más posible dichas
interferencias.
• El método debe tener una alta sensibilidad y el límite de detección deberá corresponder
a una concentración baja del analito.

Resultados

Nota: Los cálculos se encuentran en el Anexo

Tabla 1. Selección de tubos comunes para usarlos como celdas

Tubo %T400 nm %T400 nm
No. (H2O) (NiSO4)

2 95.8 24.9

3 95.9 24.9

4 95.6 24.6

5 95.1 24.6

7 95.5 24.7

8 95.8 24.9

9 96.2 24.7

10 95.4 24.8

12 95.5 24.9

13 95.8 24.8
 Tabla 2. Curva de calibración de Fe3+ por el método del NH4SCN
Tubo Fe3+ A480 nm A LDD = 0.550
No. (g/mL) ajustada

2 0.35 0.054 0.086

3 0.70 0.114 0.132

4 1.17 0.193 0.195

5 1.75 0.279 0.273

7 2.92 0.428 0.428

8 3.50 0.511 0.506

9 4.08 0.618 0.584

10 4.67 0.673 0.662

12 8.17 1.161 1.130

13 12.83 1.719 1.753

2
1.8
1.6
1.4
1.2
A480 nm

1 y = 0.1336x + 0.0388
0.8 R² = 0.998

0.6
0.4
0.2
0
0.000 2.000 4.000 6.000 8.000 10.000 12.000 14.000
Concentración Fe3+ (mg/ml)

Figura 1. Curva de calibración

 Tabla 3. Datos para aplicar el método de Ringbom en la determinación de Fe 3+ por el
método del SCN-

Tubo Fe3+ Log A480 %T Absortancia

No. (g/mL) [Fe3+]

2 0.35 -0.456 0.086 82.118 17.882

3 0.70 -0.155 0.132 73.736 26.264

4 1.17 0.067 0.195 63.875 36.125

5 1.75 0.243 0.273 53.383 46.617

7 2.92 0.465 0.428 37.285 62.715

8 3.50 0.544 0.506 31.160 68.840

9 4.08 0.611 0.584 26.042 73.958

10 4.67 0.669 0.662 21.764 78.236

12 8.17 0.912 1.130 7.415 92.585

13 12.83 1.108 1.753 1.765 98.235

100
90
80
70
Absortancia

60
50
40
30
20
10
0
-1.000 -0.500 0.000 0.500 1.000
Log [Fe3+]

Figura 2. Gráfico de Ringbom

%Ep = 2.99
 Tabla 4. Estabilidad del color respecto al tiempo

Tiempo A480
(min)

0 0.524

30 0.49

60 0.454

90 0.433

120 0.406

0.6

0.5

0.4
A480

0.3

0.2

0.1

0
0 20 40 60 80 100 120 140
Tiempo (min)

Figura 3. Estabilidad del color en función del tiempo

Tabla 5. Efecto de la concentración de SCN- en la determinación de Fe3+
Tubo SCN- Fe3+ SCN-/Fe3+ A480
No. (g/mL) (g/mL)

1 290 4.2 69.048 0.253

2 870 4.2 207.143 0.380

3 2900 4.2 690.476 0.508

4 5800 4.2 1380.952 0.581

5 8700 4.2 2071.429 0.641

6 11600 4.2 2761.905 0.670

7 14500 4.2 3452.381 0.706

 0.800
0.700
0.600
0.500
A480 0.400
0.300
0.200
0.100
0.000
0.000 500.000 1000.000 1500.000 2000.000 2500.000 3000.000 3500.000 4000.000
SCN-/Fe3+

Figura 4. Efecto de la concentración del cromógeno

Tabla 6. Efecto del pH
Tubo pH A480
No.

1 0 0.82

2 1 0.935

3 2 0.975

4 7 0.023

5 8 0.016

1.2

0.8
A480

0.6

0.4

0.2

0
0 2 4 6 8 10
pH

Figura 5. Efecto del pH

 Tabla 7. Efecto de algunos aniones en la reacción de Fe 3+ - SCN-
A480 A480
Anión inicial final

Fluoruro 0.827 0.152

Oxalato 0.815 0.144

Tartrato 0.805 0.79

Fosfato 0.807 0.799

1
0.8
0.827 0.815 0.805 0.79 0.807 0.799
0.6
A480

0.4
0.2 0.152 0.144
0
Fluoruro Oxalato Tartrato Fosfato
Anión
A480 inicial A480 final

Figura 6. Efecto de algunos aniones

Tabla 8. Condiciones óptimas para la determinación de Fe3+ con NH4SCN

Parámetro Valor optimo

pH 2

Tiempo 0 minutos

Concentración de SCN- 870 g/mL

Limites de concentración con %Ep mínimo 2.92 – 4.67 g/mL

%Ep calculado 2.99

Aniones que interfieren (en orden Oxalato, fluoruro, tartrato, fosfato

creciente)

Limite de detección del método (LDD) 0.550

Discusión
Existen diversos factores que se deben tomar en cuenta para la implementación de un
método espectrofotométrico.
Lo primero a considerar es la selección de las celdas; las cuales deben ser ópticamente
equivalentes y de diámetro interno equivalente ya que, si no cumplen con estos
requisitos, puede provocarse luz parasita, lo cual afectaría en las lecturas de absorbancia
y transmitancia registradas.
La superficie óptica equivalente se refiere a que las celdas presenten una superficie
homogénea, es decir que sean idénticas o similares en cualquier punto de éstas.
El diámetro interno equivalente es análogo a la superficie óptica equivalente: el
diámetro de los tubos deberá ser igual en cada tubo para que el paso de luz sea
constante
En el caso del resultado obtenido en la curva de calibración, la línea recta nos indica que
se cumple con la ley de Bouger y Beer ya que se observa que la cantidad de luz absorbida
es directamente proporcional a la concentración de la muestra.
Para la duración del producto colorido se percibió que es muy poco estable por lo que,
a los pocos minutos el color proveniente de la reacción efectuada comenzará a ser
menos intenso y resultará en el registro de resultados falsos, por lo que será
recomendable realizar la lectura inmediatamente después de comenzar la reacción.
La concentración del cromógeno es otro factor que también hay que tomar en cuenta ya
que de este depende que haya una máxima absorbancia, además de que si se agrega
más esta absorbancia no cambiara por lo cual se estaría desperdiciando reactivo.
El pH es un factor que afecta a la reacción, por lo cual se debe conocer con que valor de
pH se desempeña mejor la reacción. La reacción efectuada en esta práctica se debe llevar
a cabo en un pH acido de alrededor de 2 debido a que, en pH alcalino, el cromógeno
(SCN- ) se neutraliza evitando la reacción con el ion Fe3+ haciendo que no haya desarrollo
de color y por lo tanto nos dé falsos negativos.
En otras palabras, a valores de pH ácido (2 siendo lo ideal) se mantiene el sistema
colorido. Conforme aumenta el valor de pH, el sistema pierde la capacidad de absorción
de la radiación y se obtienen absorbancias muy bajas
Con la presencia de cierto aniones, se modifica la reacción e intervienen con el desarrollo
del color.
Se usaron los compuestos: tartrato de sodio, fluoruro de sodio, oxalato de sodio y fosfato
de potasio. En el caso del tartrato y el fosfato se visualiza que casi no interfieren en la
reacción, mientras que el fluoruro y el oxalato sí lo hacen. Esto se debe a que el hierro
 presenta mayor afinidad con el fluoruro debido a su alta electronegatividad y al oxalato
debido a forma compuestos de coordinación, lo cual hace que haya una competencia
entre los iones y el SCN- para unirse al hierro.
Conclusiones
Cada tubo seleccionado presenta un diámetro interno y superficie óptica equivalente,
por lo que son ideales para ser utilizados como celdas en el espectrofotómetro.
Parámetros como el pH, concentración de cromógeno, tiempo y efecto de aniones, son
fundamentales para establecer el método espectrofotométrico utilizado.
Bibliografía
Torres Cartas Sagrario, Gómez Benito Carmen. “Técnicas instrumentales. Manual de
Laboratorio”. Editorial Universidad Politécnica de Valencia.
D.A. Skoog, J.J. Leary, 1994, “Análisis Instrumental”, McGraw-Hill, 4ta. Edición
Anexo

Ejemplo del calculo realizado para obtener las concentraciones de Fe 3+ (g/ml) para la
curva de calibración.
(14000)(0.15) 2.1 𝜇𝑔
Tubo No.2: [𝐹𝑒 3+ ] = = 2.1μ𝑔 ∴ [𝐹𝑒 3+ ] = = 0.35𝜇𝑔/𝑚𝑙
1000 6 𝑚𝑙

Ejemplo de calculo para conocer la A ajustada

Usando la ecuación de la recta y = 0.1336x + 0.0388
Tenemos que: y = (0.1336)(0.35) + 0.0388 = 0.086
Conociendo todas las A ajustadas de los 10 tubos seleccionados:
Sumatoria (A – A ajustada)2 = 0.004793483
0.004793483 0.004793483
= = 0.000599185
𝑛−2 10
∴ √0.000599185 = 0.024478262 − − − −→ 𝐷𝑒𝑠𝑣𝑖𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑒𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟 = 𝑆
Conociendo la desviación estándar, sacamos LDD
LDD = 3S/b
Donde b es la pendiente de la ecuación de la recta obtenida en la curva de calibración
Entonces LDD = 3(0.024478262)/0.1336 = 0.54966 ≈ 0.550
El logaritmo de [Fe3+]
Log (0.35) = -0.456
Para determinar el %T

10(2-A ajustada) ∴ 10(2−0.086) = 82.12

Entonces la Absortancia será igual a 100 - %T, por lo que Absortancia = 100 – 82.12
= 17.88
Para %Ep se tomaron los valores de los tubos 7, 8, 9 y 10, obteniendo una ecuación
de la recta para estos valores: y = 76.984x + 26.861
Entonces, calculando %Ep = 230.3/b, siendo b la pendiente de la ecuación de la
recta: %Ep = 230.3/76.984 = 2.99
En el caso de la concentración del cromógeno, debemos conocer las concentraciones de
SCN- y Fe3+
 (29000000)(0.05𝑚𝑙) 1450
Para el caso de SCN-: [SCN-] = = = 290 (El único valor que cambia
1000 5
son los ml).
(14000)(1.5 𝑚𝑙) 21
Para el caso de Fe3+: [Fe3+] = = = 4.2 (este dato es igual para todos los
1000 5
tubos).
Conociendo [SCN-] y [Fe3+], se obtiene SCN-/Fe3+
290/4.2 = 69.048

Nota 1: Todos los ejemplos realizados fueron para el tubo no. 2

Nota 2. Para el caso de efecto de pH y de algunos aniones, no se realizaron cálculos.