INFORME DE

UNIVERSIDAD DE LOS LLANOS MICROBIOLOGIA

Facultad de Ciencias Agropecuarias y Recursos Naturales

Ingeniería Agroindustrial

PRACTICA N° 3

AISLAMIENTO Y SELECCIÓN DE MICROORGANISMOS PRODUCTORES DE SOLVENTES ORGANICOS

(ETANOL)
Karen Ortiz , Dilan Gutierrez2, Leandro Quiroga3, Manuel Ariza4
1

1. Cód. 117004228, Ing. Agroindustrial.

2. Cód. 117004216, Ing. Agroindustrial.
3. Cód. 117004230, Ing. Agroindustrial.
4. Cód. 117004250, Ing. Agroindustrial.
Facultad de ciencias agropecuarias y recursos naturales Programa Ing. Agroindustrial.

RESUMEN
Se obtuvo colonias de cultivos de bacterias mediante técnica de estriado, por medio de la
técnica disoluciones en las cuales se observó, describió y enumero sus características junto
con la observación microscópica. Para esta práctica se realizaron diferentes tipos de
siembras de cultivos como lo son la siembra por superficie para cual fue necesario utilizar
el método de diluciones el cual facilito su recuento en agar papa destroza PDA y agar
nutritivo AN a esta última se realizó la descripción macroscópica, obteniendo su tamaño,
forma, elevación, aspecto, color superficie y borde de tres colonias previamente
seleccionadas con resultados similares para dichas colonias. Otra técnica fue el aislamiento
de microorganismos por agotamiento de un repique de una muestra del agar nutritivo AN,
de la cual se efectuó la descripción microscópica gracias a la tinción de Gram, que para este
caso se obtuvo coloración violeta indicando su tinción +, donde se puedo conocer algunos
tipos de bacteria como lo fue los bacilos, diplobacilos, cocos y diplococos. Concluyendo así
con un resultado favorable.
Palabras clave: colonias, diluciones, microorganismos, recuento, siembras.
convertir las hexosas del mosto en etanol
1. INTRODUCCION cuando las condiciones son anaeróbicas.
La fermentación puede definirse como un El 96% de la producción de etanol la
proceso de biotransformación en el que se llevan a cabo diferentes especies de
llevan a cabo cambios químicos en un levaduras debido a su alta productividad
sustrato orgánico por la acción de en la conversión de azucares a etanol y a
enzimas sintetizadas por que se separan mejor después de la
microorganismos conocido cómo fermentación. Entre las especies más
catalizadores bioquímicos o utilizadas están: Saccharomyces
biocatalizadores. En este caso capaces de cerevisiae, Saccharomyces anamensisi,
Candida seudotropicalis entre otras. En la
producción industrial de alcohol es
importante conocer la tolerancia alcohol,
la cual depende de la habilidad de la
célula para exportar el etanol del interior
al medio externo, un proceso que depende
de la composición de la membrana y de la
fluidez de la misma.(1)
Las levaduras son hongos unicelulares
capaces de producir, en su metabolismo,
grandes cantidades de etanol, tolerarlo y
seguir desarrollándose a concentraciones
a las que otros microorganismos son
incapaces de sobrevivir. La producción de
bebidas alcohólicas utilizando levaduras,
por fermentación de azúcares es, por
tanto, una de las aplicaciones de la
biotecnología, más antiguas y de gran
importancia económica. En la actualidad,
la bioproducción de etanol como
carburante presenta también interés
comercial y ecológico, como alternativa a
los combustibles tradicionales, más caros
y con mayores riesgos de contaminación
ambiental. (2)
Saccharontvces cerevisiae es la especie de
levadura que ha sido empleada
empíricamente desde tiempos muy
antiguos en la obtención de bebidas
alcohólicas, 3 tales como vino y cerveza,
hasta que Pasteur abordó el estudio de las
fermentaciones con una perspectiva y
metodología científicas. La fermentación
alcohólica implica la degradación de las
hexosas, por la vía glicolifica, hasta
piruvato y, posteriormente, la actuación
de las llamadas enzimas alcohologénicas,
que producen etanol como producto final
de la fermentación, regenerando el poder
reductor, en forma de NAD. (2)
DETERMINACION DE LA
TOLERANCIA A ETANOL
Como se ha concretado, las bases
fisiológicas de la acción del etanol sobre
las células de levadura son múltiples y
complejas. Uno de los métodos
empleados para definir la tolerancia al
etanol es determinar la concentración de
etanol que suprime completamente el
crecimiento. Así mismo, la tolerancia
puede determinarse por los efectos del
etanol sobre la viabilidad celular,
utilizando la tasa de pérdida de viabilidad
celular, en presencia de etanol, como
criterio. Kalmokoff e Ingledew (1985),
comprobaron que el etanol afectaba a la
viabilidad celular, en función del estado
de crecimiento de las células, siendo más
resistentes las células en fase estacionaria
que aquellas que se encontraban en fase
exponencial. También se pudo comprobar
que las condiciones nutricionales, del
medio de cultivo, afectaban a la tasa de
pérdida de viabilidad celular.(3)
La determinación de la tolerancia al
etanol de una estirpe concreta es una
característica fundamental, desde una
perspectiva aplicada. Por ello, numerosos
autores han buscado un método que, de
forma sencilla e inequívoca, permita
predecir la tolerancia a etanol, sin
necesidad de recurrir a la propia eficacia
de la fermentación. Los distintos métodos
de determinación de tolerancia
propuestos, están basados en la acción del
etanol sobro una determinada estructura o
proceso diana, pero, hasta el momento, no
ha sido hallado un método aceptado
universalmente, a pesar de que se han
propuesto vanos. (3)
2. MATERIALES
TABLA 1. Materiales, Equipos, Reactivos y
Medios de cultivo.
MATERIALES MEDIO DE CULTIVO
 10g de uva
Cajas de Petri con medio
Sabouraud (2)
Perlas de vidrio Etanol: 3%, 6% y
9%
Gradillas
Balanza
Incubadora
Cajas Petri
tubos de ensayo
Pipetas de vidrio de 1 ml
estéril (2)
Pipeta Pasteur estériles (3)
Mechero
Microscopio
Mortero
Perlas de vidrio: para mezclar y
desmenuzar en molinos. Mientras más
pequeñas sean las perlas y mayor la
cantidad de ellas, más intensiva es la
mezcla respectiva y el desmenuzamiento.
Gradilla: Una gradilla es una herramienta
que forma parte del material de
laboratorio, y es utilizada para sostener y
almacenar gran cantidad de tubos de
ensayo o tubos Eppendorf.
Balanza analítica: es una clase de
balanza utilizada principalmente para
medir pequeñas masas. Este tipo de
balanza es uno de los instrumentos de
medida más usados en laboratorio y de la
cual dependen básicamente todos los
resultados analíticos.
Incubadora: son contenedores aislados
con un calentador ajustable, en este caso
de utilizo a una temperatura de 30 °C.
Cajas de Petri: consta de una base
circular y sus paredes son de una altura
baja, aproximadamente de 1 cm. Posee
una cubierta de la misma forma pero algo
más grande de diámetro, para que se
pueda colocar encima y cerrar el
recipiente, aunque no de forma hermética,
es de cristal.
Tubo de ensayo: es un recipiente de
vidrio que consiste en un
pequeño tubo cilíndrico de vidrio con un
extremo abierto y el otro cerrado y
redondeado.
Pipetas de vidrio: Instrumento de
laboratorio de vidrio diseñado para medir
un solo volumen, que consiste en un tubo
largo y estrecho con un ensanchamiento
en la parte central y que en su parte
superior comprende la línea de aforo que
indica el volumen máximo que debe
alcanzar el líquido. Permiten la
transferencia de un 1 mL volumen a las
cajas de Petri.
Pipetas Pasteur: tienen un tallo y un
bulbo integrados en una sola pieza de
plástico blando. La pared del bulbo es
más blanda y delgada, por lo que
Puede apretarse para producir la
expulsión del líquido de la pipeta, o para
liberar la presión de modo que se
produzca la aspiración de líquido.
Mechero: frasco que contiene el alcohol,
elaborado de acero inoxidable, es un
instrumento utilizado en los laboratorios
científicos para calentar, esterilizar o
proceder a la combustión de muestras o
reactivos químicos.
Microscopio: es una herramienta que
permite observar objetos, que son
demasiado pequeños para ser observados
a simple vista. El tipo más común y el
primero que fue inventado es el
microscopio óptico.
Mortero: es una herramienta que se
utiliza para moler y mezclar sustancias,
incluidos los productos químicos en un 4. RESULTADOS
laboratorio o también la comida en la
cocina.
3. METODOS
Siembra en superficie
Se pesó aproximadamente 10 g de uvas
sin lavar, con el mortero se macero hasta
obtener el jugo, con una pipeta Pasteur se
tomó un 1 mL del jugo en un tubo de
ensayo con 4,5 mal de agua peptona para
proceder en la dilución 10-1, a partir de
esta se realizó la dilución 10-2, de la cual
obtenemos 0,1 mL de las cuáles Figura 1. Cultivo de microorganismos de uva 10-2
obtenemos 0.1 mL de ambas dilución
para agregar a la caja de Petri con medio
sabouraud, se homogenizo e incubo a 30
°C por 48 horas.
Pruebas de tolerancia a etanol:
De una muestra de levadura se tomó 1mL
y se agregó un tubo con 4.5 mL de agua
peptona al 0.1% p/v, para la dilución 10-
1, así mismo se realizó hasta la dilución
10-3 con la misma cantidad de agua
peptona para cada tubo, se tomó las cajas
de Petri con medio Sabouraud a
diferentes concentraciones de etanol (3%,
6%, 9%) y se realizó la siembra a partir
de la dilución 10-3 e incubó a 30°C por
48 horas. Figura 2. Cultivo de microorganismos de uva 10-1

Se realizó el UFC x g/mL para ambos

procedimientos, y como no se encontró
microorganismos en la prueba de
tolerancia a etanol, se extrajo varias
colonias de la muestra de la caja de Petri
que contenía la muestra de uva la cual se
agregó a un tubo que contenía agua
peptona para hacer la dilución 10-1 hasta
las 10-2, en la que se tomó 0,1 mL y se
procedió hacer la siembra a cada caja de
Petri de diferentes concentraciones.
 5. DISCUSIÓN
Como se evidencia en la figura 1 y figura
2 de la siembra realizada por superficie
del jugo extraído de la uva; se presentaron
los resultados esperados, los cuales eran
ver presencia de estas colonias en dos
diferentes cantidades, en la disolución 10-
1
encontramos 200 colonias y en la
disolución 10-2 fueron 77 colonias (tabla
1), ya que era una disolución de más. En
estas dos siembras se presentaron
Figura 3. Microscopio de levaduras100x pequeñas diferencias de forma y
características, pero una igualdad de
RECUENTO NUMERO DE TOTAL, DE
color. El recuento final, tras realizar el
COLONIAS COLONIAS
Dilución 1 200 colonias 2000UFC cálculo respectivo; fue en la primera
x10 -1 disolución 2000UFC y en la segunda
Dilución 2 77 colonias 7700UFC disolución 7700UFC (tabla 1).
x10-2
Al analizar los datos de la (Tabla 2, 3 y
Tabla1. Recuento del número de 4) se evidencia que no hubo crecimiento
colonias presentes en el cultivo de uva. bacteriano, esto debido a un error
realizado en la práctica, el cual fue haber
Dilución Etanol 3% UFC x g/ml realizado una disolución de más, esto nos
Gram etanol 3%
dio como resultado una nula observación
10 −3
indeterminable 0
microbiana. De allí se hizo otro
Tabla 2. Determinación de la tolerancia
procedimiento, el cual fue extraer
a etanol al 3%
colonias de la muestra de la caja de Petri
Dilución Etanol 3% UFC x g/ml
Gram etanol 6% que contenía la muestra de uva, se
indeterminable 0 preparó dos disoluciones y se sembró en
10−3
Tabla 3. Determinación de la tolerancia diferentes concentraciones. Aun así el
a etanol al 6% recuento de este procedimiento no se
Dilución Etanol 3% UFC x g/ml obtuvo y seguimos trabajando con los
Gram etanol 9% resultados (hipotéticos/nulos). Por lo
10 −3
indeterminable 0 tanto, no se puede hacer una afirmación
Tabla 4. Determinación de la tolerancia del efecto de la concentración de etanol
a etanol al 9% respecto al crecimiento bacteriano lo
único que se puede afirmar es que el
número de UFC es menor que 1.
Al observar en el microscopio a 40X ya
logramos observar las células de las levaduras
de la uva, aun así se hizo el aumento a 100X
y de allí se hizo la observación final (figura
3)
6. CONCLUSIÓN
Se logró evidenciar la presencia de
levaduras en las dos diluciones de la
muestra de uva de forma homogénea;
obteniendo un total colonias que van
desde los 2000 UFC has los 7700 UFC e
indicando que la coloración de Gram fue
positiva. Proceso que fue satisfactorio
respecto a los métodos.
Para el proceso de pruebas de tolerancia a
etanol no se vio resultado alguno ya que
se cometieron errores operativos,
obteniendo un resultado desfavorable para
la práctica.
7. CUESTIONARIO
 ¿Cuál es la estructura específica en los
microorganismos productores de
etanol, que les proporcionan
tolerancia a grandes cantidades de
etanol?
RTA: Las levaduras, presentan cierta
resistencia a las concentraciones de
alcohol que se producen durante la
fermentación, debido a que el etanol,
inhibe el transporte de D-xilosa,
amonio, glicina y algunos
aminoácidos, así como afecta la
función y estabilidad de algunas
enzimas citoplasmáticas. "es decir la
tolerancia al alcohol depende de la
habilidad de la célula para el portar el
etanol del interior al medio eterno, un
proceso que depende de la
composición de la membrana y de la
fluidez de la misma. La levadura es
afectada en alto grado por la
concentración de alcohol. por la
concentración alcohólica superior al
2% ya influye en el crecimiento.
Cuando la concentración de etanol
alcanza el 10% se produce una
paralización total en el crecimiento, la
concentración maneja fue del 9% y de
esta se puede apreciar la disminución
de las levaduras con respeto a la
concentración del 2%, a pesar de no
ser el resultado esperado por el
crecimiento tan exponencial que tuvo
se tiene en cuenta la disminución.
el género Saccharomyces sp. el más
ampliamente utilizado las cualidades
que hacen que este microorganismo
sea el más empleado, son su
capacidad de convertir rápidamente
los azucares a etanol, alta tolerancia al
etanol más de 80 g/l.
 ¿Cómo se presenta el mecanismo de
inhibición a etanol y cómo se presenta
la inhibición de crecimiento por
exceso de sustrato?
RTA: El etanol es un inhibidor
competitivo de la enzima alcohol
deshidrogenasa (ADH) que se utiliza
como tratamiento en caso de
intoxicaciones por alcoholes (metanol
y etilenglicol) si no se dispone de
fomepizol. La enzima ADH, al
metabolizar el metanol y el
etilenglicol, produce metabolitos
tóxicos, que van a ser los responsables
de la toxicidad.
La inhibición competitiva se
caracteriza por disminuir la afinidad
de la enzima por su sustrato sin
afectar la velocidad máxima aparente
(en presencia de inhibidor). La
inhibición competitiva disminuye la
Vmax y no afecta la eficiencia
catalítica. Y la inhibición no
 competitiva disminuye el valor de
ambos parámetros (Vmax y sacarosa
Vmax/Km).
 ¿Cuál es la concentración de etanol y
glucosa que debe soportar una cepa
para ser considerada productora de
etanol a nivel industrial?
RTA: Los parámetros para
seleccionar una cepa optiman en la
producción de etanol, como mínimo
debe permitir valores del 8-9% de
alcohol en volumen. También debe
ser resistente a la acidez este
parámetro podrá aumentar para evitar
infecciones. Y su resistencia a los
cambios de temperatura es
fundamental.
Se debe mantener regulado el
ambiente en el que se realiza la cepa
y constantemente monitoreado su
crecimiento.
Dichas cepas estuvieron que están
bajo el efecto de dos concentraciones
de sacarosa (170 y 250g/L) y dos
sustratos (industrial con melaza caña
azúcar y sintético con sacarosa).
Durante la fermentación en sustrato
industrial se obtuvo mayor
producción de etanol a concentración
de 250g sacarosa/L. Bajo estas
condiciones, la cepa GG570-CIBII
produjo en promedio 2,34g etanol/L
mas con respecto a la cepa control y
en adición, a las 10h, produjo 8,02g/L
por encima de la cepa control. Por
otro lado, la cepa GG570- CIBI
produjo 3,46g etanol/L menos que la
cepa control. De esta forma, se
encontró que la cepa GG570-CIBII es
tolerante a alta concentración de
sacarosa, y además, es capaz de
producir una concentración mayor de
etanol con respecto a la cepa control
en melaza caña azúcar con 250g/L
Actualmente, el bioetanol es
producido por fermentación
alcohólica de los azúcares presentes
en materiales renovables [1, 2]. Dicha
fermentación está influenciada por
factores como la concentración de
azúcares del sustrato y el
microorganismo fermentador que se
emplee. De acuerdo con reportes
previos [3, 4] cuando S. cerevisiae se
encuentra cultivada a altas
concentraciones de azúcar (menores a
30 – 40%) se incrementa la
producción de etanol.
Adicionalmente, cuando S. cerevisiae
se encuentra bajo condiciones de alta
concentración de oxígeno disuelto [5]
y la concentración de azúcares supera
0,16g/L [6] o 9g/L [7], la levadura
convierte su metabolismo oxidativo a
oxidoreductivo o fermentativo
incrementandose la producción de
etanol. Dicho fenómeno se conoce
como efecto Crabtree
8. BIBLIOGRAFÍA
(1)
http://biologia.laguia2000.com/hongos/m
edios-para-crecer-levaduras.
(2) AGUILERA,A. & BENITEZ,T.
(1986): Ethanol-sensitive mutants of
Saccharomvces cerevisiae . Areh.
Microbiol.,143, 337-344.
(3) AGUILERA,A. & BENTrEZ,T;
(1985): Role of mitochondria on ethanol
tolerance of Saccharomvces cerevisiae .
Arch. Microbiol 142, 389-92.