UNIVERSIDAD DE CIENCIAS MÉDICAS

Licenciatura en Microbiología y Química Clínica

MANUAL DE PRÁCTICAS DE
BIOQUÍMICA

II semestre de 2021

Bioquímica para Microbiología MB-8

Coordinadora:
Marijose Artolozaga Sustacha, MSc
profemjas@hotmail.com

Estudiante:

# de grupo: # de mesa:
 Prácticas de Bioquímica para Microbiología, II-2021
MJ Artolozaga Sustacha, MSc

Índice:
Normas de seguridad y trabajo en el laboratorio.......................................................................3
Azúcares reductores .................................................................................................................. 7
Espectrofotometría ................................................................................................................... 12
Espectro de absorción ....................................................................................................... 15
Recta de calibración y aplicaciones de la ley de Beer ....................................................... 18
Proteínas ...................................................................................................................................26
Precipitación con sulfato de amonio .................................................................................28
Cromatografía .................................................................................................................... 30
Determinación de la concentración de proteínas ............................................................. 32
Electroforesis de proteínas de suero ................................................................................. 37
Hemoglobina .............................................................................................................................40
Cinética enzimática ................................................................................................................... 45
Glucosa oxidasa: progreso de la reacción, efecto de la temperatura y del pH ......................... 47
Colinesterasa sérica: efecto de la concentración de enzima, de sustrato y de inhibidores ...... 55
Radicales libres y antioxidantes ................................................................................................ 66
Peroxidación lipídica ................................................................................................................. 75
Extracción y análisis de ADN .....................................................................................................78
Anexo: obtención de suero y plasma........................................................................................ 87
Anexo: Incógnitas ..................................................................................................................... 90

-2-
 Prácticas de Bioquímica para Microbiología, II-2021
MJ Artolozaga Sustacha, MSc

Normas de seguridad y trabajo en el laboratorio

“La insistencia detallada sobre la preparación y el entrenamiento del personal es importante. No hay
cámara de seguridad biológica ni cualquier otro equipo o procedimiento que sea capaz de garantizar la
seguridad por sí mismo, a no ser que sus usuarios apliquen técnicas seguras, basadas en la información y la
comprensión. Ese equipo puede hasta crear una falsa sensación de seguridad y favorecer el descuido, al punto de
aumentar el peligro, a no ser que sea planeado, instalado, mantenido y manejado con los debidos
conocimientos. El autocontrol alerta e inteligente es indispensable durante los procedimientos, junto con
vigilancia y supervisión apropiadas.”
N. R. Grist, 1995

“La calidad de un laboratorio se puede definir como la exactitud, fiabilidad y puntualidad de los resultados
analíticos notificados. Los resultados analíticos deben ser lo más exactos posible, todos los aspectos de las
operaciones analíticas deben ser fiables y la notificación de los resultados debe ser puntual para ser útil en el
contexto clínico o de la salud pública.
Para poder lograr el más alto nivel de exactitud y fiabilidad, es esencial realizar todos los procesos y
procedimientos del laboratorio de la mejor forma posible. El laboratorio es un sistema complejo, que implica
muchos pasos de actividad y a muchas personas. La complejidad del sistema exige que se lleven a cabo de forma
adecuada diversos procesos y procedimientos. Por tanto, el modelo de sistema de gestión de la calidad, que
examina todo el sistema, es muy importante para lograr un buen rendimiento en el laboratorio.”
Organización Mundial de la Salud, 2016

Buenas prácticas de trabajo en el laboratorio y normas de seguridad:

A continuación, se presentan unas reglas fundamentales, aunque no necesariamente en orden de
importancia:
- No pipetear con la boca.
- No comer, beber, fumar, guardar alimentos, aplicar cosméticos, chupar etiquetas o colocar
cualquier material en la boca.
- Mantener el laboratorio limpio, organizado y libre de materiales que no sean usados durante el
trabajo.
- Limpiar las superficies de trabajo después de cualquier derramamiento de material potencialmente
peligroso y al final de la jornada de trabajo. Descontaminar las superficies de trabajo diariamente.
- Permitir el acceso al laboratorio solamente a las personas autorizadas.
- Durante el trabajo en el laboratorio, usar ropas, delantales o uniformes propios, en este caso, la
gabacha. Ésta no debe ser usada en ningún otro espacio: oficina, biblioteca, cafetería… Lavar o
desinfectar las ropas contaminadas con una técnica adecuada. No guardar la ropa de protección
junto con el resto de la ropa. Se recomienda no usar reloj de pulsera en el laboratorio.
- Usar zapatos cerrados, que no tengan los dedos descubiertos, mientras se trabaja en el laboratorio.
- Usar protección ocular (lentes) contra salpicaduras o impacto de objetos, siempre que sea indicado.
- Llevar el pelo corto o recogido.

-3-
 Prácticas de Bioquímica para Microbiología, II-2021
MJ Artolozaga Sustacha, MSc

- Lavarse las manos después de manipular materiales infecciosos o peligrosos, de quitarse los guantes
y antes de salir del laboratorio.
- Usar guantes adecuados en todas las actividades que puedan resultar en contacto directo con
sangre o materiales infecciosos, así como con químicos. Se deben descartar siempre en las bolsas
rojas especiales. El uso eficaz de los guantes depende de dos simples prácticas.
1. Quitarse los guantes cuando se abandona la zona de trabajo para evitar la contaminación de
otras zonas como el teléfono, los pomos de las puertas o los bolígrafos.
2. No reutilizar jamás los guantes. No intente lavar o descontaminar los guantes: se producirán
microgrietas, se harán más porosos y perderán sus propiedades protectoras.
- Seguir cuidadosamente todas las instrucciones sobre el manejo y el descarte de las jeringas y otros
materiales para la extracción de sangre.
- Seguir cuidadosamente todas las instrucciones sobre el manejo del equipo de laboratorio. Este debe
ser manejado correctamente para evitar errores que podrían causar peligro o deterioro del mismo.
- Leer las etiquetas de los frascos antes de utilizar cualquier sustancia.
- Rotular claramente los frascos que contengan preparados y soluciones hechas en el laboratorio, al
igual que las muestras.
- Comunicar al encargado del laboratorio cualquier derramamiento de material, así como todo
accidente y exposición a materiales infecciosos. Proporcionar
examen médico, vigilancia o tratamiento adecuados y llevar un
registro sobre tales incidentes.
- En caso de sufrir algún corte o laceración con cristalería quebrada,
tener cuidado de no dejar partículas de vidrio en la herida e
informar al profesor o encargado inmediatamente.
- Nunca tocar un aparato eléctrico con las manos húmedas o cuando
se encuentre de pie sobre un piso húmedo, esto para evitar un
posible choque eléctrico.
- En caso de que alguna sustancia química caiga en el ojo, irrigar
inmediatamente, con abundante agua por 15 minutos. Para tal
efecto se encuentra una ducha de ojos en el laboratorio (fig.1). Si la
persona tiene lentes de contacto, éstos deben ser removidos
inmediatamente y luego proceder a la irrigación de los ojos.
- En caso de quemaduras en la piel, realizar una irrigación de la zona
afectada con agua abundante por al menos 15 minutos.
- En caso de incendio sobre una mesa o el piso proceder con el
extintor. Si el fuego alcanza a alguna persona utilizar también la
manta o la ducha si la situación así lo amerita.
Fig.1. Duchas de ojos y para
- Localizar desde el principio las salidas de emergencia y los emergencias.
implementos de seguridad disponibles en el laboratorio.

-4-
 Prácticas de Bioquímica para Microbiología, II-2021
MJ Artolozaga Sustacha, MSc

Descarte de desechos
No todos los desechos generados en el laboratorio pueden descartarse en un basurero común.

Desechos corrientes:
Los desechos corrientes son todos aquellos residuos considerados como “no peligrosos” de índole
similar a los desechos doméstico y pueden descartarse en un basurero común. NUNCA se debe
descartar guantes, ni algodón (aunque no se encuentren contaminados), en este tipo de basurero.

Desechos infecciosos:
Los residuos infecciosos son todos los desechos que pudieran contener agentes patógenos
transmisores de enfermedades víricas, bacterianas, parasitarias o micóticas. Dentro de este tipo de
desechos se incluyen: sangre, heces, semen u orina, apósitos, torundas, algodones, guantes y jeringas
(sin aguja).
Los residuos infecciosos deben ser descartados en los basureros con BOLSA COLOR ROJO, que para
tal efecto se encuentran en el laboratorio. El algodón y los guantes SIEMPRE deben ser descartados en
esta bolsa, aunque no se encuentren aparentemente contaminados. Además, debe descartarse
cualquier otro material (gasas, papel toalla, etc.) que estuviera en contacto con sangre o algún desecho
anatomopatológico.

Descarte de puntas plásticas:

Las puntas de las micropipetas se descartan en el frasco designado para esto, ya que en muchos
casos serán lavadas y reutilizadas. Las puntas plásticas que estuvieron en contacto con algún desecho
bioinfeccioso, como sangre, suero o plasma, deben ser descartadas en bolsa roja.

Desechos punzocortantes:
Se define como todo objeto con capacidad de penetrar o cortar
tejidos humanos, facilitando el desarrollo de infección. Los objetos
cortantes sin riesgo de exposición química o infecciosa también pueden
ser incluidos, pues pueden causar heridas en las personas que los
manipulan. Ejemplos de objetos punzocortantes son: instrumental
médico-quirúrgico metálico, plástico y de cristal, todo tipo de agujas,
alambres, tornillos, hojas de bisturí, tubos de vidrio y plástico rígido,
ampollas, frascos, aplicadores de madera, instrumental médico-quirúrgico
con filo y puntas.
Estos desechos punzocortantes se deben descartar en los
RECIPIENTES RÍGIDOS que se encuentran en el laboratorio para tal fin
(fig.2). Fig.2. Basurero para desechos
punzocortantes

Descarte de líquidos:
Muchos líquidos usados en el laboratorio pueden ser descartados normalmente en el desagüe. Sin
embargo, los reactivos líquidos utilizados para ciertas pruebas se deben descartan en un recipiente
-5-
 Prácticas de Bioquímica para Microbiología, II-2021
MJ Artolozaga Sustacha, MSc

provisto especialmente ello, al igual que el contenido de los tubos de ensayo que hayan contenido
suero o sangre.

Bibliografía:
- Organización Mundial de la Salud, OMS (2016). Sistema de gestión de la calidad en el laboratorio (LQMS):
Manual. Ediciones de la OMS, Ginebra, Suiza.
- Silva Trejos, P. (2009). Buenas Prácticas de Laboratorio en Química Analítica Cuantitativa. Editorial UCR.
- Quesada Mora, S. (2007). Manual de experimentos de laboratorio para Bioquímica. EUNED, San José, Costa
Rica
- Grist, N.R. (1995). Manual de Biossegurança Para o Laboratório, 2° ed., Livraria Santos Editora, São Paulo,
Brasil

-6-
 Prácticas de Bioquímica para Microbiología, II-2021
MJ Artolozaga Sustacha, MSc

Azúcares reductores

Los monosacáridos pueden ser oxidados por iones oxidantes relativamente débiles, como el hierro
(Fe+3) y el cobre (Cu++). El grupo carbonilo se oxida a carboxilo, formándose su correspondiente ácido
aldónico; por ejemplo, la glucosa se oxida a ácido glucónico (fig.1). Los azúcares capaces de reducir a
estos iones, se denominan azúcares reductores. Esta propiedad es la base de la reacción de Fehling y la
de Benedict, que se usaron por muchos años para la estimación de la concentración de glucosa en
sangre y en orina, y el diagnóstico de diabetes.
Actualmente se utilizan otros métodos muy específicos y precisos para la determinación de la
glicemia, como por ejemplo el método colorimétrico con la enzima glucosa oxidasa (GOD).

Fig.1. Reacción simplificada de los azúcares reductores. Oxidación de glucosa a ácido glucónico o
gluconato, con reducción de los iones de cobre II a cobre I.
Modificado de Nelson, DL y Cox, MM (2004)

Además de los monosacáridos, también son azúcares reductores los disacáridos que tienen un
carbono anomérico libre, ya que en solución se pueden abrir de la forma hemiacetálica (cíclica) a la
forma lineal y reducir los iones de hierro y de cobre (fig.1). Esto permite que aún hoy en día se utilice
esta prueba para ayudar en el diagnóstico de la intolerancia a la lactosa en niños, ya que la lactosa es
un azúcar reductor (fig.2).

Fig.2. Algunos disacáridos son azúcares reductores. La lactosa (izquierda) es un azúcar reductor,
mientras que la sacarosa no lo es. La sacarosa (derecha) no tiene ningún carbono anomérico libre, por lo
que no puede abrirse a la forma lineal para que su grupo carbonilo se oxide a carboxilo.
Fuente: Nelson, DL y Cox, MM (2004)

-7-
 Prácticas de Bioquímica para Microbiología, II-2021
MJ Artolozaga Sustacha, MSc

Bibliografía
- Nelson, DL y Cox, MM (2004). Lehninger Principles of Biochemistry, 4th edition, W. H. Freeman Publishers.
- Quesada Mora, S (2007). Manual de experimentos de laboratorio para Bioquímica, EUNED, San José, Costa
Rica.
- Wiener lab. Inserto Glicemia enzimática AA, para determinación de glucosa.

Propósitos de aprendizaje de la práctica:

 Afianzar el concepto de azúcares reductores.
 Visualizar ejemplos de azúcares reductores y no reductores.
 Conocer ejemplos de diferentes muestras que contienen azúcares reductores o no reductores.
 Comparar dos métodos de determinación de la concentración de glucosa.
 Conocer los conceptos de método cualitativo, cuantitativo y semicuantitativo.
 Familiarizarse con el manejo de equipo de laboratorio: espectrofotómetro, pipetas y micropipetas.

Determinación de azúcares reductores con la prueba de Benedict

El reactivo de Benedict contiene carbonato de sodio (Na2CO3), que alcaliniza la solución. El sulfato
de cobre aporta el Cu++ para que se reduzca en presencia de los azúcares reductores. Además, contiene
citrato de sodio, que forma complejos poco ionizados con el cobre, de color azul, y así evita que se
pierda el cobre II en forma de precipitado de Cu(OH)2, antes de que éste reaccione con los
carbohidratos. El calor y el medio alcalino favorecen que el carbohidrato se convierta en su enediol,
rompiéndose luego en dos fragmentos altamente reductores. Éstos, con sus electrones expuestos,
reducen el Cu++ a Cu+. Este Cu+ ya no puede formar complejo con el citrato y reacciona con los iones
OH– presentes en la solución para formar el hidróxido de cobre I amarillo, Cu(OH), que precipita.
Además, el Cu(OH) puede perder agua y formar otro precipitado de color rojo ladrillo. Puesto que el
color depende de la concentración del azúcar reductor, la prueba se considera semicuantitativa
(cuadro 1).

Cuadro 1. Reacciones y colores en la prueba de Benedict positiva. La aparición de un precipitado

amarillo (+2), anaranjado (+3) o rojo ladrillo (+4) en la prueba, indica la presencia de un azúcar reductor, en
concentración creciente. Si la solución queda de color azul, la prueba es negativa (-) y si la concentración del
azúcar reductor es muy baja, el color de la solución puede verse verde (+1).

Cu++ + azúcar reductor  Cu+ Azul –

Cu+ + OH–  Cu(OH) (precipitado amarillo) Verde +1
2 Cu(OH)  H2O + Cu2O (precipitado rojo ladrillo) Amarillo +2
Naranja +3
Fuente: Quesada Mora, S (2007). Rojo ladrillo +4

Materiales
- Reactivo de Benedict -
- Soluciones en agua: glucosa 50 y 200mg/dL, fructosa, sacarosa, almidón 200mg/dL
- Muestras: Suero diluido 1/2, leche descremada y leche descremada deslactosada, diluidas 1/10
- Agua destilada - Plantilla-calentador o baño María
- Pipetas, beakers, tubos de ensayo, parafilm - Guantes para calor o pinzas

-8-
 Prácticas de Bioquímica para Microbiología, II-2021
MJ Artolozaga Sustacha, MSc

Procedimiento y resultados
Se realizará la prueba de Benedict a varias muestras, con diferentes contenidos y concentraciones de
carbohidratos.
1. Preparar un recipiente con agua a ebullición o al menos a 85°C. Puede ser en una plantilla o un
baño María a 85-90°C.
2. Rotular los tubos de ensayo, según las muestras disponibles.
3. Agregar 2mL de reactivo de Benedict a todos los tubos. Tomar nota del color.
4. Añadir 1mL de cada muestra en su tubo correspondiente. El tubo 1 lleva agua en vez de muestra.
5. Mezclar por inversión, con parafilm.
6. Colocar los tubos con cuidado en el baño a ebullición, por 5 minutos.
7. Observar y anotar algún cambio de color interesante durante el calentamiento.
8. No volver a mezclar, para no quemarse.
9. Reportar el resultado y explicar:
a. En las soluciones de diferentes carbohidratos: por qué da positivo o negativo (carbono
anomérico libre - tipo de enlace glucosídico).
b. En las muestras: por qué es positivo o negativo el resultado. Cuál es el carbohidrato presente en
la muestra. Anotar si hay alguna dificultad para determinar el resultado de la prueba.

Resultado
Muestra (  + 2+ 3+ 4+ ) Observaciones
según color
1. Agua 

2. Glucosa 50mg/dL

3. Suero (1/2)

4. Glucosa 200mg/dL

5. Fructosa 200mg/dL

6. Sacarosa 200mg/dL

7. Lactosa 200mg/dL

8. Leche (1/10)

9. Leche deslactosada
(1/10)

10. Almidón 200mg/dL

-9-
 Prácticas de Bioquímica para Microbiología, II-2021
MJ Artolozaga Sustacha, MSc

Determinación colorimétrica de glucosa, con reactivo enzimático

Este es un método cuantitativo, utilizado generalmente para la determinación de glicemia o

concentración de glucosa en sangre. Se basa en la utilización de enzimas para generar un complejo
coloreado, cuya concentración se puede determinar mediante el espectrofotómetro y es directamente
proporcional a la concentración de glucosa de la muestra.
El reactivo contiene enzimas y moléculas cromogénicas. La enzima glucosa oxidasa (GOD) oxida a
ácido glucónico la glucosa presente en la muestra, produciendo H2O2. Este peróxido de hidrógeno lo
utiliza la enzima peroxidasa (POD) junto al fenol y la 4-aminoantipirina, para generar una quinonimina
de color rojo (cuadro 2).
La utilización de un patrón de glucosa de concentración conocida permite el cálculo preciso de la
concentración de glucosa de la muestra.

Cuadro 2. Fundamento de la determinación de glucosa. La glucosa presente en la muestra es oxidada

por la glucosa oxidasa (GOD), produciendo ácido glucónico y H2O2, el cual reacciona con la 4-amino-
antipirina (4-AAP) y el fenol para producir una quinonimina de color rojo, que absorbe cerca de 505nm.

GOD
glucosa + O2  H2O2 + ácido glucónico

POD
2H2O2 + 4-AAP + fenol  quinonimina roja

Fuentes: Wiener Lab, Google-imágenes y Allain (1974).

Materiales

- Reactivo enzimático - Baño María a 37°C

- Patrón de Glucosa de 100mg/dL - Micropipetas
- Suero o plasma - Tubos de ensayo, parafilm
- Agua destilada - Espectrofotómetro

-10-
 Prácticas de Bioquímica para Microbiología, II-2021
MJ Artolozaga Sustacha, MSc

Procedimiento y resultados
En este procedimiento se utilizará el mismo suero disponible diluido 1:2 y también se analizará una de
las muestras de leche, normal o deslactosada.
NOTA:
Los valores de referencia de glucosa en suero son de 74 a 106mg/dL (Fuente: WienerLab).
El contenido de lactosa de la leche es de 0,3g por porción de 250mL y menos de 0,1g en la leche deslactosada
(Fuente: Dos Pinos)

1. Preparar el espectrofotómetro a 505nm.

2. Rotular 4 tubos de ensayo: blanco (B), patrón (P) y muestra de suero (S) y leche (L).
3. Agregar 2mL de reactivo enzimático para determinación de glucosa a cada tubo.
4. Añadir 20µL de agua al blanco, 20µL de solución patrón al tubo P y 20µL de cada muestra a su tubo
correspondiente.
5. Tapar con parafilm y mezclar suavemente, por inversión.
6. Incubar los cuatro tubos por 15 minutos en baño maría a 37°C.
7. Poner a cero el espectrofotómetro con el blanco.
8. Medir y anotar la absorbancia del patrón y de las muestras.
9. Calcular la concentración de glucosa, según la siguiente fórmula:

Abs Muestra
[Glucosa]Muestra (mg/dL) = x [Glucosa]Patrón (mg/dL)
Abs Patrón
NOTAS:
- El color de reacción final es estable por 60 minutos. Medir la absorbancia en este lapso.
- El patrón tiene una concentración de glucosa de 100mg/dL.

Concentración Observaciones:
Tubo Abs505nm
(con unidades)
Patrón 100mg/dL

Suero (1/2)

Leche (1/10)

Leche deslactosada (1/10)

Integración y comparación de los métodos de determinación de glucosa

10. Explique los resultados obtenidos con este método y con la prueba de Benedict.

11. A la vista de los resultados obtenidos, compare desde varios puntos de vista los dos métodos de
determinación de glucosa utilizados en esta práctica.

-11-