UNIVERSIDAD DE LOS LLANOS, FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS Y RECURSOS NATURALES,

INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL, MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL,

MSc. RODOLFO ANDRÉS CABEZA HERRERA

GENERALIDADES DEL ANÁLISIS MICRIBOLÓGICO DE ALIMENTOS

La seguridad microbiológica de alimentos generalmente ha sido determinada mediante métodos convencionales que
ofrecen datos importantes acerca de la calidad del producto. Actualmente, el desarrollo de métodos rápidos y
automatizados para la detección, aislamiento, identificación y enumeración de microorganismos (y/o sus metabolitos)
relacionados con la alteración y seguridad de los alimentos es una subdivisión del área de la microbiología aplicada con
una importancia cada vez mayor, disponiéndose en el mercado de sistemas y kits miniaturizados, métodos
inmunológicos y genéticos que permiten obtener resultados rápidamente y así poder liberar al mercado lotes de
producto. Sin embargo, el recuento en placa así como el número más probable, siguen siendo técnicas ampliamente
utilizadas en el control de calidad de alimentos. Los análisis microbiológicos de rutina en alimentos comprenden
aerobios mesófilos, coliformes totales, coliformes fecales, mohos y levaduras. Los análisis especiales incluyen
Staphylococcus aureus coagulasa positivo, Bacillus cereus, Clostridium perfringes, Salmonella spp, Listeria
monocytogenes.

IMPORTANTE: Los análisis de rutina o especiales a realizar a cada alimento, dependen de las particularidades del
producto y se establecen en la legislación.

PREPARACIÓN Y DILUCIÓN DE LOS HOMOGENIZADOS DE LAS MUESTRAS DE ALIMENTOS

El procedimiento más común para realizar el aislamiento y recuento de microorganismos en alimentos consiste en
preparar una suspensión homogénea del alimento y de los microorganismos que permita preparar diluciones a partir de
las cuales se apliquen los métodos de recuento. Cuando los alimentos son sólidos se requiere la utilización de aparatos
de trituración y mezcla como el homogenizador o la licuadora.

MÉTODO DE RECUENTO EN PLACA: Es de lejos, el método comúnmente utilizado para determinar el número de células
viables o de unidades formadoras de colonia UFC en un alimento. En esta técnica, las porciones del alimento
muestreadas, se trituran y homogenizan, se diluyen de forma seriada con un diluyente adecuado, se depositan en una
caja junto a un medio de cultivo respectivo y se incuban a la temperatura precisa durante un tiempo determinado.
Transcurrido este, se cuentan las colonias visibles.

MÉTODO DEL NÚMERO MAS PROBABLE NMP: Es un método simple, básicamente estadístico que se emplea cuando se
presume el número de microorganismos en una muestra es bajo, pudiéndose determinar grupos específicos
microbianos ya que pueden utilizarse medios selectivos y diferenciales, partiendo desde la muestra diluida (tres
diluciones consecutivas), se siembra en series de tubos (9 o 15) y la cantidad de microorganismos existentes en el
alimento se determinan mediante el uso de tablas normatizadas.

RECUENTO DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESÓFILOS

Es el indicador más amplio ya que incluye todos los géneros aerobios y facultativos que crecen en medios simples a una
temperatura entre 20°C y 45°C. Este recuento se considera indicador del grado de contaminación de los alimentos en
cualquier etapa del proceso de producción, permite obtener información sobre la alteración incipiente de los alimentos
y su probable vida útil.

RECUENTO DE MOHOS Y LEVADURAS

Los mohos y levaduras tienen algunas características similares a las bacterias cuando contaminan los alimentos, tales
como la capacidad de alteración y la producción de metabolitos tóxicos. Como microorganismos indicadores, son útiles
para evidenciar grado general de contaminación en alimentos con características no favorables para el desarrollo
bacteriano o cuando los aerobios mesófilos no son útiles, como en alimentos fermentados.
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RECUENTO DE COLIFORMES
Este grupo de microorganismos comprende varios géneros de la familia Enterobacteriaceae; está ampliamente
difundido en la naturaleza, agua y suelo. También es habitante normal del tracto intestinal del hombre y animales de
sangre caliente. Su presencia en alimentos es signo de mala calidad higiénica en el proceso, falta de higiene de los
manipuladores, recontaminación después del proceso y hasta contaminación de origen fecal.

OBJETIVO DE LA PRÁCTICA: Aplicar algunas de las técnicas utilizadas para determinar la calidad microbiológica de
alimentos.

MATERIALES Y EQUIPOS
 Vaso de licuadora, base, cuchilla, estériles.
 Tenedor, cuchillo, espátulas, perlas, estériles. Gradillas.
 5 pipetas 1 ml estériles
 Balanza analítica, motor licuadora, incubadora
 8 cajas estériles
 Muestra de alimento

MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS

 1 Erlenmeyer con 99 mL de agua peptona
 3 tubos con 9 mL de agua peptona
 100 mL de agar SPC (standard plate count)
 100 mL de agar Sabouraud, OGY, malta, PDA.
 4 cajas agar Baird Parker
 9 tubos con 9mL caldo LMX fluorocult

PROCEDIMIENTO
 Tomar asépticamente 11g ó mL (dependiendo si es sólida o líquida) de la muestra homogenizada y transferirla al
frasco con 99 mL de diluyente (agua peptona al 0.1%), para obtener la dilución 10-1.
 Agitar vigorosamente y dejar en reposo durante 10 minutos
 Preparar la dilución 10-2 transfiriendo 1 mL de la dilución 10-1, con pipeta estéril a un tubo que contenga 9 mL de
agua peptona. Agitar cuidadosamente.
 Preparar la dilución 10-3 transfiriendo 1 mL de la dilución 10-2, con pipeta estéril a un tubo que contenga 9 mL de
agua peptona. Agitar cuidadosamente.
 Repetir estos pasos hasta obtener el número de diluciones necesarias
 AEROBIOS MESÓFILOS: Transferir por duplicado, alícuotas de 1 mL de dos diluciones consecutivas* en cajas
estériles. Verter agar SPC fundido y mantenido a 45° C, mezclar el inóculo con el medio con movimientos suaves,
dejar solidificar e incubar a 35 + 2° C durante 48 horas.
 MOHOS Y LEVADURAS: Transferir por duplicado, alícuotas de 1 mL de dos diluciones consecutivas* en cajas
estériles. Verter agar Sabouraud fundido y mantenido a 45° C, mezclar el inóculo con el medio con movimientos
suaves, dejar solidificar e incubar a 22 + 2° C durante 5-7 días.
 Staphylococcus aureus**: Transferir por duplicado, alícuotas de 0,1 mL de dos diluciones consecutivas* en
cajas con agar Baird Parker, expandir el inóculo sobre la superficie del agar con un asa de hockey o perlas
estériles e incubar a 35 + 2° C durante 48 horas.
 COLIFORMES TOTALES Y Escherichia coli: Transferir 1 mL de cada una de tres diluciones consecutivas a tubos
con caldo LMX fluorocult (tres tubos por cada dilución). Incubar a 35 + 2° C durante 24 horas.
*La elección de las diluciones depende del producto a analizar
** Staphylococcus aureus es un análisis especial y requiere confirmación bioquímica
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CÁLCULO E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

RECUENTO EN PLACA:
Seleccionar dos cajas de la misma dilución que tengan los siguientes rangos de crecimiento: entre 30 y 300 colonias para
aerobios mesófilos; 10 y 100 colonias para mohos y levaduras; 20 y 200 colonias para Staphylococcus aureus.
Contar las colonias en cada análisis, hallar la media aritmética de los valores y multiplicar por el factor inverso de la
dilución. Reportar como UFC/g ó mL.

Las colonias de Staphylococcus aureus sobre Baird Parker son negras, lustrosas, convexas, entre 1 a 5 mm de diámetro
con borde estrecho blanquecino, rodeado por un halo claro de 2 a 5 mm de anchura. Dentro del halo claro presencia de
anillos opacos no visibles antes de las 48 horas de incubación.

NUMERO MAS PROBABLE: Proceder a la lectura de los tubos positivos por cada dilución y comparar los resultados con
la pabla del NMP.
Calcular el número de microorganismos con el valor obtenido en la tabla usando la siguiente fórmula:

= NMP/g ó mL

En presencia de coliformes totales, el caldo LMX vira a un color verde azulado. Escherichia coli se distingue por la
emisión de fluorescencia en los tubos sometidos a luz UV y se puede confirmar con la adición del reactivo de Kovac´s y
formación de un anillo rojo-cereza en la superficie.

TABLA DEL NMP PARA AGUAS Y ALIMENTOS